JPS6393727A - インフルエンザワクチン凍結乾燥製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 不発明はインフルエンザワクチン凍結乾燥製剤、更に詳
しくはインフルエンザウィルスに由来するＨＡＮＡ抗原
と合成アジュバントとして知られるムラミルジペプチド
目導体（以下、ＮｊＤ　Ｐ　Ｑ導体と称す、）との複合
体からなるインフルエンザウィルス粒子様人工膜ワクチ
ンいわゆるビロソームワクチン（ＶＩＲＯ５ＯＭＥ　Ｖ
ＡＣＣＩＮＥ）　（７）凍結乾燥製剤に間する。

〈従来技術〉 本田旧人等は、現在使用されているインフルエンザワク
チンの安全性及び有効性を改良すへく検討した結果、イ
ンフルエンザＨＡＮＡ抗原とｋｌＤＰ誘導体との複合体
からなるインフルエンザウィルス様人工膜ワクチンを開
発し先に特許出願している（特コ昭６０−１２３３４１
号）。

このワクチンは天然のウィルス粒子とにぼ同じ大きさの
ＭＤＰ誘導体人工膜（直径１００〜３００ｎｍ　）の表
面にＨＡＮＡ抗ぶが結合した形のいわゆるビロソームを
形成している。そして、ビロソームの高次構造を保持さ
せ、物理化学的安定・ｈを保つことは、ビロソームワク
チンの有効性に対して極めて１要である。

このワクチンは、溶、友状態におし１ても、　　’、噌
ＤＰ誘導体が人工膜を形成しているためｈｔｏｐＨ導体
の加水分解が抑制され（ＭＤＰ説導体は通常の条件下で
加水分解を受けやすくその活性が損なわれる）。

化学的にはかなりの安定性を示すが、様々な環境条件で
のワクチン輸送及び使用を考慮したとき。

いまだ安定・池は充分とはいえない１例えば、　　ＭＤ
Ｐ誘１体は通常のワクチン保存条件下である５℃におい
て１週間程で約１０零もの加水分解を受けその分活性が
低下するのに対し１人工膜を形成させた場合同じ温度で
３遍間経過後も約１〜２を程度しか加水分解を受けない
、しかしながら９人工膜を形成させた場合でも、保存条
件が苛酷になった場合９例えば３０℃、３遍間で約１０
零、又５０℃、３週間で約４０亀もの含量の低下が生じ
ている（纂１表参照）。

又１人工膜を利用した製剤において１人工膜粒子の凝集
や融合の問題がある。

このような化学的あるいは物理的に不安定な間９は、一
般【凍結貯蔵又は凍結乾燥により安定化が計れる。

例えば９本発明のビロソームと類似の人工膜を利用した
製剤としては、レシチン等のリン脂質を用いたリポソー
ム製剤がある。そしてリポソームの凍結貯蔵あるいは凍
結乾燥において、グルコースやガラクトース等の１１；
！がリポソームの人工膜の損傷を防ぐ効果を持つが、復
水後のリポソームの凝集や融合は避けられないことが知
られている。

〈発明が解決、しようとする問題点〉 従って、ビロソームワクチンの凍結貯蔵、凍結乾燥によ
る安定化のみならず、復水後のビロソーム製剤の凝集や
融合を避けつる凍結乾燥製剤を提供することが望まれる
。

〈発明の構成〉 本発明は優れた安定性を有するビロソームワクチンの凍
結乾燥製剤を提供するものである。

本発明の凍結乾燥製剤を製するには、先づビロソームワ
クチンを製する。該ビロソームワクチンを製する方法は
９本発明者等が先に出コした特願昭６０−１２３３４１
号明細書中に詳述しているが、概要下記の操作により製
しうる。

先づ、インフルエンザ）ＩＡＮＡ抗原とλｌＤＰ誘導体
とを適当な緩衝液１例えばリン酸緩衝液中で１ｏ／１〜
１／３００　　（重量比）の割合で混合し、この混合物
に赤面活性剤を有効量（０，１〜ＩＯＷ／ｖ％）を加え
て可溶化する。その後、透析により鼻面活性剤を除去し
、新規なＨＡＮＡ抗原−ＭＤＰ誘導体複合体を得る。こ
の場合、使用する界面活性剤は透析により除去可能なも
のを選択することがＭ５であり０例えばオクチルグル：
シト、コール酸ナトリウム等を挙げ得る。かくして得ら
れたＨＡＮＡ抗原−ＭＤＰ誘導体の複合体は９ＭＤＰ誘
導体自体が人工膜をも形成し得。

これにＨＡＮＡ抗原が結合した形のいわゆるビロソーム
を形成している。

別の態様によれば、　　ＭＤＰ誘導体と組合せてコレス
テロール及び／又はレシチンとジセチルフォス°フニー
ト等の使用も可能であり、これによって！Ｊ　Ｄ　Ｐ誘
導体人工膜形成能を高揚させ得る。しかも、この態様に
おいては、上述の鼻面活性剤の使用及び透析を必ずしも
行う必妥はなく９例えば通常のソニケーション（乏音波
法）、マイクロインジェクション法、逆相エバボレーシ
ョン法等によってもλ＋ＤＰ銹専体人工膜が形成できる
という利点がある。

ここで使用するｙ、＋　ｏ　ｐｙ、導体とは、　　ＭＤ
Ｐ自体の種々の化学修ｎ体であり９本土題人の１人その
他により開発されたもので、その特許出願明細書中に詳
しく記載されている。例えば特開昭５２−４６０２０号
、特開昭５２°−１５５８１２号、特開昭５４−７３７
２９号、特開昭５４−１３０５１７号、特開昭５５−１
！１２３８号、特開昭５５−２８９３２号、特開昭５５
−２８９３３号、特開昭５６−１８９９６号及び特開昭
５６−４９３９Ｅ号記社のＭＤＰ誘導体がある。

好ましいのは、特２昭５４−１３０５１７号の一般式：
（式中、ｑは総炭素数２０〜６０の合成高級脂肪酸残基
を意味し、ＡはＬ−アラニン、Ｌ−セリン又はグリシン
を、　１ｓｏＧ１ｎはイソグルタミンを意味する。）で
示されるｋｌＤＰ高級脂肪酸エステル［特に好ましのは
８３０−Ｎ！ＤＰと称される６−Ｏ−（２−テトラデシ
ルヘキサデカノイル）〜ＩＤＰである。コ及び特開昭５
６−１８９９５号記載の一般式： （式中、Ｘはし−アラニン、し一セリン、し−バリン。

グリシン等のアミノ酸を、Ｙは−ＮＨ−Ａ又は−Ｎ）Ｉ
ｃ）Ｉ　（Ｃ）＋２）。−ＮＨＣＯ−Ａを意味し、Ｒｏ
は水素原子、°低級アルキル基、カルボキサミド基又は
カルボキシル基を、ｎは１〜δの整数を、Ａは炭素数８
〜３００分枝を有することもある飽和又は不飽和脂肪族
炭化水素残基を意味する。）で示されるｕｏｐＢ導体〔
特に好ましいのは、　ＭＤＰ−Ｌｙｓ　（Ｌｉ２）と称
されるＮｃ！−（Ｎ−アセチルムラミル−し−アラニル
−Ｄ−イソグルタミニル）−Ｎ６−ヌテアロイルーし一
リジンである］及び特公昭６０−７８９９７号記載のＭ
ＤＰ　（ＭｅＡｌａ）　−Ｌｙｓ　（Ｌｉ２）と称され
るＮ”−（Ｎ−アセチルムラミル−Ｎ−メチル−し−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミニル）−ＮＦ−ステアロイル
−し−リジンである。

又、使用するインフルニンザＨＡＮＡ抗原は、インフル
エンザウィルス感染尿腹腔液から低高速遠心又は化学的
処、理によってウィルスを精製し、得られた精製ウィル
スを鼻面活性剤１例えばトリトンＸ−ＩＧＯ、コール酸
ナトリウム等で可溶化するかあるいはエーテルのような
有機溶媒によってウィルスを分解し、その後、更にショ
糖密度勾配遠心法やアフィニティークロマト法等によっ
て分ＥＭ　′４ｉ製することによって取得できる。

上述の如くして製したビロソームワクチンの安定な凍結
乾燥製剤、即ち本発明の凍結乾燥製剤は下記の如くして
ユしつる。

即ち、上述した如くして製したビロソームワクチンの溶
液に、阜精類、二糖悶又は三糖類の粘類より還ばれる少
くとも一種以上を粉末あるいは水溶液として加え、必要
であれば除菌濾過を行った後、包装単位に従い分注し、
常法に従って凍結乾燥すればよい。

本発明に用いられる安定化剤としての糖類の具体例とし
ては、！＃４類として、ガラクトース、キシロース、グ
ルコース、フルクトース、マンノース又（±リボースが
挙げられる。二日頚は、ラニークロース。マルトース、
ラクトース又はセロビオースが挙げられる。三糖類は、
マルトトリオース又はラフィノースが挙げられる。

安定化剤の濃度は、凍結乾燥時の濃度として規定すると
、　３〜３０（Ｗ／Ｖ）λの範囲で添加すればよく、望
ましくは、　５〜２０（＊／ｖ）％である。なお、添加
する安定化剤を２種以上混合して使用する場合において
も、添加ユは総ユとして上記幅であれば充分効果を発揮
する。

安定化に有用な糖頚は、記を例に留まらず、凍結乾燥可
能であり、イ目対的に水和量が多く、凍結時、氷晶形成
を妨げる糖類でおれば効果を発揮する。

一方０通常、凍結乾燥剤の安定化剤として用いられるマ
ンニトール、イノシトール等の砧アルコールは、凍結乾
燥時の氷晶形成が大きく１人工膜の凝集、融合を生じ、
安定化効果に欠け、不発明の目的を達することができな
い。

本発明コツ日道ツ１１の凍結乾燥剤に供するビロソーム
は前、述したコレステロールを包含させたものが特に好
ましく、かつ又、ビロソーム人工膜における！、Ｉ　［
Ｉ　Ｐ誘導体とコレステロールの組成比は重量比で１／
２以下が望ましく、特に、１／１以下においては、凍結
乾燥前後及び２５℃、　６力月保存後も粒子径の増大を
にとんと認めず、巧めで安定である。

〈発明の効果〉 本ビロソームワクチンは単に凍結産乞燥しただけでは、
′ａ、結時の氷晶形成により１人工膜の　２や融合を起
こし、かつ又、復水後においてビロソーム製剤が得られ
ないが１本発明によって裂した凍結乾燥製剤は優れたビ
ロソーム製剤としてのε力理化学的安定性を維持するの
みならず、薬効の維持及び成分Ｍ　Ｄ　Ｐ　ｕ導体の化
学的安定性にも寄与するものである。

本発明凍結乾燥製剤の優れた効果は、凍結乾燥原液と凍
結乾燥後復水したものとのビロソーム粒子径測定、電子
頌徴鏡写真の形状判定、抗体価の測定、更には長期保存
後の同上の判定をすることにより確認した。

その結果９本発明の凍結乾燥製剤は凍結乾燥前後及び長
期保存において、一定の粒子径を保持するという物理化
学的安定性のみでなく、　　ＭＤＰ３導体の化学的安定
性にも及ぶことが明らかになった。

このような安定性の改善により、ビロソームワクチンの
防沫の改善及び有効朗間の延長が期待される。又２本凍
結乾燥ワクチンは凍結乾燥粉末であり、投与対象として
、非経口のみならず腸溶性カプセルに充填することによ
り経口投与も可能である。

尚、安定性評価のための粒子径の測定は光子相開法によ
るレーザー光散乱測定装置によった。

又、有効性評価のための抗体価の測定は、　ＷＩＩＯ法
に準じてヘマグルチニンインヒビジョンテスト（Ｈｅｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｔｅ５
ｔ　）を行い抗体産生能を測定した。

実施例１ 精製インフルエンザＨＡＮＡ抗原（Ａ／ＢＡＮＧＫＯＫ
／１／７９（）１３Ｎ２１株より精製したもの）を含む
０．０１モルのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｌｌＨ７
，２）にＢ５０−１１１ＤＰ　３０ｍｇ及びコレステロ
ール（純度９８．Ｈ以上）　３０１ｎｇを混合したのち
、界面活性剤のオクチルグルコシドを誂の割合になるよ
うに加え、超音波発生装置を用い均一に混合した。その
混合液を透析膜に入れ。

ＰＢＳに対して透析しオクチルグルコシドを除去した。

得られたサンプルをＨＡＮＡ抗Ｎ　’ｔＲａとして１０
μｇＮ／ｍｌになるように５整したのち、濃度２０零の
マルトース溶液とｌ：１　に混合し、凍結乾燥原液とし
た。そのｉｍｌをバイアルに分注した後、常法により凍
結乾燥した。

上記で調製した原液とその凍結乾燥品の経時安定性を、
ビロソームの粒子径及びＢ５０−！、ｌＤＰ　（７）残
存率により評価した。サンプルの保存条件は５，３０゜
４０、５０℃の各温度で３週間とした。

結果は表１のとおりであり、ビロソームの粒そ径及びＢ
３０−ＭＤＰの残存率の両方共、凍結乾燥製剤の安定性
が極めて優れていることを示している。

実施例２ Ｂ　３０−　）、＋　Ｄ　Ｐとコレステロールの重量比
１７０．４更にオクチルグシド濃度３９６の条件で実施
例１と同様の方法により、安定化剤としてマルトースを
使用し、サンプルを調製した。そして、その長期安定性
を外観及びビロソーム粒子径により評価した。

結果は表２及び３のとおりであり、凍結乾燥製剤は２５
℃、　６力月の保存において開始時と比較して、外観試
験でのにとり及び粒子径の増大を認めす、朽めて安定で
あった。

実施例３ 安定化剤として表４に示す各糖類を用いた以外は実施例
１の手順を繰返して各種凍結乾燥製剤を調製した。

各々のすｙｆｚヲ凍結乾燥後３０℃、　３遍間保存した
のち復水したものについて、ビロソーム粒子径及びＢ３
０−ＭＤＰ残存率を測定した。結果を表４に示す。

通常、凍結乾燥製剤の安定性として用いられる粘アルコ
ールであるマンニトール（Ｎｏ、１０　）及びイノシト
ール（Ｎｏ、１１　）は、凍結乾燥前後の粒子径の増大
が大きい。これらの糖アルコールは、凍結時の氷晶形成
が大きく２人工膜の凝集、融合を生じさせやすい。

Ｂ３０−ＭＤＰの含量は３０℃、　３週間保存後原液が
約１０％、糖無添加の場合約詰の低下を示したのに対し
、糖類を添加したものはほとんど含量低下を認めなかっ
た。

表１　ビロソームワクチン原液と凍結乾燥製剤の安定性
の比較 注二〇人ロ膜を形成していないＢ２Ｏ−ＭＤＰ液の５℃
保存の残存率は１週間で約９０４でありた。

■原液の出発時のビロソーム粒子径は２２６．５ｎｍで
あった。

表２　凍結乾燥製剤の長期安定性（外説試襞）表３　凍
結乾燥製剤の長期安定性（粒子径）表４　各種安定化剤
の評価 参粒子径１１００００ｎ以上の為測定不能特許庁長官　
黒　１）明　雄　殿 １．事件の表示　　昭和６１年特許願第２４０５４２号
２、発明の名称　　インフルエンザワクチン凍結乾燥製
剤３、補正をする者 事件との関係　　　出願人 名称　　国立予防衛生研究所長 同　　第−製薬株式会社 同　　　　財団法人　化学及血清療法研究所４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 （１）明細書第１６頁最下行の次に、下記の記載を追加
する。

「実施例４ 実施例３で調製したＮα２、Ｎα３およびＮα４ワクチ
ン即ち安定化剤としてシュークロース、マルトースおよ
びラクトースを用いたものの、それぞれの液状品および
凍結乾燥品についてマウスにおけるＨＩ抗体産生能を測
定した。

マウスはＤＤＹマウス（４週令、♀）を用い各群１０匹
の腹腔内にそれぞれＨＡ　Ｎ　Ａ抗原量で０．１μｇＮ
／マウスの投与量で接種した。

その後接種３週間口および２ケ月目の各５匹について採
血を行い、ＷＨＯ法に準じてヘマグルチニンインヒビシ
ョンテストヲ行いＨｉ抗体価を測定した。結果は表５に
示すとおりであり、免疫３週間では液状品、乾燥品とも
に変りはないが、免疫２ケ月ではむしろ凍乾品に抗体価
の上昇がみられた。

なお、比較のため）ｉＡＮＡのみのものおよびホルマリ
ン処理（０，０２％添加）および無処理についても検討
した。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）インフルエンザＨＡＮＡ抗原とＭＤＰ誘導体との
   複合体からなるインフルエンザワクチンに、単糖類、二
   糖類又は三糖類の糖類より選ばれる少くとも一種以上を
   添加して製したインフルエンザワクチン凍結乾燥製剤。
2. （２）ＭＤＰ誘導体がウィルス様人工膜粒子を形成して
   いる特許請求の範囲第（１）項記載のインフルエンザワ
   クチンの凍結乾燥製剤。
3. （３）ウィルス様人工膜粒子がコレステロールを含む特
   許請求の範囲第（２）項記載のインフルエンザワクチン
   凍結乾燥製剤。