JPS639520B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な抗生物質FM−1001物質及びそ
の製造法に関する。 本発明者らは、新規な抗生物質の探索を目的と
して多数の微生物を土壌より分離し、その産生す
る抗生物質を分離探索した。その結果アンプラリ
エラ属に属する微生物を適宜の培地で培養する
と、グラム陽性細菌特にサルシナ・ルテアに特徴
的に抗菌力を示す抗生物質が培地中に蓄積される
ことを見出した。そこでこの抗生物質を単離し、
その理化学的性質及び生物学的性質を検討したと
ころ、新規な抗生物質であることを認め、これを
FM−1001物質と命名した。 本発明はこの知見に基づくもので抗生物質FM
−1001物質及び本抗生物質を生産する能力を有す
るアンプラリエラ属菌を培養し、その培養物から
FM−1001物質を採取することを特徴とする抗生
物質FM−1001物質の製造法である。 FM−1001物質の製造に用いられる微生物とし
は、FM−1001物質の産生能を有する限りすべて
のアンプラリエラ属に属する微生物を用いること
ができるが、例えば本発明者らが新たに分離した
アンプラリエラsp.FM−1001号菌（微工研菌寄第
5749号）が特に好ましい。FM−1001号菌は真正
の栄養菌糸を有し、よく分岐発達するが、気菌糸
は通常観察されない。培地表面に短い胞子のう柄
を生じ、その先端に１個づつの胞子のうを着生す
る。胞子のうは通常円筒形もしくはやや不整形
で、内部に胞子を縦方向に並列して収納する。胞
子のう胞子は水中で放出され徐々に運動性を有す
る遊走胞子となる。栄養菌糸の色調は黄色調で特
徴的ではない。全細胞の加水分解物中には、主と
して３−ハイドロキシピメリン酸と少量のメソジ
アミノピメリン酸が出されるがLL−２，６ジア
ミノピメリン酸は検出されない。以上の諸性質及
び栄養菌糸と胞子の直径からFM−1001号菌は射
線菌目中、アクチノプラーネス科、アンプラリエ
ラ属に属する一菌株である。アンプラリエラsp.
FM−1001号菌は下記の菌学的性質を有する。 形態的性質 栄養菌糸は放線菌類の分類に用いられる培
地、例えばスターチ寒天培地、イースト・麦芽
寒天培地、グルコース・アスパラギン寒天培
地、グリセロール・アスパラギン寒天培地、チ
ロシン寒天培地、オートミール寒天培地等で中
等度もしくはやや良好に生育し、曲線状に分岐
し、直径は0.5〜0.8μｍである。液体培地例え
ば１％ソリユーブルスターチ・１％イーストエ
キス液体倍地で28℃４日間振盪培養しても、菌
糸は桿菌状又は球菌状に分断して培地を混濁さ
せることはない。またジグザグ状の分岐も観察
されない。気菌糸状のごくうすい発育が裸眼
で、グリセリン・アスパラギン寒天培地、スタ
ーチ寒天培地、チロシン寒天培地、オートミー
ル寒天培地、リンゴ酸カルシウム・グリセリン
寒天培地等で見られるが、顕微鏡的には未発達
で、ごく短い痕跡状の菌糸のみが観察され、１
個、２個、３〜６個あるいはそれ以上の胞子の
連鎖は見られない。胞子のうは栄養菌糸より生
じる胞子のう柄に着生し、主として培地表面に
位置する。接種後、28℃３日後には水道水寒天
培地、1/10ポテト・キヤロツト寒天培地、スタ
ーチ寒天培地等に無数に着生する。胞子のうは
円柱状ないしビン状で大きさはかなり大小があ
るが、５〜10×14〜20μｍ位であり、内部に多
数の胞子のう胞子を縦方向に連鎖し配列してい
る。胞子のう胞子は、大きさが約0.5〜0.8×1.0
〜1.8μｍであり、鞭毛を有し、水中に放置する
と放出されて遊送胞子となる。その他菌核や結
束糸などは観察されない。 培養上の性質 実験の方法はイー・ビー・シヤーリングらの
報告（インターナシヨナル・ジヤーナル・オ
ブ・シスチマチツク・バクテリオロジー第16
巻、313〜340頁、1966年）に準じ、その他付加
的に公知の培地及び実験方法を併用した。色調
の決定にはキセノンランプを光源とする標準光
源下で標準色票としてカラー・ハーモニー・マ
ニユアル第４版を用い、一致する色票があれば
一般名を示し、括弧内に色票コードを併記し
た。繰返し同色が現われた場合は色票コードの
みを示た。以下特記しない限り28℃、３週目の
生育の状態であり、ａ欄には生育、ｂ欄には気
菌糸の状態、ｃ欄には溶性色素及びｄ欄にはそ
の他の性質を記載した。 (1) シユクロース・硝酸塩寒天培地 ａ：中等度、アプリコツト、ライト・オレン
ジに近似（near4ia）。 ｂ：作らない。 ｃ：作らない。 ｄ：少数の胞子のうが見られるが３週目には
菌糸に半ばおおわれて観察しにくい。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地 ａ：中等度、ライト・メロン・イエロー
（3ea）。 ｂ：ほとんど見当らない。 ｃ：作らない。 ｄ：胞子のうは多数作られるが、形状は不整
形が多い。 (3) グリセロール・アスパラギン寒天培地 ａ：中等度ないし良好、ライト・アプリコツ
ト（4ea）〜アプリコツト（4ga）。 ｂ：僅かに着生 ｃ：作らない。 ｄ：定型的な胞子のうを多数作る。 (4) スターチ寒天培地 ａ：中等度、4ea。 ｂ：うすくベール状に着生。 ｃ：作らない。 ｄ：定型的な胞子のうを多数着生する。裸眼
でうすい気菌状に見えるのはほとんどが胞
子のうである。スターチは加水分解される
が、ヨード・ヨードカリ液による透明帯は
広くない。 (5) チロシン寒天培地 ａ：中等度、オークブラウン、ラシツト、ブ
ラウン（4pi）。 ｂ：汚白色。 ｃ：ヘンナ、ライト・カツパー・ブラウン、
ラシツト、ラスト・ブラウン。 ｄ：痕跡状の気菌糸と胞子のうを中等度に着
生する。胞子のうは定型でないものが多
い。 (b) 栄養寒天培地（デイフコ・バクト・ヌート
リエントアガー） ａ：貧弱、ライト・メロン・イエロー
（3ga）。 ｂ：作らない。 ｃ：作らない。 ｄ：痕跡状の気菌糸は認められるが胞子のう
は見出されない。 (7) イースト・麦芽エキス寒天培地 ａ：中等度ないし良好、ライト・アムバー
（3ic）。 ｂ：良好。 ｃ：作らない。 ｄ：痕跡状の気菌糸を多く着生するが、胞子
のうは稀にしか見出されない。 (8) オートミール寒天培地 ａ：中等度、3ga。 ｂ：ベール状に着生。 ｃ：作らない。 ｄ：裸眼で粉状の気中生育の見られるところ
は定型的な胞子のうが密集している。 (9) リンゴ酸カルシウム・グリセロール寒天培
地（ワクスマンNo.７） ａ：中等度、4ga。 ｂ：うすくベール状に着生。 ｃ：作らない。 ｄ：痕跡状の気菌糸と胞子のうが良好に形成
される。リンゴ酸カルシウムは溶解しな
い。 (10) 水道水寒天培地 ａ：貧弱。 ｂ：白色、良好。 ｃ：作らない。 ｄ：裸眼で白色、ベール状の寒天培地表面の
生育は顕微鏡下では気菌糸を認めず、多数
の胞子のうよりなる。 (11) 1/10ポテト・キヤロツト寒天培地（エム・
ピー・ルシユバリエー、ジヤーナル・オブ・
ラボラトリー・アンド・クリニカル・メデイ
シン第71巻、934〜944頁、1968年） ａ：貧弱。 ｂ：良好、クリーム色。 ｃ：作らない。 ｄ：定型的な多数の胞子のうを作る。 生理学的性質 (1) 生育温度範囲（スターチ寒天培地斜面、温
度勾配装置）： ８〜36℃（6.5℃以下及び36.5℃以上では
生育しない） 滴温：20〜28℃ (2) グルコース・ペプトン・ゼラチン培地穿刺
培養の液化：弱陽性 (3) スターチの加水分解：弱陽性 (4) 脱脂乳の疑固・ペプトン化：除々にペプト
ン化する。 (5) メラニンの生成 ISP・チロシン寒天培地：褐色 ISP・トリプトン・イーストエキス液体培
地：− ISP・ペプトン・イースト鉄寒天培地：− メラニン形成寒天培地穿刺（ワクスマンNo.
４）：士 (6) 耐塩性（スターチ寒天培地＋食塩、28℃、
２週目）：１％まで生育するが２％では生育
しない。 (7) キサンチン、ヒポキサンチン、アデニンの
溶解性：アデニンを除いてすべて陰性。 炭素源の利用能（プリドハム、ゴドリーブ基
礎培地） 利用陽性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−フラクトース、シ
ユクロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マニトー
ル 利用陰性：ｉ−イノシトール、ラフイノース、
サリシン 以上の菌学的性質に類似する性質を有するアン
プラリエラ・レギユラリス（カウチ）カウチ：
1964年（アプルーブド・リストNo.１、1980年）が
あげられる。両者は胞子のうの大きさ、形状及び
培養上の諸性質でよく類似している。ジエー・エ
ヌ・カウチ及びシー・イー・ブランドはアンプラ
リエラ・レギユラリスを３種のバイオバール
（Biovar）に分別したが（バージース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
ー・第８版、1974年、716〜717頁参照）、FM−
1001号菌はこの内のバイオバールａに属すると考
えられる。野々村ら（醗酵工学会誌、第57巻、79
〜85頁、1979年）によると、アンプラリエラ・レ
ギユラリスの基準株はマニトールを利用しないと
いわれているが、FM−1001号菌はこれを利用す
る点で異なる。しかし炭素源利用能の差異は菌種
を別とする程重要なものでないので、FM−1001
号菌はアンプラリユラ・レギユラリスの一菌株と
固定された。更にこの菌を例えば紫外線、Ｘ線、
放射線、化学薬剤等の人工変異手段により得られ
る変異株を用いることもできる。 培養は公知の放射線菌の培養法又はその改良法
により行うことができるが、工業的には発酵槽中
で通気撹拌培養することが好適である。生産培地
としては、放射菌の培養に用いられる通常の原料
が使用され、すなわち各種の炭素源、窒素源及び
無機塩類並びに場合により生長促進剤や消泡剤な
どを適宜に組合せて用いることができる。一般に
炭素源としてはぶどう糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、
殿粉、デキストリン、糖蜜、大豆油、亜麻仁油な
どを用いることができる。窒素源としては大豆
粉、綿実粉、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、
コーンスチープリカーなどを用いることができ
る。そのほか無機塩類として、たとえばカリウ
ム、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、燐
酸、硫酸、炭酸、硝酸なども必要に応じ用いられ
る。 培養温度は一般に25〜35℃の範囲であるが30℃
付近が好ましい。培養時間は種々の条件により異
なるが通常は72〜148時間でFM−1001物質の産
生蓄積量は最大となる。 培養物からFM−1001物質を単離、精製するた
めには、本物質の理化学的性質を利用し、公知の
手段、例えば不純物との溶解度の差を利用する手
段、イオン交換樹脂又は各種吸着剤に対する吸着
力の差を利用する手段、水と混和しない有機溶媒
よる抽出手段、あるいは沈殿、不純物の除去、透
析、乾燥、再結晶などの手段を適宜選択し組み合
わせて行うことができる。 培養物中に生産された抗生物質FM−1001物質
は、例えば次のようにして採取することが好まし
い。FM−1001物質は菌体及び体の双方に含ま
れるので、たとえば培養物にメタノール、エタノ
ール、アセトン等の水と混和しやすい溶媒を加え
て抽出し、過し、液中の溶媒を留去したの
ち、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム等の
水と混和しない溶媒に転溶する。転溶溶媒は濃縮
して残留物をメタノール−水あるいは酢酸エチル
−ヘキサンの溶媒系で絹晶化する。あるいは培養
物に過助剤を加えて過し菌体と液に分け、
菌体をメタノール、エタノール、アセトン等で抽
出し、溶媒留去後に酢酸エチル、クロロホルム等
に転溶する。一方液は同一溶液で抽出する。両
抽出液を一緒に合わせて濃縮したのち濃縮物を前
記の方法で結晶化する。 夾雑する成分が多い場合は、スチレン系の吸着
樹脂、シリカゲル、アルミナ等の担体でクロマト
グラフイーを行い夾雑物を除去する。たとえばア
ルミナクロマトグラフイーの場合は、展開溶媒と
して酢酸エチル又は酢酸エチル−メタノール混合
液を用い、溶媒中のメタノールの濃度を０％から
10％に変える段階溶出法によりFM−1001物質と
夾雑物を分離することができる。またシリカゲル
クロマトグラフイーの場合は展開溶媒としてクロ
ロホルム−メタノール（100：２容量比）混合溶
媒を用いて展開することにより、FM−1001物質
を他物質から分離することができる。得られた生
物活性溶出区分を減圧濃縮し、前記の溶媒から結
晶化し、再結晶することにより純粋なFM−1001
物質が得られる。 FM−1001物質の理化学的性質並びに生物学的
性質は下記のとおりである。 (1) 色及び性状：無色針状結晶 (2) 融点：156℃〜158℃ (3) 比旋光度：〔α〕²⁵ _D−81゜（ｃ＝１、メタノー
ル） (4) 溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム等の有機溶媒に可溶、水及び
ヘキサンには不溶である。 (5) 安定性：PH３〜９で比較的安定である。 (6) 呈色反応：過マンガン酸カリウムに陽性、ニ
ンヒドリン及び塩化第二鉄の反応は陰性。 (7) 元素分析値（実測値）： 炭素63.56％、水素7.83％、窒素10.30％、酸素
16.65％ (8) 分子量： ¹³C−NMRスペクトル及び元素分
析値から900〜10000程度と推定される。 (9) 紫外部吸収スペクトル：第１図に示す。 メタノール中で測定すると222nｍ（Ｅ１％ 1cm
＝352）、282nｍ（Ｅ１％ 1cm＝60）及び292nｍ
（Ｅ１％ 1cm＝52）に極大吸収を有する。 (10) 赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠によ
るスペクトルを第２図に示す。 特性吸収値：3350、1640、1510、1453、1410、
1370、1315、1240、1090、740cm^-1 (11) 核磁気共鳴スペクトル：重クロロホルム中で
測定したスペクトルを第３図に示す。 (12) シリカゲル薄層クロマトグラフイーによる
R_f値：

【表】 (13) 構成アミノ酸 アラニン、バリン、イソロイシン、微量のグ
リシン（6N塩酸分解による分析）及びトリプ
トフアン（紫外部吸収スペクトルによる分析） (14) 酸性、中性、塩基性の区別：中性物質 (15) 抗菌スペクトル：プレート法による生育阻
止円径を次表に示す。

【表】 (16) 急性毒性：マウスの腹腔内投与でのLD₅₀は
300mg／Kg以上である。 以上の理化学的性状及び生物学的性状を有する
FM−1001物質は脂溶性のペプチド抗生物質で、
その紫外部吸収スペクトルからトリプトフアンを
分子中に有することが示唆される。トリプトフア
ンを分子中に有するペプチドとしてはガルデマイ
シン、コベノマイシン、ラルゴマイシンＦ−、
Ｆ−、Ｆ−、マクロモマイシン、フエノマイ
シン、レナスタカルシン等多くの抗生物質がある
が、これらのペプチドとはその物理化学的諸性質
及びアミノ酸組成が明らかに異なり新規な抗生物
質と判定するに至つた。 実施例 １ 殿粉５％、大豆粉１％、トルラ酵母1.5％、小
麦胚芽2.5％及び炭酸カルシウム0.1％を含有する
液体培地70mlにアンプラリエラsp.FM−1001号菌
株（微工研菌寄受理番号第5749号）を接種し、30
℃で２日間振盪培養して前培養液を作成する。同
じ培地組成からなる液体培地100を200容の発
酵槽に仕込み、これに前記の前培養液１を接種
し、30℃で５日間培養する。通気量は100／分、
回転数は250rpmである。 培養終了後、培養物に同量のアセトンを加え２
時間撹拌したのち過する。液からアセトンを
留去したのち60の酢酸エチルで抽出する。次い
で酢酸エチル層を分離し、減圧下で濃縮し、ヘキ
サンを加えると沈殿が生ずる。この沈殿を別し
減圧乾燥するとFM−1001物質を含む粗粉末約
130ｇが得られる。 この粗粉末10ｇを酢酸エチル100mlに溶解し、
あらかじめ酢酸エチルで充填したアルミナ（50
ｇ）のカラムにかけ同溶媒300mlで洗浄する。続
いて酢酸エチルとメタノールの混合溶媒でメタノ
ール濃度を２％、５％、10％の順に段階溶出する
とFM−1001物質が比較的純度よく分離溶出され
る。この活性区を集めて濃縮し、あらかじめクロ
ロホルムで充填したシリカゲル（50ｇ）のカラム
にかけ同溶媒100mlで洗浄したのち、クロロホル
ム−メタノール（100：２）の溶媒系で展開する
と、FM−1001物質が夾雑物と分離され溶出され
る。次に活性区を集めて濃縮し酢酸エチル−ヘキ
サンの溶媒系で結晶化すると、FM−1001物質の
粗結晶が得られる。更に同溶媒で結晶化を繰返す
ことにより、FM−1001物質の無色針状結晶10mg
が得られる。 実施例 ２ 実施例１と同様に培養したのち、培養物を菌体
と液に分離する。液80を同量の酢酸エチル
で抽出する。一方菌体部は80％アセトン水80で
抽出し、アセトン留去後、水層を酢酸エチルで抽
出する。両者の抽出液を合併し減圧濃縮してヘキ
サンを加えると沈殿が生じる。この沈殿を別し
減圧乾燥するとFM−1001物質を含む粗粉末約
145ｇが得られる。この粗粉末10ｇを実施例１同
様に精製すると、FM−1001物質の無色針状結晶
12mgが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はFM−1001物質の紫外部吸収スペクト
ル、第２図はFM−1001物質の赤外部吸収スペク
トル、第３図はFM−1001物質の核磁気共鳴スペ
クトルを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する抗生物質FM−
   1001物質。 (1) 色及び性状：無色針状結晶 (2) 融点：156〜158℃ (3) 比旋光度：〔α〕²⁵ _D＝−81゜（ｃ＝１、メタノー
   ル） (4) 紫外部吸収スペクトル： メタノール中で測定すると222nｍ（Ｅ
   １％ 1cm＝352）、282nｍ（Ｅ１％ 1cm＝60）及び
   292nｍ（Ｅ１％ 1cm＝52）に極大吸収を有す
   る。 (5) 赤外部吸収スペクトル： KBr錠剤法による特性吸収は次のとお
   りである。 3350、1640、1510、1453、1410、1370、
   1315、1240、1090、740cm^-1 (6) 元素分析値：炭素63.56％、水素7.83％、窒
   素10.30％、酸素16.65％ (7) 溶解性：メタノール、アセトン、酢酸エチ
   ル、クロロホルム等の有機溶媒に可溶、水
   及びヘキサンに不溶である。 (8) 酸性、中性、塩基性の区別：中性物質 ２ FM−1001物質を生産する能力を有するアン
   プラリエラ属菌を培養し、その培養物から抗生物
   質FM−1001物質を採取することを特徴とする、
   抗生物質FM−1001物質の製造法。