JPS6362699B2 - - Google Patents

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JPS6362699B2
JPS6362699B2 JP55022356A JP2235680A JPS6362699B2 JP S6362699 B2 JPS6362699 B2 JP S6362699B2 JP 55022356 A JP55022356 A JP 55022356A JP 2235680 A JP2235680 A JP 2235680A JP S6362699 B2 JPS6362699 B2 JP S6362699B2
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S436/819—Multifunctional antigen or antibody

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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体、特には生物学的流体例えば血清
についてのその中に存在する免疫学的化学物質例
えば抗原または抗体の存在の分析に関する。本明
細書において記号“Ag”，“Ab”および“Ab：
Ag”はそれぞれ抗原（ハプテン、および抗体お
よび同様の結合タンパク質と結合することができ
る他の物質を含む）、抗体〔同様の結合タンパク
質およびタンパク質たとえばリウマチ様因子
（RF）、CIqおよびマウスの血清および腹水液の
活性成分を含む〕およびAgとAbとの複合体を意
味するものとして使う。
Agが適当なAbと反応してAb：Agを形成する
ことは公知であり、大部分の免疫学的検定操作で
はこの反応を使う。さらに微粒子状材料たとえば
ポリスチレン〔一般にラテツクス（latex）と呼
ばれる〕をAbまたはAgでおおい、次にそのコー
テイングされた粒子を試験すべき試料溶液に接触
させて粒子が凝集するか否かどの程度凝集するか
を観察することも公知である。凝集は、１つまた
はそれ以上のコーテイングされたラテツクス粒子
と反応して凝集を起こすことができるAbまたは
Agが試料中に存在することを示す。
コーテイングされた粒子の凝集を観察する技術
は多くの点で充分なものであるが、少量（とりわ
け低濃度）のAbまたはAgを検定するには問題が
ある。少量のAbまたはAgはそれぞれAg―コー
テイングラテツクスまたはAb―コーテイングラ
テツクスの信頼できる観察が可能な凝集を起こす
には充分でないことがあり得る。従つて抗原また
は抗体と通常使うラテツクス粒子との間の大きさ
と量の違いのために、２つまたはそれ以上のラテ
ツクス粒子の間に数個の抗原／抗体架橋が形成し
た場合にだけ観測できる凝集が起こる。しかしも
し抗原または抗体の分子数が非常に少ないと凝集
を起こす数個の抗体架橋が形成する統計的な可能
性は非常に低く、従つて凝集も非常に小さい。
本発明で２種の異なるコーテイングされた粒子
を使うことによつてこの問題を解決する方法を発
明した。本発明によれば、検定すべきAbまたは
AgをAbまたはAgと結合する第１の粒子試薬と
混合する。結合反応は可逆的であり次のように示
される： Ab＋粒子〔Ab.粒子〕 (1) 少量の凝集では正確で信頼できる測定をするに
は不充分であろう。この混合物に次に過剰量の第
２の粒子試薬を加える。この第２の試薬は〔Ab.
粒子〕複合体と結合して凝集塊を形成し、複合体
は平衡関係から効果的に除去されて平衡は右へ移
る〔式(1)において〕。検定すべきAbまたはAgは
実質的にすべて複合体に変換され凝集塊となるこ
とができる。混合物中で凝集しないで残つている
第１の試薬または第２の試薬の量を測定すること
によつてAbまたはAgの存在および／または量を
決めることができる。
すなわち本発明は、 (a) 検定すべき抗体（Ab）または抗原（Ag）と
結合して複合体を形成するAgまたはAbを結合
した第１の微視的または次微視的粒子試薬と液
体とを混合し、 (b) 段階(a)で形成した複合体と結合して該複合体
を保持する第１の粒子試薬との凝集塊を形成す
るが遊離の第１の粒子試薬とは凝集塊を形成し
ない、第１の粒子試薬とは異なるAgまたはAb
を結合したそして第１の粒子試薬との識別が可
能な第２の微視的または次微視的粒子試薬を段
階(a)の混合物に加え、そして (c) 凝集していない第１のまたは第２の粒子試薬
の存在および／または量を選択的に測定し、そ
うして検定すべきAbまたはAgの存在および／
または量を決める ことから成る、液体についてその中のAbまたは
Agを試験する方法 を提供する。
本発明の方法で使う粒子試薬は微視的または次
微視的大きさであり、すなわち一般に15ミクロン
よりも小さく最も普通には２〜３ミクロンまたは
ミクロン以下の桁の大きさである。そのような大
きさのラテツクス粒子は一般に販売されている。
AbまたはAgが微視的粒子材料たとえばラテツク
スと結合することは公知である。これは粒子上に
反応性のコーテイングをほどこし、AbまたはAg
の間で化学的に結合をおこすかまたはAbまたは
Agをその上に吸着することによつて通常行なわ
れる。ある環境ではAbまたはAgと粒子とを直接
（介在するコーテイングなしに）結合させること
もできる。粒子試薬の製造方法は本発明を構成す
る部分ではなく、当該技術分野では公知であるの
で本明細書にはくわしく記載はしない。
本方法の段階(c)で凝集していない第１のまたは
第２の粒子試薬の存在および／または量を選択的
に測定する。そのために第１の粒子試薬と第２の
粒子試薬とは識別可能なものとする。識別手段と
して寸法、比重、標識、磁気吸引性等任意の手段
を利用できる。たとえば本発明の好ましい実施態
様においては、遊離の第１または第２の粒子試薬
を凝集塊の存在下すなわち分離段階を経ないで計
数することによつて選択的測定を行なうことがで
きる。このことは第１および第２の粒子試薬とし
て異なる大きさのものを使い、２つのうちの少な
くとも１種の試薬を選択的に反応混合物中で計数
できるようにすればよい。この目的のために使え
る計数法は公知である。与えられた範囲以外の大
きさのすべての粒子を無視する設定をすることが
できるので、２つの試薬として適当な大きさのも
のを選べば一方の試薬および凝集塊の存在下で他
方の試薬を選択的に計数することができる。一般
に信頼できる計数を行える粒子の最小の大きさは
約0.6μであり、従つて少なくとも１つの粒子試薬
はこの大きさ以上である。他方の試薬はより小さ
いかまたはより大きくてよい。他方の試薬はより
小さいことが好ましく、最も好ましくは0.6μより
小さい大きさであつて従つて第１の試薬の定量を
妨げる重大な可能性がないのがよい。また第２の
試薬が第１の試薬よりも小さい場合、複合体〔式
(1)で生成する〕と第２の試薬との反応はより効果
的になる。第１の試薬の粒子は第２の試薬の粒子
の少なくとも約２倍の大きさであることが好まし
い。それぞれの粒子試薬の粒子の大きさは実質的
に均一であることが好ましい。
遊離の粒子試薬のうちの１種を分離段階なしで
選択的計数によつて検定することが本発明方法の
きわめて好ましい特色であるが、凝集塊と一方
（または両方）の遊離の粒子試薬とを分離した後
段階(c)の選択的検定を行なうこともできる。分離
段階は種種の方法たとえば遠心分離によつて行な
うことができる。好ましくは２種の粒子試薬は大
きさが異なるため、遠心分離を行なうと凝集塊お
よび２種の粒子試薬のうちの大きい方の試薬は沈
殿し、他方の遊離の粒子試薬は検定すべき上澄液
に残る。その検定は計数法または他のいずれの通
常の方法で行なつてもよい。たとえば残留してい
る遊離の粒子試薬に固定用の標識たとえば放射性
原子、発ケイ光団または酵素を保持させ、公知の
技術による標識方法によつて検定を行なうことが
できる。
分離を通常の方法で容易に行なう別の方法は、
１種の粒子試薬に磁気に吸引される材料を含ませ
ておいて磁場をかけることによりその試薬（遊離
形も凝集塊に含まれるものもともに）を沈殿させ
るかまたは局在化させ他方の（磁性でない）遊離
の試薬をけん濁液中に残すことである。そして前
記した通常の技術たとえば計数法または標識を使
う方法によつて遊離の試薬を検定する。磁気に吸
引される粒子は公知である。
本発明の方法に従つて特定のAbまたはAgの存
在を探知する場合は、凝集を起こつたか否かを確
認するだけでよい。すなわち必要なのは第１のま
たは第２の粒子試薬のいずれかが凝集塊にとりこ
まれたか否かを観ることだけである。従つて例え
ば、反応混合物中に遊離のまま残留している第１
の試薬粒子の数を計数しその結果を段階(a)で加え
たその粒子数と比較することにより、第１の試薬
の粒子が検定すべき特定のAbまたはAgの粒子と
結合し従つて凝集塊にとりこまれたか否かを決め
ることができる。
定量検定のために通常使うのは、標準の結果す
なわち既知の量の特定のAbまたはAgの検定に使
う特定の量の試薬を使つて得る結果である。段階
(c)の検定結果と標準の結果を比較するだけでその
AbまたはAgの未知の量を求めることができる。
標準の結果つまり標準曲線をこの一般的な方法で
使うことはよく知られた技術である。
本発明による方法はウイルス性または細菌性感
染症に対して体が産生する多くの種類の抗体たと
えば抗―DNA、抗麻疹ウイルス、抗食物抗原、
抗ブルセラ菌および他の物質たとえばフエリチン
の探知および検定に使うことができる。本発明の
方法はとりわけヒト血清中の少量の抗体の検定に
有効である。例えば特定のアレルゲンに対する少
量のIgE抗体をIgEおよび他のアレルギンに対す
るIgE抗体の存在下に定量することが本方法によ
つて可能である。
患者が感作している物質を同定するためにある
アレルゲンに対するIgE抗体を定量および滴定す
ることは普通に使われる。本発明の方法ではアレ
ルゲン例えば家のほこり、猫の毛または草花の花
粉の抽出物を例えば吸着または共有結合で第１の
試薬粒子にコーテイングする。このラテツクスを
患者の血清中でインキユベートする。粒子上に存
在するアレルゲンに対するIgE抗体を患者の血清
が含むならば粒子は抗体を取りこむ。例えばヒト
IgE抗体に対するウサギまたはヤギの抗体を持つ
第２の試薬粒子を使うとIgE抗体によつてアレル
ゲンのコーテイングをされた粒子が凝集すること
ができる。凝集の量は結合しているIgE抗体の量
に依存する。抗IgEまたは抗IgA抗体によつてコ
ーテイングされた第２の試薬粒子を使うと他のク
ラスの抗体を測定することができる。粒子上のア
レルゲンと反応しなかつた粒子グロブリンによる
妨害を避けるためにラテツクスは遠心分離および
洗浄してもよい。本方法の２つの段階は以下のよ
うに示される： (1) Lx―花粉＋IgE抗花粉＋IgE抗（他のアレル
ゲン）→Lx−花粉―IgE抗花粉＋IgE抗（他の
アレルゲン） (2) Lx―花粉―IgE抗花粉＋Lx―抗IgE抗体→凝
集 抗原によりコーテイングされたラテツクスを抗
原によりコーテイングされた磁性粒子に置き換え
ることができる。この場合遠心分離の代わりに磁
気による分離を使い、第２の試薬粒子を加えた後
さらに磁気による分離を行ない、遊離の第２の試
薬粒子だけを計数のためにけん濁液中に残すこと
ができる。
本発明の方法はリウマチ様因子（RF）および
他の同様の結合タンパク質または凝集素
（agylutinator）〔たとえばClq、マウス血清の活
性画分（米国特第4162895号参照）およびマウス
腹水液の活性画分（欧州特許出願第793023425号
参照）〕の検定にも有効である。RFはIgGに対す
る自家抗体である。これはそれ自身でIgG，IgM
またはIgAクラスの免疫グロブリンになることが
できる。RFのクラスを同定することはある種の
疾患の診断および激しさの判断に有効であり、こ
の同定は本発明の方法によつて行なうことができ
る。本方法では、例えばウサギのIgGをコーテイ
ングした磁性のセルロース粒子と血清とを混合す
ることによつてまず血清からRFを取り出す。
（RFを持つている）粒子を分離して洗い、例えば
抗ヒトIgG（または所望により抗ヒトIgAまたは抗
ヒトIgM）のヤギIgGでコーテイングした第２の
試薬粒子と混合する。磁気的に分離した後遊離の
第２の試薬粒子を定量する。
本発明の方法はAgの検定にも有効である。こ
の操作においては抗原を含む血清を、まずその同
じAgが付着しているラテツクス粒子次にそのAg
に対する限られた量のAbと混合する。遊離のAg
とラテツクスに結合したAgとがAb上で競合し、
ラテツクス―Agと結合する（その結合ラテツク
ス上で免疫複合体を生成する）Abの量は血清試
料中の遊離のAgの量に依存することになる。
次に第１段階で使つたAbに対する試薬のAbか
ら成る第２の粒子試薬を加える。第２の試薬は免
疫複合体を持つている第１の試薬粒子の凝集を起
こす。凝集していない第１のまたは第２の試薬粒
子を測定することによつて血清中のAgの存在お
よび／または量を決めることができる。
この検定は例えばプロゲステロンに対し、第１
の粒子試薬として物理的吸着によつてフエリチン
―プロゲステロン複合体でコーテイングされた
0.8μのラテツクスを使い、第２の粒子試薬として
抗ウサギIgGのヤギIgGの吸収によりコーテイン
グされた0.2μの粒子を使つて、行なうことができ
る。使用する抗血清はウサギの抗プロゲステロン
抗血清である。
前記のAgに対する本検定方法では、本検定は
第１の粒子試薬と結合することができるAbの量
に実際上依存し、その量は逆に血清中に存在する
Agの量に依存することが認識できる。
本発明の方法では第１の粒子試薬は検定すべき
被分析物に対して選択的であり、第１の試薬粒子
は第２の試薬粒子よりも大きいことが好ましい。
プロゾーン効果を得るために第２の試薬粒子の大
過剰量を使う。
本発明をさらによく理解するために以下に実施
例を示すが、これらは本発明の範囲を限定するも
のではない。
例 １ ヒト血清中のIgE抗体の検定 アレルゲン（例えばブタクサの花粉）に対する
IgE抗体は以下に従つて検定する。
比較的大きい直径（例えば0.79μ）のラテツク
ス粒子を例えば単純な収着またはシアン化臭素ま
たは水酸化ラテツクスとの共有結合によつてアレ
ルゲンでコーテイングする。血清のある量（例え
ば50μ）を緩衝液中のこれらの粒子のけん濁液
（例えば107個粒子／ml）のある量（例えば50μ）
と混合する。この混合物を約10分間25℃でインキ
ユベートする。次に比較的小さい直径（例えば
0.08μ）のラテツクス粒子のある量（例えば50μ
）を加える。この粒子にあらかじめ吸着によつ
てウサギの抗IgE抗体をコーテイングしておき、
緩衝液中の約107個粒子／mlのけん濁液とてして
混合物に加える。
できた混合物を約10分間25℃でインキユベート
し、GBS緩衝液（グリミン0.1M、NaCl0.17M，
PH９）60mlで希釈し、大きな凝集塊およびラテツ
クス―Ab粒子を計量しない粒子計数器に導く。
凝集しなかつた大きなラテツクス粒子の数は、大
きな粒子上のアレルゲンに結合したIgEの量に反
比例し、従つて血清中のIgEの量に反比例する。
例 ２ リウマチ様因子の定量 試薬：粒子の大きさがガウス分布に従いその95
％が0.5〜3.0ミクロンにある磁性セルロース粒子
にウサギIgGを結合させる。0.8μのポリスチレン
粒子を物理的吸着によつて抗ヒトIgGのヤギIgG、
抗ヒトIgAのヤギIgGまたは抗ヒトIgMのヤギ
IgGのどれかでコーテイングする。セルロース粒
子をコーテイングする材料を交さ反応することを
避けるためにヤギ抗血清をウサギIgGであらかじ
め吸収しておく。反応媒質は0.1Mグリシン―
NaOH緩衝液から成り、PH9.2でNaCl0.17Mを含
む。
磁性粒子のけん濁液（５mg／mlグリミン緩衝
液）75μと血清の種々の希釈液300μを３mlの
ガラス管に入れ、うず撹拌器（vortex mixer）
上室温で45分間インキユベートする。粒子を捕え
るために磁石を使いながら磁性粒子をグリシン緩
衝液２mlずつで３回洗う。洗浄後グリシン緩衝液
75μを加え、そのけん濁液を３本のガラス管に
分けそれぞれ１つずつのクラスの抗体の定量に使
う。抗IgGラテツクスのけん濁液（0.625ｇ／）
試料100μを１番目の管に、抗IaAラテツクスの
それを２番目の管に、および抗IgMラテツクスの
それを３番目の管にそれぞれ加える。ラテツクス
およびセルロース粒子をうず撹拌器上室温で30分
間インキユベートする。グリシン緩衝液２mlで希
釈した後管を２度ひつくり返し、磁性粒子は磁石
で管壁に保持しておく。上澄液250μをグリシ
ン緩衝液２mlで希釈し、テクニコン自動分析器
（Technicon Auto Analiser）に導入する。磁性
粒子によつて保持されなかつた粒子が自動計数器
で計数される。粒子の数は試薬している血清の希
釈度に関係する。
本発明の方法は不連続または連続流体自動化方
法によつて操作することができる。自動装置の例
では用意した試料50μをぜん動ポンプでラテツ
クス―アレルゲン50μと同時に吸引する。そう
してできる流れを振動混合コイル（50Hz）に10分
間通す。ラテツクス―Ab複合体を含み0.1ml／分
の流速のもう１つの流れにコイルから出てきた流
れを合わせる。合わせた流れを２番目の振動混合
コイルにさらに５分間通す。その流れを400倍に
希釈し、凝集した粒子および小さいラテツクス―
Abを除去するために２つの出口をそなえたセル
計数器に通す。
前記の例は実施例として記載したものであり、
本発明の範囲を限定するものではない。試験すべ
き血清または他の液体が本発明の方法を妨害する
可能性のある物質を含む場合は、そのような物質
を除去しまたは不活化するために血清または液体
を処理すると考えてよい。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 検定すべき抗体（Ab）または抗原
    （Ag）と結合して複合体を形成するAgまたは
    Abを結合した第１の微視的または次微視的粒
    子試薬と液体とを混合し、 (b) 段階(a)で形成した複合体と結合して該複合体
    を保持する第１の粒子試薬との凝集塊を形成す
    るが遊離の第１の粒子試薬とは凝集塊を形成し
    ない、第１の粒子試薬とは異なるAgまたはAb
    を結合したそして第１の粒子試薬との識別が可
    能な第２の微視的または次微視的粒子試薬を段
    階(a)の混合物に加え、そして (c) 凝集していない第１のまたは第２の粒子試薬
    の存在および／または量を選択的に測定し、そ
    うして検定すべきAbまたはAgの存在および／
    または量を決める。 ことから成る、液体についてその中のAbまたは
    Agを試験する方法。 ２ 第１と第２の粒子試薬として異なる大きさの
    ものを使い、段階(c)において分離操作なしに第１
    および第２の試薬粒子および凝集塊の混合物中で
    凝集していない第１または第２の試薬粒子の少な
    くともどちらか一方を選択的に計数してその存在
    および／または量を測定する前項１に記載の方
    法。 ３ 前記粒子試薬の一方として0.6ミクロン以下
    の粒子の大きさのものを使い、他方として0.6ミ
    クロン以上の粒子の大きさのものを使う前項２に
    記載の方法。 ４ 第２の粒子試薬として第１の粒子試薬より小
    さいものを使う前項１に記載の方法。 ５ 段階(c)において選択的測定の前に遊離の第１
    または第２の試薬の少なくとも一方を凝集塊から
    分離する前項１に記載の方法。 ６ 分離を遠心分離法によつて行なう前項５に記
    載の方法。 ７ 第１および第２の粒子試薬のうちの一方とし
    て磁気吸引性材料を含むものを使い、磁場をかけ
    ることによつて凝集塊および一方の試薬の遊離の
    磁性粒子を他方の試薬の遊離の粒子から分離す
    る、前項５に記載の方法。 ８ 粒子試薬のうちの一方として標識を持つもの
    を使い、凝集塊と分離した後のその試薬の遊離の
    粒子の存在および／または量をその標識によつて
    測定する、前項５に記載の方法。 ９ 凝集塊から分離した後の一方または両方の遊
    離の粒子試薬の存在および／または量を計数によ
    つて測定する、前項５に記載の方法。 １０ 検定すべき抗体がリウマトイド因子（RF）
    である、前項１に記載の方法。 １１ 段階(b)の第２の試薬としてIgG，IgMまた
    はIgAを使い、段階(c)においてRFのIgG，IgMま
    たはIgA画分をそれぞれ定量する、前項１０に記
    載の方法。 １２ 粒子試薬としてそれぞれ試薬を保持するラ
    テツクス粒子から成るものを使う、前項１〜１１
    のいずれかに記載の方法。 １３ 液体中のAbの量を検定し、そのAbの量が
    液体中に同時に存在するAgの量に依存すること
    からその検定結果によりAgの量を決める前項１
    に記載の方法。 １４ 連続流動技術によつて行なう前項１に記載
    の方法。
JP2235680A 1979-02-26 1980-02-26 Biological analysis Granted JPS55156866A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB7906686 1979-02-26

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JPS55156866A JPS55156866A (en) 1980-12-06
JPS6362699B2 true JPS6362699B2 (ja) 1988-12-05

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ID=10503430

Family Applications (1)

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JP2235680A Granted JPS55156866A (en) 1979-02-26 1980-02-26 Biological analysis

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4279617A (ja)
JP (1) JPS55156866A (ja)
CA (1) CA1132902A (ja)
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