JPS63290854A - 二官能性キレート化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鼠！上Δ机１立１ 本発明は二官能性キレート化剤に関する。本発明は金属
イオンを含む安定な錯体を形成することかできるポリア
ミノポリカルボン酸キレート骨格中のカルボキシメチル
基に、特異な基質反応性基を結合させて成る二官能性キ
レート化剤を提供する。

本発明は一般に、自然に産生ずる分子または合成分子の
双方の生物学的活性分子に、金属イオンを結合させるた
めのキレート化剤に関する。特に本発明は、金属結合基
、および金属イオンで標識されるべき分子（以下、基質
（“５ｕｂｓｔｒａｔｅ”）と呼称する）上に存在する
１個ないしそれ以上の官能性機能と反応する追加的単一
部分（以下、基質反応性（５ｕｂｓｔｒａｔｅ　　ｒｅ
ａｃｔｉｖｅ”））基の配列から成る二官能性キレート
化剤に関する。一つの実施態様によれば、本発明は、上
記二官能性キレート化剤から成る抗体結合体および抗体
−金属イオン結合体、ならびに放射線放出および放射線
吸収金属イオンを用いる生体診断用画像形成法のための
上記抗体−金属イオン結合体の用途に関する。さらに本
発明は、細胞毒性放射線を放出する上記のような抗体−
金属イオン結合体の使用法を包含する治療法に関する。

従来技術と解決すべき課題 本発明に関連するものとして診断および治療上の目的の
ための蛋白質／金属イオン結合体の使用を記載した文献
がみられる。ガンソウ（Ｇ　ａｎｓｏｖ）ら（米国特許
第４，４５４，１０６号）は、インビトロおよびインビ
ボ放射線画像形成診断法のためのモノクロナール抗体／
金属イオン結合体の使用法を開示している。ゴールデン
バーグ（Ｇ　ｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）ら（Ｎ、Ｅｎｇ、　
Ｊ、　Ｍｅｄ、第２９８巻１３８４〜８８頁（１９７８
年））は、既知の腫瘍関連抗原胎児性癌抗原（ＣＥＡ）
に対する抗体をヨウ＄　１３１で標識し、癌患者に注射
する診断的画像形成実験を開示している。４８時間後、
この患者をガンマ線シンチレーションカメラで走査し、
ガンマ線放射図形により腫瘍の位置がわかる。

他の研究者らは、細胞毒性ラジオアイソトープを生体内
腫瘍沈着物に分配するための抗体／金属イオン結合体の
治療的使用法を開示している。オーダー（Ｏｒｄｅｒ）
ら（Ｉ　ｎｔ、　Ｊ　、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｏｎｃｏ
ｌｏｇｙＢ　ｉｏｌ、　Ｐ　ｈｙｓ、第１２巻２７７〜
８１頁（１９８６年）は、イツトリウムｓ０でキレート
化した抗フェリチンポリクロナール抗体による肝細胞層
の処理を開示している。ダックスバウム（Ｄ　ｕｃｈｓ
ｂａｕｍ）ら（Ｉ　ｎｔ、Ｊ、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｏ
ｎｃｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｌ、Ｐｈｙｓ。

第１２巻７９〜８２頁（１９８５年））ハ、ＣＥＡに対
するモノクロナール抗体をイツトリウム■で放射線標識
する処理を開示し、これによる結腸直腸癌の位置決定お
よび処置の可能性を示唆している。ニコロツテイ（Ｎ　
１ｃｏｌｏｔｔｉＸ欧州特許出願第１７４．８５３号、
公開日１９８６年３月１９日）は、金属イオンと抗体フ
ラグメントか・ら成る結合体を開示している。この開示
によれば、サブクラスＩｇＧのモノクロナール抗体は酵
素的に処理されてＦｃフラグメントが離脱し、抗体の主
要分枝鎖を結合しているジスルフィド結合を還元的に開
裂させる。Ｐ　ａｂ’フラグメントを、生体内診断的ま
たは治療的用途のために放射性核種金属イオンに結合し
たキレート化剤に連結させる。

抗体／金属イオン結合体は、金属結合基ならびに蛋白質
基質に共有結合することができる部分の配列から成る二
官能性キレート化剤を使用することにより形成させるこ
とができる。二官能性キレート化剤に関する従来の研究
では、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｄ　Ｔ　Ｐ　
Ａ）化合物およびその誘導体が例示されている。この化
合物は２個のエチレン鎖により連結する３個の窒素原子
を基本骨格とするものである。該基本骨格上の窒素原子
からの拡がりは５個のカルボキシメチル部分である。

このカルボキシメチル基のうちの１個と、抗体または他
の蛋白質分子上に存在するアミノ酸残基と反応してアミ
ド結合を形成させることができることが開示されている
。他の４個のカルボキシメチル部分は、３個の窒素原子
と共に金属結合のために使用されるために保留される。

不幸にして反応性基質とＤＴＰＡ中のキレート官能性の
間に固有の差異がないので、上記方法は架橋結合、およ
び標的抗原との結合性能の付随的低下を伴う抗体の変性
が生じる可能性がある。

このような好ましくない架橋結合の可能性を避けるため
、特異な蛋白質基質反応性サイトを組入れた二官能性キ
レート化剤が開発された。かかる化合物の最初のものは
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）化合物の誘導体で
ある。この化合物はエチレン鎖を連結した２個の窒素原
子の基本骨格を有する。該基本骨格上の窒素原子からの
拡がりは４個のカルボキシメチル部分であって、金属の
結合のため該構造中の窒素原子が適当である。このＥＤ
ＴＡの二官能性キレート誘導体は、特異な蛋白質基質反
応性官能基がポリアミン骨格のエチレン炭素において結
合することが特色である。サンドバーブ（Ｓ　ｕｎｄｂ
ｅｒｇ）ら（Ｊ、Ｍｅｄ、　ＣｈｅＩｌｌ、第１７巻１
３０４頁（１９７４年））は、バラアミノフェニル蛋白
質反応性置換基を有するＥＤＴＡ誘導体の合成法を開示
している。次いで該アミンと化学的に修飾した蛋白質部
分を反応させるか、または第一アミン体を温和な条件で
処理して蛋白質基質に結合することができる他の置換基
を形成させることにより、上記誘導体を、温和な条件で
蛋白質基質に結合することができる二官能性キレート化
剤に変換することができる。

ミーアス（Ｍｅａｒｅｓ）ら（Ｊ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　　
ＣｈｅＩｌｌ、第３巻２１５〜２２８頁（１９８４年）
）は、そのパラアミノフェニル誘導体を、亜硝酸処理に
よりジアゾニウム誘導体に変換し、チオホスゲン処理で
誘導されるイソチオシアネートに変換し、臭化ブロモア
セチルで処理して誘導されるブロモアセトアミド誘導体
に変換し、さらに塩化バルミトイルで処理することによ
りパルミタアミドベンジル誘導体に変換する方法を開示
している。アルドマン（Ａ　ｌｔ＋＋＋ａｎ）ら（Ｊ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｔｒａｎｓ、　！
　。

第３６５巻５９〜６２頁（１９８３年））は、上記ＥＤ
ＴＡ化合物の多くのフェネチル類似体を開示している。

またサンドバーブ（Ｓ　ｕｎｄｂｅｒｇ）ら：米国特許
第３，９９４，９６６号参照。

かかる技術分野において環状キレート化剤が知られてい
る。クロール（Ｋ　ｒｏｔ　Ｉ）ら（Ｎａｔｕｒｅ第１
８０巻９１９〜２０（１９５７年）は、人体から得られ
た重金属イオンを除くため、シクロヘキサン−１，２−
）ランス−ジアミンテトラ酢酸を使用する方法も開示し
ている。モイ（Ｍｏｉ）ら（Ａｎａｌ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、第１４８巻２４９〜２５３頁（１９
８５年）は、６−（ｐ−ニトロベンジル）−１，４，８
゜１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ、Ｎ’。

Ｎ”、Ｎ”−テトラ酢酸（ｐ−ニトロベンジル−ＴＥＴ
Ａ）の名称を有する多環二官能性キレート化剤萌駆体（
これから生理学的条件下のヒト血清中で非常に安定な銅
キレートが形成される）を開示している。さらに、この
ＴＥＴＡのｐ−ブロモアセトアミドベンジル誘導体は、
モノクロナール抗体と抱合した後、高い安定性を示す。

このモイらの文献は、抱合体が蛋白質とＴＥＴＡの間の
スペーサ一部分（ｓｐａｃｅｒ　　ｇｒｏｕｐ）を含む
ある種の場合において改良された金属結合収率を得るこ
とができることを開示している。

キレート化剤を開示したグリーン（Ｇ　ｒｅｅｎ）ら（
■ｎｔ、Ｊ　、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、第１２巻
３８１〜８５（１９８５年））およびクリアフェロ（Ｔ
　ａｔ　１ａｆｅｒｒｏ）ら（Ｉ　ｎｏｒｇ、　Ｃｈｅ
ｍ、第２３巻１１８８〜９２頁（１９８４年））の開示
は、本発明に関連するものである。グリーンらは、ガリ
ウム６８とインジウムＩ１１で錯体化した六座配位子Ｎ
、Ｎ’−ジピリドキシルエチレンジアミンーＮ、Ｎ’−
ジ酢酸（ＰＬＥＤ）を開示している。クリアフエロらは
、ＰＬＥＤキレート類ならびにＮ、Ｎ’−エチレン−ビ
ス［２−（。

−ヒドロキシフェニル）グリシン］（ＥＨＰＧ）および
Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジ
アミン−Ｎ、Ｎ’−ジ酢酸（ＨＢＥＤ）のキレート類を
開示している。

公知ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ誘導体に関する他の変種は
、パラアミノフェニル置換基をポリアミン骨格のメチレ
ン炭素に結合したＤＴＰＡ誘導体を記載したプレヒビエ
ル（Ｂ　ｒｅｃｈｂｉｅｌ）ら（Ｉ　ｎｏｒｇ。

Ｃｈｅｗ、第２５巻２７７２〜８１頁（１９８６年）に
開示の誘導体変種を包含する。さらに、アルドマンら（
Ｊ　、Ｃｈｅ讃、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、
　　１　、第５９巻（１９８４年）は、ＥＤＴＡの２−
カポキシエチルキレート誘導体を開示している。

ポリアミン骨格のメチレン炭素に蛋白質反応性官能基を
結合するＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ誘導体、の合成法は複
雑で実施するのが困難であって、適用性が制限される。

また、炭素が環状系の部分であるキレート化剤のような
多くのキレート化剤のポリアミン骨格炭素原子は、置換
のために容易に利用されない。それ故すべてのポリアミ
ノポリカルボン酸骨格に共通でかつこれに受入れられる
部分に結合する特異な基質反応性官能基を有する二官能
性キレート化剤を開発することが好ましい。

さらにかかる化合物の一般的合成法を開発するのが好ま
しい。

式： ［式中、Ｒは長鎖アルキルを表わす］ で示される界面活性化合物を説明したタケシタおよびマ
エダ（Ｙ　ｕｋａｇａｋｕ第１９巻９８４〜９３頁（１
９７０年））の開示は本発明に関連する。

またフェニルピルビン酸およびバラヒドロキシフェニル
ピルビン酸を含む種々のピルビン酸を、穏和な条件下に
アンモニアおよび水素化シアノホウ素ナトリウムで還元
的アミノ化し、対応するｄＱ−α−アミノ酸を得る反応
を説明したポーチ（Ｂ。

ｒｃｈ）ら（Ｊ、Ａｌｌ１ｅｒ、ＣｈｅｔＳｏｃ、第９
３巻２３９７頁（１９７１年））の開示も、本発明に関
連する。

発明の構成と効果 本発明は、金属イオンを含む安定な錯体を形成すること
ができるポリアミノポリカルボン酸キレート骨格中のカ
ルボキシメチル基に、特異な基質反応性（“５ｕｂｓｔ
ｒａｔｅ　　ｒｅａｃｔｉｖｅ”）部分を結合させて成
る二官能性キレート化剤を提供するものである。適当な
基質反応性基は、アミノ、チオンアナト、ジアゾニウム
およびブロモアセトアミドのような基質反応性基（金属
イオンで標識されるべき基質分子上に存在する１個ない
しそれ以上の官能基と反応することができる１＆）で直
接置換されるか、らしくは脂肪族スペーサーアーム（ｓ
ｐａｃｃｒａｒｍ）を介して置換されたフェニル基を包
含ずろ。

また基質反応性基は、チオセミカルバノドおよびヒドラ
ノンのような基質反応性基で直接置換されるか、らしく
は脂肪族スペーサーアームを介してＩｆ喚されたフェニ
ル基を包含する。

本発明は、構造中の金属結合性を傷つけることなく該ポ
リアミノポリカルボン酸構造中に適用性の多い基質反応
性基を導入する一般的方法を提供することにおいて特に
ａ益である。ポリアミン骨楕のメチレン炭素原子に基質
反応性基を導入するという従来技術の合成法は、エチレ
ン炭素原子が環状系の部分であるような他の多くの好ま
しいキレート化剤の合成に容易に類推適用することがで
きない。すべてのポリアミノポリカルボン酸骨格に共通
であってかつこれに受入れられる部分に基質反応性官能
基を結合した化合物を製造することにより、本発明は、
金属イオンを有する生物学的活性分子に標識する処理を
含む問題に対し、上記のような骨格により発現されるキ
レート特性を充分に適用するための方法を提供するらの
である。

本発明の二官能性キレート化剤は、蛋白質、糖蛋白質、
ペプチド類、ポリアミノ酸類、脂質、炭水化物、多糖類
、ヌクレオノド類、ヌクレオチド類、核酸類、胆汁酸、
薬物、抑制剤および完全細胞（ｉｎｔａｃｔ　　Ｃ（！
Ｉｔ８）などに制限されるしのでなくこれらを含む種々
の基質分子に、放射性金属を含む金属を結合さけるのに
適当である。本発明の化合物は、ランタニドおよびアク
チニド金属のような高配位数の金属イオンをキレート化
するときに改良された安定性を有する高次ＷＩＦＩ！に
化合物に付随する１０個またはそれ以上の金属結合置換
基を何する。また本発明は改良された安定性を与える環
状二官能性キレート系を提供する。

本発明の一つのｇｌによれば、二官能性キレート化剤を
包含し、抗体結合体（ａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｊｕｇＩ
Ｉｔｅｓ）および抗体−金属イオン結合体（ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ−ｍｅｔａｌ　　ｉｏｎ　　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｓ）を提供する。

本発明は、さらに放射線放射および放射線吸収金属イオ
ンを用いる生体内診断画像形成法を提供する。更に本発
明の上記以外の懸様によれば、本発明のキレート化剤を
用い、細胞毒性の放射線放射液種を抗Ｉｌｌ瘍特異的抗
原抗体に結合させることに癌のような症状の処置のため
の治療法を提供する。

次いで本発明の抗体−放射性核種結合体を患者に導入し
、細胞毒性放射性核種を、直接的にＩＩＩ瘍関連抗原含
打細胞に向わせる。

本発明のキレート化剤の具体的説明 本発明は、金属イオンを含む安定な錯体を形成すること
ができるポリカルボン酸キレート骨格中のカルホキ／メ
チル基に、特異な基質反応性基を結合さけて成る二官能
性キレート化剤を提供する。

本発明化合物は、特に次式で示される構造特性を有する
。

［式中、Ｘはメタまたはパラ位に位置するニトロまたは
基質反応性基； ｎは０〜約！０； Ｒ，は−（ＣＨ，）ｑ−１ ［（ＣＨｙ）Ｑ　Ｎ　（ＲｓＸ　Ｃｔｌ　ｔ）ｒコー　
、［（ＣＨｔ）ｑＯ（ｃ　Ｉ−１ｔ）ｒｏ　（ＣＩ（−
）ｓコ、［（ＣＨ＝）ｑＮ　（Ｒ５）（ＣＨ−）ｒＮ　
（ＲｓＸＣＩ（ｔ）ｓ］−１（基中、ｑは２または３、
ｒは２または３、Ｓは２または３）を表わし： Ｒ２、Ｒ１、Ｒ−、Ｒ５およびＲｓは同一らしくは異な
って水素、−ＣＨ，Ｃｏ、Ｈおよびオルト−ＣＨｔ　Ｃ
＠　Ｈ、ＯＨから選ばれる居を表わずか、または ＲＩが−（ＣＨｚ）Ｑ〜であるとき、Ｒ２およびＲ５は
一緒になって 基＋　　（ＣＨＪｔＮ（ＲｔＸＣＨｔ）ｕＮ（ＲｓＸＣ
Ｈ＊）ｖ−（基中、ｔは２または３、Ｕは２または３、
■は２または３、Ｒ９およびＲ６は水素、　ＣＨｔ　Ｃ
Ｏｔ　Ｈ−およびオルト−ＣＨ，Ｃ，Ｈ，ＯＨから選ば
れる基）で示されるヒドロカルビル環を形成することが
できる〕。

本発明は、多様な基質反応性基と種々の大きさ、形状お
よびデンテイシテイ（ｄｅｎｔ　ｉｃ　ｉｔ　１ｅｓ）
を有するキレート化の官能基から成る多くの二官能性キ
レート化剤を提供するが、本発明による好ましいキレー
ト化剤は唯一種類だけではない。好ましい化合物は基質
および結合させるべき金属イオンの特性により変化する
。それにもかかわらず特定の置換基および生成物が特定
の状況下で一般に好ましい傾向がある。

Ｘがニトロであるとき、基質との反応に先立ってさらに
基質反応性基に変換することが必要であＸのための好ま
しい基質反応性基は下記から選ばれる基を包含する。

−Ｎ　Ｈｔ　（アミノ）、 −ＮＮ”（ジアゾニウム）、 −Ｎ　ＣＳ　（イソチオシアネート）、−ＮＧＯ（イソ
シアネート）、 −Ｎ　ＨＮ　Ｈ＊　（ヒドラジン）、 −Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＮ　Ｈバセミカルバジド）、−ＮＨ
ＣＳＮＨＮＨ，（チオセミカルバジド）、ＮＨＣＯＣＨ
ｔＣ１２（クロロアセトアミド）、Ｎ　ＨＣＯＣＨｔ　
Ｂ　ｒ　（ブロモアセトアミド）、−Ｎ）（ＣＯＣＨｆ
ｆｉＩ　（ヨードアセトアミド）、−Ｎ、（アジド）、 ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨｔ）ｍＮＨｔ（アミノアルキル尿素
）、 −ＮＨＣ８ＮＨ（ＣＨｔ）ｍＮＨＮアバノアルキルチオ
尿素）、 キシボリル）フェニルチオ尿素） ［上記基中、ＹはＣＱ、ＢｒおよびＦから、ＺはＣＱｌ
ＢｒＳＦ、ＯＨおよびＯＣＨ３から選ばれる基、ｍは１
〜約１０を表わす］。

特に好ましい基質反応性基は、Ｘがバラ位に置換されて
おり、−ＮＨ，、−ＮＣＳ、−ＮＨＣＯＣＨｔＢｒおよ
び−Ｎ　ＨＣＳ　Ｎ　Ｈ（ＣＨｔ　）　ｔ　Ｎ　Ｈｔか
ら選ばれる基を包含する。蛋白質基質のアミノ酸側鎖と
直接結合するのを避けることが好ましい場合、好ましい
基質反応性基は、ある種の蛋白質上に存在するグリコジ
ル基と反応することができる基を包含する。かかるグリ
コジル基は一般に不活性であるので、しばしばその反応
性を増大させるために反応性穴なる基に誘導するかまた
は酸化せねばならない。グリコジル化蛋白質を結合する
のに使用する好ましい基質反応性基は、−ＮＨＮＨ。

および−ｐＪ　ＨＣＳ　Ｎ　ＨＮ　Ｈｔを包含する。

Ｒ１のために好ましい置換基は下記から選ばれる基を包
含する。

−（ＣＨ，）−１ ［（ＣＨ−）ｚＮ　（ＣＨｔＣＯｔＨＸｃ　Ｈｔ）ｔ］
−１−［（、ｃＨｔ）ｔｏ（ｃＨｔ）ｔｏ（ｃＨｔ）ｔ
］−１［（ＣＨｔ）ｙＮ（ＣＨｔＣＯｔＨＸＣＨＪｔＮ
（ＣＨｔＣＯｚＨＸＣＨＪ＊コー、 置換基Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８
は、好ましくは水素およびｃＨｔｃｏｔｒ−ｒから選ば
れる。ある適用のために好ましい化合物は、Ｒ１とＲ１
が合してヒドロカルビル環を形成することなく、Ｒ２、
Ｒ５、Ｒ４、Ｒ６およびＲ６がそれぞれ水素およびＣＨ
ｔ　ＣＯｔ　Ｈから選ばれる化合物を包含する。ある適
用のため、特にＲ２、Ｒ１、Ｒ４およびＲ６がＣＨ，Ｃ
Ｏ！Ｈである化合物が好ましい。

好ましい化合物は、更にｎ＝１である化合物を包含する
。ある適用のため、Ｒ１が−［Ｃ）Ｉ、−ＣＨ１］−ま
たは−［（ＣＯｘ）ｔＮ（ＣＨｔＣＯｔＨＸＣＨｌ）、
］−およびＸがＮＣＳであるキレート化剤が特に好まし
い。特に好ましい化合物群は、Ｘがパラ位にありかつ−
Ｎ　Ｏｔｌ−Ｎ　Ｈｔ、−ＮＣＳ、−ＮＨＣ８ＮＨＮＨ
１および−Ｎ　ＨＣＳ　Ｎ　Ｈ（ＣＨｔ　）　ｔＮ　Ｈ
ｔから選ばれる基、ｎ＝１　％　Ｒｒが−（ｃｔｔｔ）
＊−１ −［（ｃＨｔ）ｔｏ（ｃＨｔ）ｔｏ（ｃＨｔ）ｔｌ−１
−［（ＣＨｚ）ｔＮ（ＣＨｔＣＯ！ＸＣＨｅ）］−１お
よび ぐ）から選ばれる基、 Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６がそれぞれ−ＣＨｆｆ１ＣＯｔＨであ
る化合物を包含する。

デンテイシテイ３を有する好ましい化合物は次式により
定義される： Ｎ−（２−アミノエチル）−（４−アミノフェニル）ア
ラニン。

本発明のキレート化合物のある種の置換基および部分が
一般に好ましいものであっても、本発明化合物の特定の
構造は、基質の性質および結合させるべき金属イオンに
より広く変化する。それにもかかわらず本発明化合物を
特定の用途に向けることに一般的原則を適用することが
できる。たとえばアクチニドおよびランタニド系金属の
ようなある種の金属イオンは大なるラジアス（ｒａｄｉ
ｉ）を有し、高配位数を優先する。かかるイオンと結合
する好ましいキレート化剤はデンテイシテイの高い大な
る化合物である。他の例として、蛋白質の構造中の特定
のアミノ酸残基の正確な位置（酵素の活性サイト上また
はその近辺、もしくは抗体の認識領域（ｒｅｃｏｇｎｉ
ｔｉｏｎ　　ｒｅｇｉｏｎ）上またはその近辺）は、キ
レート化剤上のいずれかの基質反応性基の選択を必要と
することができる。また本発明の大環状キレート化剤は
、ある種の金属イオンの結合のため改良された安定性を
与えることができる。それ故本発明の複数の態様はその
種々の変形態様に従う。

脂肪鎖長はコア構造の範囲内で変わり、デンテイシテイ
はＲ１鎖上の金属反応性カルボキシメチルアミノ基の組
入れにより増大することができる。

デンテイシティの水準の増大から成る本発明のキレート
化剤は、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス
（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−アミノ
フェニル）アラニン（以下、ＮＨｔ−化合物Ａ）（デン
テイシテイ６）、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ　−（
２−アミノエチル）−Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ
’−（２’＝（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチ
ル）−（４−アミノフェニル）アラニン（以下、ＮＨｔ
−化合物Ｂ）（デンテイシテイ８）、およびＮ−（カル
ボキシメチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（
カルボキシメチル）−Ｎ’−（２°−アミノエチル）−
Ｎ”−（カルボキンメチル）−Ｎ”−（２”−（ビス（
カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−アミノフ
ェニル）アラニン（デンテイシティ１０）。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボ
キシメチル）アミノ）エチル）−（４−アミノフェニル
）アラニン。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ　−（２−アミノエチル
）−Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ’−（２°−（ビ
ス（カルボキシメチル）アミノエチル）−（４−アミノ
フェニル）アラニン。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）
−Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ’　−（２°−アミ
ノエチル）−Ｎ”−（カルボキシメチル）−Ｎ”−（２
”−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（
４−アミノフェニル）アラニン。

約６〜１０もしくはそれ以上の増加するデンテイシテイ
を有するキレート化剤は、ランタニドおよびアクチニド
系のような高配位数を与えるキレート金属のために特に
有用である。

また環状系の骨格を作ることにより、ジアミン骨格中に
立体拘束を導入するようにＲ，基を選択することができ
る。非芳香族または芳香族環状形のいずれかにおけるこ
のような立体拘束の導入は、ある種の金属錯体のために
改変された安定を導く。

骨格をこのように改変した本発明のキレート化剤は、Ｎ
−（カルボキシメチル）−Ｎ−トランス−（２−（ビス
（カルボキシメチル）アミノ）シクロヘキシル）−（４
−ニトロフェニル）アラニル（デンテイシテイ６）、お
よびＮ−（カルボキシメチル）−Ｎ　−（２−（ビス（
カルボキシメチル）アミノ）フェニル）＝（４−ニトロ
フェニル）アラニン（デンテイシテイ６）を包含する。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−トランス−（２−（ビ
ス（カルボキシメチル）アミノ）シクロヘキシル）−（
４−ニトロフェニル）アラニン。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボ
キシメチル）アミノ）フェニル）−（４−ニトロフェニ
ル）アラニン。

ＲＩ基に関する更に有用な変形体は、Ｒ１が金属中心と
共に配位結合を形成することができる追加的な供与原子
（ｄｏｎｏｒ　　ａｔｏｎｅｓ）を含むことから成るキ
レート化剤を包含する。本発明によるかかるキレート化
剤の一つは、下記式のＮ−（１−カルボキシ−２−（ｐ
−ニトロフェニル）エチル）−１，８−ジアミノ−３，
６−シオキサオクタンーＮ、Ｎ’。

Ｎｏ−トリ酢酸である。

この構造において、この２個のエーテル酸素原子は、２
個のアミン窒素原子と共に金属結合に関与することがで
き、４個のカルボン酸酸素原子は全テンテイシテイ８を
与える。

本発明は、更にポリアミノポリカルボン酸キレート化剤
中の１個ないしそれ以上のカルボキシメチル基がオルト
−ヒドロキシベンジル基により置換された化合物を提供
する。かかる置換基は、金属結合部分から成り、キレー
ト化のために適当な立体化学を提示する。下記式で示さ
れるＮ−（（２−ヒドロキシフェニル）メチル）−Ｎ−
（２−アミノエチル）−Ｎ’　−（（２°−ヒドロキシ
フェニル）メチル）−Ｎ’−（カルボキシメチル）−（
４−アミノフェニル）アラニン（デンテイシテイ６）は
、上記のような化合物の適当な例を構成する。かかる構
造は、従来技術のキレート化剤に比しインジウム錯体の
改良された安定性を提供する。

Ｎｉｌ。

また本発明は、Ｒ９とＲ１が合体してヒドロカルビル環
を形成することができる大環状キレート化剤を包含する
。かかる大環状キレート化剤は、ある種の応用のため好
ましいこともある改良された安定性を提供する。このよ
うな大環状キレート化剤の典型的化合物は、次式を有す
るＮ−（（α−（３−（４−アミノフェニル）プロピル
））カルボキシメチル’）−Ｎ’、Ｎ”、Ｎ”−（カル
ボキシメチル）−１゜４．８．１１−テトラアザシクロ
テトラデカンである。

金属イオン 本発明によりキレート化することができる金属イオンは
、診断的シンチグラフィーに有用なガンマ線放出アイソ
トープを包含する。半減期２．８日のインジウムＩＩ＋
は特に有用であるが、ガリウム６７、ガリウム０および
テクネチウム８１を包含する他の適当なガンマ線放出体
も有用である。本発明による物質は、放射線療法のため
の細胞毒性剤として有用なベータ放射線放出体にキレー
ト化することができる。かかる放出体は、スカンジウム
４６、スカンジウム４７、スカンジウム４１１、Ｉ”、
ガリウム７１、ガリウム７３、イツトリウム＠０、ルテ
ニウム９７、パラジウム１００、ロジウム＋ｏ＋１、パ
ラジウム１０９、サマリウム＋５３、レニウム１■、レ
ニウム＋１１１１、レニウム１ａｍ、金１＠１１、ラジ
ウム３１オおよび鉛！１３のようなアイソトープを包含
する。

本発明のキレート化剤は、ビスマス３１３のようなアル
ファ放射線放出物、ガリウム８８およびジルコニウム＠
８のような陽電子放出体、テルビウムおよびユーロピウ
ムのようなランタニド系およびルテニウムのような遷移
元素系の蛍光元素およびガドリニウムと鉄のようなパラ
磁性元素を結合させて使用することができる。また本発
明のキレート化剤は、金属イオンの触媒性が有効である
ような場合を含む種々の目的のために有用なこともある
他の多くの金属イオンと結合させるのに適当である。鉄
、銅、バナジウム、ロジウム、白金、パラジウムおよび
チタンは、ヒドロキシル遊離基の鉄による触媒作用発現
による核酸の開裂のような種々の有機反応における触媒
作用に有用な金属イオンの例である。

金属イオンの錯体化 キレート他剤／金属イオン結合体のｆ！Ｊ造法は、この
技術分野でよく知られている。キレート化剤と金属イオ
ンの錯体は、一般にキレート他剤／基質の結合体（Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ）を、金属イオンと共に該結合体が生理
学的に安定に保持される緩衝溶液中で熟成させることに
より製造することができる。

適当な緩衝剤はクエン酸塩、酢酸またはグリシンのよう
な弱い金属−結合特性を有する緩衝剤を包含する。適当
な濃度、温度およびｌ）！−１は、基質上の弱い金属結
合サイトよりむしろキレート化官能性への金属イオン結
合を確実にするようにこの分野の技術者により選択する
ことができる。溶液はすべて金属不純物が含まれないよ
うに保持することが特に望ましい。適当時間熟成後、必
要に応じて未結合金属を、ゲル濾過のような操作により
基質／キレート他剤／金属イオン結合体から分離しても
よい。

基質反応に関する官能性 本発明による基質反応性基は、生物学的活性基質である
ことができる基質中に存在する少なくとも１個の官能基
と、特異な結合反応をすることができる基である。基質
が蛋白質であるとき、かがる基を、ポリペプチド骨格を
構成するアミノ酸の側鎖基と反応させることができる。

かかる側鎖基は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残
基のカルボキシル基、リシン残基のアミノ基、チロシン
およびヒスチジンの芳香族基ならびにシスティン残基の
スルフヒドリル基を包含する。

ポリペプチド骨格のような基質により表わされるカルボ
キシル側基を、溶解性カルボジイミド反応により本発明
化合物のアミン基質反応性基と反応させることができる
。基質により与えられるアミノ側基を、本発明のイソチ
オシアネート、イソシアネートまたはハロトリアジン誘
導体と反応させてキレート化剤をポリペプチドに有効に
結合さ仕ることができる。また他方において、ジアルデ
ヒド類およびイミドエステル順のような二官能性試薬に
より、基質上のアミノ側基と、アミン基質反応性基を有
する本発明化合物を結合させることができる。基質によ
り与えられる芳香族基を、ジアゾニウム誘導体を経由し
て本発明のキレート化剤に結合させることができる。基
質上のスルフヒドリル基とマレインイミド類と反応させ
るか、またはヨードアセトアミドのようなハロアルキル
基質反応性基と反応させることができる。かかる反応に
適当な遊離スルフヒドリル基は、蛋白質免疫グロブリン
類のジスルフィド結合から生成させるか、または化学的
誘導法により導入することができる。免疫グロブリン類
の内部大形鎖領域に生成した遊離スルフヒドリル基との
結合は、その免疫グロブリンの抗原結合サイトと抵触し
ないが、抗体が補体を活性化することを不可能にするこ
とがある。

基質がグリコジル化された蛋白質であるとき、そのポリ
ペプチド骨゛格により本発明化合物に結合を形成させる
ための別法は、マクカーン（ＭｃＫｅａｒｎ）ら（ＥＰ
Ｏ第８８，６９５号）のような方法に従って糖蛋白質の
炭水化物側鎖と共有結合を形成させることである。この
ように抗体の炭水化物側鎖を選択的に酸化してアルデヒ
ド基を形成させ、次いでこれをアミン基質反応性基と反
応させてシッフ塩基を形成させるか、もしくはこれをヒ
ドラジン、セミカルバジドまたはチオセミカルバジド基
質反応性基と反応させてそれぞれ対応するヒト）シン、
セミカルバゾンまたはチオセミカルバゾン結合を形成さ
せることができる。またこれらと同じ方法は、本発明に
二官能性キレート化剤を炭水化物および多糖類のような
非蛋白質性基質に結合するために用いられることができ
る。

あらかじめ酸化する必要がなく炭水化物および多糖類に
結合するのに有用な別の基質反応性基は、本発明のメタ
−（ジヒドロキシボリル）フェニルチオ尿素誘導体中に
存在するようなジヒドロキシボリル基である。この基は
、ｌ、２−シス−ジオールを含む基質と反応して５員環
状ホウ酸エステルを形成し、この基を含む炭水化物、多
糖類および糖蛋白質と共に使用される。またローゼンバ
ーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら（Ｂ　１ｏｃｈｅＩＩｌ
ｉｓｔｒｙ第１１巻３６２３〜２８頁（１９７２年））
が開示したようにリボースはその２°、３゛−位に１．
２−シス−ジオール基を含むので、本発明のキレート化
剤をリボヌクレオシド類、リボヌクレオチド類およびリ
ボ核酸と結合するために、ジヒドロキシボリル誘導体を
使用することができる。デオキシリボヌクレオチド類お
よびＤＮＡ基質は、３′−ヒドロキシル基を欠くような
様式で本発明のキレート化剤に結合させることはできな
い。しかしエンゲルハルト（Ｅ　ｎｇｅｌｈａｒｄｔ）
ら（Ｅ　Ｐ　Ｏ第９７，３７３号）に開示されているよ
うに、初めにデオキシリボヌクレオチドのアリルアミン
誘導体を形成させることにより、上記デオキシリボヌク
レオチド類およびＤＮＡ基質をキレート化剤のイソチオ
シアネート誘導体と結合することができる。

本発明のキレート化剤と結合すべき基質が完全細胞であ
るとき、ポリペプチド−反応性または炭水化物−反応性
基のいずれかを使用することができる。ホワング（Ｈｗ
ａｎｇ）およびウエイズ（Ｗａｓｅ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ第５１２巻５４〜７１
頁（１９７８年））は、白血球および血小板をインジウ
ム−１１１で標識するため、サンドバーブ（Ｓ　ｕｎｄ
ｂｅｒｇ）ら（Ｊ　、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｒａ、第１７巻１
３０４頁（１９７４年））の二官能性ＥＤＴＡキレート
化剤の他剤ゾニウム誘導体の使用を開示している。

ジヒドロキシボリル部分は種々の細菌類、ウイールス類
および微生物類と反応する（ライトル（Ｚｉｔｔｌｅ）
（Ａｄｖａｎ、　Ｅｎｚｙｍ、第１２巻４９３頁（１９
５１年））およびバーネット（Ｂ　ｕｒｎｅｔｔ）ら（
Ｂ　１ｏｃｈｅａ＋、　Ｂ　ｆｏｐｈｙｇ、　Ｒｅｓ、
　Ｃｏａｔｓ、第９６巻１５７〜６２（１９８０年））
参照）。

本発明による基質反応性基は以下に述べるものを包含す
るニアミノ（−Ｎ　Ｈ、）、ジアゾニウム（−ＮＮ”）
、イソチオシアネート（−ＮＣＳ）、イソシアネート（
−ＮＣＯ）、ヒドラジン（−Ｎ　ＨＮ　Ｈ＊’）、セミ
カルバジド（Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＮ　Ｈ！　）、チオセミ
カルバジド（−ＮＨＣＳＮＨＮＨ＊）、ハロアセト７ミ
Ｆ（−Ｎ）（ＣＯＣＨ，Ｘ）、（クロロ−、ブロモ−お
よびヨードアセトアミドを含む）、アジド（−Ｎｊｌ）
、アミノアルキル尿素（−ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨｔ）ＩＩ
ＩＮ　Ｈり、アミノアルキルチオ尿素（−ＮＨＣＳ　Ｎ
　Ｈ（ＣＨｘ）ｍＮ　ＨｔＸｍは１〜約１０）、マレイ
ンイミド、ハロトリアジン（クロロ−、ブロモ−１およ
びヨードトリアジンを含む）およびメタ−（ジヒドロキ
シボリル）フェニルチオ尿素（−Ｎ　ＨＣＳ　Ｎ　ＨＣ
＠　Ｈ４Ｂ　（ＯＨ）　ｔ　）。キレート化剤を基質に
結合するために適当な他の反応性基は、ジスルフィド類
、ニトレン類（ｒ＋１ｔｒｅｎｅｓ）、スルホンアミド
類、カルボジイミド類、スルホニルクロリド類、ベンズ
イミデート類（Ｂ　ｅｎｚｉｍｉｄａｔｅｓ）、−ＣＯ
ＣＨｓおよび−ＳＯ３Ｈを包含する。本発明の特定の応
用のために好ましい基質反応性基は、その基質の性質、
および与えられた型の結合を形成させる結果として生物
学的活性の損失に対する感受性により、指示されるであ
ろう。定義により、与えられた型の結合の形成は、基質
反応性基Ｘの結合体型への化学的変換体（以下、Ｘの残
基（“ｒｅ＋＋１ｄｕｅ“）と呼ぶ）を包含する。

本発明の反応性基は、脂肪族スペーサー基により、本発
明のポリアミノポリカルボン酸キレート骨格中のカルボ
キシメチル基１個に結合したフェニル基上のメタ位また
は好ましくはバラ位に位置する。このスペーサー基は炭
素原子１〜約１０から成り、直鎖または分枝状アルキル
もしくは置換アルキルであってこれらの分枝鎖あるいは
置換基が金属結合サイトまたは基質反応性基と抵触しな
い条件のアルキル基であることができる。それにもかか
わらず直鎖アルキル結合基としては、ＣＱ−アルキル結
合基が特に好ましい。

本発明における　用な基質 本発明のキレート化剤と反応することができる基質分子
は、蛋白質、糖蛋白質、ペプチド類、ポリアミノ酸、脂
質類、炭水化物、多糖類、ヌクレオシド類、ヌクレオチ
ド類、核酸類、胆汁酸類、薬物類、抑制剤類または完全
細胞などを包含する。

適当な蛋白質は、免疫グロブリン類、抗原類、酵素類、
血液凝固／抗凝固系成分ならびに種々の生化学的活性分
子および受容体を包含する。このような蛋白質は、たと
えば遺伝学的に操作した細胞から誘導することができる
。本発明の一つの実施態様によれば、［ｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含む種々のタイプの抗体
を結合させるために本発明の二官能性キレート化剤を使
用することができる。これらの抗体は、腫瘍、組織適合
性および他の細胞表面抗原、細菌類、菌類、ウィルス類
、酵素類、毒素類、薬物類および他の生物学的活性分子
に関連する抗原決定基を含む種々の抗原決定基に対する
ものでもよい。腫瘍に関連する抗原（それに対して抗体
が特異に反応することができる）は、ザルクバーグ（Ｚ
　ａ　ｌｃｂｅｒｇ）およびマツケンシイ（ＭａＫｅｎ
ｚｉｅ）（Ｊ　、　Ｃｌｉｎ。

ＯｎｃｏｌｏｇＶ第３巻８７６〜８２頁（１９８５年）
）が述べたような抗原（かかる抗原に限定されるもので
はない）、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２のよ
うなムチン類、人乳脂肪球抗原およびＩＬ−２のような
受容体およびトランスフェリン受容体を包含する。前記
のような抗体はモノクロナールまたはポリクロナールで
あることができ、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８１巻６８５１〜５５頁（１９８４年））
記載のような遺伝子組換え体により作り出すことができ
る。

また抗体分子のフラグメントは半抗体分子およびＦ　ａ
ｂ、　Ｆ　ａｂ’またはＦ　（ａｂ’　）　ｔフラグメ
ントを含み結合することができる。ここに引用するニコ
ロテイ（Ｎ　１ｃｏｌｏｔｔｉＸＥ　Ｐ　Ｏ第１７４，
８５３号、１９８６年３月１９日公開）は、完全な抗体
を処理してその部位を２本のＨ鎖に特異的に開裂し、Ｈ
鎖のカルボキシル末端におけるＦＣ部位を除く方法を開
示している。

上記のように開示された方法により基質と、キレート化
剤の基質反応性基を反応させる。各基質は所望により１
個を超えるキレート化剤と結合することができる。しか
し蛋白質のような基質上の最高度の置換は、その蛋白質
のグリコジル化の性質またはその分子上の反応性アミノ
酸側鎖の数と位置により制限される。抗体に関し、結合
した蛋白質がその生物学的活性を保持することが好まし
いときは、置換の程度は、蛋白質の第１および第３配列
の両方での標的グリコジル化またはアミノ酸残基の性質
および位置ならびに抗原結合部位の包含の程度により制
限される。

本発明により企図される他の基質は多糖類母型を包含し
、これはキレート化剤で誘導されたとき金属蛋白質およ
び他の金属含有基質から金属を抽出する手段ならびにポ
ラス（Ｐｏｒａｔｈ）およびオリン（Ｑ　ｌ　１ｌ）（
Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　第２２巻１６２１〜３０
頁（１９８３年））の方法による蛋白質のアフィニティ
クロマトグラフィーのための手段を提供する。本発明の
キレート化剤に結合した核酸は、エンゲルハルト（Ｅ　
ｎｇｅｌｈａｒｄｔ）ら（Ｅ　Ｐ　Ｏ第９７，３７３号
）に開示されているような核酸ハイブリダイゼーシジン
反応をモニターするために使用することができる。薬物
に結合した二官能性キレート化剤は、薬物の組織内への
吸収を追跡するのに使用することができる。例えば、腫
瘍画像形成手段として、サンドバーブ（Ｓ　ｕｎｄｂｅ
ｒｇ）ら（Ｊ、Ｍｅｄ。

Ｃｈｅｍ、第１７巻１３０４頁（１９７４年））の二官
能性ＥＤＴＡ誘導体に結合した抗生物質プレオマイシン
を使用する例である。［プリーマー（Ｄ　ｅＲ１ｅＩｌ
ｅｒ）ら（Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｓ＋、第２２巻１０
１９〜２３（１９７９年）；グツドウィン（Ｇｏｏｄｗ
ｉｎ）ら（Ｊ　、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、第２２巻７８
７〜９２頁（１９８１年）参照］。薬物のほかに、特定
の器官系を標的とする他の低分子量物質を、その器官系
の画像形成のために同様に使用することができる。ボイ
ド（Ｂｏｙｄ）ら（Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、第２２
巻７２０〜７２５頁（１９８１年））記載のようにヒト
の胆道胆のう系を標的にすることで知られたコール酸は
、本発明の二官能性キレート化剤に結合したとき、およ
びガンマ線を放射する放射性金属（ラジオシンチグラフ
ィー検出のため）で、またはガドリニウムのようなパラ
磁性金属（磁気共鳴画像形成法による検出のため）で標
識したときの特定の器官系の画像にするために使用する
ことができる。ホワング（ｌ（ｓａｎｇ）およびウエイ
ズ（Ｗａｓｅ）（Ｂ　ｉｏｃｈｉｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙ
ｓ、　Ａｃｔａ第５１２巻５４〜７１頁（１９７８年）
）により述べられているように赤血球および血小板のよ
うな完全細胞を、二官能性キレート化剤に結合させた放
射性同位体金属で標識処理し、この標識細胞を体内にお
ける異常集積領域検出のために使用することができる。

本発明化合物は、低分子量の物質（それ自体は生物学的
高分子量の分子と特異的結合反応する）と結合すること
が予期される。バナー（Ｈａｎｅｒ）ら（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、第２３１巻４７７
〜８６頁（１９８４年））は、活性部位に強く結合して
その部位を探求するのに使用する親和性標識を提供する
トリプシンの特異的阻害剤であるｐ−アミノベンズアミ
ジンに、ＥＤＴＡを結合させる方法を開示している。シ
ュルツ（Ｓｈｕｌｔｚ）およびダーバン（Ｄｅｒｖａｎ
）（Ｊ　、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｆｆｉ、　Ｓｏｃ、第
１０５巻７７４８〜５０（１９８３年）は、ＥＤＴＡを
ディスタマイシン（Ｎ−メチルビロールトリペプチド類
）（これが配列−特異性型のＤＮＡに結合）に結合させ
ることにより生成する結合体の鉄錯体による、ＤＮＡの
配列−特異性二重鎖（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　−５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ　　ｄｏｕｂｌｅ　　５ｔｒａｎｄ）の開裂を開
示している。

後記実施例は本発明による種々のキレート化剤の合成法
について説明するものである。実施例１〜５で、Ｎ−（
カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメ
チル）アミノ）エチル）−（４−アミノフェニル）アラ
ニン（ＮＨｔ−化合物Ａ）およびその他方の基質反応性
基を有する類似体の合成法を説明する。実施例６および
７で、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（アミノ
エチル）−Ｎ’　−（カルボキシメチル）−Ｎ’−（２
°−（ビス−（カルボキシメチル）アミノ）エチル）＝
（４−アミノフェニル）アラニン（ＮＨ，−化合物Ｂ）
およびその４−イソチオシアナトフェニル類似体の合成
法を説明する。

実施例８で、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（トラン
ス−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）シクロ
へキシル−（４−ニトロフェニル）アラニンの合成法を
説明する。

実施例９およびｌＯにおいて、実施例３の４−イソチオ
シアナトフェニル・キレート化剤を抗ＣＥＡモノクロナ
ール抗体に結合し、この結合体を従来技術によるＤＴＴ
Ａ結合体と比較する。実施例１１において、実施例７の
４−イソチオシアナトフェニル・キレート化剤を抗ＣＥ
Ａモノクロナール抗体に結合させ、実施例９の方法によ
り評価する。実施例１２において、実施例９の抗ＣＥＡ
モノクロナール抗体を開裂して得られたＦ　（ａｂ’　
）フラグメント２本を実施例３のキレート化剤に結合さ
せる。実施例１３において、実施例３のキレート化剤を
モノクロナール抗体８７２．３に結合させ、これを腫瘍
−関連糖蛋白質（ＴＡＧ−７２）と特異的に反応させる
。

実施例１４において、実施例５の４−（２−アミノエチ
ルチオ尿素）−フェニル・キレート化剤をポリグルタミ
ン酸と結合させる。実施例Ｉ５．１６．１７および１８
において、それぞれ実施例９．１１．１２および１３の
抗体結合体でバイオディストリビューション（ｂｉｏｄ
ｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）試験を行なった。

実施例１９で、Ｎ−（１−カルボキシ−２−（ｐ−二ト
ロフェニル）エチル）−１，８−ジアミノ−３，６−シ
オキサオクタンーＮ、Ｎ’、Ｎ’−）り酢酸、窒素とカ
ルボン酸結合部位に加うるに２個のエーテルオキシテン
（ｏｘｙｔｅｎ）供与体の存在する８−配位キレート化
剤の合成法を説明する。

実施例２０で、実施例５の二官能性キレート化剤とコー
ル酸の間に形成される結合体の製造法を説明する。実施
例２１において、実施例２０の結合体をインジウム−１
１１で標識し、マウスを用いてバイオディストリビュー
ション試験を行なう。

実施例２２で、インジウム−Ｉｌｌで標識した実施例２
１の結合体を胆道胆のう系を画像形成させるのに使用す
るガンマカメラ画像試験を説明する。

実施例１ この実施例において、４−ニトロフェニルピルビン酸を
エチレンジアミンで還元的アミノ化して得られたモノ置
換ジアミンをカルボキシメチル化することにより、本発
明のＮ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カ
ルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−ニトロフェ
ニル）アラニン（Ｎ　Ｏを−化合物Ａ）（２個のアミノ
基と４個のカルボキシメチル（金属反応）基を有するパ
ラ−ニトロフェニル置換二官能性キレート化剤）を合成
する。

４−ニトロフェニルピルビン酸・アザラクトンを製造す
るため、最初酢酸２０肩σ中Ｎ−アセチルグリシン７．
０９（６０ミリモル）および無水酢酸２１蛙中４−二ト
ロベンズアルデヒド（米国ウィスコンシン州、ミルウオ
ーキー在ＡＩｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃｅｌ　　Ｇｏ、）
９．７９（６４ミリモル）と酢酸ナトリウム１００℃で
２時間反応させることにより、５−ケト−２−メチル−
４−（４°−ニトロベンジリジン）−４，５−ジヒドロ
オキサゾールを得る。混合物を１０℃に冷やした後、強
く撹拌しながら水１００ｘ（を加え、生成したアザラク
トン体１２．９９を濾取する。

次の工程で、５−ケト−２−メチル−４−（４’−二ト
ロベンジリジン）−４，５−ジヒドロ−オキサゾール７
．９９（３４ミリモル）を酢酸２００肩Ｑに溶解し、１
００℃に加熱する。次いで水５ＲＱを加え、混合物を１
００℃で更に１５分間撹拌する。

次いでこの溶液をゆっくり室温に冷やし、α−アセトア
ミノ−４−二トロ桂皮酸７．２９を単離する。

３Ｍ塩酸５０村中、α−アセトアミノ−４−ニトロ桂皮
酸７．２９（２９ミリモル）から成る懸濁液を７時間撹
拌、還流する。混合物を０℃に冷やし、得られた４−ニ
トロ−フェニルピルビン酸５．４ｇを濾取し、冷水で洗
って減圧乾燥する。

メタノール５００軒中、４−ニトロフェニルピルビン酸
１５９Ｃ７１，７ミリモル）から成る溶液を、水１００
ｘ＆中エチレンジアミン・二塩酸塩１１゜６９（８７，
２ミリモル）から成る溶液に加える。得られた混合物に
７Ｍ水酸化ナトリウムでその９１４を６．０にする。混
合物に水素化シアノホウ素ナトリウム７．８６９（１２
５ミリモル）を加え、６Ｍ塩酸を用いてｐＨ６、０に再
調節する。混合物を室温で３日間撹拌し、次いで濃塩酸
３０酎を加える。

更に３０分間撹拌後、溶液を減圧下、残留物がオレンジ
色になるまで蒸発させる。これを水２５０ｙＱに懸濁し
、酢酸エチルで（２００１１２Ｘ　５回）洗う。

黄色水層を減圧下に蒸発させ、黄白色残留物を得、これ
は粗Ｎ−（２−アミノエチル）−（４−ニトロフェニル
）アラニン・二塩酸塩と同定された。この粗生成物をダ
ウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　５０　ｘ　２−２００（Ｈ
＋型）イオン交換カラム上、クロマトグラフィーに付し
、初め水７００峠、次いで水酸化アンモニウム５％（ｖ
／ｖ）溶液で溶離する。紫外線吸収ニンヒドリン陽性分
画を合し、減圧下に蒸発させて得られた残留物をエタノ
ールに溶解する。この溶液に濃塩酸を加えて生成した濃
厚な白色沈澱を濾取し、エタノールおよびジエチルエー
テルで洗い、風乾してＮ−（２−アミノエチル）−（４
−ニトロフェニル）アラニン・二塩酸塩６．５６９を得
る。

Ｎ−（２−アミノエチル）−（４−ニトロフェニル）ア
ラニン・二基酸塩純品３９Ｃ９，２０ミリモル）を、水
２５ｘＱ中でブロモ酢酸４．５１９（３２，５ミリモル
）から成る溶液に加え、混合物を４５℃に加温する。こ
の混合物に７Ｍ水酸化ナトリウムを加えて混合物をｐＨ
１０に調節し、同期的に７Ｍ水酸化ナトリウムを加えて
ｐＨ１０に保持しながら混合物を４５℃で２０時間撹拌
する。

分子内縮合によるラクタム形成に基づく、還元的にアミ
ノ化段階においてジアミン体が生成する問題はなかった
が、カルボキシメチル化反応において用いる高温により
、Ｎ、Ｎ’−ビス（カルボキシメチル）誘導体として同
定されるラクタム体を生成する。この理由によりラクタ
ム不純物を除くため、冷生成物をバイオランド（Ｂ　ｉ
ｏ　−Ｒａｄ）Ａ　ＧＩ−Ｘ４（ギ酸型）イオン交換カ
ラム（米国カリフォルニア州、リッチモンド在Ｂｉｏ−
Ｒａｄ）上、クロマトグラフィーに付し、順次水、３．
５Ｍギ酸および６．０Ｍギ酸各１ｅで溶離する。各分画
を、ウォーターズ・デルタ・ブレプ（Ｗａｔｅｒｓ　　
Ｄ　ｅｌｔａ　　Ｐｒｅｐ）３０００系により、ウォー
ターズ・ミューボンドパック（Ｗａｔｅｒｓ　　μｍ　
Ｂｏｎｄｐａｋ）Ｃ−１８カラム（０，３９ｘ　３０ｃ
ｍ）上、２０％メタノールおよび酢酸中０．０１Ｍ）リ
エチルアミン（移動相として）を用いるＨＰＬＣにより
、評価する。この分析により、３．５Ｍギ酸で溶離した
ラクタム体と、６．０Ｍギ酸で溶離した所望の生成物を
見出した。生成物を含む分画を合して蒸発乾固し、Ｎ−
（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシ
メチル）アミノ）エチル）−（４−ニトロフェニル）ア
ラニン１．７９９を得た。

実施例２ この実施例において、実施例Ｉにより製せられた４−ニ
トロフェニル置換キレート化剤を、４−アミノフェニル
置換化合物に変換する。実施例Ｉにより製せられたＮ−
（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシ
メチル）アミノ）エチル）−（４−ニトロフェニル）ア
ラニン０．９１９＜２．１３ミリモル）、水１００１（
！およびギ酸１５１１２から成る溶液を、パル（Ｐａｒ
ｒＸイリノイ州、モリン在、型３９１１）水素化容器中
、触媒として１０％パラジウム／炭素（０，１０１？）
の存在下、室温、３５ｐｓｉで２時間水素化する。次い
で混合物をセライトに通して触媒を濾去し、濾液を蒸発
乾固する。

得られた残留物を４Ｍ塩酸５０１（２に溶解し、凍結乾
燥して４−アミノフェニル置換化合物＋Ｎ−（カルボキ
シメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）ア
ミノ）エチル）−（４−アミノフェニル）アラニン・二
塩酸塩０．８７９を得た。

実施例３ この実施例において、実施例２の４−アミノフェニル・
キレート化剤を反応させて対応する４−イソチオシアナ
トフェニル・キレート化剤を製する。

ミーアズ（Ｍｅａｒｅｓ）ら（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、第１４２巻６８〜７８頁（１９８４年））の操作
に従って実施例２の４−アミノフェニル生成物０．６８
９を３Ｍ塩酸１２１１２に溶解する。これに８５％（ｖ
／ｖ）チオホスゲン／四塩化炭素１．７０＊１２（１８
，９５ミリモル）を加え、得られた懸濁液を室温で６時
間撹拌する。次いでジエチルエーテル１５ＪＩＩ２部分
を加え、生成した白色沈澱を濾別して減圧下に乾燥し、
４−イソチオシアナトフェニル置換化合物二Ｎ−（カル
ボキシメチル）−Ｎ−（２−ビス（カルボキシメチル）
アミノ）エチル）−（４〜イソチオシアナトフエニル）
アラニン・二塩酸塩０．３８９を得た。

実施例４ この実施例において、実施例３の４−イソチオシアナト
フェニル・キレート化剤を反応させて対応する４−チオ
セミカルバジドフェニル・キレート化剤を製する。４−
イソチオシアナトフェニル生成物０．１５９（０，２９
ミリモル）を水１５ｕｄに懸濁し、水浴中で冷やす。こ
の懸濁液に、トリエチルアミン０，２５５ｉ１２および
８５％ヒドラジンヒトレート０．０６６ｉＱ（１，７５
ミリモル）を加え、この混合物を水浴中で２時間次いで
室温で更に１時間撹拌する。混合物を減圧下に蒸発乾固
し、残留物を４Ｍ塩酸２０１ＩＩＱに溶解する。この溶
液を再び減圧下に蒸発乾固し、生成した残留物をバイオ
ラッドＡＧＩ−Ｘ４イオン交換カラム（クロリド型）上
、クロマトグラフィーに付し、順次水容１００ｘＱおよ
び４Ｍ塩酸で溶離する。４Ｍ塩酸溶出液を減圧下に蒸発
、乾固し、白色固体型としてＮ−（カルボキシメチル）
−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチ
ル）−（４−チオセミカルバジドフェニル）アラニン・
二塩酸塩０．１５ｇを得た。

実施例５ この実施例において、実施例３の４−イソチオシアナト
フェニル・キレート化剤を対応する４−（２−アミノエ
チルチオ尿素）フェニル誘導体に変換し、２−炭素スペ
ーサーによりフェニルチオ尿素置換分に結合した反応性
脂肪族アミノ基を形成させる。

最初モノ保護されたエチレンジアミン誘導体を得るため
、水浴中で冷やしたメタノール１５０ｚ（１中エチレン
ジアミン４０．５９（６７４ミリモル）の溶液に、撹拌
下、ＴＨＦ３００ｊ１７２中ジーｔ−プチルジカルボネ
ート６．０（２，７５ミリモル）の溶液を３時間に渡っ
て滴下する。この混合物を水浴中で更に１時間撹拌し、
室温に加温する。この溶液を蒸発乾固して得られた残留
物を、シリカカラム（キーゼルゲル（Ｋ　ｉｅｇｅｌｇ
ｅｌ）　７０〜２３０メツシユ（西ドイツネダルムシュ
タット在メルク（Ｅ。

Ｍｅｒｃｋ）））上、りａマドグラフィーに付し、メタ
ノール：水酸化アンモニウム：塩化メチレン（２０：０
．５ニア９．５）で溶離する。所望の生成物を組む分画
をシリカプレートにュージャージー州、クリフトン、ホ
ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ　　Ｃｏ、　））上、薄
層クロマトグラフィーに付し、カラムを溶離するのに用
いたものと同一の溶媒混合物中に展開することにより、
所望の生成物を同定した（Ｒｆ＝０゜６）。これらの分
画を合し、減圧下に蒸発乾固し、黄色油状物としてＮ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）エチレンジアミン４　、１
９（収率９３％）を得る。

続く工程において、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）エ
チレンジアミン０．３９９（２，４ミリモル）のＤＭＦ
５ｘｄ溶液を、ＤＭＦ’７村中実施例３の４−イソチオ
シアナトフェニル生成物０．３４ｇ（０，６６ミリモル
）およびトリエチルアミン０．３５ｕＣ（２，５ミリモ
ル）の混合物（０℃に冷却）に加える。この混合物を０
℃で更に１５分間、次いで室温で４８時間撹拌する。こ
の時点で水２ＲＱを加え、混合物を更に６時間撹拌後、
減圧下に蒸発乾固する。

残留物を水２０村に溶解し、この溶液を塩化メチレン２
５１ｇ部で３回洗う。水層を凍結乾燥し、得られた褐色
固体を、バイオラッドＡＧＩ−Ｘ４カラム（ギ酸型）上
、クロマトグラフィーに付し、水１５０村、３．５Ｍギ
酸２００１１２および７Ｍギ酸２００ｘＩ２で順次溶離
する。７Ｍギ酸溶出液を蒸発乾固し、Ｎ−（カルボキシ
メチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミ
ノ）エチル）−（４−（Ｎ’−（２°−Ｎ”−ｔ−ブト
キシカルボニル））アミノエチルチオ尿素）フェニル）
アラニン０．２３ｇ（５８％）を得る。この物質０．１
７（０，２８ミリモル）を、トリフルオロ酢酸５　、　
ＯｘＱ中、大気中水分から保護して室温で６時間撹拌す
ることにより脱保護する。溶媒を蒸発させ、残留物を２
Ｍ塩酸１０ｙｔ（ｌに溶解し、この溶液を減圧下に蒸発
乾固する。

得られた残留物をバイオラッドＡＧＩ−Ｘ４カラム（ギ
酸型）上、クロマトグラフィーに付し、水１００村、次
いでＩＭ、２Ｍ、３Ｍおよび４Ｍギ酸それぞれ５０ｘＱ
で順次溶離する。ギ酸溶出液からの紫外線吸収分画を合
し、減圧下に蒸発乾固する。

得られた残留物を４Ｍ塩酸１００ｘＱに溶解し、減圧下
に蒸発乾固し、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−
（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−
Ｎ’−（２−アミノエチル）チオ尿素）フェニル）アラ
ニン・二塩酸塩０．１４ｇ（８１％）を得た。

実施例に の実施例において、４−ニトロフェニルピルビン酸をＮ
’−（Ｎ、Ｎ−ジエチルカルボキサミトメチル）ジエチ
レントリアミンで還元的アミノ化することにより得られ
た生成物を、カルボキシメチル化し、得られた物質を還
元し、次いで酸加水分解して、本発明の３個のアミノ基
および５個のカルボキシメチル（金属反応性）基を有す
るパラ−アミノフェニル置換二官能性キレート化剤：Ｎ
−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）−
Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ’−（２°−（ビス（
カルボキシメチル）アミノ）エチル）＝（４−アミノフ
ェニル）アラニン（ＮＨ，−化合物Ｂ）を製造する。

Ｎ’−（Ｎ、Ｎ−ジエチルカルボキサミトメチル）ジエ
チレントリアミンを製造するため、最初に２箇所保護さ
れたトリアミン、　Ｎｌ、　Ｎ？−ビス（ｔ−ブトキシ
カルボニル）ジエチレントリアミンを、以下の操作によ
り製造する。２−（ｔ−ブトキシカルボニルオキシイミ
ノ）−２−フェニル−アセトニトリル（ウィスコンシン
州、シルウォーキー在アルドリチ・ケミカル社（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

）２６．０９（１０５，６ミリモル）のＴＨＦ５０（ｌ
ＪＩＱ溶液を、ＴＨＦ　Ｉ　００ｘＱ中ジエチレントリ
アミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）５．４４９（５２，７ミリモ
ル）とトリエチルアミン１５．９７９（１５７，８ミリ
モル）を含む溶液（水浴中で冷やす）に、撹拌しながら
３０分間に渡って添加する。水浴中更に２時間、次いで
室温で更に１時間撹拌後、ＴＨＦを減圧下に蒸発させて
緑色油状物を得る。これを酢酸エチル２００ｚ（ｌに溶
解し、この溶液を冷５％（ｖ／　ｖ）水酸化ナトリウム
水溶液１０００ｘｆｆで洗う。有機層を無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥後、減圧下に蒸発乾固する。

生成した残留物を、プレブーバク（Ｐ　ｒｅｐ−Ｐ　ａ
ｋ）５００シリカカラム付属のウォータース・デルタ・
プレグ（Ｗａｔｅｒｓ　　Ｄ　ｅｌｔａ　　Ｐ　ｒｅｐ
）　３０００系（マサチュセッツ州、ミルフォード在、
ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　　Ｃｏｒｐ、　））
を用いるプレパラテイブＨＰＬＯに付し、メタノール：
塩化メチレンＣ２，５：９７．５）で溶離することによ
り精製する。所望の生成物を含む分画を、シリカプレー
ト（Ｗｈａｔｍａｎ）上、薄層クロマトグラフィーに付
し、同−溶媒系で展開することにより生成物を同定する
。これらの分画を合し、減圧下に蒸発乾固し、白色固体
としてＮ１．　Ｎ７−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）
ジエチレントリアミン１１．３９（７１％）を得る。

続く段階において、エタノール２００ｘｆ２中％　Ｎ　
’　＋Ｎ’−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル）ジエチレ
ントリアミン１０．４０９（３４，２９ミリモル）、２
−クロロ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアセトアミド５．１３ｇ（
３４，２９ミリモル）（Ａ　１ｄｒｉｃｈ）およびトリ
エチルアミン３．５４９Ｃ３４，９８ミリモル）の混合
物を、４８時間還流することにより、ジエチルアセトア
ミド基を、ジエチレントリアミン骨格中の中心非保護窒
素に置換する。室温に冷やした後、溶媒を減圧下に蒸発
させ、残留物に酢酸エチル２００ｘＱを加える。この混
合物を濾過し、濾液を５％炭酸ナトリウム水溶液１００
０ｉ１２で洗う。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後
、減圧下に蒸発乾固して黄色油状物を得る。これをＰｒ
ｅｐ−Ｐａｋ５００シリカカラム上プレパラティブＨＰ
ＬＣに付し、メタノール：塩化メチレン（５：９５）で
溶離することにより精製し、所望の生成物を含む分画を
再びシリカプレート上、薄層クロマトグラフィーに付し
、カラムの溶離に用いたものと同一の溶媒混合物中に展
開することにより、生成物を同定する。これらを合して
蒸発乾固し、黄色油状物としてＮ’、Ｎ’−ビス（ｔ−
ブトキシカルボニル）−Ｎ４−（Ｎ、Ｎ−ジエチルカル
ボキサミトメチル）ジエチレントリアミンＩ　Ｏ，７０
９Ｃ７５％）を得る。この物質１　ｏ、ｏ９部分（２４
，０ミリモル）をトルフルオロ酢酸？５ｘＱ中、室温で
２時間撹拌することにより脱保護する。この反応混合物
を蒸発乾固し、残留物に４Ｍ塩酸１００ｘ１２に溶解し
、再び減圧下に蒸発乾固し、白色固体としてＮ’−（Ｎ
、Ｎ−ジエチルカルボキサミトメチル）ジエチレントリ
アミン・二塩酸塩７．４５９（９５％）を得る。

続く反応段階において、水１５ｍｇ中Ｎ’−Ｎ、Ｎ−（
ジエチルカルボキサミトメチル）ジエチレントリアミン
・三基酸塩純品５．０ｇ（１５，３５ミリモル）から成
る溶液を、メタノール５０酎中４−二トロフェニルビル
ビン酸３．１４９Ｃ１５，０１ミリモル）（実施例１で
製せらたもの）から成る溶液に加えることにより、還元
的アミノ化処理を行なう。

得られた混合物を７Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ６。

０に調節し、水素化シアノホウ素ナトリウム１゜４５９
を加える。混合物のｐＨを６Ｍ塩酸で６．０に再調節し
、室温で更に３日間撹拌を続けた後、濃塩酸１５ｊ１１
２を加える。減圧下に蒸発乾固し、得られたオレンジ色
の残留物を水２００ＲＱ中に懸濁し、酢酸エチル１２０
０ｘ（で洗う。水層を蒸発乾固し、黄白色残留物をＰｒ
ｅｐ−Ｐａｋ５００シリカカラム上、プレパラティブＨ
Ｐ　Ｌ　Ｃに付し、メタノール：Ｏ，０１Ｍ酢酸トリエ
チルアンモニウム（２０：８０）で溶離することにより
精製する。所望の生成物を含む分画をシリカプレート上
、薄層クロマトグラフィーに付し、水酸化アンモニウム
２９５％エタノール（２０：８０）中に展開することに
より、同定する。これらの分画を合し、この物質を再び
プレパラティブＨＰＬＣカラムに付し、メタノール：水
（２５ニア　５）で溶離することにより緩衝塩類を除く
。所望の生成物を含む分画を再び薄層クロマトグラフィ
ーで同定し、生成物を合して蒸発乾固する。残留物を４
Ｍ塩酸５０村に溶解し、減圧下に蒸発乾固し、白色固体
としてＮ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（Ｎ”、Ｎ″
−ジエチルカルボキサミトメチル）−Ｎ’−（２’−ア
ミノエチル）−（４−ニトロフェニル）アラニン・二塩
酸塩１．９６ｇ（２５％）を得る。

Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（Ｎ”、Ｎ“−ジエ
チルカルボキサミトメチル）−Ｎ”−（２’−アミノエ
チル）−（４−ニトロフェニル）アラニン・三基酸塩純
品１．０９部分（１，９３ミリモル）を、水２０ｍ（ｌ
ブロモ酢酸１．１６９（８，３３ミ’Ｊモル）を含む溶
液を加え、混合物を４５℃に加温する。この混合物に７
Ｍ水酸化ナトリウムを加えてそのｐ）（を１２に調節し
、７Ｍ水酸化ナトリウムを周期的に加えることによりｐ
Ｈ１２に保持しながら混合物を４５℃で２４時間撹拌す
る。混合物を室温に冷やし、蟲塩酸でｐＨｔに調節する
。混合物を酢酸エチル！５０村で洗い、７Ｍ酸化ナトリ
ウムを加えて水層をｐＨ２に調節する。得られた溶液を
バイオラッドＡＧＩ−Ｘ４カラム（ギ酸型）に適用し、
最初水５００ｘＱ、次いで１．２Ｍギ酸７５０ｘＱで溶
離する。所望の生成物を含む反応混合物をシリカプレー
ト上、薄層クロマトグラフィーに付し、水酸化アンモニ
ウム２９５％エタノール（２０：８０）中に展開するこ
とにより、生成物を同定する。これらの分画を合し、蒸
発乾固して、得られた黄色油状物を４Ｍ塩酸５０ｍ１２
に溶解する。この溶液を蒸発乾固し、白色固体型として
Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）
−Ｎ。

−（Ｎ’、Ｎ”−ジエチルカルボキサミトメチル）−Ｎ
’−（２’−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチ
ル）−（４−ニトロフェニル）アラニン・二塩酸塩０．
６０９（４５％）を得る。

更に続く段階において、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ
　−（２−アミノエチル）−Ｎ“−（Ｎ”、Ｎ“−ジエ
チルカルボキサミトメチル）−Ｎ’−（２°−（ビス（
カルボキシメチル）アミノ）エチル）＝（４−ニトロフ
ェニル）アラニン・二塩酸塩１．１１Ｆ（１，５９ミリ
モル）、水３００１（！およびギ酸３０ｊＩＱから成る
溶液を、触媒として１０％パラジウム／炭素（０，１１
９）の存在下、室温、３５ｐｓｉで２時間水素化する。

混合物をセライトに通して触媒を濾去し、濾液を蒸発乾
固する。残留物を４Ｍ塩酸１００ｍＱに溶解し、減圧上
蒸発乾固し、Ｎ−（カルボキンメチル）−Ｎ−（２−ア
ミノエチル）−Ｎ’−（Ｎ”、Ｎ“−ジエチル−カルボ
キサミトメチル）−Ｎ′−（２°−（ビス（カルボキシ
メチル）アミノ）エチル）−（４−アミノフェニル）ア
ラニン・四基酸塩１゜１９（９８％）を得る。

６Ｍ塩酸［００＋ｌ１２中、Ｎ−（カルボキシメチル）
−Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−（Ｎ”、Ｎ″−ジ
エチルカルボキサミトメチル）−Ｎ’−（２’−（ビス
（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−アミノ
フェニル）アラニン・四基酸塩１．０９（１，４３ミリ
モル）から成る溶液を、６０時間還流する。

反応混合物を室温に冷やした後、減圧下に溶媒を蒸発さ
せ、生成した残留物をバイオラッドＡＧＩ−Ｘ４カラム
（ギ酸型）上、クロマトグラフィーに付し、水、０．１
Ｍギ酸、０．２Ｍギ酸および０゜３Ｍギ酸各４００ｍ（
ｌで順次溶離する。０．３Ｍギ酸中に溶出した所望の生
成物と関連する分画を、シリカプレート上、薄層クロマ
トグラフィーに付し、水酸化アンモニウム；９５％エタ
ノール（２０：８０）中に展開することにより、生成物
を同定する。これらの分画を合して蒸発乾固する。この
残留物を４Ｍ塩酸５０酎に溶解し、減圧下に蒸発乾固し
、白色固体としてＮ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２
−アミノエチル）−Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ’
−（２’−ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）
−（４−アミノフェニル）アラニン・四基酸塩０．２９
（２１％）を得た。

実施例７ 実施例６の４−アミノフェニルキレート化剤を対応する
４−イソチオシアナトフェニルキレート化剤に変換する
。

Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２−アミノエチル）
−Ｎ’−（カルボキシメチル）−Ｎ’−（２°−（ビス
（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４−アミノ
フェニル）アラニン四塩酸塩０．１０ｇ（０，１６ミリ
モル）、３ＭＨＣ１４ｍｌおよび８５％チオホスゲン／
四塩化炭素（Ｖ／Ｖ）０．２ＪＩ１２（２，２３ミリモ
ル）からなる溶液を室温にて６時間撹拌する。四塩化炭
素５ｍｌを追加したのち、水層と有機層を分ける。水層
を減圧蒸発乾固すると、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ
−（２−アミノエチル）−４−イソチオシアナトフェニ
ル）アラニン三塩酸塩０．０９３ｇ（９２％）を得る。

実施例８ ヒドロカルビル基を介して結合するアミン窒素原子と共
に２個のアミンおよび４個のカルボキシメチル金属反応
基を有する本発明のパラ−ニトロフェニル置換二官能性
キレート化剤であるＮ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（
トランス−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）
シクロヘキシル））−４−にトロフェニル）アラニンを
、４−ニトロフェニルピルビン酸とトランス−１，２−
ジアミノシクロヘキサンのシッフ塩基縮合によって得ら
れるイミンの還元、ついでカルボキシメチル化により合
成する。

第１工程で、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサ
ン２．９６ｇ（２５，９ミリモル、アルドリッチ）を、
４−ニトロフェニルピルビン酸５．０ｇ（２３，９ミリ
モル、実施例１と同様にして調製）をメタノール１００
ｘＱに溶かした溶液中に、室温にて添加する。この混合
物を室温で２２時間撹拌し、得られた沈殿をろ取し、メ
タノールで洗浄後、減圧乾燥して２−（トランス−２−
アミノシクロヘキシル）イミド）−３−（４−二トロフ
ェニル）プロピオン酸６．７８ｇを得る。

次工程において、水素化ホウ素ナトリウム０゜２４ｇ（
６，２９ミリモル）をエタノール４ｘ（ｌに溶かした溶
液を、２−（トランス−（２−アミノシクロヘキシル）
イミド）−３−（４−ニトロフェニル）プロピオン酸１
．８３ｇ（６，０ミリモル）および水酸化ナトリウム０
．２ｇのエタノール３５酎中懸濁液に水浴中３０分間、
さらに室温にて３０分間撹拌する。この反応混合物にギ
酸を加えてｐＨ６に調節し、沈殿を生成させる。この沈
殿をろ取し、エタノールで洗浄する。ろ液と洗液を合わ
せ、減圧下に蒸発乾固し、残渣を水に溶かし、ｐｉ−ｔ
ｔｏとする。この溶液を５０％酢酸エチル−５０％ノエ
チルエーテルにて洗浄し、水層をバイオラッドＡＧｌ−
Ｘ４カラム（ホルメート型）でクロマトグラフィに付し
、水２００酎ついで０．０５Ｎギ酸５００１にて溶出す
る。紫外吸収性およびニンヒドリン反応陽性の両分を合
せ、減圧下に蒸発乾固させる。その残渣をメタノールで
トリチュレートし、得られた白色固体を減圧乾燥してＮ
−（トランス＝（２−アミ、ノシクロヘキシル））−（
４−ニトロフェニル）アラニン０．９１ｇを得る。

精製したＮ−（トランス＝（２−アミノシクロヘキシル
））−（４−ニトロフェニル）アラニン０．３ｇ（０，
９９ミリモル）を水２０ｘＱに溶かした溶液を、ブロモ
酢酸０．８７ｇ（６，２９ミリモル）を水４酎に溶かし
た溶液に加える。この混合物に水酸化ナトリウム０．２
ｇを加えてｐＨ１３に調節し、ついでヨウ化ナトリウム
０．０４ｇを加え、その混合物を５７℃に加熱し、２２
時間撹拌する。室温にまで冷却後、反応混合物に５％水
酸化ナトリウム水溶液を加えて再びｐＨ＋３に調節する
。この溶液をバイオラッドＡＧＩ−Ｘ４カラムにてクロ
マトグラフィに付し、水７５酎、０．２Ｍギ酸２５０Ｒ
１２，１，０Ｍギ酸５００ｉ１２および５．０Ｍギ酸２
５０ｘＱにて順次溶出する。目的化合物は５Ｍギ酸で溶
出され、その紫外線吸収性画分を合せ、蒸発乾固してＮ
−（カルボキシメチル）−Ｎ−（）ランス−（２−（ビ
ス（カルボキシメチル）アミノ）シクロヘキシル））−
（４−二トロフェニル）アラニン０゜０２ｇを得る。

実施例９ 実施例３で得た４−イソチオシアナトフェニルキレート
化剤（ＮＣ９−化合物Ａ）を抗ＣＥＡモノクローナル抗
体に結合し、得られた結合体を従来技術で得られたもの
と比較した。従来技術のものは、ナトウィッチらの文献
［Ｈｎａｔｏｖｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ　、　　Ｉ　ｕ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈ、、６５．１
４７（１９８３）］に記載されているように、タンパク
質をＤＴＰＡの２環無水物と反応させることによってそ
のタンパク質分子にジエチレントリアミンテトラアセテ
ート（ＤＴＴＡ）残基を組み込んである。上記抗体はＩ
ｇＧ＋サブタイプの免疫グロブリンであり、ＩＯ’Ｌ、
１モルよりも多いときに一定の親和性でＣＥＡに結合し
、非特異的交差反応性抗原１（ＮＣＡＩ）とは反応しな
い。抗体はＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスで産生させ、
プロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ（シグマ・ケミカ
ル、セント・ルイス、ＭＯ）上のアフィニティークロマ
トグラフィーにより腹水から単離した。０．１Ｍ　　Ｋ
Ｈ，ＰＯ，１０，１５Ｍ　　ＮａＣ１１０，０５Ｍ　　
ＨＰＥＳ（ｐＨ７，２）に対し徹底的に透析した後、抗
体濃度を１．０ｍｇ／ｉ１に調節し、その溶液を必要な
ときまで２〜８℃で保存した。抗体濃度はブラッドフォ
ード色素結合アッセイ（バイオ・ラド・ラボラトリーズ
、リッチセント、ＣＡ）により測定した。これは製造業
者の説明書に従って行った。すべてのバッファーは、１
８メガオームまたはそれより大きい抵抗率に精製したＭ
ＩＬＬＩ−Ｑシステム（ミリボアコーポレーション、ベ
ッドフォード、ＭＡ）からの水を用いて調製した。抗体
溶液は、必要なときは名目上の分子量の遮断が１０，０
００ダルトンの膜を備えた超濾過セル（アミコン・コー
ポレーション、デンバー、ＭＡ）を用いた超濾過によっ
て濃縮した。

抗体はミアーズらの文献［Ｍｅａｒｅｓ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、。

Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、、　１４２．６８（１
９８４）］に記載された一般的な手順に従って、実施例
３の４−イソチオシアナトフェニルキレート化剤に結合
した。モノクローナル抗体ｌｏｌ＋Ｉｇを０．１Ｍ　　
ＫＨｔＰＯ，１０，１Ｍ　　ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ８，５
）に対し約２〜約８℃で一夜透析することによってバッ
ファー交換した。抗体溶液の濃度を１　、　Ｏｍｇ／ｍ
ｌに調節した後、Ｎ−（カルボキシメチル）−Ｎ−（２
−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−（４
−イソチオシアナトフェニル）アラニン２塩酸塩を加え
て抗体に対してキレート化剤が５００倍モル過剰となる
ようにした。そのキレート他剤／抗体溶液をついで３７
℃で３時間インキュベートし、得られた結合体（以下、
抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ａという）を０．０５Ｍクエ
ン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）に対し約２〜約８℃で４
８時間透析した。

ついでその結合体溶液を必要なときまで一２０℃で保存
した。

抗体・キレート他剤結合体における抗体１モル当たりの
キレート化剤のモル数で表したキレート化剤の平均置換
率を、ミアーズら（上述）の放射コバルト結合アッセイ
法により測定した。この方法による結果によれば、抗Ｃ
ＥＡ−ＮＣＳ−化合物へ結合体は抗体当たり平均２〜４
個のキレート化剤を含有していた。

抗体・キレート化剤の分子間集合体の生成は、レムリら
［Ｌａｅｍｍｌｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、
　　２２７．６８０（１９７０）］の方法により１０％
スラブゲル上の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定した。ゲルをクマシーブルーで染色し、免疫グ
ロブリンのＬ鎖およびＨ鎖に特徴的なもの以外のバンド
が存在しないかどうか調べた。ペインら［Ｐａ１ｋ　　
ｅｔ　　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、、２４
．１１５Ｂ（１９８３）］に記載されているように、架
橋物質の存在はゲルの方へほとんど移動しないバンドの
存在によって示すことができ、モノマー性の抗体・キレ
ート他剤結合体から生じた２本のバンドから十分に単離
することができた。この手順によって抗ＣＥＡ−ＮＣＳ
−化合物へ結合体には架橋が存在しないことが明らかと
なった。

本発明の２官能性化合物Ａ結合体を従来技術により製造
した同じ抗ＣＥＡモノクローナル抗体のキレート免疫結
合体を比較するために、二つのＤＴＴＡ結合体を調製し
た。すなわち、抗体１モル当たりのキレート化剤のモル
数での置換が匹敵し得るレベルである第１のものと、架
橋が匹敵し得る低いレベルである第２のものである。こ
の手順に従って、抗体を０．１Ｍ　　ＮａＨＣＯｓｌｏ
、０５Ｍ　　ＨＰＥＳ（ＰＨ８，２）からなる溶液に対
し一夜透析することによってバッファー交換した。つい
で抗体濃度を１　、０　ｍｇ／ｍｌに調節し、得られた
溶液を０〜５℃に冷却し、ＤＭＳＯ中のＤＴＰＡの２環
式無水物（シグマ・ケミカル、セント・ルイス、ＭＯ）
の飽和溶液を抗体溶液に滴下しながら撹拌した。反応混
合物のｐＨは添加の間を通して精密にモニターし、０゜
０５Ｍ　　ＮａＯＨを加えることによって８．２に維持
した。混合を完了した後、塩基を加え続けてＰＨを８．
２に維持しながら０〜５℃でさらに１５分間撹拌した。

得られた結合体を０．０５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ
６，０）を何回も取り替えて約２〜約８℃で２日間透析
し、ついで必要なときまで一２０℃で保存した。この反
応が抗体に対して２環式ＤＴＰＡ無水物が６００＝１モ
ルの過剰量で行なわれたときは、得られた結合体は抗体
１モル当たり平均５個のキレート化剤（以下、抗ＣＥＡ
−ＤＴＴＡ（５，０）という）を含んでおり、それゆえ
その置換レベルにおいて抗ＣＥＡ−ＮＣＳ化合物Ａ結合
体に匹敵するものであった。しかしながら、ゲル電気泳
動法による検出では抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５，０）結合
体には実質的にモノマー性の免疫グロブリンは認められ
なかった。カブプリング反応が抗体に対して２環式ＤＴ
ＰＡ無水物が１００＋１の過剰量で行なわれたときは、
得られた結合体はごく少量の架橋物質を含んでいること
が電気泳動によって示され、平均の置換が抗体！モル当
たり０．５個のキレート化剤を含んでいる（以下、抗Ｃ
ＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）という）ことが放射コバルト
結合アッセイによりわかった。

実施例１０ 本実施例では実施例９の結合体を酵素結合抗体免疫アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）法により評価し、結合体によって保
持された免疫反応性の程度を遊離の形のものと比較して
測定した。９６のウェルマイクロタイタープレート（Ｉ
　ｍｍｕｌｏｎＴ　Ｍｓダイナチク・ラボラトリーズ・
インコーホレーテッド、アーリントン、ｖＡ）を、各ウ
ェルにｌθミリモルＴｒｉｓ中に抗体１．０μｇを含有
する溶液０．１ｍｌをインキュベートすることによって
精製ＣＥＡでコーティングした。室温で一夜インキユベ
ートした後、ウェルを空にし、脱イオン化水で２回洗浄
した。ついで各ウェルを、０．１Ｍリン酸バッファー規
定食塩水（ｐＨ７、４）中のウシ血清アルブミン（シグ
マ・ケミカル、セント・ルイス、ＭＯ）の０゜１％ｗ／
ｖ溶液で室温で２時間インキュベートすることによって
さらにコーティングした。そのコーティングプレートを
、各ウェルに第２のコーティング溶液の０．１ｍｌアリ
コートを入れた状態で使用のときまで２〜８℃で保存し
た。使用する直前にプレートを空にし、各ウェルを脱イ
オン化水で５回洗浄した。

ついでタンデムＥＬＩＳＡアッセイを、各抗体・キレー
ト他剤結合体とその結合体を調製した天然の（誘導体に
していない）抗体とについて行った。

両アッセイは同じマイクロタイタープレート上で行い、
初期タンパク質濃度を２．ｊｌ＋ｇ／ａ＋１に調節した
溶液の２倍系列希釈を用いた。各抗体調製物につき各濃
度で２個のウェルを用いた。

このアッセイの手順に従って、０．１Ｍ！Ｊ：ｚ酸バッ
ファー規定食塩水０．０５ｓｌ中のウシ血清アルブミン
（１，０％Ｗ／Ｖ）およびツイーン（シグマ、０．１重
量％）の溶液を各ウェルに加え、ついで抗体調製物０．
０５ｍ１を加えた。そのプレートをついでカバーし、３
７℃で１時間インキュベートし、ついで空にし脱イオン
化水で５回洗浄した。ついで西洋ワサビペルオキシダー
ゼに結合させたヤギ抗体マウス抗体（キルケガール・ア
ンド・べり−・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド
、ゲイタースブルク、ＭＤ）０．０６　ｔｔｇ／ｍｌ、
１．０％ウシ血清アルブミン、０．１％ツイーンおよび
０．１Ｍリン酸バッファー規定食塩水（ＰＨ７，４）を
含む溶液の０．ｉｏ＋ｌアリコートを各ウェルに加えた
。

ついでそのプレートをカバーし、３７℃で１時間インキ
ュベートした。空にし脱イオン化水で５回洗浄した後、
前辺て調整したキット（アボット・ラボラトリーズ、ノ
ースジカゴ、ＩＬ）から製造業者の説明書に従って調製
した０−フェニレンジアミン溶液のアリコート０　、１
　ｍｌを各ウェルに加えた。そのプレートをついで室温
暗がりで１５分間インキニベートし、各ウェルに加えて
酵素反応を停止させた。各ウェルに生じた色をマイクロ
タイタープレート読み取り器（ミニリーダー■、ダイナ
チク）を用いて４９０ｎｍで読み取った。

ついで４９０ｎｍでの２回の平均光学濃度を抗体濃度に
対してプロットすることによって抗体滴定曲線を作成し
、結合体の曲線を非結合の抗体の曲線と比較した。結合
体の吸光度を５０％滴定での天然抗体の吸光度のパーセ
ントとして表すことによって、標識後に保持された免疫
反応性の半定量的評価を得ることができた。

第１ａ図、第１ｂ図および第１ｃ図に示したＥＬＩＳＡ
アッセイの結果によれば、抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５
）結合体が非結合抗体に比べて免疫反応性を良く保持し
ていることがわかる。一方、抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５，
０）結合体は非結合抗体に比べてほとんど活性を保持し
ていない。ＥＬＩＳＡプロットは、抗体分子当たり平均
４．０個のキレート化剤を有する抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化
合物Ａ結合体が非結合の抗体に近い有意の免疫反応性レ
ベルを保持していることを示した。置換の程度が増加し
ても、抗体当たりのキレート化剤数が約１０に達するま
で抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ａ結合体は免疫反応性の有
意の低下を示さなかった。この点を越えると、ＣＥＡに
結合する能力の連続的な低下をきたす。

実施例１１ 本実施例では、実施例７の４−イソチオシアナトフェニ
ルキレート化剤（ＮＣＳ化合物Ｂ）を実施例９で用いた
のと同じ抗ＣＥＡモノクローナル抗体に結合させた。こ
れは抗体１０ｍｇを０．１ＭＫＨ１ＰＯ４１０，１Ｍ　
　ＮａＨＣＯｓ（１）８８．５）に対して約２〜約８℃
で一夜透析することによって行った。抗体濃度を１０ｍ
ｇ／ｍｌに調節し、ついで固体のＮ−（カルボキシメチ
ル）−Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ′−（カルボキシ
メチル）−Ｎ′　−（２′　＝（ビス（カルボキシメチ
ル）アミノ）エチル）−（４−イソチオシアナトフェニ
ル）アラニン３塩酸塩を加え、キレート化剤が免疫グロ
ブリンに比べて２５倍モル量過剰になるようにした。穏
やかに混合すると固体キレート化剤は溶解して透明で均
一な溶液を得、これを３７℃で３時間インキュベートし
た。得られた結合溶液を０．０５Ｍクエン酸ナトリウム
１０．０１Ｍ　　ＤＴＰＡ（ｐＨ６，０）に対して約２
〜約８℃で２４時間透析し、ついで０．０５Ｍクエン酸
ナトリウム（ｐＨ６，０）に対して約２〜約８℃でさら
に２４時間透析した。この抗ＣＥＡモノクローナル抗体
結合体（以下、抗ＣＥＡ−ＮＣＳ＝化合物Ｂという）を
実施例９および１０に記載した方法で分析すると、分子
間の凝集はなく、抗体当たりキレート化剤の平均置換数
が１３であり、免疫反応性を完全に保持していることが
わかった。

５実施例１２ 本実施例では、実施例９．１０および！１の抗ＣＥＡモ
ノクローナル抗体を開裂して対応するＦ（ａｂ’　）！
断片を得、ついでこれを実施例３の４＝イソチオシアナ
トフエニル（ＮＣ３−化合物Ａ）キレート化剤に結合し
た。抗体の消化は、ファームらの文献［Ｐ　ｈａｒＩＩ
ｌｅｔ　　ａｌ、　、　Ｊ　、　　Ｉ　＋ｕｕｎｏｌｏ
ｇｙ。

１３１．２８９５（１９８３）］に記載の一般的方法に
従って行った。すなわち、リン酸バッファー食塩水（ｐ
Ｈ７、２）中の濃度２ｍｇ／ｍｌの抗体１０ｍｇを１．
０Ｍクエン酸（ｐＨ３、５）　１　、６６　ｍｌに加え
た。

ついでこの溶液にリン酸バッファー食塩水：クエン酸（
９：１．ｖ／ｖＳｐＨ３，７）中のペプシン０．２５ｍ
ｇ／ｍｌの溶液０．８３ｍ１に加え、さらにリン酸バッ
ファー食塩水（ｐＨ７，２）をさらに１．６６ｍ１加え
た。得られた混合物を３７℃で１６時間インキュベート
し、ついで１．０Ｍ　　Ｔｒｉｓｌ、６６ｍｌを加えて
ペプシンを不活性化した。その溶液をプロティンＡ−セ
ファロースカラム（ファルマシア、ニューシャーシー）
に通して完全な免疫グロブリンおよびＰｃ断片を除き、
ついで溶出液をバイオ・ゲルＰ−１００カラム（バイオ
・ラド）上のクロマトグラフィーにかけて免疫グロブリ
ンをペプシンから分離した。所望のＦ（ａｂ’）を断片
をこのカラムからボイド容積中に溶出させた。

つぎの工程では抗ＣＥＡモノクローナル抗体からのＦ（
ａｂ’）を断片を０．１Ｍ　　ＫＨ，ＰＯ，１０゜Ｉ　
Ｍ　　ＮａＨＣＯ５（ｐＨ８、５）に対して約２〜約８
℃で一夜透析した。断片の濃度を１　、３３　ｍｇ／ｍ
ｌに調節し、ついで固体のＮ−（カルボキシメチル）−
Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル
）−（４−イソチオシアナトフェニル）アラニン２塩酸
塩を断片の全２　、０　ｍｇに加えて最終的に抗体断片
に対してキレート化剤が２５０倍モル過剰になるように
した。固体のキレート化剤が溶解した後、得られた溶液
を３７℃で３時間インキュベートし、ついで０．０５Ｍ
クエン酸ナトリウム１０、ｏ　ＩＭ　　ＥＤＴＡ（＋）
Ｈ６，０）に対して約２〜約８℃で２４時間透析し、つ
いで０．０５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）に対
して同じ温度で２４時間透析した。得られた結合体（以
下、抗ＣＥＡ　　Ｆ（ａｂ’　）ｚ　　ＮＣ５−化合物
Ａという）を実施例９に記載の方法で分析したところ、
Ｆ（ａｂ’　）ｙ断片当たりキレート化剤の平均置換が
！であり、電気泳動では凝集物質は認められなかった。

断片およびそのキレート化結合体の免疫反応性を実施例
１０に記載の方法をほとんどそのまま用いることによっ
て評価した。ただし、この方法では実施例１０で発色に
用いた西洋ワサビベルオシダーゼに結合したヤギ抗体マ
ウス抗体の代わりにマウス免疫グロブリンのし鎖に特異
的なりギ抗体の西洋ワサビベルオシダーゼ結合体（クー
パー・バイオメディカル、モールパン、ＰＡ）を用いた
。このようにしてアッセイしたとき、キレート化結合体
の免疫反応性は誘導体にしていない断片と同じであった
。

実施例１３ 本実施例では、腫瘍関連グリコプロティン（ＴＡＧ−７
２）を認識するモノクローナル抗体Ｂ７２．３（シュロ
ムらの文献［Ｓｃｈｌｏｍ　　ｅｔ　　ａｌ、、　Ｉ　
ｎｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９．５３８（１９８２）］に
詳細に記載されている）を実施例３の４−イソチオシア
ナトフェニルキレート化剤に結合した。その抗体をまず
抗体濃度１０ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ　ＫＨｔＰＯ。

１０．１Ｍ　　ＮａＨＣＯａ（ｐＨ８，５）に対して約
２〜約８℃で一夜透析した。ついで得られた抗体溶液の
アリコート１０ｍ１を、上記と同じリン酸／重炭酸塩バ
ッファー６２μｌに溶解したＮ−（カルボキシメチル）
−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチ
ル）−（４−イソチオシアナトフェニル）アラニン３塩
酸塩１ｍｇと混合した。その結果、キレート化剤；抗体
の比は２０：ｌであった。３７℃で３時間インキュベー
トした後、その結合体を０．０５Ｍクエン酸ナトリウム
１０．０１Ｍ　　ＥＤＴＡ（ｐＨ６，０）に対して約２
〜約８℃で２４時間透析し、ついで０．０５Ｍクエン酸
ナトリウム（ｐＨ６，０）に対して２４時間透析した。

得られた免疫結合体を実施例９に記載の方法により分析
したところ、抗体当たりのキレート化剤の平均置換が１
であり、架橋物質は全く存在しないことがわかった。８
７２．３の免疫反応性を実施例１Ｏ記載のＥＬＩＳＡ法
をほとんどそのまま用いて測定した。

ただし、マイクロタイタープレートはＣＥＡではなくウ
シ下顎ムチン（Ｂ７２．３と交差反応し、容易に入手可
能、クーパー・バイオメディカル）でコーティングし、
その場合のコーティング溶液は１０ミリモルＴ　ｒｉｓ
（ｐＨ７、４）中にムチンＩＯμｇを含んでいた。別の
方法では、洗浄工程で脱イオン化水の代わりに０．１Ｍ
　　ＫＨ＊ＰＯ−１０，１５Ｍ　　ＮａＣ１（ｐＨ７，
，４）用いたほかは実施例ＩＯの手順にそのまま従った
。このようにしてアッセイしたところ、キレート結合体
Ｂ７２．３（以下、Ｂ７２．３−ＮＣ５−化合物Ａとい
う）の免疫反応性が、誘導体にしていない抗体の約５０
％であることがわかった。

実施例１４ 本実施例では、実施例５の４−（２−アミノエチルチオ
ウレア）−フェニルキレート化剤（アミノエチルＮＣ８
−化合物Ａ）を非タンパク質性基質であるポリ（グルタ
ミン酸）に結合した。１分子当たり平均９０のグルタミ
ン酸塩残基を含有し平均分子量が１４，０００ダルトン
であるポリ（グルタミン酸）のナトリウム塩２．３Ｉ１
ｇ（０，１６ミリモル、シグマ・ケミカル、セント・ル
イス、ＭＯ）を乾燥ジメチルホルムアミド０．３ｍｌに
溶解した。４−メチルモルホリン１．５ｍｇ（１４，８
ミリモル）を加え、その溶液を水浴中で冷却した。この
撹拌溶液にイソブチルクロロホルメート２．０ｍｇ（１
４゜８ミリモル）を加え、その混合物を水浴中で１時間
撹拌した。ついで４−メチルモルホリンをさらに４．５
μ＋ｇ（４４，４ミリモル）加え、その後Ｎ−（カルボ
キシメチル）−Ｎ−（２−（ビス（カルボキシメチル）
アミノ）エチル）−（４−（Ｎ’　　−（２−アミノエ
チル）チオウレア）フェニル）アラニン３塩酸塩１０、
Ｏｎ＋ｇ（１４，８ミリモル）を加え、得られた混合物
を室温で一夜撹拌した。その反応混合物を０゜ｌ　Ｍ　
　ＮａＨｔＰ　Ｏ−（ｐＨ７、Ｏ）を用いて全容量５゜
０ＩＩ１１まで希釈し、名目上の分子量の分離が２．０
００ダルトンである透析チューブ（スペクトラム・メデ
ィカル・インダストリーズ・インコーホレーテッド、ロ
サンジェルス、ｌ０Ａ）を用いて同じバッファーに対し
て徹底的に透析し、ついで脱イオン化水に対して透析し
た。得られた溶液を凍結乾燥してポリ（グルタミン酸）
鎖当たり２０〜３０キレート残基を含有する結合体を得
た。

実施例１５ 本実施例では、抗ＣＥＡ免疫結合体をガンマ線放射イン
ジウムＩＩ＋で標識し、その生体内分布を、高いＣＥＡ
レベルを示すヒト結腸直腸癌株ＬＳＩ７４Ｔの異種移植
を有するヌードマウスで調べた。

抗体・キレート他剤結合体には、実施例９による抗ＣＥ
Ａ−ＤＴＴＡ（０，５）結合体、抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（
５，０）結合体および抗ＣＥＡ−ＮＣ８−化合物Ａ結合
体を含んでいた。各結合体をインジウム１′で標識した
。この場合、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，
０）に１　、０　ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体・キレート他
剤結合体のアリコート０．１１１１１をプラスチック製
のミクロ試験管に移し、６Ｎ）（ＣＩを加えてｐ［（を
４．５〜５．０に調節した。その結合体溶液に０．０４
Ｍ　　ＨＣｌ中のキャリヤーなし”’ＩｎＣ１５（約５
０〜４００　ｔａｃ　ｉ／ｎ＋１．一般的には約８０ｍ
Ｃ１／ｍ１％ＮＥＮ−デュポン）６μ＋を加え、６Ｎ　
　ＮａＯＨを加えてそのｐＨを再び７゜０に調節した。

その溶液を室温で約３０分間インキュベートした後、未
結合インジウムＩ１１をミアーズらの文献［Ｍｅａｒｅ
ｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１
４２．６８、（１９８４）］に記載の遠心分離ゲル濾過
カラム法により放射活性の結合した抗体から分離した。

ＩｏｏＸｇで２分間遠心分離したセファデックスＧ−５
０ミクロカラムから溶出した放射標識結合体を規定食塩
水中に希釈して最終濃度をＩＯμｇ／ｍｌにした。実施
例ＩＯに記載したようにしてＥＬＩＳＡアッセイを行っ
たところ、インジウムＩ１１標識手順の間中に免疫反応
性の損失は認められなかった。

動物に注射するに先立って、この溶液のアリコート２０
μｌを０．１Ｍ　　ＥＤＴＡ溶液ｌＯμｌとともに室温
で２０分間インキュベートした。ついで標識の特異性を
ミアーズらの方法に従って薄層クロマトグラフィーで評
価した。これは放射コバルト結合アッセイの場合と同じ
条件で行った。ＥＤＴＡの攻撃にもかかわらず、すべて
の場合においてインジウムＩｌ＋活性の９０％以上が抗
体に結合したまま残った。一般に特異活性２〜３　ｍｃ
　ｉ／ｍｇタンパク質の結果が得られた。

メス無胸腺ヌードマウス（Ｂ／　ｎｕ、　Ｂ　Ａ　Ｌ　
Ｂ　／Ｃバックグラウンド、チャールズ・リバー・バイ
オテクノロジー・サービシイズ・インコーホレーテッド
、ウィルミントン、ＭＡ）を用意し、ＬＳ１７４Ｔヒト
結腸直腸癌細胞（規定食塩水０．１ｍｌ中に１．２５Ｘ
１０＠〜２．５ｘｌＯ’細胞）を右後部脇腹に皮下注射
して生体内分布を調べた。１〜２週間以内に腫瘍が発生
し、大きさは０．４〜０゜８ｇに達した。

ついで処理群の動物を無作為にグループ分けしく通常一
群５匹）、規定食塩水０．１ｒａｌ中の３種の標識抗体
結合体の一つ１．０ｇｇを尾静脈から静脈内注射した。

注射後の種々の時間に頚部脱臼により層殺し、すべての
内臓を取り、重さを測り、つイテガンマカウンター（Ａ
ＵＴＯ−ＬＯＧ　Ｉ　Ｃガンマカウンター、アボット・
ラボラトリーズ）中でカウントした。血液、筋肉および
皮膚のアリコート（重量測定）もカウントした。またそ
の動物死体の残部も同様にカウントした。尾は注射部位
での溢血をチェックするために別にカウントし、コント
ロールに放射ヨード処理した抗体を用いたときには甲状
腺の取り込みを評価するために頭部を別にカウントした
。注入物質のアリコート０．１ｍｌを組織と同時にカウ
ントし、ついで各組織で測定した放射活性を組織１ｇ当
たりのこの注入投与量のパーセントで表した。

コントロールについては、右脇腹にＣＥＡ抗原陽性腫瘍
を有する動物の左後部脇腹に抗原陰性腫瘍を移植するこ
とによって実験した。Ｍ［Ａ　　ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ
１４２０ヒト膵臓癌株は評価できる程のＣＥＡを表さな
いので、この目的に用いた。抗ＣＥＡ抗体のＬＳ　Ｉ　
７４Ｔ異種移植中への取り込みは、ＭＩＡ癌の場合より
も約８〜１０倍大きかった。他のコントロールとして、
抗アルファフェトプロティンＩｇＧ、ヨウ素１１６で標
識したモノクローナル抗体を用いて実験した。標識は５
〜１０ｍＣ１／ｍｇの特異活性に対してクロラミン−Ｔ
法を用いて行った。これらの実験によって、ＣＥＡ非特
異的抗体の取り込みは抗ＣＥＡ抗体の取り込みよりも小
さいことがわかった。これらの実験におけるタンパク質
の注射量および解剖やカウントの手順は、インジウム標
識試薬について上述したものと同じである。抗ＣＥＡ抗
体のＬＳＩ７４腫瘍中への取り込みの経時的測定によっ
て腫瘍／血液比が２日後に最大に達することがわかった
ので、これをキレート他剤結合体の実験のための期間と
して選んだ。

生体内分布の実験の結果を第１表および第２表に示す。

第１表では、実施例３の抗ＣＥＡ−ＮＣ８−化合物Ａ結
合体を従来技術の抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５，０）結合体
と比較している。抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５，０）結合体
にみられる低い免疫活性と広範な架橋は、腫瘍の取り込
みが小さいことおよび肝臓への蓄積が増大していること
と相関関係にある。本発明による抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化
合物Ａを投与された動物における平均の腫瘍／肝臓比は
２．５０±１．２４であった。これは平均腫瘍／肝臓比
が０．９２±０．２８であった抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５
，０）結合体に比べてかなり高い値（２列スチューデン
トを検定（ａ　ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ　５ｔｕｄｅｎｔ
’ｔ　ｔｅｓｔ）によればｐ＜０．０５）であった。

第１表　組織ｔｇ当たりの注入投与量の％第２表　組織
１ｇ当たりの注入投与量の％上記第１表および第２表に
おけるすべての値はｎ＝５の平均（±ＳＤ）で表した。

第２表では、実施例９の抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ａ結
合体を抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）結合体と比較した
。置換レベルにおいては８倍の違いがあったとしても、
これらの結合体を免疫反応性の等価レベルで比較した。

平均の腫瘍／肝臓取り込み比に有意の差は認められなか
ったが（抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）結合体の２．５
６±０．４３に対し本発明の結合体が２．５０±１．２
４であった）、絶対的な腫瘍の取り込みは抗ＣＥＡ−Ｄ
ＴＴＡ（０，５）結合体が有意に大きかった。しかしな
がら同時に、他のほとんどの体内器官への取り込みは抗
ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）結合体が高かったが、これ
は４８時間の時点での放射活性の体全体での保持を反映
しており、このとき抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）結合
体の方が本発明の結合体よりも有意に高かった（１）＜
０．００１）。従って、体全体の放射活性のパーセント
として表した腫瘍中の放射活性の絶対量はラジオイムノ
イセラピーのモデル化のための重要な指標であるが、抗
ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）結合体は本発明の抗ＣＥＡ
−ＮＣＳ−化合物Ａ結合体よりも有意に大きくなかった
。

第３表 （インジウム■１−抗ＣＥＡ−結合体）上記第３表にお
いてすべての値はｎ＝５の平均（±ＳＤ）で表しである
。

第３表は、ＬＳＩ７４Ｔ腫瘍を存するヌードマウスにお
ける活性の全体内保持との相関におけるインジウム■１
標識抗ＣＥＡ−結合体の腫瘍取り込みを示している。腫
瘍の取り込みおよび全体内活性は、結合体のヌードマウ
スへの静脈内注射後４８時間で屠殺して測定した。屠殺
時の動物の腫瘍重量は平均してほぼ等しく、かなり狭い
範囲にあった。このことは重要である。というのは、大
きなＬＳ　Ｉ　７４Ｔ腫瘍は壊死性になる傾向があって
、その結果取り込みは小さくなり、一方重量が１００ｍ
ｇ未満の皮下ＬＳＩ７４．Ｔ異種移植はしばしば血管分
布をすることがほとんどなくて、その結果らまた取り込
みが小さくなるからである。従って腫瘍の大きさは、た
とえ単位重量に基づいて標準化したとしても腫瘍の取り
込み値に影響を与え得る。

実施例１６ 本実施例では、インジウム１１放射標識および実施例１
５に記載したヌードマウス異種移植モデルを用い、実施
例１１の抗ＣＥＡ、−ＮＣＳ−化合物Ｂ結合体の生体内
分布を調べた。実施例１１の抗ＣＥＡ−ＮＣ９−化合物
Ｂ結合体を実施例１５記載の方法によりインジウムＩＩ
Ｉで標識し、ＬＳＩ７４Ｔ異種移植を有するマウスにマ
ウス当たり結合体１．０μｇの投与量で注射した。実施
例！５に記載のごとく注射後４８時間で得た生体内分布
データを第４表に示す。

第４表 上記第４表において、すべての値はｎ＝５の平均（±Ｓ
Ｄ）で表しである。

抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ｂ結合体の生体内分布データ
を実施例１５の結合体と比較すると、抗ＣＥＡ−ＮＣＳ
−化合物Ｂの腫瘍取り込みは抗ＣＥＡ−ＮＣ８−化合物
Ａおよび抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）よりも大きくは
ないが、肝臓の取り込みおよび４８時間の時点での放射
活性の血液レベルは両方とも抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物
Ｂが驚く程低いことが明らかである。その結果、抗ＣＥ
Ａ−ＮＣ８−化合物Ｂで処理した動物の腫瘍／肝臓取り
込み比（５，３±１．７）は、本発明の抗ＣＥＡ−ＮＣ
８−化合物Ａ結合体（２，５±１．２、ｐ〈０゜０１）
かまたは従来技術の抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０゜５）結合
体（２，６±０．４、ｐ＜０．００１）を投与された動
物よりも有意に高くなる。同様に抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化
合物Ｂの腫瘍／血液取り込み比（３，４０±１．１５）
は、抗ＣＥＡ−ＮＣ９−化合物Ａ（２，１５±０．４９
、ｐ＜０．０５）よりも有意に高くなる。

１１表 上記第５表において、すべての値はｎ＝５の平均（±Ｓ
Ｄ）で表わしである。

第５表は、ＬＳＩ７４Ｔ腫瘍を有するヌードマウスの注
射後４８時間における活性の全体内保持との相関におけ
るインジウム１１放識抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ｂの腫
瘍取り込みを示している。

第５表のデータを実施例１５の第３表のデータと比較し
たとき全体内放射活性の％として表した腫瘍中の放射活
性の絶対量は実施例１５の結合体よりも抗ＣＥＡ−ＮＣ
９−化合物Ｂ結合体の方が高いことを示唆しているよう
だが、この差は統計的に有意のものではなく、おそらく
抗ＣＥＡ−ＮＣ８−化合物Ｂを投与された動物の方が平
均腫瘍重量が大きいことを反映しているものと思われる
。

実施例１７ 本実施例では、インジウム１１放射標識および実施例１
５に記載したヌードマウス異種移植モデルを用い、実施
例１２の抗ＣＥＡ　　Ｆ（ａｂ’　）！−ＮＣＳ−化合
物Ａの生体内分布を調べた。その結合体を実施例１５記
載の方法によりインジウムＩｌｌで標識し、ＬＳＩ７４
Ｔ異種移植を有するマウスにマウス当たり結合体１．０
μｇの投与量で注射した。実施例１５に記載のごとく注
射後４８時間で得た生体内分布データを第６表および第
７表に示す。

第６表 第７表 上記第６表および第７表において、すべての値はｎ＝５
の平均（±ＳＤ）で表わしである。

腎臓クリアランスを反映した高い腎臓取り込みを除いて
、抗体断片の生体内分布と完全な抗体の対応結合体（実
施例１５）の生体内分布の間の最も顕著な違いは、予想
されるように、４８時間の時点で血液中に残っている放
射活性が非常に低いレベルにある点である。このことは
腫瘍／血液比が１４．５±３．３という結果となり、こ
の結果は実施例１５および★施例１６のいずれの完全な
抗体の結合体にみられるものよりもはるかに上回ってい
る。このような血液のバックグラウンドに比較して高い
腫瘍レベルの対比を得ることができ、従って注射後の早
い時期に腫瘍の見当がつけられ得ることは、抗体断片を
使用することから得ることができる主要な利点である。

細胞毒性の放射性金属を用いた治療を試みるときに存り
得る不利益としては、腫瘍中への放射活性の絶対的な取
り込みが完全な抗体の結合体にみられるものよりも実質
的に低いことである。このことは、腫瘍活性を４８時間
の時点における全体内放射活性の％として表したときに
も、これが完全な抗体の結合体を投与した動物における
活性の全体内保持よりも約４倍低いにもかかわらず、依
然として当てはまる。

実施例１８ 本実施例では、実施例１３のＢ７２．３−ＮＣ８−化合
物Ａ結合体をインジウム１１で標識し、一方の脇腹にＴ
ＡＧ−７２陽性腫瘍（ＬＳ１７４Ｔ）［チーナンらの文
献［Ｋｅｅｎａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｊ。

Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　、２５．１１９７（１９８４）
］参照］を有し他方の脇腹にＴＡＧ−７２陰性異種移植
（この目的のためにメラノーマ株Ａ３７５を用いた）を
有するヌードマウスで経時的に試験を行った。

このモデルはコルヒャーらの文献［Ｇｏｌｃｈｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、、４４．５７４
４（１９８４）］およびプレッヒビールらの文献［Ｂｒ
ｅｃｈｂｉｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒ　ｎｏｒｇ、　Ｃ
ｈｅ＋ｓ、、２５．２７７２（１９８６）］に詳しく記
載されている。インジウム　ＩＩＩでＢ７２．３−ＮＣ
５−化合物Ａ結合体を標識する方法および生体内分布手
順は実施例１５に記載した方法と同じである。結合体１
．０μｇを各動物の尾静脈からゼロ時点で投与し、つい
で一群のマウスを注射後２４時間、７２時間、１２０時
間および１６８時間で連続的に屠殺した。その結果を第
８表に示す。

第８表 上記第８表において、すべての値はｎ＝５の平均（±Ｓ
Ｄ）で表しである。

腫瘍の取り込みは２４時間の時点で最大であり、その後
ゆっくりと減少していった。放射活性の血液レベルは一
層急激に減少していき、その結果、腫瘍／血液比は試験
の全期間を通じて連続的に増加していった。肝臓、膵臓
および腎臓の取り込みは２４時間の時点ではそれほど大
きくなくその後も有意には増加しなかった。他のすべて
の器官への取り込みは注目に値しなかった。

実施例１９ 本実施例では、キレート他剤エチレングリコールビス（
２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　。

Ｎ′−テトラ酢酸（Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａ）のバラニトロフェ
ニル置換２官能性誘導体を、１，８−ジアミノ−３゜６
−ジオキサオクタンをｐ−二トロフェニルピルビン酸を
用いて還元的アルキル化しついで得られた生成物をカル
ボキシメチル化することによって製造した。

メタノール５ｍｌ中に４−二トロフェニルビルビン酸０
．２１ｇ（１，０ミリモル）を含有する溶液に、水１ｍ
ｌ中に１．８−ジアミノ−３，６−シオキサオクタン０
．１５ｇ（１，０１ミリモル）を含有する溶液を加えた
。得られた深紅色溶液をｐ）（が６．０になるまで４Ｍ
塩酸で処理した。ついでシアノホウ素水素化ナトリウム
０．１ｇを加えた。得られた反応混合物を室温、ｐＨ６
、０で４日間撹拌し、ついで濃塩酸を加えてｐＨ１，０
の酸性にした。得られた混合物を真空下で蒸発乾固し、
その残渣を水１００ｍ１に溶解した。この水溶液を酢酸
エチルのアリコート１００ｍ１で３回抽出した。つぎに
水層を真空下で濃縮し、イソプロパツール／ドライアイ
ス浴中で凍らせ凍結乾燥した。凍結乾燥した固体を水５
ｍｌ中に溶解し、４Ｍ塩酸を加えてこの溶液のｐＨを３
．０に調節した。ついでその溶液をＤａｔｅｘ５０Ｘ２
−２００カチオン交換カラム（ベッドサイズ２５ｇ）に
流し、水、１Ｍ塩酸、２Ｍ塩酸および４Ｍ塩酸で連続的
に溶出した。所望の生成物は４Ｍ塩酸フラクション中に
溶出された。これらのフラクションを集め、真空下で濃
縮し、水５０ｍ１で希釈し真空下で再濃縮する工程を４
回繰り返して過剰の塩酸を除いた。真空下で溶媒を完全
に除いた後の残渣を水に再び溶解し、イソプロパツール
／ドライアイス浴中で凍らせ、凍結乾燥して所望の生成
物であるＮ−（１−アミノ−３，６−シオキサオクチル
）−４−二トロフェニルアラニン０．０７５ｇを得た。

上記で得た中間体Ｎ−（１−アミノ−３，６−シオキサ
オクチル）−４−二トロフェニルアラニン０．０６ｇ（
０，１４５ミリモル）を、１Ｍ水酸化ナトリウム０．４
４ｍ１およびＤＭＦｏ、０５ｒＡｌからなる溶液に溶解
した。ついでこの溶液を、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
０．４４ｍ１中のブロム酢酸０゜０６ｇ（０，４３ミリ
モル）の撹拌溶液に滴下した。

ついでその溶液に１Ｍ水溶液ナトリウムをさらに０．４
４ｍ１加えた。得られた反応混合物を約８０℃で２．５
時間撹拌し、ついで室温に冷却し、濃塩酸を加えてＩ）
Ｈｌの酸性にした。その溶液を真空下で濃縮し、その残
渣を水１０（ｌｎｌに再溶解して真空下で再蒸発させる
工程を４回繰り返して過剰の塩酸を除いた。得られた油
状残渣を水１０ｍ１に溶解し、イソプロパツール／ドラ
イアイス浴中で凍らせ、凍結乾燥した。これによって薄
ベージュ色の粉末０．１９ｇを得、これを水の最小容量
に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８に調節し
た。得られた溶液をＢｉｏ−Ｒａｄ　　ＡＧ　Ｉ　−Ｘ
　４アニオン交換カラム（ギ酸塩、ベッドサイズ５ｇ）
に流し、水、１Ｍギ酸、２Ｍギ酸、３Ｍギ酸および５Ｍ
ギ酸で連続的に溶出した。生成物は１Ｍギ酸フラクショ
ン中に溶出した。そのフラクションを集め、真空下で濃
縮乾固し、凍結乾燥して所望の生成物であるＮ−（１−
カルボキシ−２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル）−１
，８−ジアミノ−３゜６−シオキサオクタンーＮ、Ｎ’
　、Ｎ’　−トリ酢酸０．０４ｇを得た。

実施例２０ 本実施例では、脂肪族カルボン酸基を有する側鎖を含む
胆汁酸であるコール酸と実施例５記載のエチレンジアミ
ンテトラ酢酸の４−（２−アミノエチルチオウレア）フ
ェニル２官能性誘導体との間で結合体を形成した。その
結合体は、まずコール酸の活性エステル誘導体を生成さ
せ、ついでこれを２官能性キレート化剤中の脂肪族アミ
ン置換基と反応させることによって得た。

その活性エステルは、コール酸１．１ｇ（２，４ミリモ
ル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド０゜３５ｇ（
３，０４ミリモル）をＴＨＦ２０ｍｌとアセトニトリル
５ｍｌとの混合物に溶解し、得られた溶液を水浴中で冷
却して調製した。ついでＴＨＦ５ｍｌ中の１＝エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩０．４７ｇ（２，４ミリモル）の溶液を滴下し、つ
いでトリエチルアミン０．３４ｇ（２，４ミリモル）を
加えた。その反応混合物を室温で１７時間撹拌した。つ
いで溶媒を真空下で蒸発させて除いた。得られた残渣を
クロロホルム１５０ｍ１に溶解し、ついで冷水のアリコ
ート１ｏｃａｌ、冷ＩＭ塩酸のアリコート１００ｍ１゜
冷飽和炭酸水素ナトリウム水溶液のアリコート１０１０
０Ｘ３で連続的に抽出した。ついで有機層を分離し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過して除き、
濾液を真空下で蒸発乾固して白色固体の形の所望の化合
物１．１８ｇを得た。

ＴＨＦＩＩＩｌｌ中のＮ−（カルボキシメチル）−Ｎ−
（２−（ビス（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−
（４−（Ｎ’　　−（２−アミノエチル）チオウレア）
フェニル）アラニン３塩酸塩３１ｍｇ（０，０５ミリモ
ル、実施例５に記載したようにして製造）とトリエチル
アミン３６ｍｇ（０，３６ミリモル）との溶液を、ＤＭ
Ｆｏ、２５ｍ１中のコール酸活性エステル２５゜５ｍｇ
の溶液を滴下しながら室温で撹拌した。この反応混合物
をきつく栓をしたフラスコ中、室温で６日間撹拌した。

ついで溶媒を真空下で蒸発させて除き、残渣を水５ｍｌ
に溶解した。１Ｍ水酸化ナトリウムを用いてこの溶液の
ｐＨを約８に調節し、ついでこれをＢｉｏ−Ｒａｄ　　
ＡＧＩ−Ｘ４アニオン交換カラム（ギ酸塩、ベッドサイ
ズ７ｇ）に流した。

カラムを水、１Ｍギ酸、３Ｍギ酸、４Ｍギ酸、４゜５Ｍ
ギ酸、５Ｍギ酸および１Ｍ塩酸で連続的に溶出した。所
望の物質は５Ｍギ酸フラクション中に溶出した。これら
のフラクションを集め、真空下で蒸発乾固した。得られ
た残渣を４Ｍ塩酸１００ｍ１に再溶解し再び蒸発乾固す
る工程を４回繰り返した。この工程からの残渣を水１５
０ｍ１に溶解し、凍結乾燥して粘着性の黄色固体を得た
。これを水５０ｍ１に再溶解し、イソプロパツール／ド
ライアイス浴中で凍らせ、再び凍結乾燥して薄ベージュ
色の粉末の形の所望のコール酸・ＥＤＴＡ結合体３０ｔ
ａｇを得た。

実施例２１ 本実施例では、実施例２０で製造したコール酸・ＥＤＴ
Ａ結合体をインジウム目１で標ｊｌ、その生体内分布を
マウスで測定した。

１．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）２０μｌ
を、塩化インジウム１目溶液（１μｍ当たり１３゜４マ
イクロキユリー、アトミック・エナジー・オブ・カナダ
・リミッテッド）２０μ１１および０゜１Ｍ酢酸ナトリ
ウムバッファー（ｐＨ６）２ｍｌ中に結合体２１Ｉ１ｇ
を溶解して得たコール酸・ＥＤＴＡ結合体（実施例２０
と同様にして製造）の貯蔵（ｓｔａｃｋ）溶液４０μｍ
とともにミクロ試験管に入れた。試験管の中身を混合し
、室温で３０分間放置した。

ついでミアーズらの文献［Ｍｅａｒｓ　　ｅｔ　　ａｌ
、　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、１４２．６８
（１９８４）］に記載されているようにして、反応混合
物４０μｌをｃｈｅｌｅｘ樹脂（シグマ・ケミカル、５
０〜１００メツシユ）を入れた小さなカラム（ベッド容
積３００μｌ）に流し、未結合インジウムをカラムの遠
心分離で除いた。カラムの溶出液はＯ，１Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ６，６００μＩ）であった。遠心分離後にカ
ラム溶出液中のインジウム１１１標識したコール酸・Ｅ
ＤＴＡ結合体を集めた。１μｍ当たり８．６マイクロキ
ユリーの比活性を有することがわかった。

５匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにネムブタールを
腹腔内注射して麻酔し、ついで尾静脈からインジウム”
’−ＥＤＴＡ・コール酸結合体１００μＩを静脈内注射
した。注射後２時間の時点でマウスを頚部脱臼により層
殺し、インジウム１目活性の生体内分布を測定した。そ
の結果を第９表に示す。

夏１人 上記第９表において、すべての値はｎ＝５の平均で表し
である。

これらのデータは、注入した投与量のがなりの部分が肝
臓を通り、ついで腸管への胆汁の分泌の間に除かれるこ
とを示している。２時間の時点では腸管に実質的な活性
があり、胆嚢内に顕著な蓄積が認められる。腎臓にみら
れる残りの活性から、おそらく肝臓で除去されなかった
注入活性部分は尿にすばやく排出されたものと思われる
。

実施例２２ 本実施例では、コール酸・インジウム１結合体が肝胆汁
系の像形成剤として働く能力をウサギモデルで評価した
。

実施例２０で調製したコール酸・ＥＤＴＡ結合体を実施
例２１記載のようにしてインジウム１目で標識した。得
られた調製物は１　、６９　ｍＣｉ／ｍｌの比活性を有
していた。この物質１．（ｌａｃｉ投与量（０，５９ｍ
１）を、実験前の２日間絶食させたメスニューシーラン
トウサギの右耳縁の静脈に注射した。注射５分後にイノ
バール−ベット（Ｉ　ｎｎｏｖａｌ−Ｖ　ｅｔ）で麻酔
し、その後５分間隔で平面ガンマカメラ像を得た。注射
後８０分、９５分、１１０分、１２５分および１４０分
にもさらに像を得た。

ついでウサギに再び意識を回復させた。注射２５時間後
、ウサギを再び麻酔し、さらにガンマカメラ像を得た。

得られた像は放射標識の肝臓への急速な取り込みを示し
ており、注射１０分後の第１の像は肝臓への集中的な局
在を示していた。引き続き放射活性は急速に肝臓から除
かれ、注射２０〜２５分後には標識の焦点蓄積は下腹部
で顕著になり始め、１時間の時点では肝臓にはもはや活
性は観察されなくなった。活性はまた１０分の時点では
腎臓でも明らかであるが、これは急速に除かれ、注射後
３５分には識別可能な活性は腎臓にはなくなった。

膀胱は初期のすべての時点で強度の活性を示したが、２
５時間の時点の像ではみられず、このとき供試動物は膀
胱を空にした。２５時間の時点の像における活性は、胃
腸管のすべてにわたって広く分布していた。

この実験の結果により、コール酸・ＥＤＴＡ・インジウ
ム目１結合体が肝胆汁系の像を得るための放射性医薬と
して有用であることが確証された。

この結合体の実質的な部分は肝臓によって循環から急速
に引き出され、ついで胆汁管によって腸管内に分泌され
るので、核医学の方法によるこれらの構造物における生
理学的欠陥の同定が可能となる。

上記実施例から、本発明の結合体およびそれを用いた方
法が、ゴールデンバーグ（Ｇ　ｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）ら
により記載されているような外部フォトスキャンにより
抗原の局在濃度の像を得るのに有用であることが当業者
に明らかである。そのような方法においては、結合体を
患者に投与し、患者の体を結合体の濃度についてスキャ
ニングする。本発明の結合体はまたイムノアッセイや核
酸ハイブリダイゼーションアッセイのような生体外診断
法にも利用できることも明らかである。サンドイッチハ
イブリダイゼーション法のような診断法において、指示
手段を含む本発明の結合体は分析物の存在を示すのに有
用である。本発明の結合体およびそれを用いた方法は治
療法においても有用であり、その場合には金属イオンに
より細胞毒性の放射線が出される抗体・金属イオン結合
体を患者の体内に導入し、健康な組織への毒性作用を最
小限に抑さえながら細胞毒性の放射線を腫瘍に向けるよ
うにする。

【図面の簡単な説明】

第１８図は、抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（０，５）抗体結合体
により保持された免疫反応性の程度を非結合抗ＣＥＡと
比較したＥＬＩ　ＳＡアッセイの結果を示すグラフであ
る。第１ｂ図は、抗ＣＥＡ−ＤＴＴＡ（５，０）抗体結
合体により保持された免疫反応性の程度を非結合抗ＣＥ
Ａと比較したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフで
ある。第１ｃ図は、抗ＣＥＡ−ＮＣＳ−化合物Ａ抗体結
合体により保持された免疫反応性の程度を非結合抗ＣＥ
Ａと比較したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフで
ある。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ代理人　　　弁
理士　青白　葆　ほか１名蟻光／ｋ　　（０，Ｄ、　＋
９０　ｎｍ）　　　ｘ ｐ７１　先ｆｉ　（０，９−４９０ｎｍ）Ｏ×

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘはメタまたはパラ位に位置するニトロまたは
   基質反応性基； ｎは０〜約１０； Ｒ＿１は−（ＣＨ＿２）＿ｑ−、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒ］
   −、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＯ（ＣＨ＿２）＿ｒＯ（ＣＨ＿２
   ）＿ｓ］、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒＮ
   （Ｒ＿６）（ＣＨ＿２）＿ｓ］−、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
   式、表等があります▼から選ばれる基 （基中、ｑは２または３、ｒは２または３、ｓは２また
   は３）を表わし； Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿４、Ｒ＿５およびＲ＿６は同一も
   しくは異なって水素、 −ＣＨ＿２ＣＯ＿２Ｈおよび オルト−ＣＨ＿２Ｃ＿８Ｈ＿４ＯＨから選ばれる基を表
   わすか、または Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿ｑ−であるとき、Ｒ＿２およ
   びＲ＿３は一緒になって 基：−（ＣＨ＿２）＿ｔＮ（Ｒ＿７）（ＣＨ＿２）＿ｕ
   Ｎ（Ｒ＿８）（ＣＨ＿２）＿ｖ− （基中、ｔは２または３、ｕは２または３、ｖは２また
   は３、Ｒ＿７およびＲ＿８は水素、−ＣＨ＿２ＣＯ＿２
   Ｈ、およびオルト−ＣＨ＿２Ｃ＿６Ｈ＿４ＯＨから選ば
   れる基）を形成することができる］ で示される化合物。 ２、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは基質分子、Ｘはメタまたはパラ位に位置し
   て基質反応性基の残基； ｎは０〜約１０； Ｒ＿１は−（ＣＨ＿２）＿ｑ−、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒ］
   −、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＯ（ＣＨ＿２）＿ｒＯ（ＣＨ＿２
   ）＿ｓ］−、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒＮ
   （Ｒ＿６）（ＣＨ＿２）＿ｓ］−、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学
   式、表等があります▼から選ばれる基 （基中、ｑは２または３、ｒは２または３、ｓは２また
   は３）を表わし； Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿４、Ｒ＿５およびＲ＿６は同一も
   しくは異なって水素、 −ＣＨ＿２ＣＯ＿２Ｈおよび オルト−ＣＨ＿２Ｃ＿６Ｈ＿４ＯＨから選ばれる基を表
   わすか、または Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿ｑ−であるとき、Ｒ＿２およ
   びＲ＿３は一緒になって 基：−（ＣＨ＿２）＿ｔＮ（Ｒ＿７）（ＣＨ＿２）＿ｕ
   Ｎ（Ｒ＿８）（ＣＨ＿２）＿ｖ− （基中、ｔは２または３、ｕは２または３、ｖは２また
   は３、Ｒ＿７およびＲ＿８は水素、−ＣＨ＿２ＣＯ＿２
   Ｈ、およびオルト−ＣＨ＿２Ｃ＿６Ｈ＿４ＯＨから選ば
   れる基）を形成することができる］ で示される基質結合化合物。 ３、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは基質分子； Ｍは金属イオン； Ｘはメタまたはパラ位に位置する基質反応性基； ｎは０〜約１０； Ｒ＿１は−（ＣＨ＿２）＿ｑ−、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒ］
   −、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＯ（ＣＨ＿２）＿ｒＯ（ＣＨ＿２
   ）＿ｓ］、 −［（ＣＨ＿２）＿ｑＮ（Ｒ＿５）（ＣＨ＿２）＿ｒＮ
   （Ｒ＿６）（ＣＨ＿２）＿ｓ］−、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
   式、表等があります▼から選ばれる基 （基中、ｑは２または３、ｒは２または３、ｓは２また
   は３）を表わし； Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿４、Ｒ＿５およびＲ＿６は同一も
   しくは異なって水素、 −ＣＨ＿２ＣＯ＿２Ｈおよび オルト−ＣＨ＿２Ｃ＿６Ｈ＿４ＯＨから選ばれる基を表
   わすか、または Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿ｑ−であるとき、Ｒ＿２およ
   びＲ＿３は一緒になって 基：−（ＣＨ＿２）＿ｔＮ（Ｒ＿７）（ＣＨ＿２）＿ｕ
   Ｎ（Ｒ＿８）（ＣＨ＿２）＿ｖ− （基中、ｔは２または３、ｕは２または３、ｖは２また
   は３、Ｒ＿７およびＲ＿８は水素、−ＣＨ＿２ＣＯ＿２
   Ｈ、およびオルト−ＣＨ＿２Ｃ＿６Ｈ＿４ＯＨから選ば
   れる基）を形成することができる］ で示される基質−金属イオン結合化合物。 ４、Ｘがパラ位に位置する −ＮＨ＿２、 −ＮＣＳ、 −ＮＨＣＳＮＨＮＨ＿２および −ＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ＿２）＿２ＮＨ＿２ から選ばれる基質反応性基の残基、 ｎが１、 Ｒ＿１が−（ＣＨ＿２）＿２−、 −［（ＣＨ＿２）＿２Ｏ（ＣＨ＿２）＿２Ｏ（ＣＨ＿２
   ）＿２］−および ▲数式、化学式、表等があります▼から選ばれる基、 Ｒ＿２、Ｒ＿３およびＲ＿４が−ＣＨ＿２ＣＯ＿２Ｈ である特許請求の範囲第１、２または３項に記載の化合
   物。 ５、Ｑが蛋白質、糖蛋白質、ペプチド類、ポリアミノ酸
   、脂質、炭水化物、多糖類、ヌクレオシド類、ヌクレオ
   チド類、核酸、胆汁酸、薬剤、抑制剤、完全細胞、抗体
   もしくはフラグメント、組換え体誘導抗体もしくはフラ
   グメント、モノクロナール抗体もしくはフラグメントま
   たはコール酸から成る基から選ばれたものである特許請
   求の範囲第２または４項記載の化合物。 ６、Ｘが−ＮＨ＿２（アミノ）、 −ＮＮ＾＋（ジアゾニウム）、 −ＮＣＳ（イソチオシアネート）、 −ＮＣＯ（イソシアネート）、 −ＮＨＮＨ＿２（ヒドラジン）、 −ＮＨＣＳＮＨＮＨ＿２（チオセミカルバジド）、 −ＮＨＣＯＣＨ＿２Ｃｌ（クロロアセトアミド）、 −ＮＨＣＯＣＨ＿２Ｂｒ（ブロモアセトアミド）、 −ＮＨＣＯＣＨ＿２Ｉ（ヨードアセトアミド）、 −Ｎ＿３（アジド）、 −ＮＨＣＯＮＨ（ＣＨ＿２）＿ｍＮＨ＿２（アミノアル
   キル尿素）、 −ＮＨＣＳＮＨ（ＣＨ＿２）＿ｍＮＨ＿２（アミノアル
   キルチオ尿素）、 −ＮＨＣＯＮＨＮＨ＿２（セミカルバジド）、 ▲数式、化学式、表等があります▼（マレインイミド）
   、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ハロトリアジン）
   、および ▲数式、化学式、表等があります▼（メタ−（ジヒドロ
   キシボリル）フェニルチオ尿素） （基中、ＹはＣｌ、ＢｒおよびＦから選ばれるハロゲン
   、ＺはＣｌ、Ｂｒ、Ｆ、ＯＨおよびＯＣＨ＿３から選ば
   れる基、ｍは１〜約１０である） から選ばれる基質反応性基の残基である特許請求の範囲
   第１、２または３項記載の化合物。