CN110669653B - 一种单细胞自动印刷系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物组织工程技术领域，涉及一种单细胞分离设备。一种单细胞自动印刷系统，包括：支撑装置；细胞印刷装置，安装在支撑装置上，用于将细胞溶液涂布于细胞承载体上；细胞承载体，设置在所述细胞印刷装置的下方，接收所述细胞印刷装置涂布的细胞溶液；电控平移装置，用于带动细胞印刷装置及细胞承载体移动，完成细胞溶液的涂布。本发明的系统，结合自动控制技术和图像检测技术，可以实现细胞溶液的自动涂抹和涂抹的细胞密度的实时检测。通过监控装置检测细胞承载体上表面细胞数量和针头中的细胞浓度，形成反馈信息传送给计算机。计算机根据反馈信息协调控制XY电控平移台和Z轴电控平移台的移动速度，以控制细胞承载体移动速度和细胞注射器出液速度，使细胞承载体上存在尽可能多的单细胞。

Description

一种单细胞自动印刷系统

技术领域

本发明涉及生物组织工程技术领域，涉及一种单细胞分离设备。

背景技术

当前基于单细胞水平的研究越来越受到重视并成为今后研究的一种趋势。单细胞分析对于药物筛选、干细胞研究、组织器官再生、癌症诊断和治疗等具有重要意义，已广泛应用于单细胞的DNA扩增、基因组测序和单细胞水平亚细胞给药系统研究等领域。而单细胞分离技术是实现单细胞水平研究的基础。

现有的单细胞分离装置及方法主要有：1、流式细胞术分离法 ：流式细胞术能够有效获得单个细胞，但是需要对细胞进行荧光染色，且流式细胞仪价格昂贵；2、激光显微切割技术：能够从组织中分离单个细胞，但不适用于细胞的培养与扩增，且需要操作者极其熟练地掌握切割技术；3、显微操控仪：采用显微操控技术从单细胞悬浮液中吸取单细胞，再将单细胞移动到指定位置，该方法分离准确率不高且对细胞损伤较大；以上技术的缺陷限制了这些装置的推广应用。

目前很多实验室应用有限稀释技术(Limiting Dilution)分离出单个细胞，由于细胞在悬浮液中的分布近似服从泊松分布规律，当悬浮液被分成小体积时，在高度稀释的样品中，细胞的数量可以低至每个体积中只有一个细胞，这一过程被称为有限稀释技术。该方法由人工操作，对操作人员要求较高，且分离效率和单细胞分离的准确率不高。一般在20％左右，大量存在的空白孔和多细胞孔（细胞数大于或等于2）需要研究人员观察排除，费时费力，该操作方法简单，但是整个过程周期长，费时费力，而且不能保证单个细胞的获取。

发明内容

鉴于现有技术中存在上述问题，本发明提供一种单细胞自动印刷系统，本系统可以实现细胞涂抹密度的实时检测和细胞溶液的自动涂抹，提高了单细胞分离的效率和准确率，并且结构简单，自动化程度高，易于推广。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种单细胞自动印刷系统，包括：

支撑装置；

细胞印刷装置，安装在支撑装置上，用于将细胞溶液涂布于细胞承载体上；

细胞承载体，设置在所述细胞印刷装置的下方，接收所述细胞印刷装置涂布的细胞溶液；

电控平移装置，用于带动细胞印刷装置及细胞承载体移动，完成细胞溶液的涂布。

作为本发明的进一步改进， 所述的电控平移装置包括xy轴电控平移台和Z轴电控平移台，所述XY轴电控平移台与所述的细胞承载体连接，用于带动所述细胞承载体移动；所述的Z轴电控平移台与所述的细胞印刷装置连接，用于控制细胞印刷装置对细胞溶液的吸取和涂布。

作为本发明的进一步改进，所述的支撑装置包括支架和转接板；所述支架的下端固定在底座上，所述转接板固定在支架的上端。

作为本发明的进一步改进，所述的细胞印刷装置包括针头、细胞注射器、连接针头与细胞注射器的管道；所述针头的针尖与所述细胞承载体的上表面虚接触；所述的细胞注射器通过第一夹具固定；所述的针头通过第二夹具固定；所述第一夹具、第二夹具固定在所述转接板上。

作为本发明的进一步改进，所述的转接板由左侧板和右侧板组成，所述左侧板和右侧板通过轴承连接，在所述左侧板和右侧板的上部，设有滑动锁紧装置；通过该滑动锁紧装置，可将左侧板和右侧板分开或固定在一起。

作为本发明的进一步改进，所述的第二夹具包括微调平移台、夹具立臂、夹块；所述夹具立臂上端与微调平移台连接，下端与夹块的固定臂连接。

作为本发明的进一步改进，夹具立臂的下端与所述夹块的固定臂固连。

作为本发明的进一步改进， 夹具立臂的下端与所述夹块的固定臂转动连接，在所述夹具立臂的下端端部设有锁紧旋钮，所述锁紧旋钮通过上下旋转来限制或释放所述夹块的固定臂。

作为本发明的进一步改进，所述的细胞承载的上表面刻有流道，所述流道用于容纳细胞打印装置涂布的细胞溶液。

作为本发明的进一步改进，连接针头与细胞注射器的管道由软管和一段硬管组成，所述软管与所述细胞注射器的下端连接，所述硬管与针头连接。

作为本发明的进一步改进，所述的显微监控装置包括显微镜镜头和第三夹具，所述的第三夹具固定在所述的转接板上，所述的显微镜镜头被加持在所述第三夹具上。

本发明的系统，结合自动控制技术和图像检测技术，可以实现细胞溶液的自动涂抹和涂抹的细胞密度的实时检测。通过监控装置检测细胞承载体上表面细胞数量和针头中的细胞浓度，形成反馈信息传送给计算机。计算机根据反馈信息协调控制XY电控平移台和Z轴电控平移台的移动速度，以控制细胞承载体移动速度和细胞注射器出液速度，使细胞承载体上存在尽可能多的单细胞。

本发明的系统，除了可以用于细胞印刷，还可以用于分子印刷、微纳米溶液材料的布放，或者其他适宜溶液材料的印刷、涂布、布放。

附图说明

图1是本发明其中一种实施例的整体结构示意图；

图2是本发明实施例1的转接板的示意图；

图3是本发明实施例1的第二夹具的结构示意图；

图4是本发明实施例2的转接板锁紧状态的示意图；

图5是本发明实施例2的转接板打开状态的示意图；

图6是本发明实施例2的第二夹具的结构示意图；

图7是本发明实施例的针头的局部示意图；

图8是本发明实施例3的结构示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。

实施例1  本实施例的单细胞自动印刷系统，如图1所示，主要包括底座16，安装在底座16上的支架13，安装在支架13上端的转接板12。支架13与转接板12的左侧部分连接。在转接板12上安装有显微监控装置、细胞印刷装置。

在底座16上安装有XY电控平移台1。XY电控平移台1的上表面放置PDMS芯片2。PDMS芯片2作为细胞承载体，其上表面刻有流道。XY电控平移台1由计算机控制，可以带动PDMS芯片2在X、Y轴两个方向上平移。

如图1和2所示，本实施例中的转接板12为一块长方形板子，其上开设若干圆孔，该孔可以是光孔，也可以是螺纹孔，通过这些孔可将其他装置或部件固定在转接板12上。

细胞印刷装置用于将细胞溶液涂布在PDMS芯片2上的流道内，本实施例中，细胞印刷装置包括针头3、细胞注射器6和连接针头3与细胞注射器6的软管4。其中细胞注射器6被第一夹具9加持固定，第一夹具9固定在转接板12的右侧部分上。细胞注射器6的活塞端部与推拉装置7连接，推拉装置7与固定在转接板12上的Z轴电控平移台8连接。Z轴电控平移台8也由计算机控制，Z轴电控平移台8带动推拉装置7上下移动，从而带动细胞注射器6的活塞移动，通过针头3和软管4实现细胞溶液的吸取和涂布。

在本实施例中，为了实时监控细胞印刷装置在PDMS芯片2上涂布的细胞密度，设置了显微监控装置，该显微监控装置包括显微镜镜头15和第三夹具14。第三夹具14通过螺丝与显微镜微调平移台11连接，显微镜微调平移台11固定在转接板12的左侧部分上，显微镜镜头15加持在第三夹具14上。通过显微镜微调平移台11可以调整第三夹具14及显微镜15的高度。显微镜镜头15位于PDMS芯片2的上方。

本实施例中，针头3为透明材质，其水平位置位于显微镜镜头15的焦点，竖直位置与PDMS芯片2上表面虚接触。针头3倾斜放置，以利于显微镜镜头15拍摄针头3中细胞的流出情况和PDMS芯片2表面的细胞数量。

针头3的固定需要借助于第二夹具5。如图3所示，第二夹具5包括夹块51、夹具立臂53。其中夹具立臂53为L型，其上端通过螺丝与针头微调平移台10连接，下端通过固定臂54与夹块51连接。针头微调平移台10固定在转接板12的大致中间位置上。通过针头微调平移台10来调节针头及夹具立臂53的高度。涂布细胞溶液时，针头3与PDMS芯片2的上表面虚接触，可以将细胞注射器6中吸取的细胞溶液，在Z轴电控平移台8及推拉装置7的推动下，涂布在PDMS芯片2上的流道内。

本实施例中，针头微调平移台10和显微镜微调平移台11采用手动平移台，手动调节。也可以在针头微调平移台10、显微镜微调平移台11上连接步进电机，进行电动调节。

为了实现针头3在涂布细胞溶液和吸取细胞溶液之间的位置切换，需要针头能够在一定角度范围内旋转。本实施例中，夹块51的固定臂54与夹具立臂53采用转动连接方式。例如固定臂54通过螺纹、铆接、铰接或轴销等方式与夹具立臂53的下端连接，从而使固定臂54沿连接轴能够在0-180度范围内转动。本实施中，固定臂54与夹具立臂53的下端通过限位螺钉55连接，如图3所示。

固定臂54可以沿限位螺钉55在0-180度范围内转动，通过拧紧限位螺钉55，可将固定臂54固定在当前位置。当固定臂54旋转到初始位置即0度位置，或180度位置时，还可以通过夹具立臂53下端端部设置的锁紧旋钮52进行固定。锁紧旋钮52向上旋转，可将固定臂54限制在0度位置或180位置，锁紧旋钮52向下旋转可以解除对固定臂54的限制。

在本实施例中，为了方便更换针头3，在软管4与针头3的连接端，连接一段硬质圆管41，硬质圆管41的一端与针头3卡接在一起，如图7所示。第二夹具5的夹块51加持硬质圆管41，从而将针头3进行固定。如此一来，针头3的更换变得更方便，只需将用过的针头从硬质圆管41上拔下来，将新的针头卡接上去即可，无需将夹块51松开。

本实施例的单细胞自动印刷系统，其操作流程为：

1.根据悬浮液中细胞呈泊松分布的规律，配置细胞溶液；

2.将本系统放置在水平操作平面上。初始状态下，针头3的夹块51在0度位置，即针头3位于显微镜镜头15的正下方位置。将夹块51的固定臂54旋转到180度位置，旋转锁紧旋钮52将固定臂54限制在180度位置，同时拧紧限位螺钉55；

3.将针头3放置在细胞溶液内，使用计算机操控Z轴电控平移台8向上移动，带动推拉装置7向上移动进而控制细胞注射器6进行吸液。细胞注射器6的活塞移动距离由所需涂布细胞溶液量的大小决定；

4.当细胞注射器6中吸取足够的细胞溶液后，Z轴电控平移台8停止移动，旋转锁紧旋钮52使其解除对夹块51固定臂54的限制。将固定臂转到0度位置，旋转锁紧旋钮52，同时拧紧限位螺钉55，将固定臂54固定在0度位置，此时，夹块51上的针头3处于显微镜镜头15的正下方；

5.将所需涂液的PDMS芯片2放置在XY电控平移台1上并固定；

6.计算机控制XY电控平移台1移动，将XY电控平移台1上的PDMS芯片2需要涂液的位置移动到针头3的下方，调节显微镜微调平移台11使显微镜镜头15的焦点在PDMS芯片2的上表面；

7.调节针头微调平移台10使针头3与PDMS芯片2上表面虚接触，以利于细胞溶液从3针头流出到2PDMS芯片上表面；

8.开始涂液，计算机控制Z轴电控平移台8和XY电控平移台1协调移动，同时显微镜镜头15实时检测记录针头3中的细胞浓度和PDMS芯片2上流道中单细胞的存在情况；

9.细胞溶液涂抹完毕后，计算机控制Z轴电控平移台8停止移动，控制XY电控平移台1复位。

10.旋转锁紧旋钮52使其不再限制固定臂54的位置，松开限位螺钉55，将固定臂54旋转到180度位置取下针头3；

11.将涂有细胞溶液的PDMS芯片2从XY电控平移台1取下。

本实施例的系统，在涂布细胞液的过程中，显微镜镜头15实时检测记录针头3中的细胞浓度和PDMS芯片2上每个流道中单细胞的存在情况，将图片信息传输到计算机。使用python编写的图像处理程序，提取出图片中每个流道细胞个数。为了使检测与控制统一，同样地使用python编写与Z轴电控平移台8和XY轴电控平移台1的控制器建立连接的程序及速度控制的程序。根据流道中细胞的个数，控制程序可以实时调整Z轴电控平移台8和XY轴电控平移台1的移动速度，进而控制PDMS芯片2的移动速度和细胞注射器6的出液速度，以使得PDMS芯片2表面存在尽可能多的单细胞。

实施例2  本实施例的单细胞自动印刷系统，主要包括底座16，安装在底座16上的支架13，安装在支架13上端的转接板12。在转接板12上安装有显微监控装置、细胞印刷装置。在底座16上安装有XY电控平移台1。XY电控平移台1的上表面放置PDMS芯片2。PDMS芯片2作为细胞承载体，其上表面刻有流道。XY电控平移台1由计算机控制，可以带动PDMS芯片2在X、Y轴两个方向上平移。

细胞印刷装置用于将细胞溶液涂布在PDMS芯片2上的流道内，本实施例中，细胞印刷装置包括针头3、细胞注射器6和连接针头3与细胞注射器6的软管4。其中细胞注射器6被第一夹具9加持固定，第一夹具9固定在转接板12上。细胞注射器6的活塞端部与推拉装置7连接，推拉装置7与固定在转接板12上的Z轴电控平移台8连接。Z轴电控平移台8也由计算机控制，Z轴电控平移台8带动推拉装置7上下移动，从而带动细胞注射器6的活塞移动，通过针头3和软管4实现细胞溶液的吸取和涂布。

在本实施例中，为了实时监控细胞印刷装置在PDMS芯片2上涂布的细胞密度，设置了显微监控装置，该显微监控装置包括显微镜镜头15和第三夹具14。第三夹具14通过螺丝与显微镜微调平移台11连接，显微镜微调平移台11固定在转接板12上，显微镜镜头15加持在第三夹具14上。通过显微镜微调平移台11可以调整第三夹具14及显微镜15的高度。显微镜镜头15位于PDMS芯片2的上方。

本实施例中，针头3为透明材质，其水平位置位于显微镜镜头15的焦点，竖直位置与PDMS芯片2上表面虚接触。针头3倾斜放置，以利于显微镜镜头15拍摄针头3中细胞的流出情况和PDMS芯片2表面的细胞数量。

本实施例中的转接板12由左侧板121和右侧板123组成。如图4和5所示。左侧板121固定在支架13上，左侧板121与右侧板123通过轴承连接在一起，右侧板123能够相对于左侧板121作旋转活动。在左侧板121和右侧板123的上端分别设有一个固定块124，固定块124上套装滑套122。滑套122和固定块124构成了一个滑动锁紧装置。当左侧板121和右侧板123呈180度夹角时，将滑套122滑动到左侧板121和右侧板123之间，此时滑套122分别套住左侧板121上的固定块和右侧板123上的固定块，从而将左侧板121和右侧板123固定在一起，限制右侧板123的活动，如图4所示。当滑动滑套122，使其位于左侧板121或者右侧板123上时，可将滑动锁紧装置打开，右侧板123恢复活动状态，如图5所示。

在本实施例中，第二夹具5包括夹块51、夹具立臂53。其中夹具立臂53为L型，其上端通过螺丝与针头微调平移台10连接，下端通过固定臂54与夹块51连接。通过针头微调平移台10来调节针头及夹具立臂53的高度。其中，固定臂54与夹具立臂53的下端焊接固定，如图6所示，因此固定臂54不能活动。

本实施例中，第一夹具9、第二夹具5及针头微调平移台10、Z轴电控平移台8均固定在右侧板123上；第三夹具14及显微镜微调平移台11固定在左侧板121上。

本实施例的单细胞自动印刷系统，其操作流程为：

1.根据悬浮液中细胞呈泊松分布的规律，配置细胞溶液；

2.将本系统放置在水平操作平面上。初始状态时，滑套122锁紧固定左侧板121和右侧板123，如图4所示。滑动滑套122使其打开，不再固定左侧板121和右侧板123，转动右侧板123，带动其上固定的第二夹具5夹具及3针头到合适位置；

3.将针头3放置在细胞溶液内，使用计算机操控Z轴电控平移台8向上移动，带动推拉装置7向上移动进而控制细胞注射器6进行吸液。细胞注射器6的活塞移动距离由所需涂布细胞溶液量的大小决定；

4.当细胞注射器6中吸取足够的细胞溶液后，Z轴电控平移台8停止移动，转动右侧板123，使针头3恰好到显微镜镜头15的正下方。滑动滑套122使其锁住固定块124，从而将左侧板121和右侧板123连接固定；

5.将所需涂液的PDMS芯片2放置在XY电控平移台1上并固定；

6.计算机控制XY电控平移台1移动，将XY电控平移台1上的PDMS芯片2需要涂液的位置移动到针头3的下方，调节显微镜微调平移台11使显微镜镜头15的焦点在PDMS芯片2的上表面；

7.调节针头微调平移台10使针头3与PDMS芯片2上表面虚接触，以利于细胞溶液从3针头流出到2PDMS芯片上表面；

8.开始涂液，计算机控制Z轴电控平移台8和XY电控平移台1协调移动，同时显微镜镜头15实时检测记录针头3中的细胞浓度和PDMS芯片2上流道中单细胞的存在情况；

9.细胞溶液涂抹完毕后，计算机控制Z轴电控平移台8停止移动，控制XY电控平移台1复位；

10. 滑动滑套122，使其不再锁住固定块124。转动右侧板123到合适位置取下3针头；

11.将涂有细胞溶液的PDMS芯片2从XY电控平移台1取下。

本实施例的系统，在涂布细胞液的过程中，显微镜镜头15实时检测记录针头3中的细胞浓度和PDMS芯片2上每个流道中单细胞的存在情况，将图片信息传输到计算机。使用python编写的图像处理程序，提取出图片中每个流道细胞个数。为了使检测与控制统一，同样地使用python编写与Z轴电控平移台8和XY轴电控平移台1的控制器建立连接的程序及速度控制的程序。根据流道中细胞的个数，控制程序可以实时调整Z轴电控平移台8和XY轴电控平移台1的移动速度，进而控制PDMS芯片2的移动速度和细胞注射器6的出液速度，以使得PDMS芯片2表面存在尽可能多的单细胞。

实施例3 本实例中的单细胞自动印刷系统，主要结构及组成与实施例1或2相同，区别在于：本实施对第二夹具5及针头微调平移台10、第三夹具14及显微镜微调平移台11的安装位置进行了互换，支架13连接在转接板12的中间位置。其结构如图8所示。本实施例的单细胞自动印刷系统的工作流程同实施例1或2。

Claims (6)

1.一种单细胞自动印刷系统，其特征在于，包括：

支撑装置；

细胞印刷装置，安装在支撑装置上，用于将细胞溶液涂布于细胞承载体上；

细胞承载体，设置在所述细胞印刷装置的下方，接收所述细胞印刷装置涂布的细胞溶液；

电控平移装置，用于带动细胞印刷装置及细胞承载体移动，完成细胞溶液的涂布；所述的电控平移装置包括Z轴电控平移台；

所述的细胞印刷装置包括针头、细胞注射器、连接针头与细胞注射器的管道；所述针头位于所述细胞承载体的上方；所述的细胞注射器通过第一夹具固定；所述的针头通过第二夹具固定；所述第一夹具、第二夹具固定在所述转接板上；细胞注射器的活塞端部与推拉装置连接；推拉装置与Z轴电控平移台连接；所述的第二夹具包括微调平移台、夹具立臂、夹块；所述夹具立臂上端与微调平移台连接，夹具立臂的下端与固定臂固连或活动连接；

显微监控装置，所述显微监控装置位于所述细胞承载体的上方；所述的显微监控装置包括显微镜镜头和第三夹具；所述显微镜镜头加持在第三夹具上，所述第三夹具固定在所述转接板上；所述的转接板由左侧板和右侧板组成，所述左侧板和右侧板通过轴承连接，在所述左侧板和右侧板的上部，设有滑动锁紧装置；右侧板能够相对于左侧板作旋转活动；

显微镜镜头实时检测记录针头中的细胞浓度和PDMS芯片上每个流道中单细胞的存在情况，将图片信息传输到计算机；使用python编写的图像处理程序，提取出图片中每个流道细胞个数；使用python编写与Z轴电控平移台和XY轴电控平移台的控制器建立连接的程序及速度控制的程序；根据流道中细胞的个数，控制程序实时调整Z轴电控平移台和XY轴电控平移台的移动速度，进而控制PDMS芯片的移动速度和细胞注射器的出液速度，以使得PDMS芯片表面存在尽可能多的单细胞。

2.根据权利要求1所述的单细胞自动印刷系统，其特征在于，所述的支撑装置包括支架；所述支架的上端设有转接板。

3.根据权利要求1所述的单细胞自动印刷系统，其特征在于，在所述夹具立臂的下端端部设有锁紧旋钮。

4.根据权利要求1所述的单细胞自动印刷系统，其特征在于，连接针头与细胞注射器的管道由软管和一段硬管组成，所述软管与所述细胞注射器的下端连接，所述硬管与针头连接。

5.根据权利要求1-4任一项所述的单细胞自动印刷系统，其特征在于，所述细胞承载体的上表面刻有流道，所述流道用于容纳细胞打印装置涂布的细胞溶液。

6.根据权利要求5任一项所述的单细胞自动印刷系统，其特征在于，所述的电控平移装置包括XY轴电控平移台，所述XY轴电控平移台与所述的细胞承载体连接，用于带动所述细胞承载体移动。

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