JPS63502927A - 新規な診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な診断剤 この発明は、特にウィルス学に利用するのを目的とするＩｌｉ規な診断剤に関す る。

ＥＬＩＳＡ法（エンザイムーリンクト・インムノソーベント・アセイ：　ｅｎｚ ｙｍｅ　−１ｉｎｋｅｄ　１ｉｉｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）は、抗体 類滴定用の極めて感度のよい酵素抗体法であり、固相担体に結合させた抗原で形 成された免疫吸着性複合体を用いて、被検生物媒体（例えば血清）中に含有され る特異的抗体を捕捉し、得られた免疫複合体を、酵素で標識を付した抗−極・抗 体（ａｎｔｉＳｐｅｃｉｅＳ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）で検出し、次いでこの酵素に 特異的酸物を生成させ、着色の強度が反応する酵素の量に比例し、したがって前 記被検生物媒体中に存在する抗体の量に比例するので、その着色の強度を肉眼で 判定するかまたは測光法で測定することからなる方法である。

不均一相を用いるこの様の酵素抗体法では、免疫反応の担体として働くこの固相 の性質がこの測定法の感度を決定するので、その性質は極めて重要である。

ＥＬＩＳＡ試験用に提案されてきた担体としては特に、グルタルアルデヒドで活 性化されたポリアクリルアミド粒子（アブラミーズとターニンク（、Ａ、ｖｒａ ａｅａｓ　ａｎｄ　Ｔｅｒｎｙｎｃｋ　）　。

ｌ　ｍ５ｕｎｏｃｈｅ＊１ｓｔｒｙ、　１９６９年、６．５３〜６５頁〕：臭化 シアンで活性化されたセルロース粒子（この粒子には抗体が共有結合で結合され る）　〔エングバルとバールマン（Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄｐｅｒｌｍａｎｎ　 ）　、　Ｉｉ＋園ｕｎｏｃｈｃｍｉｓＬｒｙ、１９７１年、　８．　８７１〜８ ７４頁）；表面に抗原が中純な物理的吸着で結合されるポリスチレンチューブ（ エングバルとバールマン、Ｊ、１−鵬ｕｎ、　１９７２年。

１６０、　１２９〜１３Ｇ頁）：および抗体又は抗原が結合され、臭化シアンで 活性化された紙ディスク（ブライトンら（Ｂｒｉｏｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ　）　 、　５ｃａｎｄ、　１９７４年、　２９．　１６６〜１７４頁）がある。しかし 現在もっとも広く使われている担体は、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル製 で、９６個のＵ形もしくはＶ形の平底つＩルを有する小プレートの形態か又は８ 個のウェルを有する小形バーの形態のプラスチックの面である。やはり、抗原又 は抗体は、単純な物理的吸着によってこれらの小プレートもしくは類似の担体に 結合される。

蛋白質が物理的に吸舊される場合、蛋白質は構造が変化するが、その変化は蛋白 質の性質と不溶性担体の表面の組成に左右される。この構造変化の結果、与えら れた蛋白質によって抗原性が喪失することがある。ウィルスの抗原が例えばサイ トメガロウィルスやデング熱ウィルスの抗原の場合、ある種のモノクロナル抗体 は＠染１１１［１１中のウィルスを中和もしくはこれと反応しうるが、プラスチ ックの表面に吸着されたウィルスとは反応しないということが見出された。この 問題点は、ウィルス抗原を、その炭水化物残基又はアミノ酸残塁を介して、不溶 性担体に共有結合させることによって除去することができた。前記のように最も 広く用いられている担体は、９６個のウェルを備えた微ｍ滴定用プレートまたは ８個のウェルを備えた小さなバーである。この種の材料を用いるＥＬＩＳＡ反応 による測定法は比較的９価な設備を要する。このように、この測定法は、（１］ この分野の疫学的研究、（２１大きなセンター以外で行われる診断試験およびＳ ）社会経済的な基本施設が不十分な国の血清診断上の問題に対しては不適切であ る。

従ってこの発明の目的は、特にウィルス手用に利用され、この分野で用いられる 診断剤として従来提案されているものよりも実用に適した！７ｉ現な診断剤を提 供するにあり、これら診断剤は、従来技術の診断剤よりも、共有結合された抗原 もしくは抗体の機能を保持する性能に浸れ、使用し易くかつ特別の設備を必要と しない診断剤を提供するにある。またこの発明の診断剤は特に長期間保存時の問 題がない。

この発明は、ヒドラジン誘導体Ｓ体および／又はアミノ酸からなる１１鎖を有す るポリスチレン又はポリ塩化ビニルの小プレートとストリップからなる群から選 択され、これに抗原又は抗体の分子が化学的に結合している固相担体からなる新 規な診断剤に関する。

この発明の診断剤の好ましい態様の固相担体は、特にポリ塩化ビニルもしくはポ リスチレンのごとき熱可塑性物質層に適切な繊維物質層を結合してなるストリッ プで構成されている。

上記態様の有利なものの繊維物質層は、ポリアミド繊維類（特にナイロンｌ！紺 類）、特にセルロース、ニトロセルロースおよび酢ａｔ−ルロースのごときセル ロース系物質、ポリエステル類などからなる群から選択される。

この発明の診断剤の他の好ましい態様では、固相担体に結合している側鎖は、酸 ヒドラジド類ヤフェニルヒドラジンのようなヒドラジン誘導体およびアミｊａｌ ｌ類の特に−３Ｈ基を有するものからなる群から選択される化合物で構成されて いる。

この発明の診断剤のさらに他の好ましい態様において、固相担体の側鎖に化学的 に結合している分子は、ウィルス抗原類、細菌抗原類、ハプテン類、抗体類、血 漿蛋白質類、リボ核酸類およびデオキシリポ核酸類、並びに場合によって抗原も しくは抗体として用いうる免疫グロブリンからなる群から選択される。

この発明の診断剤のさらに他の好ましい態様において、固相担体の側鎖に化学的 に結合している抗原もしくは抗体は、非酸化型蛋白質類又は糖蛋白質類で構成さ れ、その側鎖はジアゾ化酸ヒドラジドまたは末端にカルボキシ基を有する有機化 合物で構成されている。

この発明の診断剤のさらに他の好ましい態様において、固相担体のＩＩｌｗＡに 化学結合する抗原と抗体は、酸化型糖蛋白質類で構成され、またその側鎖は酸ヒ ドラジド類やフェニルヒドラジンのごときヒドラジン誘導体、およびアミノ酸類 の特にシスティンのごとき一８ＨＩを有するものからなる群から選択した化合物 で構成される。

この発明のさらに他の好ましい態様の診断剤は、ポリ塩化ビニルもしくはポリス チレンの小プレート、又はポリ塩化ビニルもしくはポリスチレンのような熱可塑 性物質製の支持体に結合された防織織雑製のストリップのような、固相担体から なり、さらにこれが有するヒドラジン誘導体からなる側鎖に、まず酸化されてか ら自らの炭水化物残基を介して化学的にカップリングされたサイトメガロウィル ス（ＣＭＶ）の抗原を有する。

この発明のさらに他の好ましいＲ様の診断剤は、固相担体がこの発明のストリッ プの場合、ｍＨ材料居が、溶接、好ましくは高周波溶接によって不活性熱可塑性 材料に有利に結合される。

この発明のさらに他の好ましい態様の診断剤は、繊維材料層が酸化セルロース系 の材料で作製される。

この発明の好ましい態様の診断剤では、繊ＮＨは熱可塑性材料層の一部にだけ結 合され、実質的にストリップの形態である。

上記の態様のうちで有利な構成のものは、繊維材料層が結合されている熱可塑性 材料層の部分の表面が（抗原もしくは抗体が前記繊維層に側鎖を介して結合して いる）、熱可塑性材料層の全表面の約１７５〜１１５０である。

上記態様のうちで他の有利な構成のものは、いくつかのストリップが共通の支持 体ストリップによって互に連結されている。

また上記構成を有利に変形したものでは、各ストリップは、弱い直線部を有し、 この部分で共通の支持体ストリップに結合している。

この発明の有利な態様の診断剤は、熱可塑性材料層もしくは固相担体がポリスチ レン製の場合、後者は最初に処理してポリアミノスチレンに変換される。

またこの発明は、この発明の新規な診断剤の製造方法に関し、すなわちその診断 剤を構成する固相担体が遊離の第一アミンの基を有し、この担体の遊離のアミン の基を、これに側鎖をカップリングさせることによってその側鎖で置換し、次い でこの固相担体にカップリングさせて予め結合させた前記側鎖の遊離端に適切な 抗原もしくは抗体の分子を共有結合させる製造方法を提供づるものである。

この発明の診断剤の製造方法のひとつの態様で、その固相担体が、ｔＪＡＨ材料 層と熱可塑性材料層とが結合してなるストリップで構成されている場合の製造方 法は、ＩＩＮ製ストストリップその繊維の遊離のアミンの基にカップリングさせ た＋１１鎖で置換する第１工程および第１工程でストリップに結合させた側鎖の 自由端に、適切な抗原もしくは抗体の分子を共有結合させる第２工程からなり、 Ｉｌ雑製のストリップが、その側鎖に抗一種・抗体もしくは抗原が結合される前 又はこれらの処理工程後に熱可塑性材料層に結合される製造方法である。

この発明の診断剤の製造法を実施する好ましい方法は、担体が有するＴ１ｗｉア ミンの基をヒドラジン誘導体の側鎖で置換し、この置換反応はこのアミンの基を 無水こはく酸でこはく酸化し、次いで末端のカルボン酸基を、適切なカルボジイ ミドの存在下でヒドラジンと反応させてヒドラジドに変換することによって行わ れる方法である。

この発明の診断剤の製造法を実施する他の好ましい方法は、遊離アミノ基を有す る担体を、適切なカルボジイミドの存在下で、−３ＨＩを有するアミノ酸、特に システィンの側鎖でＷｉ換する方法である。

この発明の診断剤の製造法を実施する適切な方法では、抗原もしくは抗体は、こ れらのいずれかが固相担体の側鎖に結合される前に、酸化されて一〇ＨＯ基とさ れる少なくともひとつの（Ｊｌｚ　ＯＨＭを有する炭水化物の残基を有している 。

上記の方法を有利に変形したものでは、抗原もしくは抗体は、その末端の−ＣＨ ０基と、固相担体の（＋１１鎖が有する末端の遊離の第一アミンの基との化学反 応によって担体に結合される・この発明の診断剤の製造法を実施する好ましい方 法では、診断剤は、ａｎ材料のストリップと熱可塑性材料層との結合体で構成さ れている。

有利な上記の実施法では、繊維材料のストリップはポリアミド！ＩＮ製である。

他の有利な上記実施法では、Ｉｌ維材料のストリップはポリエステル繊維製であ る。

さらに他の有利な上記実施法では、！ｉｉ［材料のストリップは、セルロース、 ニトロセルロースおよび酢酸セルロースからなる群から選択されるセルロース系 材料の繊［１のストリップである。

上記実施法の有利な変形法では、セルロース系材料の繊Ｉｌ製のストリップは酸 化工程に付され、次いでとドラジン誘導体の側鎖が結合される。

上記実施法の他の右利なものでは、繊維の酸化されたストリップに、とドラジン 誘導体の側鎖を結合した後、この側鎖結合工程中ヒドラジド誘導体と反応しなか った遊離のカルボニル基が、特に硼水素化ナトリウムのごとき適切な還元剤でア ルコールに還元される。

この発明の診断剤の製造方法を実施するもうひとつの方法では、抗原もしくは抗 体は、そのアミンの基と前記担体に結合された側鎖の酸ヒドラジド基との化学反 応によって、固相担体に結合される。

上記実施法の有利なものでは、化学的カップリング法で結合される抗原もしくは 抗体は、蛋白質類、ホロ蛋白質類（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）および糖蛋白質 類からなる群から選択される。

上記実ｍ法の他の有利なものでは、ひとつの酸ヒドラジドで４１１成されている 、固相担体のｍ鎖は、ジアゾ化して酸アジドとし、これに、酸化されていない蛋 白質類、ホロ蛋白質類又は糖蛋白質およびリボ核酸とデオキシリボ核酸で構成さ れている抗原もしくは抗体が化学反応によってカップリングされる。

この発明はさらに、血清のごとき生物流体中の抗体類もしくは抗原類の検出方法 に関し、 この発明の診断剤を血清の溶液に適当な時間、浸漬させる第１工程、 診断剤を血清の溶液から取り出し次いで洗浄し、検出すべき抗一種・抗体（Ｍｌ 素で標識が付けられている）を含有する溶液中に導入し、次いで適切な組成の緩 衝液で数回洗浄する第２工程、および 診断剤を、ひとつの電子受容体と有利に結合された基質を含有する溶液中に導入 し、その基質を特異的な抗体もしくは抗原の存在下で該診断剤上に沈澱させて、 診断剤を、形成される生成物の量によって強度が上下する紫色に着色させ、標準 のカラースケールと比較して被検生物流体中に存在する抗原もしくは抗体の量を 測定する第３工程 かうなる自消のような生ｖＩＪ流体中の抗体もしくは抗原の検出法を提供するも のである。

上記検出法を実ＩＮする有利な方法では、診断剤の、ヒドラジンＵｉｙｌＪ体か らなる側鎖に化学的カップリングによって結合させる分子類は、診断剤の担体に 結合させたヒドラジン誘導体の側鎖のｒｉｍのアミノＷ（−ＮＨｚｌｓ＞と、対 応する免疫グロブリン−Ｇ）−１０分子の遊離の−ａｔ−ｔｏｉとを化学反応で カップリングさせてヒドラゾンを形成する、予め酸化された免疫グロブリン分子 目ａＧ、ｌｏＭ、１ｇＥなど）である。

この検出法を実施する他の有利な方法では、検出すべき抗原に対応する抗体は、 直接、酵素で４ｇ識が付けられ、非イオン界面活性剤、硼酸ナトリウム、適切な アミノ酸および塩化ナトリウムを含有する適切なＭＩＩ液を添加して−を約８． １に調節した被検生物流体に導入される。

抗原が生物流体内に存在する場合には、酵素で標識が付された抗体の残量が減少 し、したがって固相担体に抗原が結合されて担体の反応性が減少し、生物流体中 に抗原が存在することを示す。

上記検出法を実施するもう一つの有利な方法では、ヒドラジド誘導体で構成され ている、固相担体の側鎖に化学的にカップリング結合される分子は、ウィルス抗 原類、特に予め酸化されたサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の抗原である。

上記実施法の有利な方法では、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）の抗原を有する 診断剤が、被検血清中に存在する抗−ＣＭ■抗体を中和して特異的に検出するの にプレート又はストリップの形態で用いられ、この検出は、ＣＭＶ抗原をカップ リングした前記ストリップ又はプレートを被検血清に接触させ、次いで適当な緩 衝液で洗浄し、次にＶｆ素又はピオチンで標識をつけた抗−ヒト−１９Ｇ抗体に 接触させて行われる。

上記実施法のさらに他の方法では、ナイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の抗原を有 する診断剤が、被検血清中の抗−ＣＭＶ抗体の特に抗−〇ＭＶＨＩＧ抗体を中和 して検出するのにプレートの形態で用いられる。この検出は次のようにして行わ れる。

まず被検血清を、プレートのウェルに分配し適切なＷｆＩ液で適当に希釈する。

なおこのプレートの、一方のウェルにはＣＭＶ抗原がカップリング結合され他方 のウェルには対照抗原がカップリング結合されており、これらの抗原はそれぞれ 、ＣＭＶが感染した細胞のホモジネートと非感染細胞のホモジネートから調製さ れる。次いで例えばアルカリホスファターゼで標識を付けた抗−ヒト１ｇＧ抗体 を含有するヤギ血清のような血清の溶液を同量づつ各ウェルに導入し、約３７℃ で十分な時間接触させた後、特にｐ−ニトロフェニルボスフェートのような適切 な基質を用（Ｘで、酵素活性を測定する。

上記検出法を実施する有利な他の方法では、ヒドラジド誘導体で構成されている 、固相担体の側鎖に化学的にカンプリング結合される分子は、特にスタフィロコ ッカスアウレウス（３ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）起源の蛋白 質Ａのような細菌抗原であり、診断剤の担体のジアゾ化された側鎖に化学的にカ ップリングされる。

上記検出法を実施するのに有利な他の方法では、ヒドラジド誘導体で構成されて いる、診断剤の担体の側鎖に化学的にカップリング結合される分子は、ハブテン の特にカゼイン−スペルミンカップリング生成物であり、ＩＩＩ製ストストリッ プアゾ化された側鎖に化学的にカップリングされる。

この検出法を実施するのにさらに有利な他の方法では、ヒドラジド誘電体で構成 される診断剤の側鎖に化学的にカップリング結合される分子は、担体ストリップ のジアゾ化された側鎖に化学的にカンプリングされるデオキシリボ核酸である。

上記検出法を実施するのに有利な他の方法では、ヒドラジド誘導体で構成されて いる、診断剤の担体の側鎖に、化学的にカップリング結合される分子は、予め酸 化された抗−サルモネラ抗体からなる群から選択される抗体である。

上記検出法を実施するのに有利な他の方法では、診断剤のストリップ又はプレー トを生物流体から取出した際、洗浄するのに用いる緩動液は、酵素で標識を付け た抗一種・抗体を希釈するのに用いるのと同じものである。

この発明の検出法を実施するもうひとつの方法では、基質は、α−クロロナフト ール、０−ジアニシジンもしくはＯ−フェニレンジアミンと会合させた過酸化水 素の溶液又は特にｐ−ニトロフェニルホスフェートの溶液で構成されている。

この発明の検出法を実施する他の方法では、この発明の診断剤は、ＥＬＩＳＡ反 応によって検出する際の自消蛋白質の非特異的吸着をなく丈ため、前記検出法に 用いる前に、ウシ血清アルブミン、仔ウシ１９Ｇおよびゼラチンからなる群から 特に選択される蛋白質で飽和される。

またこの発明は、下記の組合わせからなる、前記の検出法を行うためのすぐに使 用できる診断用キットに関する。

即ち、適切な抗原もしくは抗体を有する前記定義の診断剤：診断剤の抗原に対応 する、酵素で標識された抗体の適当量；適当量のＭ’ｆＪ液Ｉ：適当量のｌｌ笥 液■：いくらかの微量滴定用プレート；適当ｍの酵素基質：および適当量の電子 受容体である。

この発明の診断用キットの好ましい態様では、診断剤は、適当な抗原又は抗体が 、ヒドラジド誘導体からなる＋１！１！＋１に化学的にカップリング結合され、 微量滴定プレート、特にこのプレートの各ウェルに結合されている。

この発明の診断用キットの他の好ましい態様では、診断剤が有する適当な抗原又 は抗体は、側鎖への化学的カップリングによって結合され、適当な支持体ストリ ップに結合されている。

この発明を実施する好ましい手順は次のとおりである。

１、固相担体は、ポリ塩化ビニルもしくは好ましくはポリアミノスチレンで作製 可能で、適切な数のウェルを有するマイクロプレート（例えば９６個のウェルを 有するマイクロプレートまたは８Ｉ！のウェルを有する小さなバー）又は例えば ６０ｍ＋＋Ｘ　４ｍの大きさのポリ塩化ビニルもしくはポリスチレンのような不 活性プラスチック製支持体に溶接された、例えば４ｍＸ　８１１＋１のアミン化 されたナイロンストリップ（ｚｅｔａ　ｐｒｏｂｅ）　（このアミノ化ナイロン は１　ｅａ　”当り１４ｎｍｏｌ当量のエタノールアミンを含有している）もし くはナイロンの代わりにセルロース系材料製のストリップで構成されている。

２、担体のｉｌ！鎖の！換反応は、下記ａｌｌで起こり、フランス特許第２，４ ５０，８７７号（出願人　ＩＮＳＥＲＭ）に記載されている。

（ω無水こは（酸によるこはく酸化反応↓ （ｂ）末端のカルボキシル基の、水溶性カルボジイミドの存在下ヒドラジンによ る酸ヒドラジドへの変換反応↓　ＨｔＮＮＨｔ十カルボジイミド 置換後、１１ＩＩＩ１２当り７ｎｉｏｌ当ｍの酸ヒドラジドが見出された。

酸ヒドラジド（ＡＨ）末端基によって下記のものを形成させることができる。

すなわち酸化された糖蛋白質の炭水化物の残基でヒドラゾンを、および酸化され ていない蛋白質、ホロ蛋白質もしくは糖蛋白質のアミノ基でペプチド結合を形成 させることができる。

（Ｃ）抗一種・抗体の一〇）１２０８基を酸化し、固相担体の側鎖に結合させる 反応 −Ｃ１−１ｚＯ）１基の−ＣＨ０基への酸化反応は、フランス特許第２，３３１ ，５６７号（出願人　ｌＮＳＥＲＭ）の条件に従って行うのが好ましい。

＋ｄ＞酸化された抗体の−ＣＨ０基と固相担体の酸ヒドラジド側鎖の遊離の７ミ ノ基との反応による、酸化された抗体の結合反応。

３、固相担体がポリアミド（ナイロン）ではなくてセルロース系材料の場合、こ の材料を酸化工程に付する必要がある。しかし、この酸化は、限定はしないが、 米国特許第３，９４７，３５２号（出願人　ＣＵＡＴＲＥＣＡＳＡＳら）に記載 しであるのと同様に、過沃素酸ナトリウムのリンｗａＹｆＪ液による溶液で行う のが好ましい。

この酸化反応の効率は、バタラックおよびレシエ（Ｅ３ａｃｋｒａｃｋ　ａｎｄ 　Ｒｅｃｈｅｓ　）　、　Ａｎａｌ、［３１ｏｃｈｃｔ、１９６６年、１７巻。

３８〜４８頁に記載しであるのと同様にして、ｌ”ｅ　ＣＱｓの存在下、Ｎ−メ チルベンゾチアゾロン　ヒドラゾンを用いるアルデヒド試験法で検査される。酸 化されたストリップは濃い青緑色を呈するが酸化されていない対照のストリップ はわずかに着色するだけである。

着色した酸化ストリップの６３０１１における光学密度（ＯＤ）は非酸化ストリ ップのＯＤに比べて０．４００である。この値は、１ｗｌＡ２当り８ｎｉｏｌ当 量のグリセルアルデヒドに相当する。

４、代わりに固相担体がセルロース系材料製の場合は、上記２、に記載のこはく 酸化反応と酸ヒドラジド変換反応に付する前に酸化させたストリップもしくはプ レートをヘキサメチレンジアミンと反応させ、次いで還元して、ヘキサメチレン ジアミンの第一アミンと酸化されたセルロースに形成されたカルボニル基との間 に形成されたシッフ塩基を安定化させる。

５．１１鎖が、例えば式： ％式％ で表されるアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）のような酸ジヒドラジドの場合は 、ＡＤＨとカルボニルｕ間の反応は、所定ノ条件下、即ち０．１Ｍのオーダーの 濃度の溶液中２近傍の酸性−下で直接管われる。

結合された酸ヒドラジド（ＡＨ）基の数は、飽和硼酸塩液によるトリニトロベン ゼンスルホン酸の０，００１Ｍ溶液でｇ１認される。

前記のようにして作製したＡＨのプレートもしくはストリップの４２０ｎ■の光 学密度は、酸化されたプレートもしくはストリップであってＡＤＨで置換されて いないものと比べて０．３００である。この値は１　ｇｕｎ　２当り９ｎ■０１ 当量のヒドラジドに相当する。

６、前記２．の変形として、ポリアミド、ポリエステルもしくはセルロース誘導 体のような繊維材料層又は固相担体が有する側鎖にカップリング結合される抗原 もしくは抗体が酸化されていない場合がある。

この場合は、（Ｃ）と（ｄ＋の工程の代わりに下記工程が行われる。

部ら式：ＲＣＯＮＨＮＨ２で表される、側鎖の末端の酸ヒドラジド基をジアゾ化 して式：Ｒ−ＣＯＮｓの酸アジドとし、これに抗原もしくは抗体を、フランス特 許第２，４５０，８７７号（出願人　ＩＮＳＥＲＭ）に記載の技術を用いて化学 的にカップリングさせる。

７、得られた診断用のプレートもしくはストリップは、血清のような生物流体中 の抗体を、ＥＬＩＳＡ法によって検出する試験を行うのに使用される。

第１図は、そのままで免疫酵素反応用の診断剤として用いる単一ストリップの一 例を示し、第２図は多重ストリップの一例を示す。

第１図のストリップはポリ塩化ビニル製の不活性支持体１と、これに溶接線３で 固定された、上記のように置換された、アミン化ナイロンの層２とで構成されて いる。

上記の層を溶接で固定するには、高周波溶接技術を用いるのが得策である。

第２図に示す多重ストリップは、第１図に示すストリップと構造が類似のいくつ かのストリップ４で構成され、これらのストリップは、反応性部５を有するｆａ 部と反対の端部で共通バー６によって結合されており、各ストリップはこのバー から分離可能に作製され、任意に切離すことができる。また第２図に示す多重ス トリップが、試薬貯槽として用いられる微量滴定プレートと適合するように作製 される場合は、ストリップは各々、対応するウェルに同時に導入されるので各ス トリップを分離可能にする必要はない。

これらストリップの各自由端部は、多重ストリップシートがこれと合わせて用い られる微量滴定プレートのウェルの底部と類似の形に作製するのが有利である。

前記事項とは別に、この発明には、以下の記載から明らかになる他の事項が含ま れる。

この発明は、以下の付加的記載事項によってより明確に理解されるであろう。以 下にこの発明の診断剤の製法および応用の実施例を示す。

しかしながら、これらの実施例は、いずれの限定も意味せず、この発明の課題を 例示するためにのみ提示されるということは明確に理解されるべきである。

（以下余白） Ａ、　抗原ストリップの製造 絶倒１．　サイトメガＯイルス（ＣＭＶ）にカップリングされたストリップの製 造 （ａ＞　ＣＭＶ抗原（Ａ９　ＣＭＶ）の調製ＡｇＣＭＶ　（試験用）は、ＣＭＶ を６〜８日問感染させたＭＲＣｓヒト胚細胞（ＩＩ維芽細胞）のホモジネートか ら調製した。

Ａ！ＪＭＲＣｓ（対照）を非感染Ｍ　ＲＣｓ細胞のホモジネートから調製した。

＋ｂ＋　抗原のカップリング ２つの抗原それぞれの蛋白質１１ｇづつを、まずフランス特許ｌ　２，３３１， ５６７号（出１人Ｉ　ＮＳＥＲＭ）　ニｉａ載の条件に従ッテ酸化した。

このようにして酸化した抗原を、−ＡＨストリップに、１ストリップ当り２０μ ９づつ接触させた。

Ａ！Ｉｔ　ＣＭＶとＡＯＭＲＣｓの場合は、結合される蛋白質の同ｕコストリッ プ（４１１１１１Ｘ　８Ｍ＞当り０．５μ９であった。

実施例２．　−ＡＩ−１−ＣＨＯ−１（ｌ　Ｇ診断用ストリッジ（抗原血清蛋白 質）の製造 １、ｓｏｘ　４Ｍｍのポリ塩化ビニル支持体に溶接され、１−当りエタノールア ミンを１４ｎ醜０１アミン当量含有するアミン化ナイロン（ｚｅｔａ　Ｐｒｏｂ ｅ）の４×８−のストリップに、１ｍｍｏｌの固体無水こはく酸を添加する。ｐ Ｈ９，０の０．１Ｍ硼酸緩衝液の存在下で一夜接触させた後、前記ストリップを 、０．２■０１７Ｑのヒドラジン含有の溶液２ｙｌ　（ｐＨ７，５）に接触させ 、固体のエチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（ＥＤＣ）を 最終濃度０．０５■０１／ｇまで添加する。得られた製剤を、揺動振盪機上＋４ ℃で一夜培養した。

Ｍ換によって、１−当り７ｎｍｏ　ｌ当量のヒドラジンが結合していた。

２、　フランス特許第２，３３１，５６７号（出願人ＩＮＳＥＲＭ）に記載の条 件にしたがって予め酸化された免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩａＥ ）を、その−ＣＨＯ基で、前記酸ヒドラジド側鎖のアミノ基に結合させた。下記 第１表に示すように、前記−ＡＨストリップに結合したＩＩＩＧの量は、カルボ キシル基のストリップの非特異的吸着量よりも２０倍大きい。

第１表 ＩｇＧの結合量は、Ｎ−スクシンイミジル（２，３−”　Ｈ）プロピオネートで 標識をしたＩｏＧを用いて正確に測定できた。

ストリップの酸化ＪＯＧの最大結合容量は、１ストリップ当り４０μ９のＩｏＧ −ＣＩ−ＩＱであることが分かり（４０ＭｇＩｇＧ−Ｃ）ｔｏ／ストリップ）、 この値は下記第２表に照合した数値に基づいてライン・ライ−バーバークのりプ レゼンテーションによって得られた。

第２表 ＡＨ１１＃で置換されたアミン化ナイロンストリップへの酸化１ｏＧの結合容量 ボ ＩｇＧ　：Ｎ−スクシンイミジル＜　２．３−”　ｌ−１＞プロピオネートで標 識を付けたｌｏＧ 例３．　抗原がｍ菌蛋白質（スタフィロコッカス・アウレウス由来の蛋白　Ａ） である診断用ストリップの製造蛋白質Ａ（ＩＢＦ）のカップリングを、前記技術 によってジアゾ化したストリップに対して行った。手順は次のとおりである。

４００μ９の蛋白ＩＡを、１０個のジアゾ化ストリップに接屑させた。

カップリングされた蛋白質Ａの量はストリップ当り０．８μｇと測定された。

絶倒４．　ハプテンを　する診断用ストリップの製ζω　カビイン−スペルミン まず第一に、蛋白質Ａについて記載したのと同じ条件下でカゼインをカップリン グさせた。次いでこのカゼインに下記条件でスペルミンをカップリングさせた。

２つのストリップを、水溶性カルボジイミド（１−エチル−３，３−ジメチルア ミノプロとル力ルポジイミド）をＱ、ＩＭＩｌｆｉ含有する、０．０１　Ｍ　Ｎ ａ　Ｈ２ＰＯ４ｐＨ５緩衝液５００４中テ培養した。１０分間接触させた後、ス ペルミンを最終ａ度０．１Ｍまで添加し、次いで０．１Ｍ硼酸ナトリウムで−を ８．５に変化させたくディビスおよびブレストン、　１９８１年、１１６巻、４ ０２〜４０１頁）。

″Ｃ−スペルミンを用いることによって、スペルミンの結合量がストリップ当り １０ｎｉｏｌのオーダーであることを測定できた。

１例５．　ＤＮＡを有する診断用ストリップの製造（ｉ）ＤＮＡフラグメントの 製造 ０．０５ｉｏｌ／　Ｑのｐｅａ　Ｃ１、０，０１ｉｏ１／ＱのＭ（ｌｃｌｔおよ び０．０１ｉｏｌ／　（ｌのトリス−ＨＣｌ含有の！ＩＩ液（ｍ　７．５）内で 、仔ウシ胸腺ＤＮＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｔ＋ｏｅｒ　、　ヘ−ｖ＞ｊｊ　−社）　 ！、エンドヌクレアーゼＥＣＯＲ□　（ベーリンガー社、１μ９　ＤＮＡ当り２ 単位の酵素量ンで消化した。

３１℃で２時ｌ！Ｉ消化した優、温度を０℃に低下させて反応を停止させ、冷Ｅ ＤＴＡを最終濃度０．０２　Ｍまで添加した。消化されたＤＮＡを６５℃で１０ 分間加熱して変性させ、次いで急速に０℃まで冷却した。０，０１ｉｏｌ／　Ｑ のＮａ　Ｃ１及び０．０１　ｍｏｌ　／　Ｑのトリス−ＨＣｌ含有のＭ笥液（ｐ ）１７．５）中で最終濃度０．０２Ｍのスペルミン（シグマ社、３１ｇ１ａ）を 添加してまずフラグメントを沈澱させた。蒸留水で２回洗浄後、ｖｃ澱をＩＭＮ ａＣρに溶解した。

Ｎａ　Ｃ１の濃度を０．０１　Ｍに低下させ、９５％エタノールを添加してＤＮ Ａを一２０℃で一夜沈澱させた。

１　ｚｏｏｏｇで４５分間遠心分離した後、残留物を乾燥し、最後に、０．０１ １０１／ΩのＥＤＴＡと０．０１ｓｏｌ／　ＱのＮａ　Ｎ２　ＰＯａ　／ＫＨ２ ＰＯ４を含有する緩別液（ｐＨ８，０）に再溶解した。

２６０ｎｍで光学密度を測定することによってＤＮＡフラグメントの製造収量＋ ｘ＋ｎすることができた。収量は出発ＤＮＡの５０％〜７５％であった＜４ｙＪ 造例）。

フラグメントの大きさをアガロースゲルの電気泳動法で測定した。

α）ＤＮＡフラグメントの−Ａ１−１ストリップへのカップリング 上記技術に従ってジアゾ化したストリップにカップリングを行った。

２００μ９のＤＮＡ　（フラグメント）を１０箇のジアゾ化ストリップに接触さ せた。カップリングされたＤＮＡの量はストリップ当り０．８μ９と測定された 。

（Ａ）ポリスチレンのポリアミノスチレンへの変換（Ｂ）　ｆ２ヒドラジド末端 塁を有する側鎖の導入（Ｃ）ウィルス抗原の実際のカップリング（Ａ＞ポリスチ レンのポリアミノスチレンへの変換は、チンとリンクス（ＣＨＩＮ　＆　ＬＩＮ ＫＳ）、Ａｎａｌ。

３　ｉｏｃｈｅｍ、、１９７７年、８３巻、７０９〜７１９頁に記載の方法に従 って行った。実施した方法は、これらの著者が述べたのと全く同一の方法であり 、この方法で１ウェル当り１ｎ■０１当量のＮ１１２（標準としてエタノールア ミン）で置換することができた。

（Ｂ）酸ヒドラジド末端基を有するＩ！鎖の導入は、特許第２．４５０，８７７ 号（出願人　ＩＮＳＥＲＭ）に記載の方法によって行った。ビクリルスルホン酸 を用いて、１ウェル当りに存在する酸ヒドラジド基の量を測定した結果、１ウェ ル当りｌｎｍｏｌの酸ヒドラジドが存在していることが分かった。

（Ｃ）ＣＭＶ抗原の実際のカップリングＣＭＶ抗原（ＡｇＣＭＶ）を作製し上記 実施例１に記載の方法に従ってカップリングした。Ａ９　ＣＭＶと／’ＩＭＲｃ ｓの場合、結合された蛋白質の量は１ウェル当り１μｇのオーダーであった。

Ｂ、　抗体ストリップの製造 実施例７．　抗−サルモネラ抗体を有する診断剤ストリップの艮ｌ 実際のカップリング まず０．５＋ａｇの免疫グロブリンを、フランス特許第２，３３１，５６７号（ 出願人　ＩＮｓＥＲＭ）に記載の条件に従って酸化した。

このようにして酸化した免疫グロブリンを、ストリップ当り２０μ９の量で、− ＡＨストリップに接触させた。

カップリングされた蛋白質の聞は１ストリツプ（４ｉｍｘ　８ｕ）当り１μ９の オーダーであった。

実施例８．　ＥＬＩＳＡ法で使用する前のストリップの飽和ＥＬＩＳＡ反応中、 血清蛋白質の非特異的吸着をなくすために、ナイロンとセルロースのストリップ は、ウシ血清アルブミン、仔ウシＩｇＧ又はゼラチンのような蛋白質で飽和させ た。

その蛋白質の選択と濃度はカップリングさせる抗体に依存する。

を体ストリップを備えた、ＥＬＩＳＡ法用特殊診断剤の製１実施例９．　ピオチ ンでａｉをつけたｌ−サルモネラ抗体の製置 まず０．３ｍｇの免疫グロブリンをフランス特許第２，３３１，５６７号（出願 人　ＩＮＳＥＭ）に記載の条件に従って酸化した。

０．１４ｓ＋ｏｌ／Ｒ（７）Ｎａ　Ｃ１、０，０１ｍｏｌ／ｆｆのＮａ　２　） ＩＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４含有の緩衝液（ｐｏ−６）による上記酸化抗体の溶だ。

得られた酸化抗体とピオチンヒドラジドとの溶液を０℃に冷却し、−を０．１Ｍ ＨＣｌで２にＴＡ節した。１０分間接触させた後、Ｎａ　ｔ　ＨＰＯ４（Ｆ）　 ０．４Ｍ溶ＹＪｔ　テｐＨｅ　６　ニ上昇’ａ　ｆ　だ。

４℃で２時間接触させた後、過剰のどオチンヒドラジドを０．０１　Ｍリン１Ｍ １１ｉ液（Ｎａ　２１ＩＰＯａ　／Ｋ）１２　ＰＯ４）　（ＰＨ１，５）に対し て透析して除去した。

Ｃ０抗原ストリップおよび抗原プレートによる抗原−抗体反応の実施例 実施例１０．抗原ストリップと　酵素で直１棟課金つけた　体との反応 使用したストリップは次のとおりである。

１、実験用：これらは実施例２のナイロン−Ａ）ｌ−ＣＨＯ−ＩｇＧストリップ である。

２、対照：これらは実施例２の１．で得たナイロン−ＡＨストリップである。

戊、実験用と対照の３トリツプを、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識を付けた 抗ヒトＩｇＧ抗体を含有し、下記組成：０．１４ｓｏｌ／Ω（７）Ｎａ　Ｃ１ ０，１醜０１／ｇのグリシン ０．０３ｓｏｌ／　Ｑの硼酸ナトリウム０．１％（Ｖ／Ｖ　）のプル０ニックＬ ６２　（１，ＯＭ）ｌＣ１で−８，１に調節された非イオン界面活性剤）の緩衝 液で１／　２５０に希釈されたラビット血清の溶液２００Ａ中に２０分間浸漬す る。

上記接触時間の優、得られたストリップを、洗浄ピンから放出する上記緩衝液の 放出流で３回洗浄し、各洗浄液は排棄した。

Ｂ、０．１ｍｏｌ　／ｊ２の酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ−５）と６ｍｇ のα−りＯロナフトール含有の１１！メタノール溶液と２００Ａの０．３％過酸 化水素水とを、６１！当りに含有する溶液２００Ａ中に、上記洗浄後のストリッ プを浸漬した。

１５分間接触させた後、いわゆる実験用のナイロン−Ａ）Ｉ−ＣＨＯ−１ｇＧス トリップは紫色を呈し、一方対照のナイロン−ＡＨストリップは白色のままであ る。上澄液は両者とも着色していない。

酵素又はビオチンでＩＩＡ識を付けた抗体を検出するため抗原ストリップを上記 のように使用することは限定を意味するものではない。

事実、ｌｌｉを付けた抗体と、ストリップにカップリングした抗原との反応は、 抗原ストリップを、標識をつけてｔ）ない抗体含有の血清とともに最初から培ｉ するか又は標識をつけた抗体を目標抗原含有の試料とともに予備培養することに よって阻害できる。

実施例１１　阻害法による抗体の分析 抗−ＣＭＶ抗体 血清中に存在する、中和抗−ＧＭＶ抗体を分析するために、ナイロン−〇ＭＶス トリップを被検血清と接触させる。第２段階では、好ましくは下記組成を有する 緩衝液■と称する洗浄緩衝液で洗浄した後、ストリップを、標識を付けた抗−〇 ＭＶ抗体に接触させる。

緩衝液■ ウシ血清アルブミン　１．０％ ＮａＣ１０，３Ｍ グリシン　０．１Ｍ 硼酸ナトリウム　０．０５Ｍ シンバｏ　二’７り（３ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　）ＰＥ／Ｌ６２　（界面活性剤） 　ｏ、ｉｏ％ｖ／ｖ着色は、低い力価の抗−〇ＭＶ抗体を有するｍ清で得られた ものよりも高い力価の抗−〇ＭＶ抗体を有する血清で得たものの方が弱い。

実施例１２．　それぞれの炭水化物残基でカップリングされたＡｇＣＭＶとＡＯ ＭＲＣを有するプレート上での、中和　−〇ＭＶ抗体の力価の測定 ■　ＥＬＩＳＡ＆で使用する前のプレートの飽和ＥＬＩＳＡ反応中、反応缶白質 の非特異的吸着をなくすために、０．５％濃度の仔ウシＩｇＧ含有の０．１４　 ＭＮａ　Ｃ１溶液をウェル当り２００．ＩＩ２づつ用いて、微Ｅ１滴定用プレー トを飽和したｅ＋ｂ＋　ヒト血清中の抗−ＣＭＶ　ＩｕＧの検出血清を下記組成 の！！衝液工で希釈した。

ａｍ液工 仔ウシＩＯＧ　Ｏ，５％ Ｎａ　Ｃ１０，１４Ｍ グリシン　０．１Ｍ 硼酸ナトリウム　０．０５　Ｍ シンパロニツクＰＥ／Ｌ６２　０．１０％（Ｖ／Ｖ　）この溶液を１．０ＭのＨ ＣＩで−８，１に調節した。希釈液１００Ａづつを、ＣＭＶ抗原とＭ　ＲＣｓ抗 原を含有するプレートのウェルに分配する。３７℃で２時間培養後、プレートを 、仔ウシＩｇＧを含有しないこと以外は上記したのと同じ緩衝液で洗浄した。

アルカリホスファターゼで標識をつけた抗−ヒト１９Ｇ抗体を含有するヤギ血清 の溶液１００Ａを下記緩衝液■で１／１０００に希釈した。

緩衝液■ ウシ血清アルブミン　１．０％（Ｗ／Ｖ　）Ｎａ　Ｃ１Ｏ，１４Ｍ グリシン　０．１Ｍ 硼ｆｆ塩　０．Ｏ５Ｍ シンハロニックＰＥ／１６２　０．１０％（Ｖ／Ｖ　）次いでこの希釈液を各ウ ェルに入れた。３７℃で１時間接触させ、ウシ血清アルブミンを含有しないこと 以外上記したのと同じ緩衝液で洗浄した後、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェー トを０．２％（Ｗ／Ｖ　）含有する下記緩衝液による溶液を用いて３７℃でＩｉ ）素活性を発現させる。

緩衝液 アミノメチルア０パノール　０．６２５Ｍ、　ｍ１０．２５ＭｏＣΩ、　２．０ 　ｗＭ 光学密度は、４０５ｎ■において５分間毎に３０分間測定するか、又は３０分間 培養後１回測定する。

（Ｃ）ヒト血清から緒製したＩｏＧフラクションについて、３種の方法によって 測定された抗−ＣＭＷ　ＩｏＧの力価の比較（１）　ＣＭ　Ｖ抗原とＭＲＣｓ抗 原をＰＶＣプレートに吸着させることによって結合させる通常のＥＬＩＳＡ法ｔ ２１ＭＲｃｓ細胞の培養物上でのウィルス（ＣＭＶ）の感染容量の中和試験 ３）ヒト血清についての上記の共有結合ＥＬＩＳＡ試験法３種の分析法によって 力価を測定後、これら力価は、下記第３表に示すように、Ｔ−グロブリンの希釈 していない製剤のＩＢ／ｌｌの蛋白質濃度にする。

＜’ａ、下余白） 第３表 第３表は、共有結合ＥＬＩＳＡ法と中和法で得た力価が良好な相関関係（ｒ２− ０．９３４）を有することを示している。一方吸着によるＥＬＩＳＡ法の力価と 中和法の力価との相関関係は小さい（ｒｌ−０，７２０）。

−絶倒１３．　用言法による抗原の分析スペルミン 生物流体（血清、尿素およびＣ３Ｆ）中に存在するスペルミンの濃度を分析する ために、ナイロン−カゼイン−スペルミンスト、リップ又はニド０セルロース− カゼイン−スペルミンストリップを用いる。

この反応は次のようにして行われる。生物流体の一部を、標識を付した抗−スペ ルミン抗体と共に培養する。３０分間培養すると、スペルミンと反応させた標識 つき抗体は、ストリップに存在するカゼイン−スペルミンとはもはや反応できな い。一方、スペルミンと接触しなかった標識付抗体は反応することができる。

したがって、結合した酵素によって生成した着色の強度の減少度が試料中に存在 するスペルミンの量の尺度である。

抗体が存在するすべての血清蛋白質を分析するため、自消抗原とストリップに固 定化された同じ抗原との競争反応（上記反応と同様）を用いることもできる。

実施例１４．　Ａｔ；ｌストリップを用いる、ヒト血清中に　在する抗体の検出 ヒト血清を下記組成の緩衝液工で希釈する。

緩衝液■ 仔ウシＩＱＧ　Ｏ０５％ ＮａＣΩ　０．３Ｍ グリシン　０．１Ｍ 硼酸ナトリウム　０．Ｏ５Ｍ シンパロニツク　ＰＥ／Ｌ６２　０．１０％（Ｖ／Ｖ　）この溶液の−を１．０ Ｍ　ＨＣＲを用いて８．１に調節する。希釈液２００Ａづつを、マイクロプレー トのウェルに分配した。被検抗原を含有する実験用ストリップ又は対照ストリッ プを各ウェル中に挿入する。３１℃で２時間接触させた後、ストリップを取出し 、次いで仔ウシＩ（ＩＧを含有しないこと以外上記と同様の緩衝液の、洗浄ピン からの液流で３回洗浄し、洗浄液は排棄する。

ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識を付けた抗−ヒトＩｏＧ抗体を含有するヤギ 血清を、上記のＭ衝液■で１／　２５０に希釈した溶液２００Ａ中に、上記の実 験用ストリップと対照ストリップを２０分間浸漬した。

上記時間、接触させた後、ストリップを、ウシ血清アルブミンを含有しないこと 以外緩衝液■と同じものの液流で３回洗浄し、洗浄液は排棄する。

洗浄後、ストリップを、０．０１ｍｏｌ／ΩのＮａ　ｔ　ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ ４（ＰＨ６）と０．３％過酸化水素水２００Ａと６ｍｇのα−り００ナフトール 含有の１ν！のメタノールとを６１１当りに含有する溶液２００Ａ中に浸漬する 。

１５分間接触後、紫色の着色が実験用ストリップに発現するが対照用ストリップ は白色のままである。

上澄液は両ストリップとも着色していない。

種々の量のＩｇＧを結合させたストリップで作製したカラースケールと比較する ことによって、ストリップと反応した抗体の量が計算される。

上記の方法は、（１）抗−ＣＭＶ抗体、（２１抗−ポリアミン抗体、（３）抗− ＤＮＡ抗体の濃度および蛋白質Ａと反応するヒトＩｏＧの濃度（下記第４表参照 ）を測定するために採用された。

抗−スペルミン抗体の場合は、アルカリホスファターゼで標識を付けた抗−ヤギ ＩｏＧウサギ自消を用いた。その酵素活性は、基質のｐ−ニトロフェニルホスフ ェート（テクニコン。

Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ）によって発現する。

（以下余白） 上記第４表において、“結果”の欄に引用されたＣＭＶウィルス抗原に関する第 ３図は、ＡＯＣＭＶｌ、：ｌ！ｌする第１ラインとＡＯＭＲＣｓ対照に［る第２ ラインを示している。

即ち、ＡＵ　ＣＭＶに関して、Ａ、Ｂ、ＥおよびＦは、サイトメガロウィルスで 感染されたＭＲＣｓ細胞のホモジネート由来の蛋白質が結合されたナイロン−Ａ Ｈストリップを示す。またＣ、Ｄ、Ｇおよびト１は、非感染のＭＲＣ５［１胞（ 対照）のホモジネート由来の蛋白質が結合されたナイロン−ＡＨストリップを示 す。

抗−ＣＭＶ　ＩｐＧ含有のヒト血清をＡ、Ｂ、ＣおよびＤのストリップに用い、 抗−ＣＭＶＩｏＧを含有しないヒト血清をＥ、Ｆ、ＧおよびＨのストリップに用 いた。

第４図は血清蛋白質（ＩＯＧ）によって得られた結果を示す。

即ちＡはヒトＩＯＧが結合されたナイロン−ＡＨストリップを示し、Ｂはナイロ ン−ＡＨの対照ストリップを示し、Ｃはヒト１（ＩＧが結合されたニトロセルＯ −スーＡＨストリップを示し、Ｄはニトロセルロース−ＡＨの対照ストリップを 示す。

第５図は細菌抗原（蛋白質Ａ）によってＬ７られた結果を示す。

この因において、Ａは蛋白質へが結合されたニトロセルロース−ＡＨストリップ を示し、Ｂはエタノールアミンが結合されたニトロセルロース−ＡＨストリップ を示す。

“結果゛′の欄に引用された第６図はハブテン（ＤＮＡ）で得られた結果に関す るものである。すなわちＡはＤＮＡが結合されたニトロセルロースーＡＨストリ ップを示し、Ｂはエタノールアミンが結合されたニトロセルロース−ＡＨストリ ップを示す。

第７図は全細菌（サルモネラ）の場合に得られた結果に関するものある。Ａと８ はストレプタピジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ　）　−ペルオキシダーゼで 処理され、これに抗−サルモネラ抗体が結合され、次いでサルモネラ菌の懸濁物 に接触させた。Ａはビオチンで標識を付けた抗サルモネラ抗体で処理したが、Ｂ はこの抗体では処理しなかった。

上記第４表の“結果″の欄に引用されている第５表は特にハブテン、即ちスペル ミンに関するものである。

第５表 り、抗体ストリップによる試料中の抗原の検出絶倒１５　サルモネラ・チフィム リウム（３ａｌａ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｉｕｒｉｕ■）の細菌抗原の検出 細菌（ｇｅｒｍ）懸濁ｕｉ液 ６・１０７細菌数／１！と１８μｇ蛋白／Ｖを含有する細菌懸濁液２００Ａをマ イクロプレートのウェルに分配した。実験用ストリップ又は対照ストリップを各 ウェルに挿入する。３７℃で１時間接触させた後、ストリップを、仔ウシＨＩＧ を含有しないこと以外同様の！１函液の洗浄ピンからの液流で３回洗浄し、洗浄 液〔００Ｈ 国際調査報告 −枦−−−＾−一−１−ＰＣＴ／ＦＲ８６１００３９９ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　、１ −：Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡｆ、５ＥＡＲＣＨＲＥ：’ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．特に、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのマイクロフレートおよびスト リップを含む群から選択される固相担体からなり、その担体がヒドラジド誘導体 および／又はアミノ酸からなる側鎖を有しこの側鎖に抗原又は抗体の分子が化学 結合されてなる診断剤。
2. ２．固相担体が、特にポリ塩化ビニル又はポリスチレンのごとき熱可塑性材料層 に結合された適当な繊維材料層からなるストリップで構成された請求の範囲第１ 項の診断剤。
3. ３．診断剤を構成する繊維材料層がポリアミド繊維、特にセルロース、ニトロセ ルロースおよび酢酸セルロースのごときセルロース系材料、ポリエステルなどを 含む群から選択される請求の範囲第２項の診断剤。
4. ４．固相担体に結合された側鎖が、酸ヒドラジド類とフェニルヒドラジンのごと きヒドラジン誘導体およびアミノ酸類、特に−ＳＨ基を有するアミノ酸類からな る群から選択される化合物で構成されてなる請求の範囲第１〜３項のいずれかひ とつの診断剤。
5. ５．固相担体が有する側鎖に化学結合された分子が、ウイルス抗原類、細菌抗原 類、ハプテン類抗体類、抗体類、血漿蛋白質類、リボ核酸類およびデオキシリボ 核酸類、並びに場合によって抗原類もしくは抗体類として用いうる免疫グロブリ ンからなる群から選択される請求の範囲第１〜４項のいずれかひとつの診断剤。
6. ６．固相担体が有する側鎖に化学結合される抗原類又は抗体類が、未酸化の蛋白 質類又は糖蛋白質類からなり、該側鎖がジアゾ化された酸ヒドラジド又は末端カ ルボキシル基を有する有機化合物で構成されてなる請求の範囲第１〜５項のいず れかひとつの診断剤。
7. ７．固相担体が有する側鎖に化学結合された抗原類又は抗体類が酸化された糖蛋 白質類からなり、該側鎖が酸ヒドラジド類およびフェニルヒドラジンのごときヒ ドラジン誘導体並びにアミノ酸類、特にシステインのごとき−ＳＨ基を含有する アミノ酸類からなる群から選択される化合物で構成されてなる請求の範囲第１〜 ５項のいずれかひとつの診断剤。
8. ８．ポリ塩化ビニルもしくはポリスチレンのマイクロプレート又は繊維製のスト リップであってそれ自体特にポリ塩化ビニルもしくはポリスチレンのごとき熱可 塑性材料製の支持体に結合されてなる固相担体が有する、ヒドラジド誘導体から なる側鎖に、最初に酸化した後その炭水化物残基を介して化学結合させたサイト メガロウイルス（ＣＭＶ）の抗原を有する請求の範囲第７項の診断剤。
9. ９．固相担体がストリップである場合、溶接および好ましくは高周波溶接によっ て、繊維材料層が不活性の熱可塑性材料層に有利に結合される請求の範囲第１〜 ８項のいずれかひとつの診断剤。
10. １０．繊維材料層が、酸化されたセルロース系材料で作製される請求の範囲第９ 項の診断剤。
11. １１．繊維材料層が熱可塑性材料層の一部にのみ結合される請求の範囲第９項又 は第１０項の診断剤。
12. １２．繊維材料層が結合されているプラスチック層の部分の表面が熱可塑性プラ スチック材料層の全表面の約１／５〜１／５０であり、抗原もしくは抗体が側鎖 を介して該繊維層に結合されてなる請求の範囲第１１項の診断剤。
13. １３．実質的にストリップの形態である請求の範囲第１〜１２項のいずれかひと つの診断剤。
14. １４．いくつかのストリップがひとつの共通の支持体ストリップによって互に結 合されてなる請求の範囲第１３項の診断剤。
15. １５．複数のストリップが各々、共通の支持体ストリップに弱い線で結合されて なる請求の範囲第１４項の診断剤。
16. １６．固相担体、または熱可塑性材料製のストリップの支持層がポリスチレン製 であり、後者は最初に処理してポリアミノスチレンに変換される請求の範囲第１ 〜１２項のいずれかひとつの診断剤。
17. １７．診断剤を構成する固相担体が遊離の第一アミン基を有し、この遊離アミノ 基を、側鎖とカップリングさせることによって該担体を側鎖で置換し、次いで固 相担体にカップリング結合させた前記側鎖の自由端に適当な抗原もしくは抗体の 分子を共有結合させることからなる請求の範囲第１〜１６項のいずれかひとつの 診断剤を製造する方法。
18. １８．診断剤の固相担体が繊維材料層と熱可塑性材料層とが結合したストリップ からなる場合、 適当な繊維材料製の層が、その繊維の遊離のアミノ基にカップリングされた側鎖 で置換される第１工程、及び第１工程中、繊維層に結合された側鎖の自由端に適 当な抗原もしくは抗体の分子を共有結合させる第２工程とからなる請求の範囲第 １７項の診断剤の製造方法。
19. １９．担体が有する遊離のアミノ基を無水こはく酸でこはく酸化し、次いでその 末端の酸の基に、適当なカルボジイミドの存在下でヒドラジンを反応させること によってヒドラジドに変換させることによって、遊離のアミノ基を有する担体を ヒドラジン誘導体の側鎖で置換する請求の範囲第１７項又は第１８項の方法。
20. ２０．遊離のアミノ基を有する担体を、適当なカルボジイドの存在下、−ＳＨ基 を有するアミノ酸、特にシステインの側鎖で置換する請求の範囲第１７項又は第 １８項の方法。
21. ２１．抗原もしくは抗体が少なくともひとつの−ＣＨ２ＯＨ基からなる炭水化物 残基を有し、これを−ＣＨＯ基に変換した後、その抗原もしくは抗体を固相担体 の側鎖に結合させる請求の範囲第１７〜２０項のいずれかひとつの方法。
22. ２２．抗原もしくは抗体が、その末端の−ＣＨＯ基と、固相担体の側鎖が有する 末端遊離第一アミンの基との化学反応によって該担体に結合される請求の範囲第 ２１項の方法。
23. ２３．診断剤が、繊維材料のストリップと熱可塑性材料層とが結合されて得られ る請求の範囲第１７〜２２項のいずれかひとつの方法。
24. ２４．繊維材料のストリップがポリアミド繊維製である請求の範囲第２３項の方 法。
25. ２５．繊維材料のストリップがポリエステル繊維製である請求の範囲第２３項の 方法。
26. ２６．繊維材料のストリップが、セルロース、ニトロセルロースおよび酢酸セル ロースからなる群から選択されるセルロース系材料の繊維製である請求の範囲第 １７〜２２項のいずれかひとつの方法。
27. ２７．セルロース系材料の繊維製の層を、酸化工程に付し次いでヒドラジン誘導 体の側鎖を結合させることからなる請求の範囲第２６項の方法。
28. ２８．ヒドラジン誘導体の側鎖が酸化された層に結合された後、側鎖結合工程中 にヒドラジン誘導体と反応しなかった遊離カルボニル基が特に水素化硼素ナトリ ウムのごとき適切な還元剤でアルコールに還元される請求の範囲第２６項又は第 ２７項の方法。
29. ２９．抗原もしくは抗体が、そのアミノ基と、固相担体に結合された側鎖の酸ヒ ドラジド基との化学反応によって、前記担体に結合される請求の範囲第１７〜２ ０項および第２３〜２８項のいずれかひとつの方法。
30. ３０．化学カップリングで結合された抗原もしくは抗体が、蛋白質、ホロ蛋白質 および糖蛋白質からなる群から選択される請求の範囲第２９項の方法。
31. ３１．酸ヒドラジドからなる固相担体の側鎖をジアゾ化して酸アジドとし、これ に、未酸化の蛋白質、ホロ蛋白質又は糖蛋白質および未酸化のリボ核酸とデオキ シリボ核酸からなる抗原又は抗体が化学反応によってカップリングされる請求の 範囲第２９項又は第３０項の方法。
32. ３２．側鎖と、抗一種・抗体もしくは抗原とを結合させる前か又はこれらの処理 工程の後に、繊維層を熱可塑性材料層に結合させる請求の範囲第２３〜２８項の いずれかひとつの方法。
33. ３３．請求の範囲第１〜１６項のいずれかひとつの診断剤を血清溶液に適当な時 間浸漬する第１工程：診断剤を血清溶液から取出し次いで洗浄し、酸素で標識を 付けた、検出すべき抗一種・抗体含有の溶液に導入し、次いで適切な組成の緩衝 液で数回洗浄する第２工程：及び上記診断剤を、電子受容体が有利に結合された 基質を含有する溶液に導入し、該基質が特定の抗体の存在下で前記診断剤上に沈 澱し、診断剤を、生成物の量によって高強度又は低強度の紫色に着色し、この着 色を標準のカラースケールと比較することによって被検生物流体中に存在する抗 体の量を測定する第３工程 からなる血清のごとき生物流体中の抗体又は抗原の検出方法。
34. ３４．ヒドラジン誘導体からなる、診断剤の側鎖に化学的にカップリング結合さ れる分子が、予め酸化された免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）で あって、このグロブリン分子が、ヒドラジン誘導体の側鎖の遊離アミノ基と対応 する免疫グロブリン−ＣＨＯ分子の遊離−ＣＨＯ基との化学反応によってカップ リングされて、ヒドラゾンを形成する請求の範囲第３３項の検出方法。
35. ３５．検出されるべき抗原に対する抗体が直接、酵素で標識が付され、次いで、 非イオン界面活性剤、硼酸ナトリウム、適当なアミノ酸および塩化ナトリウムを 含有する適切な緩衝液で希釈し、ＰＨを８．１に調節した被検生物流体に導入さ れる請求の範囲第３３項又は第３４項の検出方法。
36. ３６．ヒドラジド誘導体からなる、診断剤の固相担体の側鎖に化学的にカップリ ング結合させる分子が、ウイルス抗原で特にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の 抗原であり、予め酸化されたものである請求の範囲第３３〜３５項のいずれかひ とつの検出法。
37. ３７．ヒドラジド誘導体からなる、診断剤の担体の側鎖に化学的にカップリング 結合させる分子が、特にストプトコッカス・アウレウス由来の蛋白質Ａのような 細菌抗原であり、前記担体層のチアゾ化された側鎖に化学的にカップされる請求 の範囲第３３項の検出方法。
38. ３８．ヒドラジド誘導体からなる、診断剤の担体の側鎖に化学的にカップリング 結合される分子が、ハプテンであり、特に前記担体のジアゾ化された側鎖に化学 的にカップリングされるカゼイン−スペルミンカップリング生成物である請求の 範囲第３３項又は第３５項の検出方法。
39. ３９．ヒドラジド誘導体からなる、診断剤の担体の側鎖に化学的にカップリング 結合される分子が、担体層のジアゾ化された側鎖に化学的にカップリングされる デオキシリボ核酸である特許請求の範囲第３３項又は第３５項の検出方法。
40. ４０．ヒドラジド誘導体からなる、診断剤の担体の側鎖に化学的にカップリング 結合される分子が、予め酸化され、ピオチンで標識が付された抗一サルモネラ抗 体類からなる群から特に選択される抗体である請求の範囲第３３項又は第３５項 の検出方法。
41. ４１．診断剤を生物流体から取出して診断剤を洗浄するのに使用される緩衝液が 、酵素で標識を付けた抗一種・抗体を希釈するのに用いるのと同じ緩衝液である 請求の範囲第３３〜４０項のいずれかひとつの検出方法。
42. ４２．基質が、α−クロロナフト−ルもしくはｏ−ジアニシジンもしくは代りに ｏ−フェニレンジアミンと結合させた過酸化水素の溶液又は符にｐ−ニトロフェ ニルホスフェートの溶液からなる請求の範囲第３３〜４１項のいずれかひとつの 検出方法。
43. ４３．ＥＬＩＳＡ反応によって検出している際に、血清蛋白が非特異的に吸着す るのを排除するために、請求の範囲第１〜１６項のいずれかひとつの診断剤を、 前記検出方法に用いる前に、ウシ血清アルブミン、仔牛ＩｇＧおよびゼラチンか らなる群から特に選択される蛋白質で飽和させる請求の範囲第３３〜４２項のい ずれかひとつの検出方法。
44. ４４．下記組合わせ： 適切な抗原もしくは抗体を有する請求の範囲第１１〜１６項のいずれかひとつの 診断剤：診断剤の抗原に対する標識付き抗体の適切量：緩衝液Ｉの適切量：緩衝 液ＩＩの適切量：いくつかの微量滴定用プレート：酵素基質の適切量：および電 子受容体の適切量 からなる請求の範囲第３３〜４３項のいずれかひとつの検出方法を実施するため のすぐに使用できる診断キット。
45. ４５．診断剤が単一ストリップ又は多重ストリップの形態である請求の範囲第４ ４項の診断キット。
46. ４６．ヒドラジド誘導体からなる側鎖に化学的にカップリング結合された適切な 抗原もしくは抗体を有する請求の範囲第１〜１６項のいずれかひとつの診断剤が 微量滴定用プレートに結合され、特に前記プレートの各ウエルに結合されてなる 請求の範囲第４４項の診断キット。