JPS63276499A - 還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は還元型ニコチンアミド補酵素の新規な定量方法
に関する。詳しくは尿、血清等の生体液中に存在する還
元型ニコチンアミド補酵素を高精度で定値することが可
能な還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法である。

〔従来の技術及び問題点〕

還元型ニコチンアミド補酵素の定量は生体液中の物質の
定量に一般に応用されている。

例えば、生体液中に含有される胆汁酸な定量する方法と
して該胆料酸と酸化ｍニコチンアミド補酵素を脱水素酵
素によって反応させ、生成する還元型＝ニコチンアミド
酵素を定量し、該墓により胆汁酸の量を推定する方法が
知られている。また還元型ニコチンアミド補酵素の定量
は生体液中に含有されるポリアミンの測定にも応用する
ことが可能である。即ち、ポリアミンを酸化酵素により
酸化してアミノアルキルアルデヒドに変換し、該アルデ
ヒドを酸化型ニコチンアミド補酵素と脱水素酵素によっ
て反応させ、生成する還元型ニコチンアミド補酵素を定
量してポリアミンの量を推定する方法である。

従来、かかる還元型ニコチンアミド補酵素の定量は、試
料液にジアホラーゼ等の電子伝達系とテトラゾリウム塩
とよりなるテトラゾリウム系発色剤を作用させ、生成し
たホルマザンの発色度合？：測測定ることにより行われ
ている。

しかしながら、この定量方法は生地したホルマザンの測
定用器具（セル、試験管等）への沈着、凝集により呈色
安定性に乏しいという問題を有する。また、ホルマザン
の沈着による測定用器具の汚染という問題をも有する。

さらに、水溶液中での反応の場合、ホルマザンが難溶性
のため、反応により生成したホルマザンの吸光度から算
出された見かけ上の分子吸光係数は、ホルマザンの理論
分子吸光係数に対して著しく小さく、また測定条件によ
り変動し易いという問題をも有している。

従来、テトラゾリウム系発色剤を使用した還元型ニコチ
ンアミド補酵素の定量におけるこれらの問題を解消する
ため種々の工夫がなされている。

例えば、分子吸光係数な上げる方法としてテトラゾリウ
ム系発色剤を作用させる試料液のＰＨをアルカリ側（Ｐ
Ｈ８〜１０）に！ｉｉ整し、且つ、ホルマザンの分散剤
としてノニオン系界面活性剤０．０１〜０．１程度又は
牛血清アルブミン０．１％程度を添加してホルマザンの
生成反応を出来るだけ起こし易くする方法が一般的であ
る。

また、生成したホルマザンの沈着防止のための方法とし
て反応系の中にゼラチン等を添加する方法がある。

以上の方法により、前記した問題点はある程度解決でき
るが、未だ改善の余地がある１、しかも、試料液が尿、
血清等の生体液の場合には前記した問題に加えて更に下
記の問題を有する。即ち、試料液が生体液である場合、
試料中の還元性物質、例えばアスコルビン酸。

ヒリルヒン、尿酸、還元型グルタチオン等によりテトラ
ゾリウム塩が還元され、還元型ニコチンアミド補酵素以
外からのホルマザンが生成されるため、ブランク値が高
く、しかも変動し、測定に大きな誤差を与えるという間
急を生しる。

かかる問題は、前記した従来の方法によってほとんど解
決することができない。

従って、呈色安定性が高く、生成するホルマザンが高い
分子吸光係数を示し、且つ還元性物質によるブランク値
の上昇が少なく、還元型ニコチンアミド補酵素を正礒に
定量する方法の開発が望まれていた。

〔問題点を解決する為の手段〕

本発明者らは、還元型ニコチンアミド補酵素を含有する
試料液にテトラゾリウム系発色剤を作用させ、生成した
ホルマザンを比色定量する方法における上記課題を達成
すべく、鋭意研究を重ねた結果、テトラゾリウム系発色
剤を特定のＰＨで且つ特定量のノニオン系界面活性剤の
存在下に該試料液に作用させろことにより、かかる目的
を全て達成し得ろことを見い出し本発明を完成した。

本発明は還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液
にテトラゾリウム系発色剤を作用させ、その発色の度合
により該還元型ニコチンアミド補酵素な定量する方法に
おいて、該試料液のＰＲが４〜７で且つノニオン系界面
活性剤０．３〜１０！ｆｆ１％の存在下にテトラゾリウ
ム系発色剤を作用させろことを特徴とする還元型ニコチ
ンアミド補酵素の定量方法である。

本発明において、測定の対象となる還元屋ニコチンアミ
ド補酵素とは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下ＮＡＤＨと略す）又は還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下ＮＡＤＰ
Ｈと略す）があげられる。本発明の方法が良好に適用さ
れる試料液中の還元型ニコチンアミド補酵素の濃度は、
反応条件等により多少異なり、−概に限定できないが、
通常は０．００１ｍＭ〜５０　ｍＭ　　の範囲が好適で
ある。

本発明の方法が適用される還元型ニコチンアミド補酵素
を含有する試料液は特に制限されないが、特に生体液中
に還元型ニコチンアミド補酵素を含む試料液に対して顕
著な効果を発揮する。かかる試料液を具体的に例示すれ
ば、胆汁酸な含有する血清、尿、胆汁等の生体液に３α
−ハイドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼ（以下３
α−Ｈ８Ｄと略す）と酸化型ニコチンアミド補酵素とを
作用させて得られる還元型ニコチンアミド補酵素を含有
する試料液、尿、血清等の生体液中のポリアミンをポリ
アミン酸化酵素により酸化してアミノアル干ルアルデヒ
ドに変換し、該アミノアルキルアルデヒドに酸化型ニコ
チンアミド補酵素と脱水素酵素を作用させて得られる還
元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液等が挙げら
れろ。上記の還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試
料液の製造方法は公知の条件が特に制限なく採用される
。

本発明において、テトラゾリウム系発色剤は、テトラゾ
リウム塩と電子伝達系とよりなる。テトラゾリウム塩と
してはモノテトラゾリウム塩、ジテトラゾリウム墳のい
かなるテトラゾリウム塩でもよい。例えは、３−（Ｐ−
ヨードフェニル）−２−ＣＰ−二トロフェニル）−５−
フェニル−２Ｈ・テトラゾリウム・クロライド（以下Ｉ
ＮＴと略す）ニトロ＋）ラゾリウムプル−（Ｎｉ　ｔ　
ｒ　ｏ　　−’ＴＢ　Ｌネオテトラゾリウムブルー（Ｎ
ｅｏ−ＴＢ）−テトラゾリウムブルー（ＴＢ）、　　テ
トラニトロテトラゾリウムブルー（ＴＮＴＢ）等のテト
ラゾリウム塩があげられる。そのうち、反応のＰＨ等に
より異なるが、好ましくはモノテトラゾリウム塩として
、ＩＮＴ、　　ジテトラゾリウム塩としてニトロテトラ
ゾリウムブルーがあげられる。また、テトラゾリウム塩
の濃度は反応条件等により異なるが、通常は０．１　ｍ
Ｍ〜５０　ｍＭが用いられる。また、電子伝達系は、テ
トラゾリウム塩に還元型ニコチンアミド補酵素の水素を
授受させて共鳴構造をもたらせ、これをホルマザン色素
に変換せしめるものである。かかる電子伝達系としては
、ジアホラーゼ、１−メトキシ７エナジンメトサルフエ
イト（１−メトキシＰＭＳ）等があるが、好ましくはジ
アホラーゼを用いる方法がよい。この際のジアホラーゼ
量は反応条件等によつ異なるが通常０．１ｕ〜５０ｕ程
度が用いられろ。

本発明の方法は上記した還元型ニコチンアミド補酵素を
含む試料液に、該試料液のＰＨが４〜７、好ましくはＰ
Ｈ５〜＆５で且つノニオン系界面活性剤０．３〜１０重
量％、好ましくは０．５〜２憲敞％の存在下でテトラゾ
リウム系発色剤を作用させることを特徴とする。

即ち、テトラゾリウム系発色剤を作用させる際の試料液
のＰＨが４より低い場合には、還元型ニコチンアミド補
酵素が不安定になると同時に十分な発色を示さない。ま
た、ＰＨが７より高い場合には発色は十分に起こるが同
時に試料中の還元性物質によるテトラゾリウム塩の還元
反応が急激に強くなり、正確な定量が困難となる。ヌノ
ニオン系界面活性剤の濃度が０．３重ｉｔ％よりも低い
場合には、ホルマザンの十分な分子吸光係数が得られず
、さらにホルマザンの沈着や凝集が起こる。逆に、ノニ
オン系界面活性剤の濃度が１０′ｊＩＬｉｋ％よりも高
い場合には、ホルマザンの十分な分子吸光係数が得られ
るが試料中の還元性物質のテトラゾリウム塩の還元反応
も同時に進行し、正確な定黛は困難である。

前記した試料液のＰＨはいかなる方法で調整してもよい
が、好ましくは緩衝液により調整する方法がよい。緩衝
液としてはＰＨ４〜７に緩衝作用のあるいかなる緩衝液
な用いてもよい。例えは、アミノ酸系の緩衝液またはグ
ツド系ａ！衝液の中のメス緩徴液、ヒストリス緩衝液、
ピベス緩−液等が好適である。また、ＰＨの範囲として
はＰＨ４〜７の範臼内で決めればよいが電子伝達系のジ
アホラーゼ等の安定性を考えれはＰＨ５〜６．５が特に
好ましい。さらに＆ｌｌ液液濃度は反応液のＰＨを安定
に調整できれば特に制限はないが通常は０．１　Ｍ〜１
．０　Ｍが良い。

本発明におけろノニオン系界面活性剤は反応を阻害しな
いノニオン系界面活性剤であれば特に制限はないが、生
成したホルマザンの安定化、生成したホルマザンの分子
吸光係数の大きさ、生体試料中からの沈澱等の析出防止
効果などの点で、上記ノニオン系界面活性剤としてポリ
オ千ジエチレンアル千ルアリルエーテル、ポリオキンエ
チレンスチレン化フェノール等が好適に使用される。例
えは、工ｖ　ル’ｆ　＞　９３５　（商品名）−ペネロ
ールＮ　−１ｏＯＮ／Ｃ（商品名）、ペネロール５Ｐ−
２４（商品名）、エマルジェット２５（商品名）、トリ
トンＸ−１００（商品名）等があげられる。ノニオン系
界面活性剤の濃度は、前記したように反応時０．３〜１
ｏｍ１％の濃度においてその効果は認められる。しかし
、好ましくは０．５〜６．０　　重量％のノニオン系界
面活性剤を存在させるとよい。

本発明において、試料液中の還元型ニコチンアミド補酵
素を定量する場合、還元型ニコチンアミド補酵素を生成
する反比、および生成した還元型ニコチンアミド補酵素
を本発明により定量する反応を同時に進行させてもよく
、また、これら反応を２段階又は多段階反応として各反
応に適した条件下で反応させても良い。還元型ニコチン
アミド補酵素を生成する反応と還元型ニコチンアミド補
酵素を定量する反応とを同時に行う具体例として、ポリ
アミンを含む試料液にポリアミンを酸化する酸化酵素を
作用させてアミノアルキルアルデヒドに変換し、該試料
液に酸化型ニコチンアミド補酵素、脱水素酵素、テトラ
ゾリウム系発色剤１本発明における所定鑞のノニオン界
面活性剤を添加すると共にＰＨを４〜７に調整する方法
が挙げられる。かかる反応のＰＨにおいて効果的に脱水
素反応を行うための酵素として好適な脱水素酵素を例示
すれば、本願出願人による昭和６２年４月４日出願のω
−アミノアルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げら
れる。上記酵素は、下記の理化学的性質を有する。

■作　ｍ；酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド又は酸
化盤ニコチンアミドジ ヌクレオチドフォスフエイトの存 右下で４−アミノブタナールに作 用し、４−アミノ酪酸と還元型ニ コチンアミドジヌクレオチド又は 還元型ニコチンアミドジヌクレオ チドフォスフエイトを生成する。

■基質特異性二酸化ｍニコチンアミド補酵素として酸化
型ニコチンアミドジヌ クレオチド及び酸化型ニコチンア ミドジヌクレオチドフォスフエイ トに対して作用し、ω−アミノア ルチルアルデヒドとして、４−ア ミノブタナール及び５−アミノペ ブタナールに対して作用する。

■至適ＰＨ：ＰＨ７，７〜＆３ ■ＰＨ安定安定性：５屹下２４時間保ｆｉ−シた時、Ｐ
Ｈ４，５〜８５において９０％ 以上の残存活性を有する。

■分子量：１０２．ＯＯＯ±５，０００■サブユニット
の分子１：５０．ｏｏＯ±５．０００ ■サブユニットの数：２個 上記の４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼは、本＃
素を生産する能力のあるミークロコツカス属に属する細
菌を培養することによって得られる。使用する培地とし
てはグルコース等の炭素源、ポリペプトン等の窒素源。

及び無機塩類な含有するものであれば特に限定されない
。また、これらの成分の他にプトレッシン、スペルミジ
ン、ジアミノプロパン。

又はカルジン等のポリアミンを含有させることが該酵素
の生産性を高める上において有利である。培養条件とし
ては、培養温度が１５〜４０℃の範囲、好ましくは２０
〜３５℃の範囲で培養する方法が好適である。培養時の
ＰＨ条件は、４゜０〜９．０の範囲で、好ましくはＰＨ
５，０〜＆０の範囲が過当である。培養時間は、特に限
定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増殖
の後期に達する時間から休止状態に入ってから１０時間
以内の範囲が適当である。

培養によって得られた培養物から菌体な分離する方法と
しては、従来から行われている遠心分離法や濾過等の方
法が使用出来るが、遠心分離の方法が好適である。

４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼは、通常菌体内
に含まれているため該酵素を菌体から何らかの方法によ
って抽出する必要がある。抽出方法としては、従来から
行われている超音波による菌体破砕、あるいはガラス・
ヒースと共に回転させるタイツミル破砕機による菌体破
砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒に
よる細胞膜の破壊等の方法か挙げられろ。これらの中か
ら適当な方法を選択して菌体から酵素の抽出を行うこと
により、酵素の採取が出来る。

これらの方法で抽出された粗酵素液から４−アミノプタ
ナールデヒドロゲナーゼをさらに精製する必要性がある
場合は、通常実施されている一般的な酵素の精製手設で
ある硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換カラムクロマ
トグラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイト・
カラムクロマトグラフィー法。

調製用電気泳動法等の方法を適宜組み合わせるか、ある
いは繰り返すことによって精製を行うことが出来る。

また、４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼの酵素活
性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りであ
る。

光路幅１ｃｍのキュベツト中に１０　ｍＭのプトレッシ
ン・二塩酸塩を含有する０、１Ｍ）リス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ＰＨａｏ）を２５−
分注し、さらに２０μＩ！（５ユニツト）のミクロコツ
カス属由来のプトレッシンオキシダーゼを添加混和し３
０℃下で１０分間インキュベイジョンを行った後、この
反応溶液に２０　ｍＭのＮＡＤ水溶液を０．５−加え、
次いで５０μＥの４−アミノブタナールデヒドロゲナー
ゼを含有する被検体を添加混和する。直ちに３０”Ｃ下
で３４０　ｎｍ　の吸光度の増加速度を測定する。

−分間当りの吸光度の増加量（Ａ）から以下の換算式（
１）を使用して被検体１．０−当りの４−アミノブタナ
ールデヒドロゲナーゼの酵素活性値を算出する。酵素活
性値の表示は、１分間当り１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを生
成させろ酵素ｆＩｋを１ユニツト（ｐ　ｚｏｌｅ　／　
ｍ　）として表示する。

６、２　　　　０．０５ 本発明による４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼの
比活性値は、１２０〜１４０（ユニット／冨９−蛋白質
）を示す。又、ドデシル硫酸ナトリウムの存在、非存在
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動上において両者
共に単一の蛋白質バンドが観測される。

本発明において、使用するノニオン系界面活性剤の添加
時期は還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液を
調製する前処理段階から添加しても良いし、該調整され
た試料液に添加してもよい。即ち、テトラゾリウム系発
色剤を作用させる時に試料液中にノニオン系界面活性剤
がα３〜１０１１社％存在しておればその添加時期は制
限されない。また、本発明において還元型ニコチンアミ
ド補酵素を含有する試料液のＰＨが４〜７で且つノニオ
ン系界面活性剤０．３〜１０ｋ１％の存在下にテトラゾ
リウム系発色剤を作用させる反応が終結し、ホルマザン
が生成した後にそのＰＨを４以下に下げて生成したホル
マザンを定量しても安定に個定が可能である。

本発明において、テトラゾリウム系発色剤の発色より還
元型ニコチンアミド補酵素の量を推定する方法は、公知
の比色定量法が特に制限なく採用される。最も一般的な
方法として検１１Ｍを用いた方法が挙げられる。

本発明の特徴の一つはＰＨ４〜７という酸性剤で、還元
型ニコチンアミド補酵素をテトラゾリウム系発色剤によ
り比色定量することである。即ち、ＰＨ７以下ではノニ
オン系界面活性剤が高濃度存在下でも生体試料中の還元
性物質によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応が抑え
られているが、ＰＨ７以上では生体試料中の還元性物質
によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応が急激に進行
しはじめるのである。この現象はおそらく、通常用いる
反応系のＰＨ（アルカリ側）とは逆に酸性側で発色させ
ることにより、テトラゾリウム系発色剤および生体試料
中の還元性物質の双方の酸化還元電位に変化が生じ、生
体試料中の還元性物質によるテトラゾリウム系発色剤の
還元灰地、が起こらなくなったものと推定される。しか
し、これたけでは還元型ニコチンアミド補酵素のテトラ
ゾリウム系発色剤による安定且つ正確な定量はできない
。

本発明においては、さらに前記条件下でノニオン系界面
活性剤を高濃度（０，３〜１０重量％）存在させること
により正電な定量を可能とした。即ち、ノニオン系界面
活性剤を前記範囲で使用することにより、生体試料中の
還元性物質によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応の
進行はなく、ジアホラーゼ等の電子伝達体を介する還元
型ニコチンアミド補酵素によるテトラゾリウム系発色剤
の還元反応のみ進行し、且つ生成したホルマザンは高い
分子吸光係数を持つのである。この現象は、ノニオン系
界面活性剤が生成したホルマザンの分散剤としての役割
をしており、テトラゾリウム塩および生体試料中の還元
性物質の酸化還元電位にはあまり影−していない為と推
測される。

従って、本発明の二つの特徴を組み合わせろことによっ
てはじめて、生体試料において還元型ニコチンアミド補
酵素をテトラゾリウム系発色剤により比色定量すること
が可能となるのである。すなわち、本発明は、低いＰＨ
条件下で且つ高濃度のノニオン系界面活性剤を存在させ
ることにより、生体試料中の還元性物質によるテトラゾ
リウム塩の還元反応を抑えることができるためブランク
値が低く、しかも生成したホルマザンの分子吸光係数が
高いため、感度のよい定量が可能である。

また、本発明の方法によれは、生体試料中の還元性物質
によるテトラゾリウム塩の還元反応がないため、広い濃
度範囲にわたりテトラゾリウム塩を使用することが可能
である。

本発明において高濃度ノニオン系界面活性剤の添加は、
生体液中より析出沈澱する変性タンパク質等の沈澱に対
しても溶解性があり、かかる物質を含も試料液中に存在
する還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法として非常
に優れた方法である。

本発明により還元型ニコチンアミド補酵素のテトラゾリ
ウム系発色剤による定量が安定で、正確に、しかも高感
度で又測定装置や器具を汚染することなく可能となった
ので自動分析装置への適用も十分可能である。

本発明により将来、日常の臨床検査において還元型ニコ
チンアミド補酵素のテトラゾリウム系発色剤を用いた定
量方法が広く普及するものと考えられる。従って本発明
の臨床検査分野への貢献度は非常に大きいものと期待さ
れろ。

〔実施例〕

以下実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 下記組成の試薬を用い、下記方法により得られた吸光度
の測定値とその測定値に対応する還元型ニコチンアミド
補酵素濃度の関係を第２表に示す。

ａ）試薬 アスコルビン酸オキシダーゼ　　４５ｕ（東洋醸造■社
製） エマルゲン９３５　　　　　　　０．４９（花王石けん
■社製） ０．４Ｍ−）リスー塩敵綬衝液（ＰＨ７，８）にて全ｋ
を１０−としたもの。

試１１５２ ニトロテトラゾリウムプル−５，ＯＱ （向仁化学研究所■社製） ジアホラーゼ　　　　　　　　　８０ｕ（オリエンタル
酵母■社製） ０．６Ｍメス緩衝液（ＰＨ６）（同位化学研究所■にて
全社を２０−としたもの。

試　薬３ ＩＭ　　塩酸溶液 ｂ）測定法 Ｗ元ｍ　ニコチンアミド補酵素を２００μ、＋＋０１ｅ
／ｌ　　含有する尿試料を調製した。一方同じ尿に還元
型ニコチンアミド補酵素の代わりに精製水を添加したも
のも調製した。

それぞれの試料を精製水を用いて希釈系列を作成した。

次に第１表に示す様に操作した。この希釈系列溶液ｔそ
れぞれ０．５ＴＩＬｔずつ分取し、試薬１を０．５１添
加混和後３７℃２０分反応させた。その後試薬２を０．
５耐添加混和してＰＨを６．０に調整して３７℃５分間
テトラゾリウム系発色剤を作用させた後、Ｉｍｏｌｅ／
ｊ’　　塩酸水溶液を０．５１添加混和後波長５３０　
ｎｍ　の吸光度を測定した。

第１表 Ｅ　＝　Ｅｌｌ　−Ｅｌ） 第２表 第２表より作成した検量線を第１図に示す。

第１図から還元をニコチンアミド補酵素濃度と得られる
吸光度の菌体は２００μｍｏｌ・／ｌの濃度まで直Ｍ関
係が得られ、これより還元をニコチンアミド補酵素の比
色全社が可能であることがわかる。

実施例２ 尿中の還元型ニコチンアミド補酵素の定ｍ還元型ニコチ
ンアミド補酵素を３０ｕｍｏｌｅ／１　、６０　μｍｏ
ｌｅ／ｊ’　、　　１２０　μｍｏｌｅ／ｌ　　含有す
る尿試料な調製した。一方同じ尿に還元型ニコチンアミ
ド補酵素の代わりに精製水を添加したものもそれぞれ調
製した。

上記試料を実施例１と同様な方法により吸光度Ｅ８およ
びＢＨｂを得た。さらに標準液として３０ｕＭの還元型
ニコチンアミド補酵素水溶液及び盲検体として精製水を
用い前記Ｅ８及びＥｌ）の測定方法と同様な方法により
吸光度をそれぞれ測定した。かかる標準液について得ら
れた吸光度なそれぞれＥａｔ及びＥｅｔ’とし盲検体に
ついて得られた吸光度をそれぞれＥ　Ｈ２ｏ及びＥＨ’
２０とする。

上記方法によって得られた測定値により下記式を用いて
試料中の還元型ニコチンアミド補酵素量を計算して求め
た。

Ｌｊ！；８ｔ−ｐａｔノー（ｊｉ；１’１２１Ｊ−１！
ｉ％ＩＪｌ上記測定操作を３種類の尿検体について５回
ずつ行ないその結果を第３表に示した。この結果より本
発明の方法か良好な再現性を示すことがわかる。

第３表 第３表から本発明の方法は尿中の還元型ニコチンアミド
補酵素量を正薙に測定できることがわかる。

実施例３ 還元型ニコチンアミド補酵素を１２０μｍｏｌｅ／Ｊ含
有する尿試料を調製した。一方同じ尿に還元型ニコチン
アミド補酵素の代わりに精ｌ水を添加したものもそれぞ
れ調製し島上記試料を実施例１と同様な方法により吸光
度Ｅ８およびＥＢを得た。ただし実施例１に示す試薬１
中のノニオン系界面活性剤エマルゲン９３５の濃度は発
色反応時第４表に示す濃度になる様それぞれ調製した。

得られた吸光度より次式に従って尿中還元型ニコチンア
ミド補酵素濃度を計算した。

尿中還元型ニコチンアミド補酵素濃度（μｍ　ｏ　１１
　ｅ／ｌ）ａ　−ＥＢ 上記測定を同じ条件下でそれぞれ５回測定しその時の結
果を第４表に示した。また得られた吸光度からそれぞれ
の条件下でのホルマザンの分子吸光係数を計算した。そ
の結果も合わせて第４表に示した。

以上のことより本発明は還元型ニコチンアミド補酵素の
定量法として非常に安定でかつ正確にまた十分な分子吸
光係数が得られることから高感度に定量できることが判
明した。

比較例１ 比較例として実施４＋１１３においてノニオン系界面活
性剤エマルゲン９３５濃度が０．３重量％以下の場合と
１０重量％以上の場合の結果を第５表に示した。

以上のことがらノニオン系界面活性剤エマルゲン９３５
濃度が０．３重量幅以下では得られた分子吸光係数が小
さく感度が低くなりしかも測定値も非常にバラツキがあ
ることがわかる。また１０１Ｍ％以上でも感度は十分に
あるが測定値のバラツキが大きくなり、還元型ニコチン
アミド補酵素の定量方法としては不適当であることが判
明した。

実施例４ 下記組成の試薬を用い、還元型ニコチンアミド補酵素を
本発明により定量するに際し、還元性物質の定量値に対
する影響を調べ第６表に示した。

ａ）試薬 試　　薬１ ０．２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ＰＨ＆０）１０就にアス
コルビン酸オキシダーゼ４０Ｕを溶解したもの。

試　　薬２ ニトロテトラゾリウムブルー　　１．５Ｑ（同位化学研
究所■社製） ジアホラーゼ　　　　　　　　　４０ｕ（オリエンタル
酵母−社製） エマルゲン９３５　　　　　　　０．４ｇ以上のものを
０．２Ｍメス緩衝液２０１に溶解したもの。

ｂ）測定法 既知濃度の還元型ニコチンアミド補酵素と各還元性物質
を含有する溶液を等濃度の還元型ニコチンアミド補酵素
を含有する溶液で希釈し、還元型ニコチンアミド濃度が
等しく、各還元性物質の濃度の異なる希釈系列を用意し
た。同様に還元型ニコチンアミド補酵素の代わりに精製
水を用いたものの希釈系列も用意した。該試料を日立７
０５０自動分析装置を用い、還元型ニコチンアミド補酵
素を定量し、各還元性物質の影響をみた。

試料を２０μｌサンプリングし第１試薬として試薬１を
各１００μｌ　分注させ、３７’Ｃ５分反応後、第２試
薬として試薬２を各２５０μｌ　分注させ、主波長７０
０　ｎｍ　　とし還元型ニコチンアミド補酵素濃度を求
めた。

この時の盲検用試料としては生理食塩水を朗いた。試料
として還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料を用
いた時の得られた吸光度をＡ１　とし、試料として還元
型ニコチンアミド補酵素を含有しない試料を用いた時の
吸光度すなわちブランク上昇なＡ２とした。また得られ
た吸光度からの濃度換算は、あらかじめ盲検用として生
理食塩水、標準液として５０μｍｏｌｅ／７　　還元型
ニコチンアミド補＃素を含有する生理食塩水を用いそれ
ぞれの吸光度を測定しておいた。この時の５０μｍｏｌ
ｅ／ｌ還元型ニコチンアミド袖ト素の吸光度は０．０４
７５　　であった。各吸光度からのｈ度換算は次式によ
って行なった。

Ｉ Ｃ１＝　−Ｘ　　５　　Ｑ ｏ、０４７５ Ｃ２＝　−Ｘ　　５　０ ０．０４７５ その結果を第６表に示した。

第６表よりアスコルビン酸においてわずかにブランク上
昇が認められるが、その他の還元性物質の影響は認めら
れない。還元型ニコチンアミド補酵素の分析値（ＣＩ−
０２）としてはいずれの還元性物質の影梼も受けていな
いことがわかった。またホルマザンの呈色安定性にも非
常に優れ、自動分析装置のセル等への汚染や沈着はまっ
たく認められなかった。

実施例５ 実施例１と同様に尿中の還元型ニコチンアミド補酵素の
定量を行った。還元型ニコチンアミド補酵素濃度として
は６０μ＋ｎｏｌｅ／ｌとし対照検体としては精製水を
添加したものを用い、それぞれについて５３０　ｎｍ　
の吸光度Ｅ８およびＥＢを得た。還元型ニコチンアミド
濃度は次式により算出した。

還元型ニコチンアミド濃度（μｍ　ｏ　ｌ　ｅ／　ｉり
３．６Ｘ１０’ 同じ測定をそれぞれ５回繰り返し、その再現性を求めた
。ただし発色反応時のＰＨは第７表に７１１すＰＨとな
る様に調製した。その結果を第７表に示した。

第７表 Ｐ　Ｈ７，９とＰ　Ｈ３，５は比較例である。

以上のことからＰＨ７，９ではブランク上昇のために測
定値のバラツキが大きくＰＨ３，５では感度が低くバラ
ツキの原因となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＮＡＤＨ濃度と本発明の方法
を使用して得られる吸光度の関係を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液に
   テトラゾリウム系発色剤を作用させて、その発色の度合
   により該還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法に
   おいて、該試料液のＰＨが４〜７で且つノニオン系界面
   活性剤０．３〜１０重量％の存在下にテトラゾリウム系
   発色剤を作用させることを特徴とする還元型ニコチンア
   ミド補酵素の定量方法。