JPS63225395A - ポリヌクレオチド合成用支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、米国保健教育福祉省の認可、すなわち補償の
もとに行われた業務の最中に生じたものである。

本発明は、変性無機重合体並びにその変性無機重合体の
製造法に関し、更に前記無機変性重合体を支持構造とし
て用いるポリヌクレオチドの製造法に関するものである
。

［従来技術およびその問題点コ 順序の一定したオリゴヌクレオチドを合成する有効な方
法論を求めて多くの試みがなされて来た。

しかし、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドの
段階的な合成法は、依然として、多くは収率の低い困難
で時間のかかるものに止っている。

公知技術の一つでは、ポリヌクレオチドの合成に際して
有機重合体を支持体として用いている。

支持重合体による合成法の主な問題点は、元来支持重合
体の性質に同音のものであって、そのような合成に用い
られた種々の公知技術に属する重合体は： （１）支持体中に活性化したヌクレオチドが拡散する速
度が遅いこと、 （２）細孔径の大きい多孔質で低架橋度の、種々の支持
体重合体における膨潤が過剰であること、および （３）重合体中に反応物質が不可逆的に吸収されること などの理由により、不充分なものであった。

参考文献：　　Ｖ、　Ａｍａｒｎａｔｈ及び＾、０．８
ｒｏｏｍ。

Ｃｈａｍｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、　７７＠、１８３
−２１７頁　（１９７７年）。

変性無機重合体は公知技術において、例えば、液体クロ
マトグラフィーの吸着剤としての用途で元来知られてい
るものである。トリチル結合基を用いてシリカゲルにヌ
クレオシド燐酸塩を結合させることが公知資料　（Ｈｌ
にｏｓｔａｒ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ
、　＋５２７−１５３０頁、１９７２年）に記載されて
いるが、この方法は明らかにピリミジンヌクレオシドに
のみ使用可能なものである。シリカ支持体からのヌクレ
オシドの離脱分離はプリンヌクレオシドを侵すような酸
を用いなければ不可能である。

オリゴチミジレートのホスホトエステル誘導体の製造に
ついて、公知文献（Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒおよ
び’Ｉ１．　Ｂ、　Ｌｕｎ５ｆｏｒｄ、　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ
　５ｏｃｉｅｔｙ、　９８：１２．３６５５−３８６１
頁）に記載されているが、これは５゛−〇−封鎖チミジ
ンを用いたホスホロジクリダイトの反応に引続いて生成
物を３’−〇−封鎖チミジンと反応させ、次いで得られ
たホスファイトをホスフェートに酸化し、さらに封鎖基
を除去してホスホトリエステルを得るものである。この
方法を用いて、テトラマーとペンタマー、すなわち、ｄ
ＴｐＴｐＴｐＴ及びｄＴｐＴｐＴｐＴｐＴ（Ｔはチミジ
ン）が得られている。残念ながらこの方法では、各段階
毎に生成物の分離精製がヌクレオシドの正しい付加順序
を保証するために必要とされる。沈殿操作および沈殿物
の洗滌を含む分離技術が各反応段階を実施するために必
要である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は新規で有用な無機重合体を提供するもので、ま
たそのような無機重合体の製造法をも提供する。一般的
に本発明の変性Ｓ機重合物支持体は、ヌクレオシドが化
学的に結合した　ｔＡ機重会体からなり、ヌクレオシド
の重合体に対する化学結合はヌクレオシドの反応基と反
応する重合体上の反応基〈よるものである。かかる反応
基の代表的な組合せは、ヌクレオシドと支持体をアミド
結合で結ぶアミノ基とカルボキシル基、或は各々全エス
テル結合で結ぶヒドロキシル基とカルボキシル基である
。

所望の化学結合を行わせるには、各反応成分が勿論必要
な反応基金含んでいなければならない。

従って支持重合体はヌクレオシドのヒドロキシル及び／
又はアミン基と反応するカルデキンル末端基を有するも
のとするか、戒は二塩基性カルゼン酸くよってヌクレオ
シドのヒドロキシル及び／又はアミノ基をアシル化して
ヌクレオシドにカルボキシル基による官能性を与え、支
持重合体のヒドロキシル基又はアミノ基と反応させる事
が可能である。無機支持体上にヒドロキシル基又はアミ
ン基が存在しない場合には、公知の方法によってこ九等
の苓を導入して反応性を与える事ができる。

例えばシリカ支持体の場合アミノアルキルシリルハライ
ドと反応させて、アミノ官能基を導入する事ができる。

勿論本発明の変性無機重合体のヌクレオシド部分は２個
以上のヌクレオシドを含み得るもので、幾つかのヌクレ
オシドをオリゴヌクレオチドの形ＫＭ合させてその第１
７．１１ヌクレオチドが例えばエステル結合の様な単一
の化学結合によって無機重合物支持体に結合している形
態を採る事もできる。

この様にして変性した無機重合物支持体は以下に記載す
る一連゛の工程釦より、支持体上のヌクレオシド部分に
ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドを段階的に付加す
るのに用いられる。次いでこの様にして形成されたポリ
ヌクレオチドを、支持体とばりヌクレオチド間の化学結
合のアルカリ加水分解を含む一連の工程により、支持重
合体から分離し回収する。

本発明はｒオキシヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌ
クレオチド及び４すｒオキシヌクレオチド並びにポリ４
ｆチドを含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びＩＪ
　ｄ／核酸（ＲＮＡ）の化学合成に特に有用であり、天
然のＤＮＡ及びＲＮＡ、更に新規なりＮＡ及びＲＮＡの
合成が可能である。

本発明には広汎な種類の無機重合体が使用でき、例えば
シリカ、多孔質ガラス、アルミノシリケート類、ゲロシ
゛リケード類、アルミナや酸化ニッケルのような金属酸
化物、及び種々の粘土鉱物がこれらに含まれる。重合体
は使用する反応溶媒に実質的に不溶性で、支持体に最終
生成物のポリヌクレオシドを結合させる下記の出発ヌク
レオシドに対する化学結合を形成する之めの化学反応性
を当然除外すれば、工程中に用いる薬品に対して比較的
に化学的不活性なものでなければならない。

本発明の方法は、ヌクレオチド又はヌクレオシドで変性
し之無機重合物支持体を、一連の順序に従りた工程で処
理して、各工程で変性支持体上にヌクレオチドが付加結
合されて、最終的に所望の順序のヌクレオチドが得られ
る様にして行われる。

一連の工程とは以下の通りである。

（、）支持重合体と結合し之ヌクレオンド、即ちヌクレ
オシド変性支持体、に対する所望のヌクレオシドのホス
ファイト結合洸よるカッブリング、（ｂ）必要に応じ、
但し好ましくは支持重合体【結合しｔヌクレオチドの未
反応とドａキンル基の封鎖、（ｃ）段階（ａ）で形成し
たホスファイト結合の酸化によるホスフェート結合の生
成、セよび （ｄ）段階（、）に記載し定所定のヌクレオシドの封鎖
基除去により、これ等の工程からなる次のサイクルのｔ
めの反応基の再生。

段階ａ、　ｂ、　ｃ及びｄを最終のオリゴヌクレオチド
が得られるまで反復することによって、各ヌクレオシド
が支持重合体上に順次に付加され、その後加水分解反応
によってオリゴヌクレオチド０を支持体から取外すと同
時にオリゴヌクレオチド分子から封鎖基も除去する。封
鎖基の除去と支持体からのオリゴヌクレオチドの加水分
解脱離を２段階忙分けて行うこともでき、又その方が好
ましいが、これを−回の加水分解反応で行うこともでき
る。

ヌクレオシド変性支持体は、出発ヌクレオシドの３′−
又？ｉ５’−ＯＨにより、適宜のカップリング剤を用い
て無機重合体にヌクレオシドを共有結合でカノグリノグ
して生成する。これは出発ヌクレオシドの３′−又は５
’−ＯＨを封鎖して行い、封鎖してない方のヒドロキシ
ル基によってヌクレオシドと支持重合体をカップリング
剤で結合する。縮合が終了してから残余の反応基、例え
ばカルビキシル基等未反応のものは適宜な手段、例えば
、カルビキシル基を単純なアミンと反応させてカルピキ
シアミドにすること（よって封鎖することができる。

封鎖し７ｔ　３’−又は５′−ヒドロキシル基は後で封
鎖基全除去（、て遊離のヒドロキシル基とシ１．こ〕遊
離ヒドロキシル基を用いて、上記の段階（、）における
ようにホスファイト結合基を含む所望のヌクレオシドと
縮合させ得る。

カッ７’　＋Ｊング剤又は支持重合体上のカップリング
基の一種を、支持重合体と出発ヌクレオシド又はオリゴ
ヌクレオチドと共有結合させる之めに用いる事ができる
。代表的な基としては中でもアミ７基、特に−級アミン
基、ヒトａキシル基、チオール基、スルホン酸基、亜燐
酸基及び燐酸基、特にその酸ハロゲン化物、就中順化物
及び臭化物、およびカルボキシル基７３Ｅ６る。これ等
の反応基は。

通常二価のアルキレン又はフェニレン基でその原子価位
置の一方が鎖状結合で占められ他方が反応基に着いてい
るものが好適である。そのようなヒドロキシカルビル基
は約１０以下の炭素原子、好ましくは約６までの炭素原
子を含むものが良く、アルキレン基は通常主鎖中１ｃ２
−４の炭素原子を含むものが好ましい。

支持重合体にヌクレオシドを結合する反応基の性質は、
必ずというわけではないが、合成工程の最後に、容易に
加水分解して支持重合体からオリゴヌクレオチドを離脱
せしめるものが好ましい。

必要ならば、上記のカップリング基は、支持重合体上の
友応基、例えばヒドロキシル基又はアミノ基と反応する
ようにヌクレオシド上に存在させることもできるが、通
常はカップリング基は支持重合体上にあることが好まし
い。

本発明の方法及びこれに用いる新規で且つ有用なヌクレ
オシド変性無機重合体は、特にオリゴヌクレオチドの迅
速な合成工程並びに高収率、高純度を特徴とするオリゴ
ヌクレオチドを提供する点忙ち・いて優れている。各々
のモノヌクレオチド付加には、最大２〜３時間と要する
が、収率Ｆｉ９５％又はそれ以上が得られる。更に、オ
リゴヌクレオチドの分子量が増大してもこれ等の収率は
変ることはない。

本発明は種々の無機重合体を用いて行う事ができるが、
以下ではシリカグルを支持重合体として用いてより詳細
にその説明を行う。特釦好ましいシリカグルは高性能液
体クロマトグラフィー（ｈｐｌｃ）Ｋ用いる開口の大き
い多孔質シリカである。更に本発明の説明はデオキシヌ
クレオチドを用いて行うが、す？ヌクレオチドを代りに
用いても同様の結果を得ることができる。

以下の説明に用いる用語、ヌクレオシド、ヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチドは、２′位萱のヒドロキシル
基が無いという点のみが相違するデオキシ類を含むもの
として用いる。従りてこれ等の用語は２′位置の置換基
がＨ又は０）（（以下の説明では、式１．　　Ｉ［、Ｉ
ｌｌにおいて置換基Ａとして示す）である構造のものを
含む。

（Ａ）〔ヌクレオシド変性支持体の製造〕シリカダル支
持体は、好ましくは水酸化アンモニウムのような弱塩基
で容易に加水分解し得る結合によって７リ力ダル支持体
に結合していることが望ましい。このような結合は、支
持体にカルボキシル反応基全売づ結合させるか、或はエ
ステル化によってヌクレオシドにエステル結合を前以っ
て形成し、次いでエステル化酸部分によって支持体にエ
ステル化ヌクレオシドｔ−ａ合させる事により達成する
。

これら実施方法の１つは以下の工程により行う。

（１）シリカゲルを、これに共有結合で結合したアミノ
アルキル基又はヒドロキシアルキル基を含むマトリック
スに変える； （２）アミノアルキルシリカ又はヒドロキシアルキルシ
リカをジカルボン酸と反応させて、アミド結合又はエス
テル結合並びにカルボキシル基による反応性を形成する
； （３）未反応の７ラメールＯＨ基？封鎖する：（４）シ
リカの遊離カル設キシル基と所定のヌクレオシドの遊離
ヒドロキシル基（３′−又は５’−）？縮合させる；お
よび （５）未反応のカルボキシル基を、非反応性誘導体、例
えばアミドの形態にして封鎖する。

他の実施方法は次のような手順で行う。

（１）シリカゲルをアミノアルキル基又はヒドロキンア
ルキル基を含むマトリックスに変える；（２）未反応の
シラノールＯＨ基を封鎖する；（３）得られ比変性シリ
カゲルに１ノカルボン酸の半エステルを含むように変性
し九所定のヌクレオンドノ遊離カルゴキシル基をアミド
結合又はエステル結合により結合させる；および （４）支持体シリカゲル上の未反応アミノ基又はヒドロ
キシル基を、例えば無水酢酸で封鎖する。

同一の反応物質から出発すれば両方法は共に同じ生成物
を生ずるが、第二の方法の方がシリカゲル上に付着する
ヌクレオシドの量の制御かより容易であるので好ましい
。更に、第二の方法では、シリカゲルに付着するヌクレ
オシドの量が多くなる（第一の方法が１０〜４０μｍｏ
ｌ／Ｐであるのに対し約１００〜１２０μｍｏｌ／Ｓ’
である）ヌクレオシドのシリカゲルに対する結合は、５
’−ＯＨよりも３’−０１４で行い、次のヌクレオシド
とホスファイトにより５’　−０）（で結合できるよう
くすることが好ましい。そうすれば、付加するヌクレオ
シドの結合は３′−で起り、５’−ＯＨは更に付加すべ
きヌクレオシドとの結合に用いられる。

従りて夫々３″−ＯＨ及び５’　−ＯＨで所望の結合を
生成する之めには、上記のカップリング反応により出発
ヌクレオシドｉ　３’　−ＯＨでシリカゲルに結合させ
る。これは５’−０ｆ（？、例えば、ジメトΦシトリチ
ル基のよつなトリチル基を用いて封鎖する事で達成でき
る。トリチル基は３’　−ＯＨカップリング反応が起っ
た後で容易に除去できるので好ましい。

出発ヌクレオシドがアミノ基を含む場合、例えばグアノ
シン、アデノシン、シチノン％ｒオキシグアノシン、デ
オキシアデノラン及びｒオキシシブノンの場合は、アミ
ン基を例えば酢酸、安息香酸、イン酪酸又は同類の酸を
用いて公知のアンル化法により封鎖することが好ましく
、そのような封鎖基は都合の良い時釦、通常最終オリゴ
ヌクレオチドが得られ比後で、除去する事ができる。

アミノアルキル基をシリカゲル上に導入するＫは、アミ
ノアルキルートリアルフギシシラ／反応による。この反
応は例えばトルエンのような溶剤中で還流しながら数時
間行うのが普通である。適当な反応剤としては、アミン
ｆｅＩピルトリエトギ７７ラン、４−アミノブチルトリ
メトキシンラン、４−アミノブチルトリエトキシシラン
、２−アミンエチルトリエトキシシラン等がある。

シリカゲルとｒオキシヌクレオシド間のエステル結合の
形成〈用いるジカルボン酸は、コハク酸、グルタル酸、
アジピン酸、７タル酸、マレイン酸、その他好ましくは
炭素原子数１０迄の脂肪族並びに芳香族ジカルボン酸の
如何なるものでも良い。ジカルボン酸くよるステル化は
モノエステル化カ確実に起こるように酸無水物を用いる
ことか最適である。

生成物、部ちヌクレオシド変性シリカゲルは以下の弐に
よって示すことができる： あ 式中Ｂはヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド塩基で
、Ｐは支持体シリカと共有結合基を表わし、次の式： ％式％ で表わされるもので、式中ｎは１−５の整数で、２は炭
素原子数１０迄のアルキル、アルケニル、シクロアルキ
ル、アリル及びアラルキル等を含む２価のとドロカルビ
ル基である。ＡはＨ又はＯＲで、ＲはＨま之は例えばト
リチル、メトキシトリチル、ノメトキシトリチル、ノア
ル中ルホスファイト、−′ぐリルイソプチロキシカーポ
ニル、ｔ−ブチルジメチルシリル、その他の封鎖基でわ
る。

〔ホスファイト結合オリゴスクレオンドの形成〕デオキ
シヌクレオシド変性シリカゲルと所定のヌクレオシドを
結合する場合、／リカデル上のデオキシヌクレオシドの
５’−ＯＨト所定のヌクレオシドの３’　−ＯＫの間の
トリエステルホスファイト結合によって縮合させる。ホ
スファイト結合は先ずシリカゲル上のヌクレオシドの５
’−０ＨＫホスフアイト基を導入し、次いで付加するヌ
クレオシドと３’　−ＯＨＫより縮合させることＫより
行う。

更に、より好ましくは、付加するヌク７オシト。

の３’　−ＯＨＫフォスファイト基を導入しく５’−０
Ｉ（は予めトリチル化して封鎖しておく）、得られ友ヌ
クレオシドホスファイトｔンリカグル上のヌクレオシド
の５’−ＯＨと反応させる。

デオキシヌクレオシド変性シリカゲルは、シリカゲル上
のデオキシヌクレオシドの３’　−ＯＨトｉ定のヌクレ
オシドの５’−ＯＨとの間にトリエステルホスファイト
結合を形成する事によっても所定のヌクレオシドと縮合
させる事ができる。ホスファイト結合はシリカゲル上の
ヌクノオドの３’−ＯＨに、先ずホスファイト基を導入
し、次いで付加するヌクレオシドの５’−０Ｉ（と縮合
させる事で出来る、或いは、より好ましくは、ホスファ
イト基を付加するヌクレオシドの５’−０Ｈ（３’−Ｏ
Ｔ（は予めトリチル化して封鎖しておく）Ｋ導入し、次
いで得られたヌクノオシドホスファイトをシリカゲル上
のヌクレオシドの３’−ＯＨと反応させる。

反応は以下の様に一般化して−示すことができる。

好ましい反応は以下の通りである。

ゐ 式中Ａ、Ｂ及び■は前記の定義の通りであり、Ｒは前記
定Ｉ！忙よる封鎖基、Ｒ工は低級アルキル基で、Ｘはハ
ロゲン、好ましくはＣＩ又はＢｒ、或はアミン窒素忙よ
り結合し九二級アミ７基でるる。

置換基Ｘで示される二級アミノ基岐、好ましくは、環状
構造内に不飽和結合を含む窒素複素環化合物の核窒素か
ら水素を除去して形成しｔものが良い。

窒素含有複素環類は、テトラゾール、ニトロイミダゾー
ルなどの置換イミダゾール、インドールピラゾール、イ
ミダゾール、ペンシイミグゾール、イノインドール、−
ロール、トリアゾール、ジオキサゾールなど及び類似の
複素環類、更にそれらの類似物質を含む。

Ｘがそのような二級基である場合には、生成物は、反応
性に富み、常温では不安定である。本製法によれば、こ
れらの化合物は適宜新ｔに得るものとする。あるいは、
封止容器内に、常に００Ｃ以下、通常−２０°Ｃ程度の
低温に保ち、単離した状態で保存する。

封鎖基Ｒｔ−除去すると、さら釦反応式■のヌクレオシ
ドの反応が起こる。繰返し反応を行うと、共有結合基、
例えば、エステル基によりシリカゲルに付着し之一連の
ヌクレオチド類からなるポリヌクレオチドが得られる。

ホスファイト結合基は、（本明細書に既に定義され几様
に）／・イドａカルビルホスホロシクロリグイト、例え
ば、メチルホスホロノクロリダイトとの反応により、好
ましくは、有機アミン等の塩基の存在下に付加され次ヌ
クレオシドの５’−ＯＨ位又は３’　−ＯＨ位置におい
て、シリカゲルのヌクレオシド部分に導入される。反応
式■の生成物は、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性
ガスの雰囲気中で、約１週間、及び−２０°Ｃの低温で
溶媒中に保存することができる。

反応式Ｉと反応式■の化合物の反応は、有機アミン等の
塩基、好ましくは、ビリノン、ルチゾン及び類似するア
ミン類等の第３級有機アミンの存在下で行なわれる。

〔封鎖反応〕

／ｌのヌクレオシドが、シリカゲル支持体に付着したヌ
クレオシド又はオリゴヌクレオチドにホスファイト結合
により縮合された後は、シリカゲルに付着し几そのヌク
レオシド又はオリゴヌクレオシド（少量ではあるが、約
１〜５チ）は追加されたヌクレオシドと反応しない。好
ましくは、この未反応部分は、異質の配列のデオキシオ
リゴヌクレオチドの生成を防止する之めに、密封又は封
鎖されると良い。この密封又は封鎖工程は、非常に反応
性に富む亜燐酸と反応させ、５−ホスファイトエステル
基、すなわち比較的非疎水性のトリエステルを形成する
。例えばジエトキシトリアゾリルホフフィンはジエチル
ホスファイト−５′−デオキンヌクレオシドトリエステ
ルを得るのに使用することができる。相当するゾ低級ア
ルフキシ窒素含有複素環ホスフィンは、テトラゾイル、
イミダゾイル及び４−ニド−イミダゾイルホスフィン等
のトリアゾイルホスフィンの代りに使われ、相当するジ
低級アルキルトリエステルを生成する。このような窒素
複素環ホスフィンは相当する塩化ホスフィニルから作る
。当然ながら、塩化ホスフィニルはヌクレオシドをホス
フィニル化するのに使われるが、窒素複素環ホスフィン
の方が収率が高くなるので好ましい。

無水酢酸のような酸無水物及びフェニルインシアネート
のようなアリールイノシアネートは従来の封鎖基又は密
封基として使用することができる。

しかし、これらは未封鎖５′−ヒドロキシル基に対する
反応性が低１ハ。無水酢酸等の酸無水物との酢酸化が、
第３級アミン、特にジ低級アルキルアミノピリジン、例
えばツメチルアミノピリジンの雰囲気中で行なわれると
、急速にアシル化が進み、この反応は特に５′−ヒドロ
キシル基の封鎖に適している。ノアルキルホスフエート
密封基も使うことができる。生成されたトリエステルは
、比較的非疎水性を有し、好ましい精製法としては、非
疎水性副産物を、疎水性５’−０−・ジメトキシトリチ
ル基を含有する生成物から確実に分離する逆相高性能液
体クロマトグラフィーを使用することである。

ヌクレオシドを加える前に、シリカゲルの未反応シラノ
ールヒドロキシ基を封鎖するには、好ましくは、炭素原
子数１０以下のヒドロカルビルモノカルボン酸類、例え
ば酢酸、安息香酸、イソ酪酸及びナフトエ酸によるアシ
ル化によって封鎖することができるが、好ましくは、塩
化トリアルコキシシ　リルを使う方がよい。

〔亜燐酸から燐酸への酸化〕

酸化は通常ヨウ素を酸化剤として用い、標準の方法によ
り行う。あるいは、酸化は過酸化ｔｅｒｔ　−グチル、
過酸化ベンゾイル等の過酸化物およびヒトａ／イーオキ
ンド類等との反応により行うこともできる。過酸化水素
の使用は、不要な副産物を生成するので好ましくない。

最良の収率を得る之めに、ヌクレオシドの縮合全頁に行
う前に酸化を行う。すべての縮合反応が完了するまで酸
化工程を延期すると、不要な副産物の生成忙より収率が
低下する。

封鎖基の除去は、室温であっても、ま之は高温であって
も、水酸化アンモニウム等の弱い塩基を用い公知の方法
により行う。

段階的に封鎖基を取除く場合、まずジオキサン又はテト
ラヒドロフラン等の溶媒中で、トリエチルアンモニウム
チオフェノキシドを用い、メチル等のアルキル基をホス
７オトリエステルから除去する。その後、この生成物を
室温（２０’Ｃ）　Ｋて、水酸化アンモニウムで処理し
、オリゴヌクレオチドと支持体を結合するエステル基を
加水分解する。

さらに、アセチル基、ベンゾイル基およびインブチリル
基等のＮ−アンル封鎖基は約１２時間、５０°Ｃに加熱
し除去する。

トリチル封鎖基の除去は、ＡｌＣｌ　ｓ　ＢＦ　ｓ　’
ｒｉｃｔ４等のルイス酸によっても効果的に行ない得る
が、特に臭化亜鉛を使うとり利である。この反応には、
テトラヒドロフランや、ニトロメタンとメタノールなど
の低級アルコールの混合液が溶媒として使われるが、通
常は溶媒としてニトロメタンを使う。

さもなければ、トルエン−スルホン酸等のプロトン酸を
封鎖基の除去に使用する。プリンヌクレオシド含有生成
物の場合には、しかしながら、プロトン酸類を使用する
と脱プリン化が生ずる。従って封鎖基をプリン含有生成
物から除去する場合には、ルイス酸類を使用することが
好ましい。

上記の方法により、１０〜３０ヌクレオシド単位迄のヌ
クレオシドを含むオリゴヌクレオチドｔ−ｉ造できる。

オリゴヌクレオチドは、Ｔ４−　リガーゼ及びＴ−４キ
ナーゼにより周知の酵素学上ＤＮＡ配列を形成すること
ができる。

加水分解後得られた生成物は、無機支持重合体と分離し
几後、標準の方法により精製する。最終精製は、好まし
くは、上記のように５′−〇−ノメトキシトリチルオリ
ゴスクレオチドの逆相ｈｐｌｃ　Ｋより行ない、次に、
酢酸等の低級脂肪酸を使用しノメトキシトリチル基を除
去する。

添付の図面は本発明の装置の概略的工程を示すものであ
る。

より詳細に、かつ図面を参照し、装置を以下に説明する
。カラム１０には固体シリカケ９ルマトリクス１２を充
填し、本明細書に記載のように誘導体化する。

弁１４は、弁制御装置１５疋より適宜にプログラムされ
、容器１６．１Ｂ、２０及び２２０４種の活性反応物質
、並びに容器２４及び２６の洗滌溶媒を選択する。

順序に従い他の容器に関係なく、個別の容器を弁１４に
より選択することができる。従って、例えば、容器１６
から反応物質を選択し、その直後に容器２４から洗滌溶
媒を選択する。これらの反応物質は、本発明の方法によ
れば、生成物鎖を長くするｔめに必要であり室温に保持
されている。

弁２８は、容器３０，３２．３４．３６及び３８中の５
　ｆ、！■ヌクレオシドー活性ホス７アイトトリエステ
ル、及び容器４０の洗滌溶媒と全適宜選択するように制
御装置　１５’によってプログラムされている。再記す
るが、弁２８は、上記のように（混合による汚染を防止
するように）独立し比選択が可能である。

さらに、容器３０〜３８は付加物？−７８°Ｃに保持し
、この＠度において弁２８は中の物質の通過が可能であ
るように設計されている。

弁４２は、容器４４と４６の溶離剤と容器４８の洗滌溶
媒とを選択するようにプログラムされ比制御装置１５１
′によって制御されている。これらの反応物質と溶媒は
、カラム１０の支持体マトリックス１２からオリゴヌク
レオチドを溶離するのに必要であり、室＠に保持される
。

弁５０は、イン７６５６と協働して、溶媒、反応物質、
又は付加物を弁１４．２８．及び４２から弁５２へ選択
的に通す。そして、この弁５２は、弁制御装置（図示せ
ず）の適切な制御によって、カラム１０と紫外線検出器
５８ｆ：介する流路、あるいはカラム１０ｔ−介するリ
サイクル処理２還択する。紫外線検出器５８は適切な帰
還制御手段（図示せず）によって、システムを制御する
のに使用される。

システムのプログラム動作を概略的に以下の表１に示す
。この７０．ダラムは、１つのヌクレオシドを付加し、
支持体１２からヌクレオシド鎖を脱離する方法を示す。

システムは１つ以上のヌクレオシドを付加するように拡
大及び／又は変更することかでき、またシステム全体は
、適切にプログラムされたマイクｅＩ′ｆｅＩセノサコ
ンビーータによす動作されることが望ましい。

本装置は、自動化された操作ＫＩ？ＨＣ適用されるが、
その詳細は当業者に自明である。

本発明の変性ソリカケ０ル製造における出発物質として
使用されるシリカゲルは特に限定されない。

粒径が５μｍ〜約１，０００μｍの範囲のノリカケ０ル
粒子を用いることができるか、１０μｍ〜約５０μｍの
粒径の粒子のものが望ましい。同様に細孔径も特に限定
されないが、５０λ〜２，０００＾の範囲であることが
望ましい。

本発明の変性シリカゲルによれば：（１）活性化された
ヌクレオチドを比較的迅速に拡散することができ；（２
）膨潤を防ぐことができ；（３）反応物質を吸収しない
。さらに１本発明の変性シリカゲルは。

（１）殆どの溶媒に不溶であり；（２）支持体マトリッ
クスとして使用された時Ｋ、溶媒や不要な反応物質をマ
トリックスから容易に溶離する一方、所望の反応生成物
を所定の場所に保持し、かつ所望の反応を継続させるこ
とができる。

出発反応物質を生成する之めに、　オリゴヌクレオチド
鎖の出発ヌクレオシドと反応する変性シリカゲルは当業
者にとっては周知の方法により得られる。出発ヌクレオ
シドのとドロキシル基（３−又は５゛−）と反応するに
適したシリカゲルの表面上に多種の官能基を有する生成
物は、米国特許第３，５１９，５３８号、第３，４１９
，５１７号、第３，６５２，７６１号及び第３，６６９
，８４１号に記載され念方法等の公知の方法；（より得
られる。

本発明の好ましい方法によれば、アミノアル牛ルシラン
誘導体と反応させることによって、例えば、トリエトキ
シ−３−ｆｏピル／う／のヨウナトリアルコキンー３−
アミノプロピルシランをシリカ支持体と反応させること
によって、ンリカにアミノ官能基を導入して以下の共有
結合を生成し、Ｅｔ アミノ基を二塩基性カルゴン酸の一つのカルボキシル基
と反応させてカルピキシル官能性ｔｌｔ与すると、アミ
７基とカルボキシル基の縮合が起る。次に１適宜の封鎖
剤、例えば、トリメチルクロロンランやトリメチルブロ
モシランのようなトリアルキルハロンランによって反応
されていないンラノール基を封鎖するようｉｃ／１＋力
ｒル全処理する。

これにより得之カルピキシル化ンリカグルを、更て付加
しｔヌクレオシドの水酸基（３′−又は５′−）と反応
させることかで微る。

ま之は、上記のように、二塩基性カルゴン酸を選択され
比ヌクレオシドと反応させて３’−０位又は５′−０位
にモノエステルを生成し、エステル化基の遊離カルボキ
シル基を含み、これにより得られｔエステルをアミン化
ンリカと縮合させて、ヌクレオシドとシリカ支持体間に
同一の共有拮合？生成することも可能である。アミン化
ンリカｒルの未反応アミノ基は、酢酸、安置、香酸、イ
ソ酪酸等のモノカルボン酸くよるアシル化によって封鎖
することが望ましく、これＫは通常のアシル化の条件下
に酸無水物を使用することにより行なう。

第一ヌクレオシドとシリカ支持体との間の共有結合構造
は、特に限定されるものではなく、以降に行なうヌクレ
オシド付加サイクルにおいてヌクレオシドを保持するよ
うに実質上安定な共有結合が生成されればよい。従って
共有結合は、それ以降の反応条件に対して安定したもの
でなくてはならないが、適宜容易Ｋ　ｔＪ口氷水分解き
、ヌクレオシドの付加完了後に生成オリゴヌクレオチド
全回収できるものである。エステル結合及びアミド結合
は、特に所望の安定性を得るのに効果的であり、同時に
、ヌクレオシド付加完了後の容易な加水分解を弱塩基又
は強塩基で行い得る。

本明細書において、ヌクレオチド及びポリヌクレオチド
の記号は、「工ＵＰＡＣ（ＵＢ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ
　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕ
ｒａ　Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ　　（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ、　　９巻、　４０２２頁、　１９
７０年）」に準拠する。

以下に実施例により本発明を更に説明する実施例Ｉ Ａ、カルブ／酸基で官能化したポリマー支持体をシリカ
ダルを用いて調製した。

分離用シリカゲルは粒径２０μｍで、細孔径３００＾の
パイダック（Ｖｙｄａｋ　）　ＴＰシリカであり、これ
を出発物質として使用し念。シリカゲルをＬｉＣ１飽和
溶液入りのデシケータ−上に２４時間蓋い友。工程の最
初の処理は、乾燥トルエン中にてシリヵデル（２，６？
　）と３−アミノグロビルトリエトキ／シラ７（２，３
９゜０．０１Ｍ）ｔ−還流させて／リル化することであ
る。この場合、約１２時間還流させ、・／リル化が実質
的に完了しｔ後、反応混合物を冷却しトルエン溶１夜を
除去し念。このようにして得ｆｔシリル化ンリカグルを
次にトルエン、エタノール、更にエーテルで順次に洗滌
し、次に空気乾燥しｔ０無水コハク酸（２，５ｆ’、０
．０２５Ｍ）の水溶液ヲ、次にンラン変性シリカｒルと
反応させて、共有結合で結合し之ンラン側鎖の末端にカ
ルボン酸官能ｔｉｋ与え之。この後者の反応中に、例え
ば、　２Ｎの水酸化ナトリウムなどの塩基を添加してｐ
ＨＪ−４から６の間に保つ友。この反応を約６時間進め
友後、側鎖にカルボン酸官能基を有する変性シリカゾル
を水で洗滌し比ゆ次にメタノールおよびエーテルで洗滌
し、最後に室温の真空中で乾燥し比。変性シリカゲルは
、次に無水ピリシン中のトリメチルシリ／ｌ／りａライ
ド〔（ＣＨ３ン３ＳｉＣ１，１，０９Ｆ、０．０１　Ｍ
　）で、約１２時間還流させながら処理し比。得られ九
変性シリカｒルは、次に５チトリクａ口酢散水溶液で洗
滌し、次〈水で、更にエタノールおよびエーテルで洗滌
し之。真空中で乾燥し比後、変性シリカゲルのカルボン
酸官能性の生成率は約２５０μｍｏｌ／Ｓ’であつ之。

８、５’−０−ノメトキシトリチルｒオキンチミヂン（
１，１，７ｆ’、０．００２Ｍ）および上記人工程で得
之変性シリカダル（４ｆ’、０．００１Ｍカルビン酸官
能基）？、ジシクロヘキシカルゴノイミド（２，０６Ｆ
、　０．０１　Ｍ　）を縮合剤として使用して、無水ピ
リノン中で約４０時間反応させ友。変性シリカゲルの残
余のカルがン酸基は、ｐ−二）　Ｏフｘ　ノーｈ　（１
−４Ｆ、０．ＯＩＭ）ｉ添加し、次に１０チビイリジン
を含むぎりジンを添加（２５分）することＫよってブロ
ックし比。次に反応生成物を、テトラヒドロフラン、メ
タノールおよび最後にエチルエーテルで順次に洗滌した
。

次に、未反応カルボン酸が完全にブロックされているこ
とを確実にするために、生成物？ジシクロヘキシルカル
メジイミドおよびｐ−二トロフェノールで最初処理し、
ピリジン中のピーリジンで更に２回処理した。０．ＩＮ
ｐ−）ルエンスルホン酸のアセトニトリル溶液を使用し
て、ソメトキシトリチル基？除去しｔ後、支持体に付い
之チＳノ／の収率は、分光測光により、約４０ａｍｏ１
／ｆであることが解っ九。

実施例２ Ａ、ＬｉＣｌの飽和溶液の入ったデシクーター中に、シ
リカゲル（・ぐイグンクＡ、　　２！ＩＭ’）ｌ、約２
４時間入れ之。シリカゲルを５０Ｑａｔ／の丸底７ラス
：ｒＫ移し。

トルエン（２５０ｍ／）およびアミンｆ口ピルトリエト
キン７ラン（１３ゴ）を添加し次。フラスコを強固にン
ールし乏後、室温で懸濁液を約２４間入かに振とうし念
。懸濁し乏シリカゲルを入れ几フラスコを次に１８時間
還流させ友。還流を始める前に、沸石ｔ−１つ溶液に入
れ九。還流処理の後、シリカゲル懸濁液を遠心分離容器
に入れ、７リカグルを低速回転でイレット状にし友。上
澄液゛は静かに注ぎ出し、シリカゲルをトルエン（各８
０ｒｘｌ　ａ　回）、メタノール（各８０ｔｘｔ３回）
および１：１メタノール水溶液（各８０ｘｔＺ回）で洗
滌し九。次にＢｏＩＩＩＩＯｓｏｐ　メｐノール水溶液
中にシリカゲルｔ９！ｌ！させ、室温で一夜機とつし友
。再度、シリカゲル懸濁液を遠心分離容器に入れ、低速
回転させて分離と行り之。次にシリカゲルをメタノール
（各８０Ｍ２回）およびエチルエーテル（各８０１Ｌ１
３回）で洗滌し之、１後に、シリカゾルを６時間空気乾
燥し次に真空中で乾燥し友。

シリカゲル金丸底フラスコに入れ之。無水ピリノン（５
０ｍ／）およびトリメチル７リルク。ライドの溶液を添
加し、その懸濁液を室温で一夜機とぅし之。シリカゲル
は低速遠心分離によって分離し之。次にシリカゲルをメ
タノール（各８０ｍ１５　回）およびエチルエーテル（
各８０１＋＋／３回）で洗滌した。

シリカゲルｆ！−６時間空気乾燥し、更に真空中で乾燥
した。

Ｂ、無水ピリジン（ＳＲ／）およびＮ、Ｎ−ジメチルア
ミノピリジン（０，３Ｆ）からなる溶液中に、　　５’
−０−ジメトキシトリチルおよびＮ−保護デオキシヌク
レオシド（２，５ｍｏｌ）を添加し之。無水コハク酸（
２，０ｍｍｏｌ、　０．２ｆ）を加え、その溶液を室温
で１２時間攪拌し几。アセトニトリル：水（９：１、ｖ
／ｖ）の薄層りａマドグラフィーを、反応を追跡するな
めに使用することができる。未反応ヌクレオシドの町は
ほぼ０．８であり、一方生酸物はＲ（０，３からＲｆＯ
０５である。反応が完了しｔ後、ロータリーエバーレー
ダー中で溶媒を除去し、乾燥し次ガム状物質全トルエン
（１０ｘりに再溶解し之。ロータリーエ・ぐボレーター
でトルエンを除去シ、このトルエン共蒸発処理を繰り返
し之。ピリジンおよびＮ、Ｎ−ツメチル７ミノピリソン
を含まない乾燥ガム状物質をメチレンクロライド（３０
＊ｊ）中に溶解し次。この溶液を抽出漏斗に移し、１０
ｔｓの水冷クエン酸を加え几。激しく振とうし、抽出し
之後、有機相を水（各１５ｍ１）で２回洗滌し、次に硫
酸ナトリウム上で乾燥し友。硫酸す）　ＩＪウム上で乾
燥している間に脱トリチル化が起ることを最小限に止め
る友めく、約０．３ｒｔｔｌのピリジンをメチレンクロ
ライド溶液に添加し之。このメチレンクロライド溶液を
１０ｘｔｌに濃縮し、ヘキサン：エーテル（１：１、ｖ
／ｖ１２５０ゴ）で、クエン酸化ヌクレオシド誘導体に
より分離し比。沈澱は遠心分離で集め真空中で乾燥し念
。

ニドｏ　フェニルエステ”　ｋ　４　ル之’Ｊ　Ｋ　ｉ
　クエン酸化ヌクレオシド（１ｍｏり？、ピリノア（０
，３ｍ／）を含む無水ジオキサン（３扉ｔ）中に溶解し
之。次にＤＣＣ（１０ｍ　ｍｏｌ、　０．２２２）およ
びｐ−二）　ｏフェノール（０・１１’・１ｍｍｏｌ）
を添加し、溶液を２時間振とうし乏。ノンクロヘキシル
尿素を遠心分離により除去した。アセトニトリル：Ｈ２
，Ｏ（９：１、ｖ／／ｖ）中のｉ’ｌ／ｉｔククマトグ
ラフィーによる分析の結果、生成物のｎｆハ０．８で８
つ次。このノンクロヘキシル尿素を含有しない上澄液は
シリカｒルＫｌ接結合させる九めく用いることができる
。

この実施例の人工程で得次シリカｒル（５ｏμｍｏ＋ヌ
クレオシド／２を望む場合には５　ｆ、　Ｚｏｏμｒｎ
ｏｌヌクレオンド／ｆを望む場合には２．５９　）を乾
燥１）ＭＦ中に懸濁させ念。ｐ−ニドｅｌフェニルフハ
ク酸化したヌクレオシド誘導体（上記により調製しｔ上
澄液）をシリカゲル〈加え、その懸濁液を２時間振とう
し友。このシリカゲルの一部（約１ａＦ）を分析用に採
取し比ゆこれｉｆ）ＭＰ（２回）、メタノール（３回）
およびエチルエーテル（２回）で洗滌し１Ｌ　アセトニ
トリル（１Ｆ！／）にｌＪ、ＩＭのトルエンスルホン酸
を加たもの？添加しｔ０シリカから放出されたトリチル
は赤橙色であっ之。この分析は必要であれば定量的に行
うこともできる。もしこの分析結果が溝足すべきもので
あれば（即ちトリチル陽性テスト）、シリカゲル全体ｔ
−ＤＭＦ　（各１０ゴ、３回）、ジオキサン（各１０ｘ
ｇ１３回）、メタノール（各１０ａｔｌ、　３回）およ
びエチルエーテル（各１０ｆｆｉｔ、３回）で洗滌する
。次に未反応のｎ　−プロピルアミノシリル基を無水１
ｈａ　（０，７エｌ）と乾燥ピリジン（５ｍｌ　）の溶
液でブロックし几。シリカゲルは遠心分離により単離し
、上澄液をとり、メタノール（各１０ｘ＃、４回）およ
びエチルエーテル（各ＩＱｄ、　２回）で繰返し洗滌し
た。

ｎ−プロピルアきノ基のブロッキングの完全さの測定は
以下の通りである。

以下の試料（１岬）を採る： （１）誘導体にしてない・ぐイブツク（Ｖｙｄａｃ　−
Ａ　）。

（２）アミノ′ｆａピルトリエトキシシランで誘導体に
し之パイダック。

（３）ヌクレオシドを付加し、次に無水酢酸でブロック
し次ペイグック。

次に各試料を０　、２１＋９／ｄの硫酸ピクリルを含有
する２５０μｔの飽和ホウ酸ナトリウムで処理し之。こ
の試料を遠心分離し比。誘導体忙しないパイダックは白
いｔｔでなければならない。アミノ７６ｅｌビルシリル
Δイダツクは明るい赤橙色である。ブロックしたパイダ
ックは淡い橙黄色である。これは多分硫酸ピクリルとヌ
クレオシドの環内窒素との反応によるものと思われる。

ある場合くけ、コハク酸化し九ｎ　−７’　ａピルアミ
ノ基はコハク酸の存在によＩ）＠こる。このコハク酸は
、コハク酸化におＡて全ての無水コハク酸が消費されな
かった場合、あるいはクエン酸による水性抽出中・Ｋコ
ハク酸が除去できなかった場合（生ずる。もしフハク酸
化ｎ−ｆｅＩビルアミノ基が存在する場合には、次のよ
うな方法でグロックすることができる。コハク酸化ヌク
レオシドを含む保護し几シリカゲル（５ｆま之は２．５
Ｐ）をＤＣＣ（０，２８ｆ　）とｐ−ニトクフェノール
（０，１６５’）とを含有する乾燥ピリジノ（５ｒａｔ
　）中に懸濁させ、室温で一夜振とうし念。次にモルホ
リン（０，２ｒｒｔｌ）ｋ添加し、壓濁液を１０分分間
上つし友。遠心分離も・よび上澄液の除去によりシリカ
ゲルを分離し、メタノール（各１０ｍ１．４回）、ＴＨ
Ｆ（各１０ｒｒｔｌ、　３回）およびエチルエーテル（
各１０ｒｎｌ、　３回）でシリカゲルを洗滌し次。空気
乾燥の後シリカゲルを真空中で乾燥し比。

トリチルカチオンの定量分析、ヌクレオシドの７リカグ
ルへの付与は次の通りに行なう。

１、約１■の乾燥シリカケ９ルを正確に秤量する。

２、　０．１Ｍトルエンスルホン酸のアセトニトリル溶
液１　ｒａｔを添加する。

３、　４９８　ｎｍで吸光度を測定する。もし吸光度が
２．０に近付い之場合には希釈して再測定する。

付着量は次の式により計算する。

もし５２のシリカ）ｆ　ｔｂ　ｆ使用した場合には、付
着量は約４０μｍｏ１１５’である。もし２．５２のシ
リカゲルを使用した場合には付着量は約１００μｍｏ　
ｌ　／　？である。

実施例３ ０．８当量のメチルホスホロノクロリダイトおよび５当
量のコリジンのＴＨＦ溶液に一７８°Ｃで１．０轟量の
５′−〇−ノメトキシトリチルチミノ／を添加すること
により、ｒオキシテミソンホスホモノクロリダイトを合
成し乏。生成し之化合物およびチミジン変性シリカゲル
母体はオリゴヌクレオチドの合成忙使用する。第一工程
ではガラス塔にチミノン変性シリカｒルを充填する。こ
の塔には一連の弁と・ザイグを経て４ングおよびインノ
エクターループ？取付ける。この装置は反応剤を筒中を
リサイクルさせ、ま之は排出し之り採取しｔりできるよ
うになっている。支持体に付けるチミノルテ１呵ノンの
合成工程は次の通りである。

（１）　ＴＨＦおよびコリノン中のデオキ７チミノンホ
スホモノクａリダイトを変性ンリカグル塔に一時間通し
て還元する；（２）水／２．６ルチジン／ＴＨＦ中の０
．０１ＭＩ２でポリマーに支持されたノヌクレオシドホ
スファイトとホスフェート九酸化する（３０分）；（３
）　ＴＨＦ中のフェニルイノンアネートおよび２，６ル
チノンを１．５時間塔にリサイクルする（この反応剤は
、ホスホリル化してないヌクレオシドヒドロキシル基と
反応することによる不都合を除去すル）；（４）トルエ
ンスルホン酸の７セトニトリル溶液で塔′ｔ−２分間洗
滌する。これらの全工穫は室温で行なっ之。各工程の後
の各種の洗滌サイクルを含み、１つのヌクレオチドの付
加に要する時間は約４時間である。シリカグル母体に付
は九二つのオリゴヌクレオチｌ’ｄ（Ｔ）７およびｄ（
’ｒ）、の収率を良くする之めに、この４工程を何回か
繰返す。

上記と同様の工程はｄ（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ）ｔｌ−調製するために使用される。このシトシ
ンを含有するホスホモノクロリグイトは５゛−〇−ジメ
トキシトリチルーＮ−ベンゾイルｒオキシシチジンから
調製する。

実施例４ 〔支持体からオリゴデオキシヌクレオチドの除去および
生成化合物の特徴〕 オリゴデオキシヌクレオチド（ｄ（Ｔ）７、ｄ（Ｔ）、
、ｄ　（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ　）を保
護基から遊離させ、単離し、特徴を調べる。トリエチル
アンモニウムチオフェノキシドのノオキサン溶液を使用
してホスホトリエステルからメチル基を除去する。

この工程の後、濃ＮＨ４ＯＨで処理し、シトシンからＮ
−ベンゾイル基を除去し、かつ支持体からオリゴヌクレ
オチドを遊離させた。高速液体クロマトグラフィーによ
れば、各合成の主生成物は上記の七量体および各九量体
であることが解った。最初〈支持体に結合してチミジン
の量から、　　ｄ（Ｔ）、の単離収率は約２５％で６つ
九。ｄ　（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ）の同
様の収率は約２３％であった。

九量体および七量体を生化学的に試験を行う之。

これらのすべての化合物は、スネーク・ペノム（Ｓｎａ
ｋｅＶｅｎｏｍ）ホスホジェステラーゼにより完全に分
解することが解った。各九量体の合成により単離し之オ
リゴヌクレオチドは％　（５’−３２Ｐ　）　ＡＴＰお
よびＴ４−キナーゼを用いてホスホリル化し、次Ｋｌ’
ル電気泳動を行ない、後にスネーク・ペノム・ホスホノ
エステラーゼにより部分的に分解することによって分析
し之。この分析により、オリゴスクレオチドは均一であ
り、９閂のヌクレオチド単位を含有していることを確認
し次。（５’　−３２Ｐ　）　ｄ（ｐＴ　−Ｃ−Ｔ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ　）の連続を確認する之めに、サ
ンプルを二次元ホモククマトグラフィーで分析し念。連
続プロフィルは期待した結果の（ｓ’−３２ｐ）ｄ　（
ｐ’ｒ−ｃ−Ｔ−ｃ−’ｒ−ｃ−’ｒ−’ｒ−’ｒ　）
　Ｋ一致し之。最後に、（５’　−３２Ｐ　）　ｄ（ｐ
Ｔ）ｇｔ”　Ｔ４−！Ｊ　Ｎ−セオヨＵポリｒオキシア
ｒノシンの存在下に重合させ九結果、〔５−３２Ｐ　）
　ｄ（ｐＴ）、は、ポリｒオキシアデノシンシてより倍
量体を生成し、この倍量体は、Ｔ４−１７ｆｆ−ゼによ
り確認され比。従って、　　ｄ（’ｒ）、およびｄ（ｒ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ　）は試験し次範囲
に関する限り、生化学的に活性であった。

実施例中において、シトシン、アデニンおヨヒグアニン
などのアミノ基を保護する。これらの基を保護すること
は木工８において必要なことではないが、ヌクレオシド
の適宜の溶媒て対する溶解ＩＩｌを高める。ベンゾイル
、トリチル（前記の如き）またはインブチリル基は適当
な保護基を形成する。

しかしこの工程を変化させずに他の基を使用することも
できる。良好な収率で生成し得る保護され之ヌクレオン
ドは５′−〇−ノメトキシトリチル・デオキシチミゾン
（ＤＭＴ　ｒｄ　（Ｔ）　）、５′−〇−ジメトキシト
リチルーＮ−ベンゾイルｒオキシシチジン（ＤＭＴ　ｒ
ｄ（ｂｚＣ））、５′−〇−ノメトキシトリチルーＮ−
ペンゾイルデオキシアデノシｙ（ＤＭＴ　ｒｄ　（ｂｚ
Ａ）　）、および５′−〇−ジメトキシトリチルーＮ−
インブチリルｒオギシグ７ノシン（ＤＭＴ　ｒｄ　（ｉ
　ｂＧ）　）。デオキシアデノフン忙よる典型的な合成
工程は次の通りである。

実施例５ この実施例では、プリンデオキシヌクレオチドの使用に
ついて説明する。

ＤＭＴ　ｒｄ　（ｂｚＡ）　（０，６６１％１　ｍｍｏ
ｌ）を乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）に−加え−たものをメチル
ノクロロホスファイト（０，１１３ｍ／、　１．２ｍｍ
ｏ＋）および２，４．６−）リメチルピリジン（０，６
３３ｍ／、　４．８ｒｒ＋ｍｏｌ）ｉ含むＴＨＦ（３ｍ
／）溶液中に攪拌しつつ一７８°Ｃでアルゴン雰囲気中
において滴下する。−７８°Ｃで１０分経過し乏後、反
応液を焼結ガラスＦ斗でＦ遇し、真空中で４Ｍして溶剤
分除去する。生成し九粘物質をトルエン：　Ｔ！（Ｆ（
２，ｗ／、２：１）の混合液に溶解するととＫよって、
過剰のメチルホスホジクａリダイトを除去し、真空中で
再蒸発して粘物質を得る。ジクロリダイトの除去を確実
知する之めに、この工程を数回繰返す。ヌクレオシドク
ロリダイトはテトラゾライドに変える。最終の再蒸発だ
より得几粘物質をＴＨＦ（２コ）に溶解する。テトラゾ
ール（０，０６３Ｐ％０．９ｍｍｏｌ　）のＴＨＦ　（
２ｍ１）溶液を次にヌクレオシドホスホモノクロリダイ
トに、攪拌しつつ一７８６Ｃで滴下する。−７８’Ｃで
１０分間処理し比後、溶液を遠心分離管へ移し、低速で
回転させて、上澄液を除去する。この溶液は活性化ヌク
レオンドメチルホスホモノテトラゾライ端含有する。も
し直ぐに使用し逐い場合には、このテトラゾライドは、
乾燥ペンタン中に滴下して沈澱させ、沈澱を集めて真空
中で乾燥し、アルゴンま九は他の不活性ガスと共に封管
中に入れ、　−２０’Ｃで貯鳶すること罠より長期貯蔵
が可能になる。全ての操作は酸化を防止する為に１不活
性雰囲気中において行なう。活性剤は空気に触れさせな
い。

上記の処理は活性化チミジン、デオキシシチジンおよび
デオキシアデノシンヌクレオチドのｐ４ｍに有用である
。活性化デオキシグアノシンヌクレオチドの調製は、化
学量以外については同様である。ＤＭＴｒｄ（ｊｂＧ）
　：メチシソクロロホスファイト；２．４．６−　）リ
メチルピリノンおよびテトラゾールのモル比は１　：　
０．９　：　３．８　：　０．７である。変性シリカグ
ル支持体に１つのヌクレオチドを付けるために必要な工
程は次の通りである。ヌクレオチドからジメトキシトリ
チル基を除去することは、変性シリカグル支持体を０．
１ＭＺｎＢｒ２のニトロメタン溶液に１５から３０分接
触させることにより行なう。

次に支持体をブタノール：２，６−ルチシン：　Ｔ）ｆ
Ｆ（４：１：５容量）の混合液で最初洗滌し、後にＴＨ
Ｆで洗滌する。この工程はヌクレオシドの亜鉛エステル
を除去する九めに使用するので、溶剤比は重要ではない
。この工程は省略できるが収率が低下する。ＢＦ３、Ａ
Ｉ　Ｃ１３およびＴｊＣＩ４などの他のルイス散かＺｎ
Ｂｒ２の代りに使用できる。しかしＺｎＢｒ２が好まし
い。ま之：ｆａ　ｈン酸も使用できる。

！ａトン酸の量を２メトキントリチル基を除去する几め
の最少限にしても、各プリンの約３〜５チの脱プリンが
起こる。この工程の次の処理は保護され活性化し之ヌク
レオチドを支持体に共有結合し之ヌクレオシドま几はオ
リゴヌクレオチドにすることである。これは１０〜１５
当量の活性モノテトラゾライドを用い、約１時間反応さ
せることにより行う。溶剤は無水ＴＨＦである。この工
程は活性化モノクロリダイト、トリアシライドおよびニ
トロイミダゾライドの付加にも使用できる。しかし、テ
トラゾライドが最も良い結果をもたらす。

次の工程は未反応５°−ヒドロキシル基のグロノキング
である。これは無水酢酸、ツメチルアミンビリ・ノン、
ビリノンおよびＴＨＦの溶液を使用することにより達成
できる。また、２．６−ルチジン／ＴＨＦ（ｉ：５ｇ１
ｌ）中の０．３３Ｍツメチルモノトリアゾールホスファ
イト溶液を用いることにより達成できる。反応時間は５
分でｔＤす、後にＴＨＦ’で洗滌する。

他の方法としてはフェニルイノ／アネート／ルナノン（
４５：５５容ｔ）の溶液を用いて９０分反応させるとと
くより行なう。この溶液は次Ｋ　ＴＴ（Ｆとアセトニト
リルとで洗滌することにより変性シリカから除去する。

最初の方法が好適である。この工程は省略することかで
き、ま乏５′−ヒドロキシル基に反応し化学的に同等な
他の物質で置き換えることもできる。しかしこの工程を
実施することによって、所望のオリゴヌクレオチドの最
終精製が容易になる。このことは、支持体に対する全合
成物質の結合がかなり少なくなるからである。各サイク
ルの最終工程はホスファイトｔホスフェートに酸化する
ことである。種々の比率のものが使用できるが０．１Ｍ
Ｉ２の水／２．６ルチジン／ＴＨＦ（１：　１　：　３
　）溶液が好適である。更にＮ−クロロスクシンイミド
又はアリールあるいはアルキル／？−オキシドなどの他
の酸化剤も使用できる。ｔ−グチル・−一オキンドは酸
化剤として好ましい。所定の工程により適宜の活性化ヌ
クレオチドを付加し几後、上記のｄ（Ｔ）、の合成に記
載し之如くにして支持体からデオキ７オリデスクレオチ
ドを除去する。

本明細釜における式「の化合物は、窒素複素環式化合物
の等二級アミ／窒素のＫＭ＋を除去して生成し次第二級
アミノ基Ｘを有する新規な化合物であり、必要なリン化
合物を生成する之めに一部有用である。これらの化合物
は、反応性があり、従ってＸがハａグンである同様の化
合物よりも有効である。これらの化合物はＸが八ツｒン
である化合物から容易に調製することができる（例えば
実施例５に記載し之ようＫ）。ま几は所定のヌクレオシ
ドとハロ（２ａアミノ）−アルコ牛ジホスフィンとの反
応で得ることができる。

以下の実施例に複素環式アミノホスフィン化合物の用途
を例示する。特に実施例５においてはテトラゾライドの
調製および必要なリン酸結合の生成における使用につい
て説明する。

本発明の方法を採用することにより、各種のヌクレオシ
ドと共にテトラ／−ル、ニトロイミダゾールも・よびト
リアゾールを用いて、種々の化合物が得られ、対応する
ヌクレオシドホスホノモノアミンを得る。特忙これらの
化合物はヌクレオシドベースのチアミン、シトシン、ア
ｒノンンおよびグアニ／を含み、必要があれば７″ａノ
キング基例えばシトシンとアデニンのアミノ基忙対する
ベンゾイル基、グアニンのアミノ基に対するインブチリ
ル基などで保護される。

実施例６ 本実施例はグリンｒオキシヌクレオｆ　）”Ｏｆ’ｔ［
Ｋついて説明する。

Ａ、Ｉ（ＰＬＣ級ノシリカｒル（２Ｆ、パ（グノクＴＰ
−２０゜分離用、表面積１００ぜ／２、細孔径３００λ
、粒径２ｏμｍ）を約２４時間相対湿度１５チ（飽和Ｌ
ｉＣ１）に接触させ次。次に７リカ（２，Ｏｆ）を２０
’で１２時間３−トリエトキシシリルデミビルアミン（
２，３ｆ、０．ＯＩＭ）ルエン溶液）で処理し、トリエ
ライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　）乾燥管により１２時間還
流し九。この反応は磁気攪拌棒ではシリカゲルを粉砕し
てしまうので振とぅ機で行なりな。シリカは遠心分ｎＫ
より分離し、トルエン、メタノールおよびエーテルで各
２回づつ洗滌し、次に空気中で乾燥させｔ０ Ｂ、　このようにして生成し九シリカ（２？）とコハク
酸（２，５５’、０．０２５Ｍ）を水中で攪拌しカルＭ
ノ酸基を導入し之。２ＭＮａＯＨを添加することにより
ｐＨ？２〜６に調節し之。カルボキモル化反応の進行状
態はビクラートサル７エートテストにより試験し次。シ
リカの一部（約２■）を０．５ｄの０．１Ｍピクラート
サルフェート飽飽和ホウナナトリウム緩衝１ｐＨ１０）
で処理し念。最初のシリカは１０分以内に淡黄色になっ
几がアシル化し之生酸物は白いままであっ之。無水コハ
ク酸反応は、ビクラートサルフェートテストでシリカゲ
ルが白いままになるまで継続し念。通常全反応時間は１
時間であり、二度目の無水コハク酸の添加が必要であっ
た。順次に２回づつ、水、０．１ＭトＩＪり０口酢酸、
水、メタノールおよびエーテルで生成物を洗滌した後、
この化合物２を空気中で乾燥し、真空中で乾燥し、更だ
２５°Ｃで２４時間、トリメチルシリルクａ゛リド（１
，２５ｍ／、　０．０１　Ｍ　）を含むピリジン（７Ｍ
１／）で処理し、その生成物をメタノール（４回）およ
びエーテルで洗滌した。カルボキシル化の程度の分析は
２工程からなる。試料の一部を正確に秤量し、ノ／りａ
ヘキシル力ルゴノイＳ　ｌ’（ＤＣＣ）およびｐ−ニド
ミツエノールのピリノン溶液で処理する。テトラヒドロ
フランで数回ｌ１５！：破して未反応ｐ−ニトロフェノ
ールを除去した後、シリカグルに１０％ビ４リジンのピ
リノン溶液を添加し遊離し九ｐ−ニトロフェノールの量
’ｉｒ　ｓ　ｐ−ニトロフェノキシトの吸収率として１
．５７　Ｘ　１０’を用いて４１０ｎｍで測定し之。カ
ルボ／酸の付加量は２００μｎｏ　ｌ　／　ｆで６つ之
。

Ｃ，ＤＣＣｆｅ使用し、デオヤシヌクレオシドを前記生
成物と混合し九。乾燥ピリジン（２１ｍ／）中で５′−
〇−ジメトキ７トリチルチミノン（１，１？、　２．１
６ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２９，０，０１ｍｏｌ　）、お
よび２（４２，０，８ｍｍｏｌカル？ンカルを２日間攪
拌した。更Ｋｐ−二トクフェノール（１，４ｆ、０．０
１ｍｏｌ　）　ｋｍ加し、その混合物を更に１日間攪拌
し、モルホリン（ｌｘ／。

０、０１１　ｍｏ　１　）で反応を停止し念。メタノー
ルおよびエーテルで洗滌した後、シリカゲルの未反応カ
ルボン酸を分析した。通常最初のグロノキング処理で残
っている微量の遊離カルボン酸（＜１０μｍａｔ／Ｓ’
）を完全てグＣｌツクする之メにＤＣＣ（２５’、　０
．０１ｍｏｌ）およびｐ−ニド０７　ｇノー＆　（１，
４９％０．０１ｍｏ＋　＞乾燥ピリノン（２０ｍ／）溶
液およびｉｋ後にモル７オリン（ＩＪ！／）を用いる二
次処理が必要でろっ之。

５’−〇−ノメト午シトリチルチミジン、５’−〇−ノ
メトキシトリチルーＮ−ベンゾイルデオキシ’／ｆ−）
ン、５−０−ノメトキシトリチルーＮ−イングチリルデ
オキシグアノンンおよび５′−〇−ジメトキシトリチル
ーＮ−ベンゾイルデオキシアデノシンを以下の方法によ
り必要なホスホリルクロリド基を導入して活性ヌクレオ
チド忙変え之。

５−０−ジメトキシトリチルチミノ７　（１，６り、２
．９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（５ｍ／）溶
液を、Ｃ）Ｉ３０ＰＣＩ２（０，３３ａｔｌ、　２．５
ｍｍｏｌ　）およびコリジン（１，８６ｓｔ／、　１４
．１ｍｍｏ＋　）の無水テトラヒドロフラン（５Ｒ／）
溶液中に一７８°Ｃで攪拌しつつ滴下し几。滴下中に白
色の沈澱が生じた。混合物を一７８°Ｃで１５分間攪拌
し念後、焼結ガラス７斗で濾過してフリジンハイドａり
ａリドを除去し友。コリノンハイドミクロリドは無水テ
トラヒドロフラン（ＩＩＩｔ）で洗滌し之。Ｆ液を次に
乾燥トルエンで希釈し粘物質になるまで濃縮しｔ、乾燥
アルゴンを製蓋に入れｌｌ、）ルエン：テトラヒドロフ
ラン（２：１）の溶液を加えて粘物質が溶液中に完全く
溶解するまで放置し之。溶媒は真空中で＠硝して除去し
た。

トルエンとテトラヒドロフランを用いる再製ｍを３回繰
返し比。最後の濃縮の後、粘物質を乾燥テトラヒドロフ
ラン（３ｍ／）に溶解し、−７８°Ｃに冷却し、テトラ
ゾール（０，１８Ｆ、　２．６ｍｍｏｌ）の無水テトラ
ヒドロフラン（３ｍｌ）溶液を滴下し之。この添加中に
１コリジンハイドａりａライドの白色沈澱が生成した。

この混合物ｉ−７８’Ｃで更に１０分間攪拌し、次にア
ルゴンを満しｔ遠心分離管に、アルゴンの圧力と注入管
を用いて混合物を移し友。

遠心分離の後に回収し九上澄液はテトラゾリルホスファ
イト生成物を含有しており、デオキシオリゴヌクレオチ
ドの合成に直接使用することができる。ま九、テトラゾ
リルホスファイトは沈澱として保存し必要に応じて再生
成することができる。

前記のホスファイトすなわち、活性化ヌクレオチドは添
付図面て示し之自動化裟萱によってデオキシオリゴヌク
レオチド２合成するｔめに使用することができる。

（７’オキシオリゴヌクレオチドの合成〕装置はミルト
ン・ａイ・ミニーンプ、アルテックス（Ａｌｔｅｘ）三
方スライド弁、リサイクル弁（アルテックス弁の変形）
および注入ループ（アルテックス三方弁）からなる。全
ての結合はテフロン管で行い、リサイクル系中の管の容
量を最少にしである。塔は１１ｇ＋ｍのエース（Ａｃｅ
）ｆ！クラスラムであり、１ｒｒｔｌの容積になるよう
に短くしである。シリカ層を支持する几めにセルロース
フィルターを使用し之。使用する前に、無水酢酸および
ピリ・シン（１：１容量）の混合液を用い、５０°Ｃで
４時間フィルターをア七チル化し之。この装置のリサイ
クル系の全容量は約２．５ｍｌであり之。テトラヒドロ
フラン容器は窒素泡立器〈よって空気から遮断し、Ｚｎ
Ｂｒ２ｆｆｊ液はトリエライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　）
管により湿気から保護し友。

シリカに１つのヌクレオチドを付加するため【行なうべ
き各種の化学操作を次の表■に示す。

０．２５５’の３　（１０μｍｏ＋チミノン）をカラム
に供給し、シリカをニトロメタンで洗滌しｔｏ飽和Ｚ　
ｎ　Ｂ　ｒ２（約０．１Ｍ）のニトロメタン溶液ｔ−１
ｒｔｔｌ／　ｍ　ｉ　ｎのポンプ流速で供給してカラム
ｆ：７ラッシンダレ（３０分間）　、５’−０−ジメト
キシトリチル基を除去し之。

保護基の離脱状態は、淡橙色のジメトキシトリチルカチ
オンの生成を肉眼あるいは分光分析により測定すること
により追跡し友。４９８　ｎｍで吸光度を測定すること
により、前の縮合工程の完全さ全開　　・定した。この
工程に続いてｎ−ブタノール：２，６−ルチシン：テト
ラヒドロフラン（４：　１　：　５）の溶液で５分間流
速２　ｒｕｇ／　ｍ　ｉ　ｎで洗滌し友。次の工程では
乾燥テトラヒドロフランで５分間（５ｔｔｔｌ／　ｍｉ
　ｎ　）洗滌　　　１した。この洗滌工程の間、リサイ
クル弁および注入口に乾燥テトラヒドロフランを流し、
この洗滌の効果を２５４ｎｍで分光光度計を用いて試験
しｔ０次Ｋ、乾燥テトラヒドロフランを使用して再生し
比活性ヌクレオチドを用いて縮合工程を完了し比。

再生物の溶液はアルゴン中でドライアイス／アセトン浴
中に保存し九が縮合反応は室温で行なった。

再生し几堝會く、活性ヌクレオチド？このようにして保
存すると数日間安定である。０．５から０．８ｄのテト
ラヒドロフラン中の約１０当量の活性ヌクレオチド（０
，２５９の４に対し１００μｍｏｌ）を装置に生成し、
機器をリサイクルモードに切換え之。活生ヌクレオチド
はポンプ速Ｋ　２　ｗｌ／　ｍ　ｉ　ｎで１時間シリカ
グル中を循環し之。活性ヌクレオチドの一部と無水メタ
ノールおよび水の中へ採取し之。前記Ｏような分析によ
り、系中て活性ヌクレオチドが存在するか否かを示し之
。通常は存在するが、時（は（約１０回に１回）、ｒオ
キシヌクレオチドのビスメチルホスファイトはこの分析
では観察されなハ。その場合には、不完全な反応を防止
する之め（、縮合工程を反復する。次の工程では、・シ
ェドヤシトリアゾイルホスフィン（０，３Ｍのテトラヒ
ドロフラン溶液１　ｒｔｌ　）を活性ヌクレオチドの溶
液（直接添加して、ポンプ速度２ｗｔ１／ｍｉｎで５分
間リサイクルモードを継続して、未反応の５′−〇−ヒ
トａキシルのキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ　）　ｔ−
行なう。

曵余の活性ヌクレオチドおよびキャツピング剤は、テト
ラヒドロフラン（５ｍ／／ｍｉｎで２分間）ｆ２用して
装置から流す。この工程の次に、０．２Ｍの■２を含有
するテトラヒトａ７ラン：２，６−ルチノン：水（２°
１：１）の溶液を使用してホスファイトの酸化を行なう
。この溶液ｔ−５分間（２ｒｎｌ／　ｍｉ　ｎ　）装置
へ流す。最後に、乾燥テトラヒドロフランを３分間（５
ｍｅ／　ｍｉ　ｎ　）およびニトロメタンを２分間（５
ゴ／ｍ１ｎ）系に流すことてよりサイクルを完了する。

このサイクルは、所望の処理を完了する乏めに適宜の回
数繰返見す。

〔デオキシオリゴヌクレオチドの単離〕以下の方法によ
り完全に保Ｓｔ外し几デオキシオリゴヌクレオチドを単
離し念。保護され念形態のデオキンオリゴヌクレオチド
トリエステルを含有するシリカゲルの一部（１０＋＋ｖ
）を先ずチオフェノール：トリエチルアミン：ジオキサ
ン（１：１：２、ｖ／ｖ）で処理する。４５分間緩慢に
振とうし之後、遠心分離によりシリカゾルを回収し、メ
タノール（４回）およびエチルエーテルで洗滌し比。空
気乾燥の後、２０°で水酸化アンモニウムにより３時間
処理し、遠心分離することＫよって、支持体からデオキ
シオリゴヌクレオチドを除去し之。塩基性保護基は、封
管内で上澄液を５０°で１２時間加温することによって
除去し次。５′−〇−ノメトキントリチルｒオキンオリ
ゴヌクレオチドは、加水分解物を真空中で濃縮し、残渣
を０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテ−）（ｐＨ７
，０）に溶解し、その物質をＣ１８逆相高速薄層りａマ
ドグラフィーカラム（ウォーター・アンシエーツ（ｗａ
ｔｅｒ　Ａｓ５ｏｃ藷ｔｅｓ　）で分離することにより
得之。溶出緩衝液は２６チのアセトニトリルを含有スる
トリエチルアンモニウムアセテートであった。５’−〇
−ジメトキシトリチルデオキシオリゴヌクレオチドを含
有するピークを真空中で濃縮し残留物を酢酸−水（４：
１％”／）の混合液を用いて２０’で１５分間処理し、
５’−０−ノメトキシトリチル基を除去し友。完全に保
護を取り去っ之デオキシオリがヌクレオチドは、真空中
で酢酸溶液を濃縮し、残留物’１２５ｍＭの重炭酸トリ
エチルアンモニウム（ｐＨ７）に溶解し、水飽和エーテ
ルでジメトキシトリタノ−Ａ／　（ｄｉｅｔｈｏｘｙｔ
ｒｉｔａｎｏｌ　　）　ｆ抽出することにより得之。

〔デオキシオリゴヌクレオチドの特定〕各ｒオキシオリ
がヌクレオチドのダーヒドロキンルを（５’−３２Ｐ　
）　ＡＴＰおよびＴ４−キナーゼを用いてホスホリル化
した。ホスホリル化反応に使用し７’ｈｆオキシオリが
ヌクレオチドの量は、吸光ｌ１ｌｉ１１＋１　定し、淡
色効果がデオキシオリゴヌクレオチドにはないものとし
て吸光係数計算値を使用した。

１ｏ　ｍ　Ｍ　７！１　炭酸トリエチルアンモニウム（
ｐＨ７）Ｔｈ溶出剤として使用し、Ｇ−５０−４０セフ
アデツクス（５ａｐｈａｄｓｘ　）カラムで脱塩するこ
とにより、過剰のＡＴＰからホスホリル化オリゴヌクレ
オチドを分離し念。標準方法により、ポリアクリルアミ
ド上でのグル電気泳動および二次元分析を行った。

（ａ＋ｃ−ａ−Ｔ−ｃ−Ａ−ｃ−Ａ−ｘ−Ｔ−Ａ＋の合
成〕５′−〇−ジメトキシトリチルチミジン（０，２５
Ｐ、５０ｍ／り）で変性し之シリカゲルをカラムに供給
し、シリカゲルをニトロメタンで洗滌し、５′−ノメト
牛シトリチル基ｆＺｎＢｒ２で除去することＫよりサイ
クルを開始した。各縮合中Ｋ、前記のように約１０倍量
の活性ヌクレオシドホスファイ）（０，１ｍＭ）を使用
して伸長し之。合成はデオキシオリゴヌクレオチド、ｄ
（Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−τ−Ｔ）が完成する４でｆ
ａ続し九。この点で、シリカゲルをほぼ等しく二分割し
之。一方は標準的方法でｒオキシデカヌクレオチドまで
延長し比。支持体に結合しているノメトキシトリチル基
の量に基く全収率は６４チであり、逆相高速液体クロマ
トグラフィーカラムから分離されたものの収率は３０％
であった。

（ｄ（ｘ−ｃ−ｃ−ｃ−Ｔ−ｃ−Ａ−ｃ−Ａ−Ａ−ｒ−
Ｔ）　）ｄ（Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔｌの浅部
は標準的方法で伸長し、デオキシドデカヌクレオチドを
生成した。支持体く結合し九ジメトキシトリチル基に基
く全本収率は５５チでａっ之。単離収率は正確に測定で
きなかった。

上記の工程により、次のオリゴヌクンオチドを調製し几
。

５　’　−ｄ　（Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ　１５　’　−ｄ（Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−
Ｇ−Ａ＜−Ｔ）５’−ｄ（Ａ−Ｔ−τ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ
−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ）５’−ｄ（Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ
−Ｇ−Ａ−Ｔ−八）５’−ｄ（Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−Ｃ）５’−ｄ（Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ
１５’−ｄ（τ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ａ１５
’−ｄ（Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−ＧＩＳ’−
ｄ（Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−τ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ
ｌｓ　′−ａ（Ａ−ｃ−ｘ−ｃ−ａ−ｃ−Ａ−ｃ−ｃ−
ｃ−’ｒ＝ａ）一連の工程中の所望の点に所望のヌクレ
オシド部分を入れるという簡単な方法により、前記実施
例の方法は、混合ヌクレオシド、ｒオリゴヌクレオチド
、オリゴスクレオチドなどを合成するために使用できる
。従って、この方法は、各ヌクレオシドの連続からなる
オリゴヌクレオチドの製造に有用であるばかりではなく
、天然物として未知の合成オリゴヌクレオチドを調製す
る場合にも使用できる。これらはポリスクレオチドの研
究および合成に、場合によっては生物学上のシステムで
用いる遺伝子の製造に使用することができる。

本発明の好ましい実施例は、ぎ−０−）＋７チルヌクレ
オンド、ｒオキシヌクレオチド、オリゴスクレオチド、
オリゴデオキシヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび
ポリデオキシヌクレオチドの脱トリチル化をルイス酸、
特に臭化亜鉛を用いて行うことであるが、例えば、四塩
化チタンなどの他のルイス酸も使用することができる。

５’−０−位置からトリチル基を除去する場合に、ルイ
ス酸はプロトン酸よりも好適である。これは、反応が非
常に速くかつ脱プリンが起こらないからである。この方
法け５’−０−）ＩＪチル基に対して特定的であるから
、３’−〇および５−０−ノトリチル化合物と反応させ
ることにより３’−〇−）リチル封鎖ヌクレオシドを製
造することができる。

本方法においては、単に反応物質を、望ましくは溶媒中
で、接触させることが必要であり、脱トリチルは短い反
応時間中に起こる。ルイス酸は通常反応溶媒中に懸濁し
ており、溶媒は、ルイス酸と反応してプロトン酸が生ず
ることを防ぐために水を含有しない。現在の経験から言
うと、例えば、ジオキサンおよびテトラヒドロフラン、
それらの混合物、その他アセトン、メチレンクロリドナ
トの各種の溶媒を使用することができるが、ニトロメタ
ンが好適なＩ＠媒である。

脱トリチル速度を測定し、その比較データを表■に示す
。

各種のトリチルチミノンに臭ｆヒ亜鉛全室温で用い次場
合の結果を表■に示す。

更に０°Ｃの結果を表Ｖに示す＠ 脱トリチルは、４　リマー支持体合成のみ（（限定され
るものではなく、反応中にトリチル基の使用が含まれる
溶液合成工程においても有用である。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明を実施する之めの装置の系統図である。 １０・・・・カラム； １２・・・・シリカグルマトリックス １４．２８　、４２　、５０　、５２　、５４・・・・
・弁１５　、１５’、　１５”・・・・・制御装置１６
　、１８　、２０　、２２　、２４　、２６　、３０　
、３２　、３４　。 ３６　、３８　、４０　、４４　、４６　、４８・・・
・・容器５６・・・・・ポンプ ５８・・・・・紫外線検出機 特許出願人　　ユニバーシティ・・４テンツ。 インコーーレーテッド

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の式で表わされる化合物、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上式中、Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド
   塩基；ＲはＨまたは封鎖基；ＡはＨまたはＯＲ：Ｒ＿１
   は炭素数１０以下のヒドロカルビルラジカルおよびＸは
   不飽和第２級アミノ基である。
2. （２）次の式で表わされる特許請求の範囲第１項に記載
   の化合物、 ▲数式、化学式、表等があります▼ 上式中Ｂはヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩
   基；ＲはＨまたは封鎖基；ＡはＨまたはＯＲ；Ｒ＿１は
   低級アルキルおよびＸは窒素複素環化合物の第２級アミ
   ノ窒素のＨを除去して生成した不飽和第２級アミノ基。
3. （３）第２級アミノ基はテトラゾリル、ニトロイミダゾ
   リルまたはトリアゾリル基である特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の化合物。
4. （４）Ｂはチミン、シトシン、アデノシンおよびグアニ
   ンである特許請求の範囲第１項または第２項に記載の化
   合物。
5. （５）Ｒはトリチル基である特許請求の範囲第１項また
   は第２項に記載の化合物。
6. （６）Ｒはジ−ｐ−アニシルフェニルメチルまたはｐ−
   アニシルフェニルメチル基である特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の化合物。
7. （７）Ａは水素原子Ｈである特許請求の範囲第２項に記
   載の化合物。
8. （８）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造方法、 （イ）ポリマーをカップリング剤−ポリマーに変性し、 （ロ）カップリング剤−ポリマーとヌクレオシドとを結
   合させてヌクレオシド−変性支持体を生成し、 （ハ）ヌクレオシド−変性支持体を活性化して、ヌクレ
   オシド−変性支持体に対するヌクレオチドのカップリン
   グに供し、さらに （ニ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
9. （９）封鎖基はジメトキシトリチルである特許請求の範
   囲第８項に記載の方法。
10. （１０）カップリング剤の存在下に、ヌクレオシド−変
    性支持体に更にヌクレオチドを添加し、かつ変性支持体
    上のヌクレオチドの未反応ヒドロキシル基を封鎖基で封
    鎖することからなる特許請求の範囲第８項に記載の方法
    。
11. （１１）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造に使用する変性無機ポリ
    マー支持体の製造方法、 （イ）ポリマー支持体を供給し、 （ロ）ヌクレオシド上の反応基と反応し得る反応基を有
    するカップリング剤を使用し、該ポリマー支持体を該カ
    ップリング剤で処理し、 （ハ）処理したポリマーをヌクレオシドまたは封鎖ヌク
    レオシドと結合し、ヌクレオシド−支持体あるいは封鎖
    ヌクレオシド−支持体からなる変性無機ポリマー支持体
    を生成する。
12. （１２）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造方法、（イ）ポリマーを
    準備し、 （ロ）該ポリマーにアミノ基を有する化合物を反応させ
    てアミノポリマー支持体を生成し、 （ハ）該アミノポリマーをアミノ結合ジメトキシトリチ
    ルポリマー支持体に変性し、 （ニ）ポリマー支持体からジメトキシトリチル基を除去
    し、 （ホ）得られた支持体にヌクレオチドをカップリングさ
    せ、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
13. （１３）カップリング剤の存在下に、得られた支持体に
    ヌクレオチドを添加することからなる特許請求の範囲第
    １２項に記載の方法。
14. （１４）工程（ニ）および（ホ）を反復して、既にカッ
    プリングされたヌクレオチドに追加のヌクレオチドをカ
    ップリングすることからなる特許請求の範囲第１２項に
    記載の方法。
15. （１５）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造に使用する変性無機ポリ
    マー支持体の製造方法、 （イ）ポリマー支持体を準備し、 （ロ）ヌクレオシドの活性化エステルを準備し、（ハ）
    ポリマー支持体とヌクレオシドの活性化エステルを結合
    してポリマー支持ヌクレオシドを生成する。
16. （１６）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造方法、（イ）ポリマーを
    準備し、 （ロ）該ポリマーをアミノポリマーに変性し、（ハ）ヌ
    クレオシドを準備し、 （ニ）アミノポリマーとヌクレオシドとを結合してヌク
    レオシド変性支持体を生成し、 （ホ）ヌクレオシド変性支持体にヌクレオチドを結合し
    、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
17. （１７）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造方法、（イ）デオキシヌ
    クレオシドを準備し、 （ロ）該デオキシヌクレオシドを処理してデオキシヌク
    レオシドの活性化エステルを生成し、（ハ）アミノポリ
    マー支持体を準備し、 （ニ）アミノポリマー支持体と活性化デオキシヌクレオ
    シドエステルとを結合してデオキシヌクレオシド変性支
    持体を生成し、 （ホ）デオキシヌクレオシド変性支持体にヌクレオチド
    を結合し、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
18. （１８）下記（イ）から（ヘ）よりなる変性シリカゲル
    を製造する自動装置、 （イ）活性反応物質または洗浄溶媒を供給すべく選択的
    に接続する第１弁手段； （ロ）ヌクレオシド−活性ホスフェートトリエステルま
    たは洗浄溶媒を供給すべく選択的に接続する第２弁手段
    ； （ハ）脱離剤または洗浄溶媒を供給すべく選択的に接続
    する第３弁手段； （ニ）前記第１、第２および第３弁手段による流出物を
    それぞれ受けるコレクター弁； （ホ）セレクター弁；変性シリカゲルマトリックスを入
    れたカラム；およびセレクター弁とカラムとの間に直列
    に配設したポンプからなり；かつ前記コレクター弁は前
    記セレクター弁の入口に接続した流出口を有する流動閉
    回路；および （ヘ）前記変性シリカゲルをコレクター又は排出口ヘ送
    るセレクター弁の出口へ連通した紫外線検出機。
19. （１９）前記第１、第２および第３弁手段のそれぞれに
    接続され、前記弁手段から前記コレクター弁への流出量
    を定めるプログラム可能な制御手段を設けた特許請求の
    範囲第１８項に記載の装置。
20. （２０）前記セレクター弁は、前記コレクター弁からカ
    ラムを経て前記紫外線検出機へ流す場合と、前記カラム
    にリサイクルさせる場合とに調節できるようにした特許
    請求の範囲第１８項に記載の装置。