JPS6326992B2 - - Google Patents

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JPS6326992B2
JPS6326992B2 JP54165867A JP16586779A JPS6326992B2 JP S6326992 B2 JPS6326992 B2 JP S6326992B2 JP 54165867 A JP54165867 A JP 54165867A JP 16586779 A JP16586779 A JP 16586779A JP S6326992 B2 JPS6326992 B2 JP S6326992B2
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JP
Japan
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enzyme
immobilization
immobilized
reagent
carrier
Prior art date
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JP54165867A
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English (en)
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JPS5688794A (en
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Shiro Nankai
Kenichi Nakamura
Takashi Iijima
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Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Publication date
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素利用反応における酵素の有効利
用を図るため、連続使用,繰り返し使用の可能な
酵素固定化体を得ることを目的とする。
近年、酵素固定化技術の進展に伴い、固定化酵
素を利用したセンサー,薬品製造などの酵素の有
する特異的触媒作用の工業的有効利用が試みられ
ている。この中で用いられる酵素の固定化法とし
ては、高分子マトリツクス中に固定化する包括
法、固定化担体に直接化学結合する担体結合法、
あるいは酵素相互間を架橋法により架橋不溶化す
るなどの方法がある。具体的には、樹脂,セフア
ローズなどの有機高分子,あるいはガラスビー
ズ,金属,カーボンなどの無機物を用い、この担
体上に上記方法を利用して酵素を固定化する。
担体結合法では、例えば、ガラスビーズ表面を
化学修飾して官能基を導入し、次に酵素との間で
反応を行わせて酵素を結合する。この方法では酵
素と担体を直接結合させるため、酵素が脱落する
ことはないが、固定化に際しての反応,操作が複
雑であり、使用可能な担体が限定される。
また包括法では、例えば、光重合反応などを利
用して3次元樹脂マトリツクス中に酵素を閉じ込
める方法、あるいは樹脂を酵素とともに溶媒に溶
解し、これをガラス板などの上に展開した後、脱
溶媒して固定化する。この方法は酵素と担体との
結合を伴わないため、固定化による酵素活性の低
下は少ない。しかし反面、連続使用,繰り返し使
用に伴う酵素の脱離は避けられない。
これに対し架橋法では、例えば、グルタルアル
デヒドなどの固定化試薬を用いて酵素相互間に架
橋反応を行わせて不溶固定化する。具体的には、
ガラス板,ガラスビーズなど、使用する固定化担
体の表面を塗布あるいは浸漬法などにより酵素溶
液で被覆し、必要ならば乾燥し、次にグルタルア
ルデヒドなどの固定化試薬溶液を添加して架橋反
応を行わせ、酵素を架橋不溶化する。グルタルア
ルデヒドとしては数%水溶液が一般に使用される
が、固定化試薬濃度が高いと架橋反応が急激に進
み、酵素活性の低下が大きくなる。また、固定化
試薬濃度が低いと反応速度が遅く、この間未反応
の酵素が添加した固定化試薬溶液に溶解する。固
定化においては、酵素濃度をある程度以上高くす
ることが必要である。これらの点からも明らかで
あるが、この方法により担体表面を固定化(不溶
化)酵素からなる膜で均一に覆うことは非常に困
難である。すなわち、固定化反応(架橋反応)を
行わせる際に、固定化試薬を溶液状態で作用させ
る、つまり固定化試薬を液相から供給する方法で
あるがため上記に述べた問題は避けられない。
そこで、本発明者らは各種固定化法の上記のよ
うな問題点を解決すべく検討を重ねた結果、優れ
た固定化法を見出した。本発明の酵素固定化法の
特徴は以下の点にある。すなわち、固定化試薬を
作用させて酵素を固定化する際に、予め、水に不
溶な樹脂を有機溶媒に溶解しこれに酵素を添加し
て得られた溶液で固定化担体表面を被覆する。こ
の後、乾燥して脱溶媒し、次に被覆面上へ固定試
薬を気相から供給しつつ固定化反応を行わせる。
このように、酵素と樹脂で予め担体表面を被覆
し、この後、固定化試薬を一度気体状態にした
後、前記被覆面上に供給することにより、予想に
反して、良好に酵素の固定化ができることが判明
した。
本発明の固定化方法は数々の優れた特徴を有す
る。まず、固定化に不溶な樹脂(以下樹脂と言
う)を、併用しているため、酵素固定化膜の担体
への密着性が良好であり、機械的強度にも優れて
いる。また水溶液中で使用する場合の耐膨潤性に
も優れており、これらの点からも、繰り返し使
用,連続使用に十分耐える酵素固定化膜であるこ
とがわかる。さらに、固定化反応に関与する固定
化試薬の濃度をその蒸気圧で制御できるという長
所を有しているので、酵素の微妙な活性変化に重
大な影響を及ぼす固定化反応の進行度合いを容易
に制御できる。また、以上からも明らかである
が、本発明の方法によれば、担体表面が凹凸,曲
面などの形状であつても、またその形状の大小に
かかわらず表面を酵素固定化膜で被覆することが
できる。これは、樹脂を併用したことに加え、固
定化試薬を気相から供給することにより、固定化
担体表面上の酵素濃度を変えることなく、ほぼ予
め被覆した状態のままで固定化できるからであ
る。
第1図は本発明の方法により酵素を固定化した
担体の例を断面模式図で示したものである。図
中、1は固定化担体、2は酵素および樹脂からな
る酵素固定化膜である。凹凸を有する担体1の表
面を予め酵素と樹脂からなる層で覆い、この後、
固定化試薬を作用させると、このままの形状を維
持した状態で固定化できる。使用可能な樹脂とし
ては、ポリ塩化ビニル,ポリスチレン,ポリメチ
ルメタクリレート,ポリフツ化ビニリデンあるい
は、酢酸セルロース,酪酸酢酸セルロース,フタ
ル酸水素、酢酸セルロースなどのセルロース誘導
体など、水に不溶で適当な有機溶媒に溶解するも
のであれば良い。
以下、本発明をその実施例により説明する。
実施例 1 第2図はガラス電極の下端部に本発明の方法に
より酵素を固定した例を断面模式図で示す。図
中、3はガラス電極であり、下端のイオン感応部
はウレアーゼ固定化膜4で被覆されている。
この製法は以下のとおりである。まず、酵素溶
液として、ウレアーゼの100mg/ml水溶液、樹脂
溶液としてポリメチルメタクリレートの10g/dl
アセトン溶液を各々調製する。次に酵素溶液1重
量部と樹脂溶液9重量部を混合して得られた溶液
で塗布,浸漬などの方法でガラス電極イオン感応
部を覆う。乾燥させて脱溶媒した後、グルタルア
ルデヒド蒸気中で、25℃にて60〜90分間固定化反
応を行わせることにより、十分な密着性,機械的
強度を有する酵素固定化膜が得られる。反応終了
後、リン酸緩衝液中で洗浄する。このガラス電極
をAとする。比較のため、上記と同様の方法によ
りガラス電極イオン感応部を酵素と樹脂の混合溶
液で覆つた後、乾燥させただけのグルタルアルデ
ヒド処理をしないガラス電極をBとする。
上記、A,Bの電極を用いて、トリス緩衝液中
にて尿素濃度に対する電極電位の変化を測定した
ところ、第3図に示すごとく、A,Bいずれのガ
ラス電極においても1×10-2〜1×10-4モル/
の尿素濃度の対数値との間にほぼ直線関係が得ら
れた。しかし、測定と洗浄の操作を繰り返すと、
第4図に示すごとく、尿素濃度1×10-3モル/
に対する電極電位の応答特性は、Bでは使用回数
の増加とともに低下した。これに対し、本発明の
方法によるAは、安定した応答特性を維持するな
ど、優れた性質を有するものであつた。
実施例 2 酵素溶液として、グルコースオキシターゼの
100mg/ml水溶液,樹脂溶液として酢酸セルロー
スの3g/dlアセトン溶液を各々調製する。次に
酵素溶液1重量部と樹脂液9重量部を混合して得
られた溶液で白金板からなる電極を塗布、浸漬な
どの方法で覆う。次に乾燥させて脱溶媒した後、
パラホルムアルデヒド蒸気中、25℃で90分間固定
化反応を行なわせることにより、十分な密着性を
有する酵素固定化膜が得られた。比較のため、上
記と同様の方法により白金電極上を酵素と樹脂の
混合液で覆い、単に乾燥させただけの電極を作製
した。
上記2種の酵素電極について、特性比較を以下
の方法で行なつた。PH5.6リン酸緩衝液中で、白
金対極およびAg/AgCl参照極を用い、上記で作
製した酵素電極の電位を+0.6V vs Ag/AgClと
し、グルコース標準液に対する応答を測定した。
酵素反応で生成した過酸化水素の酸化電流はグル
コース濃度の変化に対して、上記2種の酵素電極
ともに良い直線性を示した。しかし、洗浄と測定
を繰り返すと単に乾燥させただけで作製した電極
においては、応答電流の低下が認められた。これ
に対し、本発明による酵素固定化法による電極
は、安定した応答を維持した。
以上述べたごとく、本発明による酵素固定化法
によれば、極めて容易に、担体を化学修飾するこ
ともなく各種担体上に酵素を固定化することがで
きる。また、この方法によりガラス板上などで固
定化反応を行わせた後、反応物を剥離することに
より容易に酵素固定化膜を得ることもできる。
本発明の方法において使用可能な固定化試薬と
しては、実施例で説明したグルタルアルデヒドに
限られるものではない。2―オキシアジポアルデ
ヒド,クロトンアルデヒド,アクロレイン,グリ
オキザール,プロピオンアルデヒド,パラホルム
アルデヒドなどのアルデヒドあるいはアルデヒド
重合物をはじめとして、気相状態で供給すること
のできる固定化試薬であればいずれも使用するこ
とができる。また、固定化担体表面を予め酵素と
樹脂で被覆する場合に、固定化試薬と反応して共
有結合を形成する高分子化合物を混合して用いる
と、さらに固定化(不溶化)が容易となり、固定
化に伴う酵素活性の低下を減ずることができる。
このような高分子化合物としては、特にポリエチ
レンイミン,ポリオルニチン,ポリリジン,ポリ
アルギニン,アルブミン等の―NH2,>NH,―
SHで表される官能基を有するものがよい。これ
ら官能基と固定化試薬の反応,および酵素と固定
化試薬の反応により、酵素相互間や酵素と上記高
分子化合物の間、あるいは高分子化合物相互間の
結合が進行し、結果として酵素が固定化(不溶
化)されるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
第1図は酵素固定化担体の表面形状と酵素と樹
脂からなる層の関係を示す断面模式図、第2図は
ガラス電極のイオン感応部とこれを覆う酵素固定
化膜を示す断面模式図、第3図は尿素濃度と電極
型電位の関係を示す図、第4図は酵素固定化ガラ
ス電極の使用回数と電極電位の関係を示す。 1……固定化担体、2……酵素固定化膜、3…
…ガラス電極、4……ウレアーゼ固定化膜。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 固定化試薬で酵素を架橋固定化する酵素固定
    化法において、水に不溶な樹脂と酵素とで固定化
    担体表面を予め被覆した後、前記固定化試薬を気
    相から供給して固定化反応を行わせることを特徴
    とする酵素固定化法。 2 固定化試薬が、アルデヒドあるいはアルデヒ
    ドの重合物から選ばれた特許請求の範囲第1項記
    載の酵素固定化法。 3 樹脂が、ポリ塩化ビニル,ポリスチレン,ポ
    リメチルメタクリレート,ポリフツ化ビニリデン
    あるいはセルロース誘導体から選ばれた特許請求
    の範囲第1項記載の酵素固定化法。
JP16586779A 1979-12-19 1979-12-19 Immobilization of enzyme Granted JPS5688794A (en)

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JPS5715878A (en) * 1980-06-30 1982-01-27 Iseki Agricult Mach Feeder for cereal grain in coarse selector

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