JPS6219096A - ポリヌクレオチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 バイブリドｒ）ＮＡ技術が出現しかつ広範な種類の天然
生産物、例えばぼりペプチド、および核酸の両者を単離
し、精製し、そして検定する可能性が急激に増加し、ア
ミノ酸および核酸のオリプマーを製造する迅速かつ効率
よい方法の必要性が増加している。

核酸では、リンカ−（１ｉｎｋｏｒ　）、アダプター、
合成遺伝子および合成制御配列、ならびにグローブ、ゾ
ライマーなどとして使用するため配列を合成することが
必要とされる。これらの配列はクローニングできるので
、初期の用途においてほんの少量の物質のみを必要とす
るが、誤りを含む配列は望ましくない産生物または結果
を生ずる構造を形成しうるので、このような配列を実質
的に含有しないことが非常に重要である。

ポリ（アミノ酸）ｆたはポリペプチドについて、天然ポ
リペプチドをその生理学的性質の研究のために、／　＋
７ペゾチドの断片および天然の産生物の製造のために、
合成できることに実質的に関心がもたれており、ここで
このような断片はその生理学的性質について研究すると
七ができ、問題の決定因子の部位に対して特異的な抗体
の産生のためのハプテン、薬物アゴニスト又は拮抗物質
等として使用できる。

ヌクレオチド、アミノ酸または他の天然モノマーのオリ
がマーを製造するための多くの手順が開発された。これ
らの手順は多くの場合、選択的に切離Ｉ−可能々結合に
より第１モノマーを固体の支持体へ取付けることに頼る
。次いで各モノマ一単位を順次に付加（ａｄｄ　）　ｌ
、、各付加はある数の化学反応を含む。

オリゴマーの合成の間各段階において、ある数の鎖が伸
長されないというある程度の可能性が存在する。したが
って、オリゴメリゼーションの間、多数の誤まりが導入
されることがあり、ここで単一または複数のモノマーが
省略された配列が生成する。配列が完結しかつ支持体が
分離されたとき、所望の配列はそれに密接に類似する配
列で汚染されるであろう。次いでこれらの誤りは種々の
態様で現われ、その態様はポリヌクレオチド捷たはポリ
ペプチドのいずれが生産されているかによって異る。、
ｊ？　ＩＪヌクレオチドでは、配列が棹々の構成でクロ
ーニングされかつ使用されるとき、誤まりが導入される
ことがありこの場合選択されるクローンが誤まった配列
を含む。造成物を配列する場合に前もってオリゴマーを
精製しないと、誤まりが保持されて望ましくない生成物
、最適でない性能々どに導く。ポリペプチドでは、誤捷
った配列は意図する配列とは異る生理学的活性、注目の
配列以外の配列に結合する抗体の形成を導くことがあり
、そして変化する結合の応答の結果、誤りの結果を与え
る可能性がある。

したがって、誤まった生成物または観察に導くであろう
、所望の配列に近似する配列の汚染が実ノ１寸的に存在
しないことを保証する配列を調製できることの重要性が
増加してきた。製造の間失敗した（　ｆａｉｌｕｒｅ　
）配列を除去することによって、材料を損失しうる引き
続く精製、例えば、電気泳動を実施する必要性を排除す
ることができる。クローニングまたは研究用ポリペプチ
ドを用いる初期の段階において非常に少量の合成される
材料を取り扱うとき、材料の損失は重大な問題と々るこ
とかある。

〔先行技術の説明〕

マチウシ（Ｍａｔｔｅｕａｅｉ　）およびカルサーズ（
１９８１）　１０３：　３１８５−３１９１は、オリゴ
ヌクレオチドの製造におけるホスホルアミダイトの使用
を記載している。ビー゛ウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　
）および゛カルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）　＋
テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ、　Ｌｅｔｔ、
　）　（１９８１／）　２２　：　１８５９−−一１−
一一一一―　　　―−１−−■ｌ−−■−−１１１　　
　　　　　　　　　　−１８６２および米国特許第４，
４１５，７３２号は、オリゴヌクレオチドの製造におけ
るホスホルアミダイトの使用を記載している。スミス（
Ｓｍ１ｔｈ　）、ＡＢＬ（１９８３年１２月）１５−２
４は、自動化された固相オリゴデオキシリがヌクレオチ
ドの合成を記載している。また、その中に引用されてい
る参考文献を参照のこと。また、ワーナー（Ｗａｒｎｅ
ｒ）ら、ＤＮＡ（１９８４）３　：　４０１−４１１診
照参照開示を引用によってここに加える。

アデノシンのアミジン保護は、マクブライド（ＭｃＢｒ
ｌｄｓ　）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）
、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａ、　Ｌｓｔｔ
、　）□ （１９８３）２４　：　２４５およびフレー２−（Ｆｒ
ｏｅｈｌｅｒ）およびマツチウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｅｉ
）、ヌクレイツク・１１　：　８０３１に記載されてい
る。他のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　）基は後述
する。

〔発明の要約〕

縮合オリゴマーの製造を包含する新規な方法および組成
物が提供され、ここで個々のモノマーは前もって決定し
た群の構成員であり、そして順次に付加されて個々の構
成員の前もって決定した配列を形成する。成長する鎖が
不溶性支持体に結合している間に、オリゴメリゼーショ
ンが起こる。

各段階の後に、失敗の配列（ｆａ目ｏｒｅ　５ｅｑｕｅ
ｎｃｅ　）をキャッピング（ｃａｐｐｌｎｇ　）Ｉ〜、
そして配列が完結する捷で次のモノマーを付加（ａｄｄ
　）　＋　ル。個々のモノマー上の保護基、末端ブロッ
キング基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　）、キャッ
ピング基、および支持体への結合は選択可能々切離しを
可能とするように選択される。ブロッキング基は末端ブ
ロッキングを欠く配列の酵素的分解を妨害１−な込よう
に選択されるか、あるいはキャッピングの除去時に選択
的に除去することができる。完結のとき、キャッピング
基を除去し、酵素的分解を妨害するブロッキング基を除
去し、そして末端ブロッキング基を欠く不完全配列を酵
素的に分解する。不完全配列の酵素的分解前に、オリゴ
マーは支持体上に保持するかあるいは除去することがで
きる。次いで、誤まｊｌ＋　（−ｒｒｏｒ　）を肩する
配列を実質的に含壜ない完成された正しい配列を単離す
る。

以下余白 〔特定の実施態様の説明〕 本発明は、共通の官能基を有するが側鎖が異なるモノマ
ーのオリゴリメリゼーシ、ンに関する。

モノマーハ縮台型オリゴメリゼーションを行い、ここで
釦は支持体へ結合している間伸長される。

オリゴリメリゼーションはモノマーを段階的に付加して
少なくとも約１０の構成員、通常少なくとも１２の構成
員の所望の配列を生成することを含み、そして構成員の
数は１００以上であることができる。種々の官能基が種
々の機能のために用いられ、それらは選択的に除去する
ことができる。

官能基は側鎖の保護基、末端ブロッキング基、キャッピ
ング基および、オリゴマーを支持体へ結合させて維持す
るための結合基を包含する。これらの官能基はオリゴマ
ーの製造の間および／または配列の完結後に選択的に除
去または切離されることができ、同時にオリゴメリゼー
シ、ンの間および必要に応じて不完全配列の酵素的分解
の間に配列を支持体へ結合させて保持するように、これ
らの官能性は選択される。

さらに、誤まりまたは不完全配列のエキソヒドラーゼ分
解を妨害【−々いか、あるいは酵素的加水分解前に選択
的除去することができる保護基を用いる。誤１りまたは
不完全の配列の分解の前または後の支持体からの完成さ
れた配列の切Ｍｌ−が実施され、そして支持体からの分
離および不完全配列の分解後、配列の調製に関連する物
質を実質的に含まない完成された配列を次いで単離する
ことができる。

本発明の方法は、誤まりを含有するかあるいは不完全な
配列を選択的に除去する。エキソヒドロラーゼはブロッ
キングされない不完全配列を加水分することができるが
、エキソヒドロラーゼの完全配列への作用を阻止する末
端ブロッキング官能基を用いることによって、上の選択
的除去が達成される。この方法は、−また、順次的付加
（５ｅｑｕｅｎｔ１ａｌ　ａｄｄｉｔｌｏｎ　）におい
て次の段階を行っておらず、かつキャッピング前に、反
応性の遊離末端官能基を保持する配列を停止するキャッ
ピング官能基の使用を必要とする。こうして、失敗の配
列は失敗の時に停ＬＦ、シ、そして連続しない。

ブロッキング基および結合基の選択的使用を可能とする
縮合オリゴメリゼーションを用いる本発明は、多くの場
合、核酸、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ　、およびポ
リ（アミノ酸）に関するが、同一の手段を多糖類、炭水
化物およびアミノ単糖類の調製に有効であろう。各ポリ
マーまたはオリゴマーは個々の縮合モノマーの間の結合
のために同一の官能基を用い、核酸のためにはホスフェ
ートエステルを用い、アミノ酸のためにはペゾチドまた
は了ミド結合を用い、糖類についてはへミアセタールま
たはへミケタールのエーテル結合を用いる。

次の式は本発明において使用するモノマーの一般化され
た表示である： 式中、 Ｍはオリゴマーの結合の形成に関与せずかつまたブロッ
キングまたけ保護に関与しない分子の部分のすべてを含
む、分子の中央の残基であり、例えば、グリシンの場合
において、それはメチレンであり、アデノシンの場合に
おいて、それはリンに結合した基及びホスフェートエス
テル結合の形成に関与するブロックされたオキシ基を除
外した分子のすべてを含み、 αはオリゴマーの末端官能基と反応するために活性化可
能な形態または活性な形態の官能基であり、 βはブロックされていないときαと反応する末端官能基
であり、 γはβのブロッキング基であり、 δは保護を必要とする官能基、通常アミノ、ヒドロキシ
またはメルカプトであり、そして存在することあるいは
存在しないことができ、εは保護であり、 μはαのブロッキング基であり、そしてａは保護しなく
てはならない官能基の数であり、一般に０〜２、より通
常０〜１である。

化合物がプリンであるとき、本発明において用いるプリ
ンヌクレオチドは多くの場合次式を有する： （Ｈ−ｆたはＯｇ） 式中、 Ｍｌは、それぞれ、グアニンおよびアデニンについては
２または６位置に環の外のアミノ基をもつアデニンまた
はグアニンの残基であり、ｚは０−ブロッキング基であ
り、 Ｂ’　ｔたはＧ１の一方は水素であり、そして他方は保
護基であることができ、あるいは２つは窒素に二重結合
した保護基を形成することができ、Ｗは１対の電子また
は酸素であり、Ｙが二置換アミノ基であるとき１対の電
子であり、そしてＹがオキシであるとき、酸素であり、 Ｙはオキシまたは二置換アミノ基であり、ここで置換基
は反応過程を妨害しない有機基であり、そして二置換ア
ミン基はホスフェートエステルの形成のための離脱基（
ｌｅａｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　）としてはたらき、 オキシは通常はアンモニウム塩であり、便利には３〜１
２個の炭素原子のトリアルキルアンモニウム塩であり、 Ｙが二置換アミノ基であるとき、それは式−ＮＴ’Ｔ２
をもち、式中Ｔ１およびＴ２は同一であるか異々す、そ
して有機であり、 Ｄは選択的除去可能な有機基であり、そしてＥは水素ま
たは保護基である。

ヌクレオチドがピリミジンであるとき、ピリミジンは次
式を有するであろう： 式中、記号のすべては前に定義した通りであるが、ただ
し Ｍ２はシトシンまたはチミンの残基であり、Ｍ２がシト
シン残基であるとき、ｂは１であり、Ｍ２がチミン残基
であるとき、ｂは０であり、Ｂ２は水素であり、そして
Ｇ２は保護基、通常アシルである。

Ｄのために用いる基は脂肪族基、とくに飽和脂肪族基；
β−へテロ置換脂肪族基（ここで、β−置換基はβ−排
除において、離脱基またはゾロトン活性化基として、容
易に関与することができる電子吸引基である）；α−置
換メチレン（ここでα−置換基は広く変化することがで
き、そして誘導作用管たけ共鳴作用を介してメチレン上
に陰性電荷を支持する）；アリール：およびアラルキル
であろう。リンの官能性の性質に依存して、１つの基を
他の基の代わりに選択することができる。

こうして、ホスホルクロリダイト、ホスホルアミダイト
、ホスフェート、チオホスフェート、ホスファイトなど
を用いるかどうかに依存して、特定のホスホロエステル
基が好ましいであろう。

ホスホルクロリダイトおよびホスホルアミダイトについ
て、アルキルおよびβ−置換ジメチレンが好ましく、一
方ホスフエートおよびホスフィンについて、アリールお
よびアラルキルの官能性が好ましいであろう。

多くの場合、Ｄけ次式により示すことができる：Ｑ（Ｃ
Ｈ）　−Ｃ’（Ｊ２）− Ｃ 式中、 １は第１炭素原子であり、 Ｊは同一であるかあるいは異なり、Ｈまたは１〜３個、
通常１〜２個の炭素原子のアルキル基、好ましくはメチ
ルであね、 ＣはＯまたは１であり、通常、Ｑが炭素原子を介して結
合しているとき、０または１であり、そしてＱが異種原
子を介して結合しているとき１であり、 ＱｔｉＨ１１〜９個の炭素原子のアルキル、ニドラド、
メチルスルホニル、シアノ、フェニル、ベンジル、フェ
ニル−、ベンジル−１置換フェニル−１置換ベンジルチ
オ普たは−スルホキシ（ここでアリール置換基の数はＯ
〜２であり、そしてシアノ、ハロ、ニトロナト、トリハ
ロメチル、トぐにフルオロおよびクロロにより例示され
る）、β−ナフチル、９−フルオレニル、２−アントラ
キノリルなどあることができ、あるいは Ｄはフェニルまたは置換フェニルであることができ、こ
こで置換基は上に示したものと同一であることができ、
さらにフェニルへ直接にあるいは酸素捷たは炭素を介し
て結合したトリチルを含むことができる。

Ｄと（７て使用に報告されている特定の基は、次の通り
である： アルキル　ビーウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ　）および
カルスサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）　ｓテトラヘド
ロ７゜レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、
）　（１９８１）２２　：　１８５９ ＮＣＣＨ２Ｃ（Ｍｅ　）　。＋　２　（Ｈ２−０）−コ
スタ−（Ｋｏａｔｅｒ）、Ｂａｙｓ　（１９８４）　１
０３　：　９７−８　：ノｆン・ブームリサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｅ　Ａｅｌｄｓ　Ｒｅｓ、）　（１９８４）１
２　：　８６３９ ｐ−０２ＮｙＣＨ２ＣＨ２−シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒ
ｚ　）およびプフレイデレル（Ｐｆｌａｉｄｓｒｅｒ　
）、テトラヘドロンｅレターズ（Ｔａｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ　Ｌｅｔｔ、）（１９８４）２５　：　５５１３ Ｍｅｍｏ　ＣＨＣＨ−クラエセン（Ｃ１ａｅｓｅｎ　）
ら、ｓｂｓｄ（１９８４）　２５　：　１３０７（ハ０
　）、ＣＣ（Ｍｌり０−２（Ｈ）０−２−　　タカク（
Ｔａｋａｋｎ）ら、ケミストリー・レターズ（Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ　）　１９８４　：　１２６
７　：レトシンガー（Ｌａｔｓｉｎｇａｒ　）ら、テト
ラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　）　（１９８４
）　４０　：　１３７０（ＣＨ２）。−１Ｓ（０）。−
２（ＣＨ２）　２　　　パルボビン１９１５　：アガル
ワル（Ａｇａｒｗａｌ　）ら、ジャーナル・オプ・ケミ
カル・ソサイアティ（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、）　（１９７６）　９８　：　１
０６５　：フェル（Ｘ）。−２痕Ｈ２−，２−ナフチル
−ＣＨ２−９−フルオレニル−ＣＨ２−アンスラキノニ
Ｉし　カルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）ロン（Ｃｈｒ
ｉｓｔｏｄｏｎｌｏｎ　）およびリーズフライアトコラ
スキー（Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ　）ら、アストラクツ
、コンフェレンス拳オン・シンセチック・オリがヌクレ
オチド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ａｂｓ　
ｔｒａｅ　ｔ　、　Ｃｏｎｆ。

ｏｎ　８ｙｎ、　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｌｄｅｓ　
ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　）、ウッノ
サラ（Ｕｐｐｓａｌ　）　、スウェーデン・コンフェレ
ンス（Ｓｗｅｄｅｎ　Ｃｏｎｆ　、）　１６−２０　（
１９８２）　’＃　６４：バルゴビ７　（Ｂａｌｇｏｂ
ｉｎ　）、　ｉｂｉｄ（Ｘ）Ｊ３’ＣＨ２ＣＨ２−ウル
マン（Ｕｈｌｍａｎｎ　）ら、テトラヘドロン・レター
ズ（１９８０）　２１　：　１１８１　；シュルツ（５
ｅｈｕｌｚ　）およびプフレイデレル（Ｐｆｌｅｉｄｅ
ｒｅｒ　）、１ｂｉｄ　（１９８３）　２４：３５８２
　：ペイテ（Ｂｅｉｔｅ）およびプフレイデレル（Ｐｆ
ｌｅｌｄｅｒｅｒ　）、１ｂｉｄ　（１９８４）２５：
１９７５　　　。

ＭｅＣＯＣＨ（Ｍｅ）−パミレズ（Ｂａｍ１ｒｅｚ　）
ら、テトラヘドロン（１９８３）　３９　：　２１５７
ｎ３＃（Ｃｔ　）−パッセウル（Ｖａｓｓｅｕｒ　）ら
、テトＸは水素あるいは中性または極性の電子供与性ま
たは電子吸引性の、一般に１〜１０個、通常１〜６個、
一般に０〜７個の炭素原子の非妨害性の安定な置換基で
あることができ、そして脂肪族、脂環族、芳香族または
複累環族の基、一般に脂肪族性飽和のハロ炭化木葉、例
えば、トリフルオロメチル、ハロ、チオエーテル、オキ
シエーテル、エステル、アミド、ニトロ、シアノ、スル
ホン、アミノ、アゾなどであることができる。槙々のＸ
Ｘ　　（ことＴｘは数である）の各々について、それら
はＸの定義の範囲内に入るが、当業者はこの発明の開示
に照して適当な基を選択することができるであろう。あ
る場合において、好ましいＸは示されるか、あるいはＸ
Ｘは再定義することができるＯ Ｄとして用いる基は、末端ブロッキング基を除去しない
かあるいは、適当ならば、オリゴマーを支持体から切り
離す試薬、例えば、フェニル−メルカプチドまたは置換
フェニルーメルカプチドおよびｔｅｒｔ−アミン、アン
モニア、アルドキシド、モノアミンまたはポリアミンを
包含する有機アミン溶媒により除去できるであろう。

２のために用いる基は、アラルキル基、とくに置換およ
び非置換のビクシルまたはトリアリールメチルであり、
ここでアリールはフェニル、ナフチル、フラニル、ビフ
ェニルなどであることができ、そして置換基はＯ〜３、
通常Ｏ〜２であり、セしてＸの定義の範囲内に入るであ
ろう。

２として用いる基は保護基およびキャッピング基の除去
に用いられる試薬に対して安定であり、主として塩基に
対して安定であり、そして酸に対して感受性である。こ
うして、ベンジル、とくにα−置換されたもの、例えば
、トリチル基は末端ブロクキング基として使用される。

ある場合において、オリゴマーの合成の完結後、２を異
なる基で置換することが望ましいであろう。

ブロクキング基（とくにトリチル基を用いる場合）およ
び不完全オリゴマーを分解するために用いる酵素の性質
に依存して、加水分解条件は有意な比率で２基を除去す
ることがある。これらの条件下では、完全オリゴマーも
また分解してオリゴマーの収率を実質的に減少させるで
あろう。

エキソヌクレアーゼによる完成オリゴマーの分解を避け
るために、２基はエキソヌクレオリティック（ｅｘｎｕ
ｃｌｅｏｌｙｔｉｅ　）条件の条件下で安定である異な
るブロクキング基で置換することができる。このような
基はキャッピング基の除去の間保持されること、エキソ
ヌクレオリティック条件の間保持されること、およびそ
れ自体であるいは支持体からの切離と関連して、オリゴ
９マーを分解せずに除去されうろことによって特徴づけ
られるであろう。

ブロッキング基を除去しかつ別の基で置換するかわりに
、代わりのブロッキング基、例えば、カル？ン酸エステ
ル、ホスフェートなどに依存して、究極のヌクレオチド
は代わりの保護基を存在させて調製することができる。

こうして、置換ブロッキング基を含有するヌクレオチド
を予備調製することにより、これらを最後の工程におい
て付加することができ、ここで手動手順または自動化手
順は異なるヌクレオチドの使用を可能とする。

多くの場合、２の代わりに使用する基は安定なエステル
を与えるアシル基であろう。アシル基は有機または無機
であることができ、例えば、カルブキシル、ホスホリル
、ピロホスホリルなどある。

とくに興味あるものは、アルカン酸、とくにアリール置
換アルカン酸であり、ここでこの酸は少なくとも４個の
炭素原子であり、そして約１２個以下、通常約１０個以
下の炭素原子をもち、通常８〜１２個の炭素原子をもつ
アリール、通常フェニル置換アルカン酸である。種々の
異亀阜子、例えば、酸素（オキシ）、ハロゲノ、窒素、
例えば、シアノなどが存在することができる。大部分に
ついて、カルデン酸エステルは塩基安定性であるが、と
くに約５０℃以下、さらにとくに約３５℃以下の温度に
おいて、および約２より大きく、とくに約４より大きい
−において適度な酸に対して安定である。

ある場合において、所望の保護を与える特殊な試薬を用
いることができる。例えば、Ｏ−ジブロモメチルベンゾ
エートを用いてエステルを形成し、次いでこれを後述す
るように特定の試薬で切離すことができる。

次の表は、ある数の使用できる基およびブロッキング剤
として使用する基およびこれらの基を除去する条件およ
び試薬を記載する参考文献を示す。

トリチルオキンアセチル　　ウェルスチウク（Ｗｅｒｓ
ｔｉｕｋ）およびネイルソン（Ｎ１目５ｏｎ）、 ベンゾエート　　　　スタウィンスキ−（Ｓｔａｗ量ｎ
ａｋｉ　）１９７６：２４３ フェノキシアセチル　　ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ　）お
よび７３９９　：リース（Ｒｅｅｓｅ）、 （１９７８）２３：３１４３ ジヒドロシンナミル　　サチデフ（Ｓａａｈｄｅｖ）お
よびスタルコフスキ＝（Ｓ　ｔａｒｋｏｖｇｋｙ　）、
１９６９ニア３３ ヒハロエイト　　　　ファン・ペラケル（ＶａｎＢｏｅ
ｃｋｅｌ　）およびファン・ブ ーム（Ｖａｎ　Ｂｏｏｍ）、テトラヘ リフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）ら、 テトラヘドロン（１９６８） ２４　：　６３９ ホスホリル　　　　　ファン・デル・マレル（Ｖａｎｄ
ｅｒ　Ｍａｒｅｌ　　）ら、テトラヘト１９８１　：　
１４６３　：Ｊ、Ｇ、ナデアウ（Ｎａｄｓａｕ　）ら、
バイオ ケミストリー（１９８４）２３： ６１５３；Ｆ、　　ヒンメルスパッ ハ（Ｈ１ｍｍ＠ｌ　５ｂａｃｈ　）およびＷ、ゾファイ
デレル （Ｐｆｌ＊ｌｄ＠ｒ＠ｒ）、テトラヘ ドロン・レターズ（１９８２） ２３：４７９３：Ｊ、Ｌマルッグ （Ｍａｒｕｇｇ）ら、ニュークレイ （１９８４）１２：８６３９：Ａ。

コンド（Ｋｏｎｄｏ）ら、Ｎｕｃｌ。

（１９８５）１６：１６１ ピロホスホリル　　　チャツト／臂ドヒャヤニケイショ
ン（Ｊ、　Ｃｈ＠ｍ。

フェニルイソシアネート　　アがルワル（Ａｇａｒｗａ
ｌ　）およびコラナ（Ｋｈｏｒａｎａ）、ジャ ＳｏＣ，） ＊除去はＡｇＣｌＯ４による処理、及びこれに続くハロ
ダン化物としての銀の除去およびモルホリンの付加を含
む。

ベンゾエート基は酵素α−キモトリノシンで容易に除去
することができる。ホスフェートはアルカリ性ホスファ
ターゼで除去できる。使用できる他の酵素は、カル？キ
シペタチダーゼＡ１０イシンアミノペゾチダーゼ、酸性
ホスファターゼ、ピロホスファターゼなどを包含する。

あるいは、酵素の加水分解を用いる代わりに、カルブキ
シレートエステル基は水酸化アンモニウム、水酸化ナト
リウム、モルホリンなどで除去することができる。

とくに興味あるものは、ヌクレオシドのヒドロキシル、
例えば、完成した配列の末端５′−ヒドロキシルをホス
ホリル化するために使用できる特定のホスホリル化剤で
ある。新規な０，０′−ジ（シアノエチル）ホスホルア
ミダイトの使用は本発明においてとくに有利であり、こ
こで窒素は置換されている（１〜２個の基）かあるいは
置換されていないことができ、とくに二置換されており
、さらにとくに、ジアルキル置換されており、アルキル
基ｉｉ１〜６個、通常２〜４個、とくに３個の炭素原子
をもち、例えば、イソゾロビルである。

（下の−ＮＴ　Ｔ　　の説明を参照。）この試薬は、酸
化可能なホスファイトエステルを与える置換ゾロッキン
グ基（ｚｌ）、およびモノマーとして使用するヌクレオ
ンジルホスホルアミダイトと同じ方法で除去される〇−
置換基として使用できる。主題の試薬はオリゴマーの末
端ヒドロキシルの容易な官能化を可能とし、完成された
鎖の保護を提供し、そして自動化された核酸の配列の合
成に容易に適合する。

Ｙに用いる基はオリコ９メリゼーションに使用するリン
誘導体の性質に依存する。ホスホルアミダイトを用いる
とき、Ｙは式−ＮＴ’Ｔ２を有し、式中Ｔ１およびＴ　
は同一であるかあるいは異なることができ、そして炭化
水素であることができ、あるいは０〜５個、通常０〜４
個の異種原子、主としてオキシとして酸素原子、チオと
してイオウ、またはアミノ、とくにｔａｒｔ−アミノ、
Ｎ０２またはシアノとして窒素を有することができる。

２つのＴは一緒になって合計１〜３、通常１〜２のへテ
ロ壌構成員および１〜３の環を有するモノ−またはポリ
複素壌式猿を形成することができる。通常、２つのＴは
合計２〜２０、より通常２〜１６個の炭素原子を有１．
、ここでＴは脂肪族（脂環族を含む）、とくに飽和脂肪
族の１価の基、あるいは、−緒になったとき、２価の基
であることができ、１ａ換または非置換の複累積弐環を
形成する。アミンは、広範な種類の飽和第二アミン、例
えば、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソノロビ
ルアミン、ジプチルアミン、メチルヘキシルアミン、メ
チルヘキシルアミン、メチルシクロノロビルアミン、エ
チルシクロヘキシルアミン、メチルベンジルアミン、メ
チルシクロヘキクルメチルアミン、ブチルシクロヘキシ
ルアミン、モルホリン、チオモルホリン、ピロリジン、
ビにリジン、２．６−シメチルビペリジン、ピペラジン
および同様に飽和された単環式窒素複累壌族を包含する
。（米国特許第４，４１５，７３２号〕 −ＮＴ　’　Ｔ　２として使用するために報告されてい
る特定の基は、次の通りである： Ｎ−ピロリジノ　　　ペアウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ
　）、２５　：３７５　；シワルッ （Ｓｃｈｗａｒｚ　）およびプフレイ デレル（Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ　）、 五ｂｉｄ　（１９８４）２５：５５１３Ｎ＝Ｘ’ −ビスーゾメチレンシ クロヘキサン、ビス− ジエチレンサルファイ ドおよびメチルアミノ ＮＸ”；仲、Ｔ２−Ｍｅ、マクプライト（ＭｃＢｒｉｃ
ｌｅ　）おＩＰｒヨＵ力に’ｔ）−−ｒ（Ｃａｒｕｔｈ
ｅｒｓ　）、１ｂｌｄ　（１９８３）２４：２４５ Ｘ１−ピスーゾメチレン オキシ、α、α、α− α′−テトラメチル被ン タメチレン ニトロイミダゾール、　　マチウシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉ　）およテトラゾール　　　　　びカルサーズ（Ｃａ
ｒｕｔｈｅｒｓ）、Ｃｈ＠ｍ、５ｏｃ−）（１９８１） １０３：３１８５ 基の例は、次の通りである：Ｎ−ピロリジノ、Ｎ−ピペ
リジノ、１−メチル−Ｎ−ビベラノノ、Ｎ−へキザヒド
ロアジビノ、Ｎ−オクタヒドロアゾニノ、Ｎ−アザシク
ロトリデカノ、Ｎ−３−アザビシクロ（３，２，２）ノ
ナン、チオモルホリノ、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ、
Ｎ−ゾメチルアミノ、Ｎ、Ｎ−ジイソゾロピルアミノ、
ピペリジノ、２ｅ２．６．６−テトラメチル−Ｎ−ピペ
リジノ。

Ｙは、また、ハロ、例えば、クロロであることができ〔
レトシンが−（Ｌｅｔａｉｎｇｅｒ　）およびルンシ（
Ｍａｔｔ＠ｕｅｅｉ　）およびカルサーズ（Ｃａｒｕｔ
ｈｓｒｓ　）、５ｕｐｒａ　］あるいはアンモニウムオ
キシ塩、とくに３〜１２個の炭素原子のトリアルキルア
ンモニウムであることができる。

ＲＮＡまたは混合ＲＮＡ　−ＤＮＡオリゴマーを調製す
るとき、とくにトリエステル法を用いる場合、Ｅとして
使用する基は次の通りである： Ｘ、ｆｆｃＨ２タカク（Ｔａｋａｋｕ　）ら、ツヤ−ナ
ル・４９：５１；オーツカ（Ｏｈｔｕｋａ）ら、２２ニ
ア６５ ２−テトラヒドロ　オーツカ（Ｏｈｔｕｋａ）ら、１ｂ
１ｄ”””’　　　　（１９８４）４０　：　４７使用
できる他の基は、三置換シリル、例えば、３〜１２個の
炭素原子のトリアルキルシリル、２−チトラヒドロフラ
ニル、　ｔａｒｔ−ブチル・ジメチルシリル、あるいは
塩基性条件および縮合条件に対して安定な他の保護基を
包含する。

環外（ｅｘｃｙｃｌｌｃ　）アミン保護基は、縮合条件
に対して安定でありかつ、末端ブロッキング基を除去し
ないであるいは、適当ならば、支持体への結合基を切離
さないで、配列の完結時に除去されうるようにあるいは
、誤まりの配列の分解を妨害しないように選択されるで
あろう。ＢおよびＧは同一であるかあるいは異なること
ができ、そして−緒になって２価の基を形成できる。

Ｂが水素であるとき、Ｇは通常２〜１６個、通常２〜１
４個の炭素原子および０〜６個（オキシ酸素を除外する
〕１通常０〜４個のカルコダン（酸素およびイオウ）ま
たは窒素である異種原子のアシルであり（ここで窒素は
通常水素以外に結合している）そして脂肪族、脂環族、
芳香族、複素環族、またはそれらの組み合わせであるこ
とができ、そして置換゛または非置換であることができ
、通常脂肪族不飽和を含まず、ここで置換基は１〜６個
の炭素原子のアルキルまたはアルコキシ、ハロ、ニトロ
、フェニル、２〜６個の炭素原子のジアルキルアミノ、
オキソなどを包含し、そしてギ酸および炭酸の誘導体を
包含する。

多くの場合、ＢがＨであるとき、Ｇは次式をもつであろ
う： （Ｘ２）ｃ−Δ−ｃ。

式中、 Δは１〜１０個、通常１〜６個の炭素原子の、通常飽和
された脂肪族または脂環族の基、またはアリール基（カ
ルコダンまたは窒素である異種原子の１〜２個を有する
複素環族を包含し、そして環は５〜６の環構成畝、１〜
２の壌および５〜１２個の炭素原子を有する）、または
アラルキル基（ここでアリールは上に定義した通りであ
り、そしてアルキルは１〜３個の炭素原子をもつ）であ
り、 ＣはΔが脂肪族であるときＯであり、そしてΔがアリー
ルまたはアラルキルであるときθ〜３、通常Ｏ〜２であ
り、 Ｘ２は１〜６個、通常１〜４個の炭素原子のアルキルマ
タハアルコキシ、ハロ、トくにクロロ、フェニル、ニト
ロ、シアノなどある。

ＢおよびＧが一緒になって２価の基を形成するとき、２
価の基は３〜１２個の炭素原子およびジオイルのオキソ
原子以外の０〜４個の異種原子のアルキリデンまたはジ
オイルであり、そして脂肪族、脂環族、芳香族または複
素環族、あるいはそれらの組み合わせであることができ
、アルキリデンはイミンまたはアミジンを形成し、ジオ
イルは環式イミドを形成し、ここでアルキリデンは通常
１〜３個の炭素原子のアルキリデンであり、二置換アミ
ノ、とくに２〜１０個の炭素原子のジアルキルアミン基
でα−置換されて誉り、一方ジオイルは４〜１２個の炭
素原子をもつであろう。

ＢおよびＧとして使用するために報告された特定の基は
、次の通りである： アルキル−Ｃｏ　　　　シャラー（Ｓａｈａｌｌｅｒ　
）ら、８５：３Ｂ２１　：コスター （Ｋｏｓｔｅｒ）ら、テトラヘドロ ン（Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　）（１９８１）３７：３
６３：オルギビエ （Ｏｌｇｉｖｉｅ　）ら、テトラヘド ロ１５ Ｘ３−アリール−ｃｏ　　　コスタ−（Ｋｏｓｔｅｒ　
）ら、前掲アリールー〆、ピリジ ル、　Ｘ　−Ｍｅｎ、卵、。

Ｍｅ　ｊ　Ｃ１−＋　Ｎｏ　２　＋ ｔ、−ブチル ＸＳ−了り−ル　　　　ヒンメルスバッ−”（Ｈｌｍｍ
ｓｌｓｂａａｈ　）（ＣＨ２）０−２０ＣＯおよびデフ
レイデレル（Ｐｆｌｅｉｄａｒａｒ）、テトラヘト３５
８３：ワトキンス（Ｗａｔｋｉｎａ　）およびラッ／母
ポー）　（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ　）、４７７１　：ワト
キンス（Ｗａｔｋｉｎｓ　）１０４：５７０２ −ＣＨニ　　　　　　　　ホリイ（）Ｉｏｌｙ）および
ゼムリ（Ｃｏ１１ｅｅｔｌｏｎ ３４：２４４９；マクプライト９ （ＭｏＢｒｉｄｅ）およびカルサー ズ（Ｃａｒｕｔｈ＠ｒａ　）、テトラへ２９５３：フレ
ーラー（Ｆｒｏｅｈｌ＊ｒ　）およびマチウシ（Ｍａｔ
ｔｓｕａｅｌλ−ＣＯ−π−ＣＯ−クメラ（Ｋｕｍｅ）
ら、１ｂｉｄクロロ置換０− フェニレン 上の成分の中にはある種の好ましい基が存在する。末端
ブロッキング基について、トリアリールメチル基、とく
にジメトキシトリチルは合成の間のモノマーのために好
ましい。環外アミノ保護基について、アルキリデン、と
くにジブチルアミノメチレンは好ましい。

次にＭ（曹な官能性はオリゴマーの支持体への結合であ
る。この結合はオリゴメリゼーションの種種の段階、キ
ャッピング基および保獲基、および通常ブロッキング基
の除去、および、適当ならば、誤甘りの配列の加水分解
的分解の間に安定であるべきである。完成されたオリゴ
マーを解放するための官能性を包含する結合単位の選択
は、支持体、プロ、キング基およびリンの基のモノマー
および性質、キャッピング基およびオリがメリゼーショ
ンのために用いる試薬により影響を受けるであろう。

広範な種類の支持体を用いることができ、それらの例は
次の通りであるニジリカ、ポラシル（Ｆｏｒａｓｉｌ　
）　０％ポリスチレン、調節された孔のガラス（Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ　）　（ＣＰＧ
　）、ケイ藻土、ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポ
リ（アクリルモルホリド〕、ポリ（テトラフルオロエチ
レン〕上にグラフトしたポリスチレン、セルロース、セ
ファデックス（５ａｐｈａｄｓｘ　）　ＬＨ−２０、フ
ラクトシル（Ｆｒａａｔｏｓｉｌ　）　５００など。興
味ある参考文献は、次の通りである：マチウシ（Ｍａｔ
ｔ＠ｕｃｃｉ　）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ　）、（１９８１）２２　：４１７７　：がイト（
Ｇａｉｔ）ら、ニュエ（Ｂｓｌａｇｊｅ　）およびブラ
ッシ（Ｂｒｕｓｈ　）、前記（１９８２）１０：６２９
５：がイト（Ｇａｉｔ）および４３９１　；ミョシ（Ｍ
ｉｙｏｍｈｉ　）およびイタクラ２０４１；シュイザ−
（Ｓｃｈｗｙｚｅｒ　）ら、ヘルペチ（１９８４）５７
：１３１．６；チョレット（Ｃｈｏｌｌｓｔ　）フレア
（Ｃｒｅａ　）およびホーン（Ｈｏｒｎ）、前掲（１９
８０）８：２３３１　；ホーン（Ｈｏｒｎ　）ら、２２
５；トラゲイン（Ｔｒａｇｌｉｎ　）ら、テトラヘト２
４：１６９１：コスタ−（Ｋｏａｔｅｒ　）ら、テトラ
ヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）（１９８４）４０
：１０３”。

（１９８３）２４　：５３２１　：コスター（Ｋｏａｔ
ｅｒ　）ら、１５３１；デンペク（Ｄｅｍｂｅｋ　）ら
、ジャーナＡ／−Ｍｅｔｈｏｄｓ）、セトロウ（Ｓｅｔ
ｌｏｗ）およびホレンダー（Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ　）
編、Ｖｏｌ、４．１９８２．１−１２ページ、ゾレナム
・プレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅ＋＋ｓ　）ニューヨーク
。

支持体の性質に依存して、異なる官能基がアンカー（ａ
ｎｅｌｒｏｒ　）としてはたらくであろう。ケイ素含有
支持体、例えば、シリカおよびがラスについて、置換ア
ルキルおよびアリールシリル化合物を用いてシロキサン
またはシロキシイミンの結合を形成する。有機ポリマー
では、エーテル、エステル、アミド、サルファイド、ス
ルホン、ホスフェートを使用できる。アリール基、例え
ば、ポリスチレンについて、ハロメチル化を官能化に使
用することができ、ここでハロ基を次いでオキシ、チオ
（これは酸化してスルホンにすることができる）、アミ
ン、ホスホ（ホスフィン、ホスファイトまたはホスフェ
ートとして）、シリルなどで置換することができる。ケ
イ藻土、例えば、多孔質ケイ藻土では、ケイ藻土をポリ
アクリル醸造誘体により活性化し、そして活性化された
官能性をアミノ基と反応させてアミン結合を形成できる
。多糖類を無機エステル、例えば、ホスフェートで官能
化することができ、ここで他の酸素は鎖を結合するはた
らきをする。ポリアクリル酸誘導体では、カルがキシル
および側鎖の官能性、例えば、Ｎ−ヒドロキシエチルア
クリルアミドは普通の方法で使用して結合基を接合する
ことができる。

結合の基および鎖は、第４ヌクレオチドを結合する長さ
、官能性および方法に関して広く変化するであろう。鎖
を延長するため、官能性はシリル基、エーテル基、アミ
ノ基、アミド官能性などを含むことができ、ここで試薬
、例えば、ジアミンおよび二塩基酸、アミノ酸、単糖、
シランなどを用いる。

文献に報告されてきているある数の支持体および結合基
を、下表に示す。

以下余白 １Ｎ開１］、’７６２−１９０９Ｇ（１５）ポリヌクレ
オチドを製造する種々の技術が文献に記載されている。

例えば、ホスホルアミダイトのその場の製造、ベアラケ
イ−）　（Ｂｅａｕｃａｇ・）、（１９８４）２５　：
３７５　：　　ホスフェートトリエステルの紙のディス
ク法、フランク（Ｆｒａｎｋ　）ら、ヌ４３６５および
メイセス（Ｍａｔｈ’ｓ）ら、ＥＭＢＯ（１９８４）８
００：ホスフェートトリエステル−１−ヒドロキシベン
トリアゾール法、ファン・デＡ／　ｊ　ｆレル（Ｖａｎ
　ｄｅｒ　Ｍａｒｅｌ　）ら、ヌクレイッホスフェート
トリエステルーアリールスルホニルテトラゾール結合法
、スタウンスキ（Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ　）ら、前掲（１
９７７）５：３５３；　ポスフェートトリエステルバリ
ウム塩法、ゴー（Ｇｏｕｇｈ　）ら、前掲（１９７９）
７：１９５５：ホスフェートトリエステル濾過法、チャ
ウドフリ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｌ　）ら、テト（１９８４
）２５　：４０３７：逆ホスフィチル化、ジャラマン（
Ｊａｙａｒａｍａｎ　）およびマククラウハーティフェ
ートトリエステル（Ｓ／−３／）法、ベラがゾエ（Ｂｅ
ｌａｇａｊｓ　）および！マチ（Ｂｒｕｓｈ　）、ヌク
レイツク・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｏ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒ＠ｉ、）（１９８２）１０　：６２９５　：ホ
スホルアミダイト法、ベアウケイジ（Ｂａａｕｃａｇｓ
＋　）およびカルサーズホスホクロリダイト法、マチウ
シ（Ｍａｔｔａｕｃｃｌ　）およびカルサーズ（Ｃａｒ
ｕｔｈｅｒｍ　）、ジャーナル・エイト６シリンゾ”法
、タナ力（Ｔａｎａｋａ　）および（１９８２〕１０：
３２４９；メチルホスロジテトラゾリド（ＭＰＤＴ　）
−ホスファイト法、カオ（Ｃａｏ　）ら、シアノエチル
ホスホルアミダイト、シンハおよびニトロフェネチルホ
スホルアミダイト、ペイツェル（Ｂｅ１ｔｚ＠ｒ　）お
よびデフレイデレル（１９８４）２５：１９７５゜ 残りの試薬はキャツピング剤であり、これは遊離ヒドロ
キシル基を有する失敗の配列をキャッピングするはたら
きをする。大部分について、キャラぎング基は、カルピ
ン酸アシル基であり、とくに２〜８個、通常２〜６個の
炭素原子および０〜２個のへテロ置換基を有するアシル
基であり、ペテロ置換基は酸素、イオウおよび窒素、と
くにオキシまたはオキソとして酸素、チオエーテルまた
はスルホンとしてイオウ、およびアミノ窒素として窒素
を含み、それに共有結合した水素原子を含有しない。キ
ャッピング基の例は、アセチル、レプリニル、アリール
チオウタニル、トくにフエニ（５５〕 ル、およびゾメトキシトリア！リルホスフィンである。

キャッピング試薬およびその使用法は、前に引用した参
考文献、マチウシ（Ｍａｔｔｅｕａｃｌ　）およびカル
サーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　）、およびチョウ（Ｃｈ
ｏｗ　）ら、ならびにアがルワル（Ａｇａｒｗａｌ　）
れており、これらの参考文献を引用によってここに加え
る。

種々の組み合わせが好ましいであろう。例えば、３／−
Ｓ／方向の核酸の調製において、好ましい末端ブロッキ
ング基は通常トリチル基であり、ここでアリール基なら
びに置換基を変更することができ、ジメトキシトリチル
は好ましい。環外アミン保護基として、好ましい基はメ
チレン基、とくにシフアルキルアミノメチレン、アルカ
ノイル、とくに分枝鎖状アルカノイル、およびアロイル
、とくにベンゾイルおよび置換ベンゾイルである。結合
官能基として、カル♂ン酸エステル、グリコール、およ
びトリチルエーテルが使用されるであろう。キャッピン
グ官能基として、カルゲン酸のキャッピング基、とくに
アセチルおよびレプリニルはとくに興味がある。

保護官能基、ブロッキング官能基、キャッピング官能基
および結合官能基の種々の組み合わせを、関連する官能
基を除去または切離すための種々の試薬と組み合わせて
使用できる。次の組み合わせは例示である。

ｉｕ下全余 白５８） 注： Ｉ　　Ｐ−０リン上の酸素の保護基 Ｎ　　環外アミンの保護基 Ｂ　　　５’−ブロッキング基 Ｃ５’−キャッピング基 Ｌ　　支持体への結合 （刑 Ｒ＝。

ポリマー −Ｎｏ２−〆−ＣＨ２− 上に示したように、環外アミノ基のための保護基の除去
のため、水性アンモニアおよびヒドラジンを用いること
ができ、これらはキャッピング基を除去するはたらきを
する。

酵素的加水分解妨害保護官能基あるいは所望の生成物上
の末端５′または３′部分を除外したすべてのブロッキ
ング基を除去した後、先端を切った失敗配列（ｔｒｕｎ
ｃａｔｅｄ　ｆａｉｌｕｒｅ　ｓ＠ｑｕ＠ｎａ＠ｓ　）
の酵素的加水分解を実施する。加水分解のための酵素は
、速度、５／−３７または３′−５′の加水分解（合成
の方向に依存する）、末端ブロッキング基による阻止、
エンドヌクレアーゼ活性の欠除および配列または二次構
造依存性の欠除に基づいて選択されるであろう。ａ／、
、、　５／合成のルートについて次の酵素を使用できる
：牌ホスホジェステラーゼ〔ベルナルディ（Ｂ・ｒｎａ
ｒｄｌ　）およびベルナルディ（Ｂ＠ｒｎａｒｄｉ　）
、１９７１、ザ・エンチム（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ　）
、Ｐ、Ｄ、　ｙｆイア−（Ｂｏｙｓｒ　）編、第３版、
■、４．２７１ポージ、アカデミツク・プレス、（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）細胞外エキソヌク
レア（１９６７）２４２　：２７００、カナモレ（Ｋａ
ｎａｍｏｒｅ　）１７３；カナモレ（Ｋａｎａｍｏｒｅ
　）ら、パイオヒミカ・サケ１テステス（Ｓａｌｍｏｎ
　ｔｅａｔｅａ　）エキソヌクレアーゼ〔メノン（Ｍｅ
ｎｏｎ　）およびスミス（Ｓｍｉ　ｔｈ　）、ステラー
ゼ〔ファイアーズ（Ｆｉｒｅｓ　）およびコラ合成ルー
トのために、次の酵素を使用できる：スネイク・ペノム
（５ｎａｋｅ　ｖｅｎｏｍ　）ホスホジェステラーゼ〔
ラスコラスキ−（Ｌａｗｋｏｗｓｈｉ　）、１９７１、
ザ・エンチムス（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）、Ｐ、Ｄ
、　＋ｔ”イア−（Ｂｏｙ＠ｒ　）編、第３版、ｖ、４
．３１３−（−ジ、アカデミツク・プレス、ニー−ヨー
ク〕、マウス　　−の腎のホスホジェステラーゼ〔ラゼ
ル（Ｒａｚｚａｌｌ）、３０３１）、　ニンジンのエキ
ソヌクレアーゼ〔ハ（Ｂｉｏｃｈ＠ｍ１ｍｔｒｙ　）　
（１９７０）　９　：　９２１　）およびアベナ・リー
ク（ａｖｅｎａ　１ｅａｋ　）ホスホジェステラーゼ〔
ウドパルディ（Ｕｄｖａｒｄｙ　）、パイオヒミ検定の
ために適当な条件は、引用した参考文献に記載されてい
る。

核酸と多くの類似性を共有するポリペプチドを本発明に
おいて使用することもできる。ポリペプチドについて、
末端ブロッキング基は通常α−ア（６１〕 ミノ基に結合した基であるが、合成は末端基としてカル
がキシルを用いて逆方向であることもできる。保護基は
側鎖のアミノ、ヒドロキシル、メルカプトおよびカル♂
キシ基に結合した基であり、これらの基はリジン、アル
ギニン、ヒスチジン、チロシン、セリン、スレオニン、
システィン、アスパラギン酸およびグルタミン酸中に存
在する。

さらに、種々の樹脂を用い、ここで完成された鎖は樹脂
から切離さなくてはならず、そして付加が起こらなかっ
た鎖をキャッピングすることが望ましく、これは核酸の
鎖の場合とまったく同じである。

多くの場合、鎖がＣ−Ｎ方向またはＮ−Ｃ方向のいずれ
に構成されるか、すなわち、鎖上の末端官能基がカル？
キシであるかアミノであるかに依存して、鎖の構成に用
いるアミノ酸は次の式の１つを有するであろう。

影、下余白 に−Ｊ ＱＮＣＨＣＯＵ Ｋ　１−　Ｊ　１ Ｑ　’Ｎ−ＣＨＣ０Ｕ’ 式中、 ＪおよびＪｌはＤ−またはＬ−アミノ酸のいずれかのア
ミノ酸の残部であり、そして２０の天然アミノ酸または
天然以外のアミノ酸、例えば、ホモセリン、ノルロイシ
ン、サルコシンなどのノルマル側鎖のいずれかを含み、 Ｋおよびに１は官能基保護基であり、官能基がアミン（
これはアミノがアミノ基、グアニジンまたはイミダゾー
ルであるかどうかによりさらに区別されうる）、ヒドロ
キシ、メルカプｉｔたはカル２キシのいずれであるか依
存して、それらの性質が異なり；アミノについて、保護
基は４〜１２個の炭素原子のα、β−不飽和ケトン、２
〜１２個、通常４〜１０個の炭素原子のオキシカル４？
ニル（とくに脂肪族、芳香族およびアラルキルは酸不安
定性である）、β−ノヶトン、アリールスルフェニル、
アリールスルホニル、アラルキル、ニトロ、およびポリ
ニトロフェニルを包含することができ、 ヒドロキシについて、７〜１２個の炭素原子のアラルキ
ルおよびアリールオキンカルゴニル（両者は置換および
非置換である）を包含することがでさ、 メルカプトについて、１〜１０個の炭素原子のアルキル
およびアラルキル（これはジサルファイドを形成するイ
オウ、例えば、メチルジチオを形成するメチルチオを含
有できる）を包含することができ、 カルがキシについて、７〜１２個の炭素原子のアラルキ
ル（置換および非置換）または２〜７個の炭素原子のア
ルキルを包含することができ、末端ブロッキングＱにつ
いて、アミン末端基について、２〜１２個の炭素原子、
通常５〜１０個の炭素原子のオキシカルがニル（これら
は脂肪族、脂環族、芳香族、またはそれらの組み合わせ
である）；ジアシル（これは５〜６の項構成員の環式イ
ミドを形成できる）；アラルキル、とくにトリチル（置
換および非置換）、および２〜４個の炭素原子のポリフ
ルオロカルデフ１浚、とくに・！−フルオロを包含する
ことができ、 Ｑｌは水素であろうが、ここで末端基はカルぜキシ予あ
り、 末端基がアミンであるとき、Ｕはヒドロキシまたは水性
媒質中でアミノ酸へのアミド結合を形成できるエステル
基であることができ、そしてＮ−オキシスクシンイミド
、０−ニトロフェニル、Ｋンタクロロフェニル、４−オ
キシ−３−二トロベンゼンスルホン酸、または、とくに
カルノン酸誘導体との、混合無水物のような基を包含す
るであろう。

Ｕｌは、末端基としてはたらき、１〜１０閥の炭素原子
のアルキルまたはアラルキルであることができる。

窒素上の残りの原子価は、他の方法で置換されていない
場合、水素であろう。

種々の！ロッキング基および保護基について一般化され
た参考文献は、次のものである：パラニー（Ｂａｒａｎ
ｙ　）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｌｓｌｄ）
、Ｂｉｏｌｏｇｙ　）、Ｖｏ　１　、２、スペシャルメ
ンズ（ＳｐａｃｌａｌＭｅｔｈｏｄａ　）、〔グロス（
Ｇｒｏａｓ）およびメイエンホフ７−　（Ｍｅｉｅｎｈ
ｏｆｅｒ　）ｆｌｆｉｌｌ、１９７９゜文献に記載され
ている保護基の例示的列挙は、次の通りである。

アミノ酸保護基 Ｈ２ エナミン　　　　　　米国特許第３，６４５，９９６号
、−ｉ＊−、ｙｈｙｖ“＝“　　　同第３，６４５，９
９６カ、６第３．９１５，９４５号；アンフィン セン（Ａｎｆｉｎａｅｎ　）、ピュア アルキルチオカル　　　コロニッシュ（Ｋｏｌｌｏｎｉ
ｔｓｈ　）８３：２２８８−２２９３ メチルスルホニル　　　テツサー（Ｔｅｓｓｅｒ）およ
びバフ：２９５ ジアルキルホスフィ　　ファン・アン・アラカー（Ｖａ
ｎ　ｄｅｎ　Ａｋｋｅｒ　）およびジェリネク（Ｊｅｌ
ｌｌｎｅｋ　）、 ジチアスクシノイル　　・々ラニイ（Ｂａｒａｎ）’）
およびメリフィールド（Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ　）、Ａｍ
、Ｃｈ＠ｍ、８ｏｅ、）（１９７７）９９ニア３６３ β−・ジケト　　　　　　米国特許第３，６４５，９９
６号、ｏ　−Ｎｏ　２ｙｓ　　　　　　　米国特許第３
，９１５，９４９号トシル　　　　　　　米国特許第４
．０６２，８１５号トリフルオロ酢酸　　　　アンフィ
ンセン（Ａｎｆ　１ｎｓｅｎ　）、ａｕｐｒａ：アサ−
トン （Ａｔｈｅｒｔｏｎ）ら、（１９７９）１ペゾチド（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ）’ 〔シーミオン（Ｓｉｅｍｉｏｎ　）お よびクプリスゼウスキー （Ｋｕｐｒｙｍｚｅｗｓｋｉ　）編〕 ２０７−２１０ページ、ウロクロ ウ大学（Ｗｒｏｃｌａｗ　Ｕｎｉｖ、）出版部、ボーラ
ンド、ウロクロ ウ；ジョーンス（Ｊｏｎｅｓ　）、 ２８５３　；シュラツタ− （５ｅｈｌａｔｔｅｒ　）ら、テトラへＬ＠ｔｔ、）　
１９７７　：２８５１ ベンジル（１ｍ） Ｎｏ２（グアニジン） フルオレニルメトキシ　チャンク（Ｃｈａｎｇ　）　ら
、インＲｅｍ、）（１９８０）１５：４８５ ２．４−ゾニトロフェ　　米国特許第４，４８７，７１
５号ニル トリチル　　　　　　ゼルパス（Ｚ＠ｒｖａｓ　）およ
びチオドロボウロス （Ｔｈｅｏｄｏｒｐｏｕｌｏｓ）、ジャ７８：１３５９
−１３６９ Ｈ ベンジル　　　　　　米国特許第３，９１５，９４９号
Ｂｒ０ＯＣＯ米国特許第４，０６２，８１５号Ｈ ベンジン　　　　　　米国特許第３，７４３，６２８号
１−４個の炭素原子の　米国特許第４．０６２，８１５
号アルキル Ｓ−アルキルメルカプト　　フリートマン（Ｆｒｉ＠ｄ
ｍａｎ）（１９７３）［アミノ酸、−１！ノチ ドおよびタンノ４り質におけるス ルフヒドリル基の化学および生 化学（Ｔｈｅ　Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　ａｎｄＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　　ｔｈｅＳｕｌｆｈｙｄｒｙｉ
　Ｇｒｏｕｐ　　ｉｎＡｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ、Ｐｅｐ
ｔｉｄｅｓａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　オフスフオー
ド・〕ぐ−ガモン〕」 Ｃｏ　Ｉ（ ベンジル　　　　　　米国特許第３，９１５，９４９号
アンフィンセン（Ａｎｆ　１ｎｓｅｎ　）、５ｕｐｒａ ２−オキシメチレン　　ケンｆ　（Ｋｅｍｐ　）および
レクゼアントラキノン ク（Ｒｅｃｚｅｋ　）、テトラヘドロ （１９７７）１２　：１０３１ 特定の！ロッキング基および保護基に加えて、支持体へ
の結合および支持体の性質に関連する官能基がまた存在
する。広範な種類の支持体がポリペプチド合成に関連し
て使用されてきている。支持体は架橋したポリスチレン
、セルロース、ポリビニルアルコール、ガラス、ポリエ
チレンイミンなどのような種々の物質を包含する。この
ような支持体を用いるとき、広範な種類の結合がこの支
持体へ最初のアミノ酸を結合するために使用されてきて
いる。結合は、ポリペプチド末端がアミノまたはカルボ
キルであるかに依存して、エステル、アミドおよび置換
アミンを包含する。

文献に記載される支持体および結合官能基の例は、次の
通りである： Ｘ−結合ポリスチレン、米国特許第３，７４３，６２８
号、ＨＯＣＨ２−スルホン化ポ リスチレン；置換ポリ 一スチレン ｐ−オキシペンシル樹　米国特許第３，８１４，７３２
号脂ガラスピーズ ビニルベンゼンアミン　米国特許第４，０６０，６８９
号酸エステル ｐ−メチレ／−ニトロ　米国特許第４，０６２，８１５
号ベンズアミドリンカ− （１ｉｎｋｏｒ　　） ポリエチレンイミン　　プレベル（Ｂｌｓｃｈｅｒ）お
よび！フェンダー（Ｐｆａ＠ｎｄｅｒ　）、１９７３：
１２６３ チオフェニルエトキ　　ガイド（Ｇａｉｔ）およびシェ
シリ７カー　　　　　　　Ａ−）−（Ｓｈ＊ｐｐａｒｄ
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７：１３１６ ｏ　−ＮＯ２ＣＨ２０−ｔ　　　　　リッチ（Ｒｌｃｈ
　）およびグルワ（１９７５）９７：６．１５７５： セハビ（Ｚｅｈａｖｉ　）ら、ジャ アメリカン・ケミカル・ソサイ フリドキン（Ｆｒ１ｄｋｉｎ　）ら、 ８７：４６４６；メリフィール ド（Ｍｅｒｒｉｆｌｅｌｄ　）、ジャーナル・オプ・ア
メリカン・ケミ Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）（１９６３）８５：２１４９ シュラツタ−（５ｅｈｌａｔｔ＠ｒ　）２８５１：ゾヨ
ンズ（Ｊｏｎｅｓ　）、アサート７（Ａｔｈ＊ｒｔｏｎ
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７−２１０ページ、ウロクロ ウ大学印刷部、ボーランド、ウ ロクロウ トリックン分解性基　　メイアーズ（Ｍｅｙｅｒｓ　）
およびを介する固定　　　　　／、ｘ（Ｇｌａｓｓ　）
ｓオ。ツー７゜２１９３；グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら、 （１９７３）１２：６６４： （１９７５）″ペゾチド （Ｐｅｐｔｉｄ＠５）１９７４”（ｙ。

ウォルマン（Ｗｏｌｍａｎ　）編〕、 ４０３−４１３、ウィリー （Ｗｔｌｅｙ）、ニューヨーク。

キャッピング基として、アミンのための側鎖の保護基と
して用いたのと同一の形であるが、末端ブロッキング基
と異なる基を使用できる。この方法におりて、キャッピ
ング基および側鎖の保護基は誤まりの配列の酵素的分解
の前に同時に除去することができる。

アミノ末端のためのキャッピング基の例は、トリチル、
Ｉリフルオロアシル、フルオロメトキシカルがニル、ジ
チアスクシニノイル、Ｏ−ニトロフェニルスルフェニル
および２．４−ジニトロヘエニルである。

オリがマーのポリＡ！プチドが完成したとき、保護基、
キャッピング基およびブロッキング基とともに含まれる
種々の官能基を切離し、基を除去し、次いで支持体から
切離す。次の表は、官能基および試薬の種々の組み合わ
せを例示する。

以下余白　　　・ ｐ−ｏ　　　側鎖の酸素上の保護基 Ｓ　　　　〃　イオウ上の保護基 Ｎ　　　　ｌ　窒素上の保護基 ＣＯＯｓ　　カルボキシレート上の保護基Ｂ　　　　末
端ブロッキング基 Ｃキャッピング基 Ｌ　　　　支持体への結合 実施例１において上に示したように、Ｉリペデチドの調
製において、保護基およびキャッピング基としてチオ分
解性基を用いることにより、末端アミノ酸が付加された
とき、保護基およびキャッピング基はカル？ニル末端ブ
ロッキング基の存在下に優先的に除去することができる
。塩基性条件下でのチオフェノールのような条件を用い
ると、α−アミノ末端ブロッキングを保持している間、
保護基およびキャッピング基を除去できる。次いで、誤
ｔりの配列をアミノペグチダーゼ、例えば、アミノペプ
チダーゼＭを用いて分解できる〔ロイアー（Ｒｏｙ＠ｒ
）およびアンドリュー　（Ａｎｄｒｅｖ　）、リー（Ｊ
、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、）（１９７３）２４８：１８０７
−１８１２〕。分解後、末端保護基および支持体への結
合は、特定の基に依存して、同時にあるいは順次に切離
すことができる。例えば、オキソ−カルノニルおよびβ
−排除を可能とする基、例えば、スルホニルエチルを用
いると、アミノ酸の鎖は同時に支持体から解放しかつ脱
ブロクキングすることができるであろう。

カルゲキシル基が末端であるとき、末端ブロッキング基
は第三アルキルまたはアラルキル基を含むことができ、
これらの基は酸不安定性であるが、塩基不安定性側鎖保
護基、例えば、ポリフルオロアセチルまたはチオ分解性
側鎖保護基（上を参照）を用いることができる。次いで
、誤まりの配列をカル？キシペノチダーゼＡ、Ｂまたは
Ｃあるいはそれらの組み合わせで分解することができる
。配列の例は、次の通りである。光年安定性である０−
ニトロベンジル結合官能基に対して第１アミノ酸を用い
て、エステルを形成する。末端ブロッキング基はｌ＠ｒ
ｔ−ブトキシオキシカル♂ニル（ｔＢＯＣ）であること
ができるであろう。チオ分解性側鎖保護基、例えば、Ｓ
−アルキルメルカプト、ジチアスクシノイル、ノニトロ
フェニル、フェナシルなどを用いる。こうして、側鎖保
護基は除去できるが、末端ブロッキング基は保持される
。

カルピキシが末端基であるとき、異なる試薬をブロッキ
ング基、保護基およびキャッピング基として使用できる
。例えば、アミン基を支持体へ酸および１１基安定性の
結合により固定し、この結合は水素化分解、例えば、ス
ルフェニル、または光分解切離しにより切離すことがで
きる。末端ブロッキング基は酸不安定性ｔａｒｔ−アル
キル基であることができ、この基は二塩化メチレン中で
トリフルオロ酢酸で除去することができる。あるいは、
ｔＢＯｃヒドラジニルを末端ブロッキング基として使用
することができ、この基は４ＮのＨｃｔ７ジオキサンの
ような試薬で除去できる。側鎖の保護基は塩基不安定性
基、例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ
ｍｏｃ）およびチオ分解性基（上を参照〕であり、一方
キャッピング基は低級アルキル、例えば、メチルである
。誤まりの配列を分解した後、末端ブロッキング基を除
去し、完成したポリペプチドを支持体から切り離し、単
離し、そして必要に応じて精製する。

通常不必要であるが、存在しうる他の物質を除去するた
めに、さらに精製を行うとき、種々の技術、例えば、透
析、ダル透過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰ
ＬＣ，親和クロマトグラフィーなどを用いることができ
る。

使用する支持体は、種々の配列の調製に手動法または自
動化法のいずれを用いるかに依存して変化するであろう
。一般に、自動化手順について、粒子サイズは約５０〜
３００ミクロン、より通常約１００〜２００ミクロンで
あり、これに対して手動合成を用いるとき粒子の大きさ
は前記範囲の下であり、一般に約１００〜１５０ミクロ
ンであることができる。

ポリヌクレオチドの合成を例示するために、次の例を提
供する。

便利には、支持体への結合基のカルボン酸を適当なカー
ゼジイミドまたは活性化カルがニル、例えば、カルボニ
ルジイミダゾールで活性化し、カルぎン酸無水物または
混合無水物との反応によりあるいは他の慣用の技術によ
り、第１ヌクレオシドへのエステル結合を形成できる。

いったん支持体へ接合したヌクレオシジルエステルがＩ
ｉ＋４製されると、それをポリヌクレオチド鎖の伸長の
開始に使用することができる。一連の段階の各々はヌク
レオチドの付加を含む各配列について反〈Ｏされるので
、第１工程は支持体へ結合した末端ヌクレオチドからの
ブロッキング基の除去であろう。すでに示したように、
多くの場合、ブロッキング基はトリチル基であろう。便
利には、この基は不活性有機媒質、例えば、ジクロロメ
タン中で、ルイス酸、金属ハロダン化物、例えば、臭化
亜鉛、またｌｄプロトン酸、とくに強いカルボンｆｉｌ
　（ｐＫａ＜４　）例えば・ジクロロ酢酸、トリクロロ
酢酸などにより除去される。ルイス酸の濃度は一般に約
０．１〜１．０モルである。反応時間は一般に約１〜５
分であり、そしてこの時間は反応を完結させ、同時に副
反応を最小とするように選択されろ。この工程はホスホ
ルアミダイト甘たけホスフェートを含むいずれの手順に
対しても共通である。

次いで粒子を適当な不活性溶媒または溶媒混合物あるい
は溶媒の系列、とくに有機極性溶媒で洗浄し、最後に不
活性無水極性溶媒、例えば、アセトニトリル、ジクロロ
メタンなどで洗浄して湿気が確実に存在し々いようにす
る。適当ならば、これらの工程は不活性の無水の環境、
例えば、アルアン、水素、ヘリウム、９素などの存在下
に実施する。通常、各段階における最後の洗浄は次の工
程の溶媒系を用いる。

よく洗浄して微量の酸を除去した後、接合粒子（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅｄ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　）は次のヌクレ
オチドを付加できる状態にある。使用する特定のリン酸
誘導体に依存して、！ロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
　）はここで変化するであろう。ホスホルアミダイトを
使用するとき、ホスホルアミダイトは活性化剤、例えば
、テトラゾールと糾み合わせて添加される。

この反応の条件は不活性無水極性溶媒、例えば、アセト
ニトリルを短時間に使用することであり、一般に５分以
内、通常約１〜３分は十分である。

トリエステルのルートにおいて、ホスフェートのトリア
ルキルアンモニウム塩の添加は活性化剤、例工ば、メシ
チレンスルホニル−３−二トロー１゜２．３−）リアゾ
ールまたは塩化スルホニルおよびＮ−メチルイミダゾー
ル、すなわち、活性化アリールスルホン酸化合物の存在
下に実施する。

リン化合物と縮合の後、不活性無水極性有機溶媒、例え
ば、アセトニトリルを用いる完全な洗浄を実施する。

ホスホルアミダイトでは、次の段階を変化させることが
でき、キャッピングは酸化と交互するであろう。すなわ
ち、ホスファイトは酸化してホスフェートにしなくては
ならない。

キャッピングのため、アミノ保挿基とともにアミン保轡
基を効率よく除去できるカルアン酸誘導体を使用する。

好ま１７いカルぜン酸は脂肪族カルボン酸であり、とく
にヒトう・シンと反応して、通（８４〕 常５〜６項構成員の、環式化合物の形成を可能とする間
隔を置いて位置するカルがニル基を有することができる
、２〜８個、通常２〜５個の炭素原子のオキソ−置換脂
肪族カルボン酸である。とくに興味あるものは酢酸また
はレブリン酸であり、これらは便利には無水物で用い、
エステルの形成に使用できる。

キャッピング反応は、４〜６個の炭素原子の極性エーテ
ル、例えば、テトラヒドロフラン中の約５〜２０容１ｉ
通常約１０容を幅のジアルキル化ピリジンのｍ液中に、
約Ｑ、１〜１モル、通常０．４〜０．６モルの濃度で複
素環式芳香族アミンまたはアミンの混合物、とくにシア
ルギルアミノピリジン、さらにとくに４−ツメチルアミ
ノピリジン（ＤＭＡＰ　）を含有する塩基性溶液を最初
に添加することによって実施する。上のアミン溶液の添
加後、脂肪族カルぜン酸無水物を極性エーテル溶媒中の
約１〜３モル、好ましくは２モルの濃度で加える。こう
して、複素環式芳香族塩基は、カルダン酸誘導体との反
応のためヒドロキシル基を活性化してエステルを生成し
、失敗配列をキャッピングする。

酸化のため、酸化は便利には温和な酸化剤、例えば、塩
基性溶液中のヨウ素を少量の、例えば各各約５〜１５容
量係のジアルキルピリジン、例えば、２．６−ルチジン
、および水を含有する極性脂肪族エーテル中で約０．１
〜０．４モル、好ましくは約０．２モルの濃度で用いて
普通に実施される。

あるいは、有機ヒドロノ母−オキシド、例えば、ｔ−ブ
チルヒドロパーオキシドまたはベンジルノ千−オキシド
を用いることができる。

キャッピング工程と酸化工程との間に、洗浄を実施し、
これには次の工程の溶媒系を使用する。

水を酸化工程において使用し、そして無水系はキャラぎ
ングのために好ましいので、この系列においては、キャ
ッピングは通常最初に実施されるであろう。トリエステ
ル系列のためには、酸化は不必要であり、それゆえキャ
ッピングは縮合後直ちに実施する。

好ましくは不活性の無水有機溶媒、例えば、アセトニト
リルおよびジクロロメタンである逐次的溶媒を用いて、
よく洗浄した後、この手順は反報することができる。ポ
リヌクレオチド鎖がいったんその所望長さに伸長される
と、保投基の除去、失敗配列の分解および所望配列の単
離をここで開始できる。

次の工程はアルキルまたは置換アルキルである酸素上の
置換基の除去のために普通に実施される。

通常、チオフェノキシトを三置換アミンの存在下に用い
る。便利には、不活性エーテル性有機溶媒、例えば、ジ
オキサンを使用する。時間はこの系の性質に依存して広
く変化するであろう。この時間は約５分根度に短かく、
そして約１時間程度に長くあることができる。便利には
、溶媒、メルカプチドおよびアミンの比は容置で２：１
：１の比である。脂肪族ホスフェートエステル基の除去
に引き続いて、極性有機ヒドロキシル化合物、とくにア
ルコール、例えば、メタノールを用いる洗浄を実施する
。酸素上の置換基がクロロフェニルであるとき、オキシ
メート、典型的に（は２−ビリジニルアルドキシメート
、および１，１，３．３−テトラメチルグアニジンの無
水塩基性溶液を普通の条件下に用いることができる。

次の工程において、キャッピング基、例えば、ルブリン
酸、およびアミノ保護基を同時に除去する。この試薬は
高度に塩基性の有機溶媒中のヒドラジンでおり、この溶
媒は少量の有機アンモニウム塩、例えば、２〜４個の炭
素原子の脂彷族カル？ン酸、例えば、酢酸と、溶媒とし
ても作用する複素環式アミンとの塩を含有する。溶媒は
複素環式芳香族塩基、例えば、ピリジンまたは５〜８個
の炭素原子の置換ビリシンであシ、ここでカルアン酸の
量は一般に約１０〜３０容量係、好ましくは約１５〜２
５容量係であろう。ヒドラジンは、水和物として、一般
に約０．２〜１モル、好オしくは約０．５モルであろう
。反応時間は少なくとも１時間、より通常少なくとも６
時間であり、そして約４８時間以下、好ましくは約２４
時間以下であり、温度はほぼ周囲温度ないし５０℃であ
る。この反応に引き続いて、極性有機溶媒、とくにメタ
（８８〕 ノールによる洗浄を実施し、次いで乾燥する。乾燥の方
法は臨界的ではなく、便利には、室温における高い真空
で十分であろう。

この時点において、失敗した配列は遊離のヒドロキシル
基を有するであろうが、成功した配列はトリチルブロッ
キング基で終るであろう。トリチル基を異なる基で置換
すべきとき、トリチル基は温和な酸を下に記載するよう
にして用いて除去することができる。通常、脱トリチル
および再ブロッキングはキャッピング基および保護基の
除去前に実施される。こうして、ヌクレオチド保護官能
基は存在してそれらの部位における反応を阻止するであ
ろう。次いで、末端ヒドロキシルをアシル無水物、例え
ば、安息香酸無水物を第三アミン、例えば、テトラヒト
９０フラン中のＮ、Ｎ−ツメチルアミノピリジン（ＤＭ
ＡＰ　）および２，６−ルチジンの組み合わせ、と−緒
に用いて再ブロッキングすることができ、ここで２．６
−ルチジンは約１　：　１０　（ｖ／ｖ　）であり、無
水物は約０．２〜２モルであり、そしてＤＭＡＰけ約３
〜１０　％　（Ｗ／Ｖ　）である。時間は通常周囲条件
において約５〜３０分で変化するであろう。

失敗した配列をここで酵素的分解、とくにホスホジェス
テラーゼを使用して分解する。用いる媒質は酵素の活性
を最適化し、通常緩衝化水性媒質を用いる。酵素は緩衝
化媒質、１：１水ニアｊ？リオール、とくにグリセロー
ル中に加えることができる。この反応は約４０℃を越え
ず、一般に約２５℃〜４０℃、好捷しくけ約３５℃〜４
０℃の高温において実施することができ、通常約１時間
より長くかつ約２４時間以下の範囲の時間を通常必要と
する。反応の完結時に、媒質を冷却することができ、次
いで支持体’ｔｐ［（約６〜７、好ましくは約６．４〜
６．５の水性緩衝化媒質で洗浄する。緩衝剤の濃度は一
般に約０．０５〜０．２モルである。

ポリヌクレオチドの配列は、前に除去されていない場合
、ここで支持体から除去し、そして末端ヒドロキシル基
を脱ブロッキングすることができる。支持体からの除去
は反応性アミン、例えば、アンモニア、とくに濃水性水
酸化アンモニウムを用いて容易に達成される。除去を脱
ゾロッキングの前に実施するとき、除去は保護基の除去
と関連させて、よりきびしい除去の条件を用いて実施し
て保護基を同時に除去することができる。この反応は周
囲＠度で比較的急速に進行し、通常約０．５〜６時間、
好ましくは約１〜３時間実施する。反応の完結時に、粒
子はポリヌクレオチド配列から、便利には遠心、および
引き続くヌクレオチド配列の単離により、便利にはＭ媒
の蒸発により、除去される。

先端が切られた失敗の断片の酵素的加水分解を５′−保
護ターｒ、ト断片の存在下に実施できる別の手段は、失
敗の断片およびターグツト断片を支持体から酵素の添加
前に除去することである。これは支持体からのＤＮＡの
除去の間に５′−保護基が安定であることを必要とする
。水酸化アンモニウム感受性の結合では、５′−ジメト
キシトリチル、モノメトキシトリチル、トリチル、ホス
ホリル、ピロホスホリルおよび他の基を使用できる。別
の結合は他の５′−保護基の使用を可能とするであろう
。

酵素的分解は、酵素を溶液中で使用し、次いで活性を除
去する（例えば、フェノール抽出）か、あるいは固体に
支持された酵素〔例えば、牌ホスホノエステラーゼ；セ
リ’ｒ”　ｙ　）　（Ｓｅｌ　ｉｇｅｔ　）ら、リング
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ　）、ｖｏｌ、　Ｘ■、　ジョン・ウ
ィリー・アンド・リング（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎ
ｄ　５ｏｎｓ　）、１９８０〕を用いて実施できる。

末端トリチルヒドロキシルブロッキング基の除去は慣用
法により、便利には酸性媒体好ましくは水中の約７５９
６〜８５係の酢酸の中にＩリヌクレオチド配列をまず懸
濁することによって達成することができる。反応が起こ
るために十分な時間を経過させた後、一般に約２時間以
内の後、ＤＮＡ。

ＲＮＡｔたはそれらの組み合わせを少量の沈殿剤、例え
ば、エタノールまたはエーテルの添加に沈殿させること
ができる。次いでポリヌクレオチドは、便利には遠心お
よび引き続く少量の塩基、例えば、濃水酸化アンモニウ
ムの添加による少なくとも部分的中和により単離し、そ
して混合物を蒸発乾固することができる。

アロイル末端ブロッキング基の除去のため、濃水性水酸
化アンモニウムを４０℃〜７０℃ノ高温において２〜６
時間実施することができる。

得られる配列はプローブとして使用することができ、Ｄ
ＮＡ　？リメラーゼとともに使用して二本鎖（ｄａ）Ｄ
ＮＡを形成することができ、あるいは複数の断片を重な
りを可能とする部分的相補性をもたせて使用して、複数
の断片から大きく伸長した配列を生成することができる
。断片をアニーリングして、複数のニックを有する二本
鎖を形成し、そして結合する。

二本鎖配列を得る場合、配列を種々の方法で操作するこ
とができる。配列はベクターまたはウィルスの中に直接
挿入することができ、あるいはアダプター（ａｄａｐｔ
ｏｒ　）、リンカ−（１ｉｎｋｅｒ）などの付加により
修飾することができ、ここで得られるｄｓＤＮＡはベク
ターの中に挿入してクローニングし、引き続いて制限マ
ツピング（”１）Ｐｌｕｇ　）または配列決定して所望
配列の存在を確保することができ、あるいは適当ならば
、発現させることができる。

Ｉリヌクレオチドの調製は図面に示すような装置を用い
て自動化することができる。脱プロ、キングおよび精製
のための自動化装置１０を構成し、この装置は温度が制
御された反応塔１２および共通のヘリウム源１４を有す
る。種々の弁がＮＣ（常態で閉じている）、ＮＯ（常態
で開いている）およびＣ（共通の弁または口）として示
されている。

反応塔１２は両端が多孔質バリヤーで囲まれている。バ
リヤー中の孔は十分に微細であって分散した固相支持体
を反応器内に保持するが、実質的な差圧を用いないで混
合を可能とする。バッキング１６は密に詰められている
。反応塔１２は試薬マニホールド１１８から単離弁２０
よシおよびヘリウムマニホールドから単離弁２２により
分離されている。弁２０および２２の各々は、それぞれ
、廃物ライン２４および２６に接続されている。廃そし
て試薬マニホールドに接続された共通の常態で開いた口
を有する。

試薬マニホールド１８はある数の試薬および洗浄溶液の
供給容器を接続する：　３０Ａ、アセトニトリル−洗浄
：３０Ｂ、水；３００．水酸化アンモニウム；３０Ｄ、
水；３０Ｅ、８０係の酢酸；３ｏｐ、緩衝剤：３０Ｇ、
ホスホジエステル塩基；３０Ｈ，メタノール；および３
０に、チオフェノール−トリエチルアミン−ジオキサン
。

試薬／洗浄溶液の対の各々は単一の入口点で試薬マニホ
ールド１８に接続されている。弁の対を直列に接続する
ことが好ましい。洗浄浴液または希釈溶液を試薬溶液と
結合させ、こうしてそれらを混合しそして反応器へ移送
することができる。

ポリヌクレオチド′ｆｃＫｆＡ製する種々の方法の前の
説明および米国特許第４，４８３，９６４号中の詳細な
説明、ならびに実験の部分に記載する手順に基づψて、
種々の弁を操作して脱ブロッキングおよび精製を実施す
る方法は明らかとなるであろう。

実験 実施例１−ホルムアミジン置換グアニジンの調製 反応フラスコに６．７ｇのデオキシグアノシンを導入し
、これをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）とともに共
蒸発させる。このデオキシグアノシンに。

８．７５１ｎｌのジ−Ｎ−ブチルホルムアミドジメチル
アセタール〔メールウニイン（Ｍｅ・ｒｗ＠ｉ　ｎ　）
ら、リーして調製〕および２００−のＤＭＦを加える。

又クレオシドは急速に溶解するが、３時間以内に完全に
は溶解しない。透明な黄色がかった溶液を蒸発させると
油が得られ、これをジクロロメタン／水性重炭酸ナトリ
ウム中に分配し、有機層を蒸発によシ乾燥し、次いでｌ
ＱＱｍＡ’のジクロロメタン中に溶解し、次いで９００
ｍ１の石油エーテルで沈殿させる。上澄み液をデカンテ
ーションし、沈殿をジクロロメタン中に再溶解し、そし
てジクロロメタンを蒸発させると、１２．９が得られ、
これをピリジンと共蒸発させる。次いでこの混合物に２
００１のピリジンおよび８．５ｇのジメトキシトリチル
クロライドを加え、そして反応を室温において１８時時
間待させる。

この反応混合物にＩＯＩＭのメタノールを加え、揮発性
物質をジクロロメタンと水性重炭酸ナトリウムとの間に
分配させ、蒸発によシ乾燥し、次でトルエン中で共蒸発
させる。得られる発泡体にジクロロメタンを加えて生成
物を溶解し、そしてこの生成物をシリカで精製する。ジ
トリチル化生成物を１１％のメタノールおよびジクロロ
メタンで溶離し、一方所望生成物は２チ〜３チのメタノ
ール溶離で得られる。生成物を含有する分画を合わせ。

蒸発によシ濃縮し、そして９０１１ｉｊのジクロロメタ
ン中に溶解し１次いで石油エーテル（９ＱＱｍｌ）で沈
殿させ、そして単離すると、７．９１１の所望生成物が
得られる。

実施例２−ホルムアミジン置換アデノシンの調製 フレーラー（Ｆｒｏａｈｌ＠ｒ　）およびマチウシ（Ｍ
ａＬｔｅｕｏｃｉ）、ヌクレイツク・アンズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄａＲｅｓ、）　（１９８３
）１１：　８０３１　８０３６に記載されているように
して調製する。

実施例３−レブリン酸キャツピング剤の調製ジエチルエ
ーテル（３２５ｍ／）中のレブリン酸（１００ミリモル
）および５０ミリモルのジシクロへキシルカーがジイミ
ドを６０時間攪拌した。

沖過後、溶媒を蒸留により除去すると、１２．９の黄色
がかった油が得られる。この油を５０ｍ／の無水テトラ
ヒドロフラン中に溶解して、最終濃度１モルのレブリン
酸無水物を得た。

実施例４−ホルムアミダイトの調製 トリチルブロックトヌクレオシド（環外アミンはジブチ
ルアミノホルムアジニル官能性またはベンゾイル官能性
により保護されている）を注意して乾燥し、そして次の
ようにして反応させた。１５ミリモルのヌクレオシドに
２１ｍ１のジイソゾロビルエチルアミジンおよび３０ｍ
１のクロロホルムを加え、そしてこの混合物を窒素の雰
囲気のもとに攪拌する。次いで上の混合物に、Ｎ、Ｎ−
ジイソプロビルアミノメトキシホスホロクロリダイト（
４，ａｍｌ）を約１分かけてゆっくり加える。この添加
を反復し、そして攪拌を２０分間続ける。次いでこの混
合物に２４０ｍ１の酢酸エチルを加え、この混合物を分
液漏斗に移し、窒素でフラッシュし、そして２５０ａｌ
Ｏ脱気した飽和水性ＮａＣ６溶液を加える。両方の相を
激しく振とうしながら混合し、相を分離させ、水相を除
去し、そして抽出を３回反復する。有機相を硫酸す）　
ＩＪウムで乾燥し、次いで蒸発乾固する。この残留物に
、５０ｍ１のトルエンを加え、蒸発を反復する。この残
留物を５０ｒｆＬｅのトルエン中に溶解し、そしてこの
溶液を６００ｍＪのヘキサンに一７０℃において撹拌し
ながら窒素のもとに滴々加える。ホスホルアミダイトは
沈殿し、これを濾過し、そして使用するまでデシケータ
−中に真空下に雑持する。

実施例５一固体の支持体の調製 ９５％のエタノール（２５０ｍ７り中に懸濁させた調節
された孔のガラス（ＣＰＧ）（２５，９、５００Ｘの孔
）〔エレクトロヌクレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒ。

Ｎｕｏｌｅｏｎｉｃｅ　）、米国マザチュセツツ州〕を
、３−アミノゾロピルトリメトキシシラン（７，！Ｍ＋
／）で４８時間処理した。濾過および洗浄後、ＣＰＧを
１２０℃で２時間硬化させてｃｐＧ−ＰｒＮＨ２を得た
。

１０Ｆのこの物質を、コハク酸無水物（３，７１および
４−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ｏ、ｓｇ）
を添加して含有するＴＩ（Ｆ中に懸濁させた。４８時間
反応を停止し、この時ＣＰＧはア之）官能について陽性
の試験（エタノール中のニンヒンドリン）をもはや与え
なかった。末端カルゲキシル基の活性化を、　ＤＭＦ中
のカル？ニルジイミダゾール（４ｇ）で１８時間真空中
で実施した。ＣＰＧを濾過し、ヘキサンジアミ／（４Ｆ
）を含有するＤＭＦ中に直ちに懸濁させた。４８時間後
、ＣＰＧを濾過し、メタノール、ジクロロメタン、エー
テルでよく洗浄し、次いで６０℃で１８時間乾燥した。

実施例６−固体支持ＤＮＡ合成。

固体支持オリゴヌクレオチドの脱保護および酵素的精製 チ（Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）（１９８
１）　９　：　２８０７−２８１１の手順に従い、脱保
護したデオキシヌクレオシド３′−〇−コハク酸訪導体
を官能化アミノ末端−ＣＰＧに結合させることによって
、ヌクレオシドを支持体へ接合させた。

次はポリヌクレオチドの調製に用いたサイクルであυ、
ここでＣＰＧと第１ヌクレオチドとの間の結合基は次の
式を有する２： ＣＰＧ５ｏｏ−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＸ
Ｎ（（ＣＩ（２八ＮＨＣＯ（ｃＩＩ２）２Ｃｏ−３’−
０− 第１ヌクレオシＰは５′−ジメトキシトリメチルでブロ
ッキングされたチミジンであった。モノマーの単位はヌ
クレオシジル置換Ｎ、Ｎ−ツインゾロビル−〇−メチル
ホスホルアミダイトであった。

アデノシンおよびグアノシンはＮ、Ｎ−ジブチルアミノ
メチレンでブロッキングされた環外窒素を有して、環外
アミン窒素をもつアミジンを形成し、一方シトシンはベ
ンゾイルでブロッキングされた環外アミン窒素を有した
。

下表１は、はぼ３Ａモルのチミジンを有する支特休の７
０１Ｒｙを使用する、用いたサイクルを示す。

表ＩＩ サイクル Ｉ　　ＤＭＴの切離 ５　％　ＤＣＡ　、　ＣＨ２ＣＡ２中　　１ｘ１ｍＡ！
、３０秒２ｘ１ｍＪ、フラッシュ通過 ２洗浄 ＣＨ２ＣＡ２　　　　　　　３　Ｘ　１ｔｔｚｌＣＨ、
ＣＮ　（試薬）　　　　　　３Ｘ１１１ＩＪＣＨＣＮ（
ａｎｈ　、　）　　　　　３Ｘ５ｍＪ、　Ａｒ３結合 ４洗浄 無水ＣＨ，ＣＮ　　　　　　０．５ｔｎ１５結合 ａ、　０．５モルのＤＭＡＰ。

ＴＨＦ／Ａ−Ｆジン（９：１ｙ〜）中、　０．５肩ｊ合
計　５分 ６洗浄 ＴＨＦ／２，６−ルチジン／ ［２０（８：　１　：　１　ｖ／ｖ）　　　ｌＴＩＬｇ
、　１５秒′　　７酸化 ８洗浄 ＣＨ３ＣＮ　　　　　　　　３　Ｘ　ＩＩＩＩＡ’９洗
浄 ＣＨ２ＣＡ２　　　　　　　３　Ｘ　１ｔｎｌＩＤＭＴ
−ｐ、ｐ’−ジメトキシトリフェニルメタンＤＣＡ−ジ
クロロ酢ＷＩａｎｈ−無水／無水物ＤＭＡＰ−４−ジメ
チレアミノピリ　ＴＨＦ−テトラヒドロフランシン ルチジン−２，６−シメチルビリ　　ｖ／ｖ−容量／容
量ジン １〜９のサイクルを１４回反復した。第１４ヌクレオチ
ドを付加後、試料を３つの部分に分割し、そして３サイ
クルを、それぞれ、Ａ、ＣおよびＧを用いて異なるよう
に実施し、第１５ヌクレオチドおよび第１６および第１
７ヌクレオチドについて、チミジンであった。試料を第
１５ヌクレオシドの後に合成を続ける前に採取し、ここ
でオリゴヌクレオチドはそれらの最後の残基としてＤＭ
Ｔ　−ｈ、　ＤＭＴ−ＣおよびＤＭＴ　−Ｇを有する。

これらを酵素分解のための対照として使用し、ここで最
後のオリゴヌクレオチドでは、紹成物を半分に分割し、
１つは完全に脱ブロッキングしかつ脱トリチル化し、そ
して第２は脱ブロッキングするが、　ＤＭＴ基を最後の
チミジン上に保持させた。双方の種を酵素反応に使用し
た。

次の配列を調製した： ３’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸＴＴＸ＝Ａ、Ｃ
またはＧ “　　断片を脱保護、酵素による消化および固体の支持
体からの除去は次のようにして実施した。支持体に２０
０μｌのジオキサン／チオフェノール／トリエチルアミ
ン（２：１：１）を加え、そして反応を室温で１時間実
施して、ホスフェートエステ尤のメチル基を完全に除去
した。次いで支持体をメタノールでよく洗浄し、次いで
２００μｌのピリジン／酢酸（４：　１　ｖ／ｖ）中の
０．５モルのヒドラジン・Ｈ２Ｏを加え、そして反応を
室温で２４時間実施し、次いでメタノールで洗浄し、そ
して高真中で乾燥した。この処理は環外アミノ保護基の
すべて、ならびにルブリンキャッピング基を除去する。

５０μ１００，１モルの酢酸ナトリウム、ｐ）１６．４
５の中に懸濁させた１〜２ｎｇの上からの支持体に、３
６μノのグリセロール／　０．１モルのコノ−り酸ナト
リウム（１：　１　ｖ／ｖ）　、　ｐＨ６，５中の３単
位の牌ホスホジェステラーゼ〔シグマ（８１ｇｍａ）Ｐ
”０７７０）を加え、この混合物を３７℃に１８時間維
持した。

この時、混合物を冷却し、そして支持体を０．１モルの
酢酸ナトリウム、ｐ）１６．４５（１００μ））でよく
洗浄した。

この洗浄した支持体に２００μノの製水性水酸化アンモ
ニウムを加え、そしてこの混合物を室温で２時間放置し
た。次いでこの混合物を遠心し、上澄み液を単離し、そ
してスピード−バク（Ｓｐａａｄ−Ｖａｅ　）内で蒸発
乾固させた。

乾燥した残留物を１００μｌの８０％の水性酢酸中に再
懸濁させ、そして反応を室温で１時間進行させた。次い
でＤＮＡを１ｗＬｌのエーテルの添加により沈殿させ、
分散物を遠心し、そして残留物を単離した。１滴の製水
性水酸化アンモニウムを沈殿物に加え、次いで沈殿をス
ピード−バク内で蒸発乾固させた。容器（エツインドル
フ管）を２５μｌの蒸留水で洗浄し、そして沈殿を蒸発
乾固した。

生成物をデル電気泳動によ如分析し、ここで試料を９（
ｌのホルムアミド／１チのフィコール（Ｆｌｃｏｌｌ　
）　／　０．００５　％ブロモフェノールブルー（１０
μＶ〜支持体）中で可溶化し、そして２０チのアクリル
アミドダル上へ装入した。

ダル電気泳動に基づき、ここで調製は本発明に従い実施
されており、鋭い帯がヘプタデカヌクレオチドについて
観測され、ここでわずかに弱く観測可能な中間の帯が存
在し、一方酵素処理前にブロッキング基を除去した調製
物は低分子量の教本の帯の存在を示し、これらは本発明
に従って調製した生成物で得られた帯はど暗色ではなか
った。

脱保護およびＮ製プロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に
ついての別のプロトコールは、次の通りである。

１、完成された合成物の脱トリチル化およびＣＨ２ｃｔ
２を用いる洗浄。

２．２．６−ルチジン／　ＴＨＦ　（１：　１０　ｖ／
ｖ）中における６、５係のＮ、Ｎ−ツメチルアミノピリ
ジン（ｗ／ｖ　）中の２モルの安息香酸無水物による１
０分のベンジル化、引き続くＣＨ３ＣＮによる洗浄。

３、チオフェノール−トリエチルアミン／ジオキサン（
ｉ　：　ｉ　：　２　ｖ／ｖ）を用いる１時間のホスフ
ェートの脱メチル化、およびメタノールによる洗浄。

４、ピリジン／氷酢酸（４：　１　ｖ／ｖ）中の０．５
モルのヒドラジン水和物による壌外窃素および５′−〇
キャッピング基の脱保護、および引続くメタノールおよ
び０．１モルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，０による洗
浄。

（１ｏ７） ５．０１モルのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，０中の１早
位（支持体１ｍｆＩにつき）の牌ホスホジェステラーゼ
による１８時間の消化、引き続く０．１モルのリン酸ナ
トリウム、ｐＨ６，０および水による洗浄。

６、ＮＨ４ＯＨで２時間処理することによる支持体から
の断片の除去。

７、上澄み液のガラスバイアル中への移しおよび６０℃
で４時間の脱ベンゾイル化のための密閉。

８、スピード−バク内の乾燥および水中の再懸濁。

実施例７−ホスホリル化試薬の調製およびオリゴヌクレ
オチドの５′−ホスホリル化 試薬ヒス（β−シアノエトキシ）　−Ｎ　、　Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノホスフィンを次のようにして調製した
。クロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−β−シアノ
エトキシホスフィン（Ｎ、Ｄ、シンハ（８ｉｎｈａ）ら
、ヌクレイツク・アシズ・リサーチメリカン・パイオネ
チクス（Ａｍｅｒｌａａｎ　Ｂｆｏｎｓｔｌａ＠）、米
国カリフォルニア州エメリービレから入手可能〕をアル
ゴンのもとに、１９ｍ７！の塩化メチレン中の３−ヒド
ロキシプロピオニトリル（４，６ミリモル）およびＮ、
Ｎ−ジイソゾロビルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：４．９
ミｌＪモル）の攪拌した溶液に０℃において急速に添加
した。この溶液を室温に加温し、酢酸エチル（５０＋ｊ
）で希釈し、そして８０％の飽和水性ＮａＣｔ（２Ｘ２
０ｍｌ）で洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥
し、そして減圧濃縮した。この油を酢酸エチル中に溶解
し、次いで各々２００μモルの前記試薬を含有する１５
ｍ１の隔膜密閉式バイアルにアリコートを入れた。溶媒
を排気により除去し、そして生成物を〜２０℃でアルゴ
ンのもとに貯蔵した。この粗生成物はそれ以上精製せず
に使用した。

乾燥した物質をアセトニトリル中のテトラゾールで活性
化し、そして固体に支持されたオリゴヌクレオチドに結
合した。引き続いて合成りＮＡを水性■２で標準条件下
に酸化し、そして６０℃においてＮＨ４ＯＨで脱保護し
た。この方法は定量的収率で５′−ホスホリル化ターゲ
ット断片を与える。

実施例８−溶液中のオリジヌクレオチドの溶解酵素的精
製 断片５’−ＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴ
ＡＣＴＣＣＡＡＡＣＣ−３’および５’−ＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＡＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＣ
ＣＡＴＧＧＡＡＡＣ−３’を、実施例６〔ワーナー（Ｗ
ａｒｎｓｒ）ら、ＤＮＡ　３，４０１（１９８４））に
記載するようにしてＣＰＧ支持体上で合成した。次いで
断片を実施例７に記載するようにして５′−ホスホリル
化した。

オリゴマーを室温においてＮＨ４ＯＨで支持体から除去
し１次いで６０℃で一夜脱保護した。溶液をスピード−
バク内で蒸発乾固した。

２１ｎ９の支持体から得られる粗生成物を２０μノのＨ
２Ｏ中に懸濁させ、これに０．３単位の牌ホスホジエス
テターゼを含有する５０μノのリン酸ナトリウム緩衝液
、−７，０を加えた。かきまぜた後、溶液を３７℃に１
時間保持した。

ポリアクリルアミドダルによると、先端が切られた失販
配列（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｆａｉｌｕｒ＠ｓ＊ｑｕｓ
ｎｅ・ｌ）は引き続いて分解されたが、これに対してホ
スホリル化ターゲット断片は加水分解から保護されたこ
とが立証された。

本発明は、問題の配列に密接に類似するが、１または２
以上の単位の欠如において有意に異なる配列を含まない
かあるいは実質的に含まない生成物を提供することにお
いて、多くの利点を有する。

本発明の変法において、オリゴマーまたはポリマーが製
造され、ここで個々のモノマーは単一のモノマーよシは
むしろモノマーの群の構成員で１）、そしてオリゴマー
またはポリマーはこれらのモノマーの特定の配列を有す
ることを必要とする。本発明によれば、オリコ９マーの
順次の形成の間に特定のモノマーの付加の失販から生ず
る、誤まりの配列である配列を含まないかあるいは実質
的に含まないオリゴマーまたはポリマーを製造できる。

本発明を用いることによシ、所望の配列の使用を妨害し
、誤まった結呆を与え、そして所望の配列を使用すると
きの効率を減少させるわとのある密接に類似する配列で
汚染されずに、生成物は合成から純粋な形態で得られ、
そして直接使用することができる。さらに、この方法は
ブロッキング基および保護基を広範な種類の官能性を官
能化するだめの現在存在する広範な技術を使用し、前記
ブロッキング基および保護基はこのような官能性の順次
および／または連続の除去を可能とすると同時に、オリ
ゴマーまたはポリマーを支持体に結合させて維持する。

次いで狽まシの配列を酵素的加水分解によシ破壊して、
所望の配列のみを支持体に結合させて残すことができる
。次いで残るブロッキング基を支持体からの切離しに関
連させて除去することができる。このようにして、ｖ４
まシの配列で汚染されてい立い、プローブとして直接使
用できるポリヌクレオチドを得ることができ、そしてポ
リペプチドの性質の評価、免疫原としてのその使用など
を妨害しうる種々の他のアミノ酸配列を含ま彦いポリペ
プチドを得ることができる。

【図面の簡単な説明】

図面は、オリゴ９ヌクレオチドを製造するこの発明の方
法において使用する装置の略図である。 １０・・・脱ブロッキング訃よび精製のための自動化装
置、１２・・・温度制御された反応塔、１４・・・ヘリ
ウム原、１６・・・バッキング％１８・・・Ｅ薬マニホ
ールド、２０．２２・・・分離弁、２４．２６・・・廃
物ライン、２８・・・廃物弁、３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ
。 ３０Ｄ、３０Ｅ、３０Ｆ、３０Ｇ、３０Ｈおよび３０Ｋ
・・・供給容器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、モノマーからオリゴマーを製造する方法であって、
   該モノマーは縮合について共通の官能基を有するが組成
   に関しては異なる複数の構成員を含み、（１）該オリゴ
   マーを末端がブロックされたモノマーの順次的付加によ
   り製造し、前記モノマーは保護基に結合した１または２
   以上の官能基を有し、その間成長する鎖は支持体に結合
   されており、（２）次いで末端ブロッキング基を除去し
   かつ次のモノマーを付加し、（３）最後のモノマーの付
   加後、末端ブロッキング基および存在する場合保護基を
   除去し、そしてオリゴマーを支持体から除去することを
   含む方法において、 各順次的付加の前に、ブロッキングされていない末端基
   を選択的に除去可能なキャッピング基でキャッピングし
   、 最後のモノマーの付加後、キャッピング基および酵素加
   水分解妨害性保護基を除去し、そして末端ブロッキング
   基の除去前に、末端ブロッキング基を欠くオリゴマーを
   酵素的に加水分解する、ことを特徴とする方法。 ２、前記除去の間、前記支持体に対して結合を保持する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記モノマーがヌクレオチドである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４、前記除去の間、前記支持体に対して結合を保持する
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記ヌクレオチドがホスホルアミダイトである特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ６、前記ヌクレオチドがホスフェートエステルである特
   許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、前記モノマーがアミノ酸である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ８、末端ヒドロキシがブロックされたホスホルアミダイ
   トまたはホスフェートを使用し、末端ブロックドＯ−お
   よびＮ−保護ヌクレオチドの順次的付加によりオリゴヌ
   クレオチドを製造し、ここで生長するオリゴヌクレオチ
   ドは選択的に切離し可能な結合を介して支持体に結合さ
   れており、そして最後のヌクレオチドの付加後、末端ブ
   ロッキング基および保護基を除去し、そしてオリゴマー
   を支持体から切離すことからなるポリヌクレオチドを製
   造する方法において、 末端ブロッキング基を保持している間に選択的に除去可
   能な基を保護基として使用し、 各順次的付加の前に、末端ブロッキング基を保持してい
   る間に、選択的に除去可能なキャッピング基でブロック
   されていない末端基をキャッピングし、 最後のモノマーの付加後、末端ブロッキング基を保持し
   ながら、キャッピング基および酵素加水分解妨害性保護
   基を除去し、そして 末端ブロッキング基の除去前に、末端ブロッキング基を
   欠くオリゴマーの酵素的に加水分解する、ことを特徴と
   する方法。 ９、前記除去の間、前記支持体に対して結合を保持する
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、前記Ｏ−保護基がアルキルまたは置換アルキルで
   あり、そしてＮ−保護基がアミノメチレンである特許請
   求の範囲第８項記載の方法。 １１、前記キャッピング基がレブニリルである特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記末端ブロッキング基がトリチル基である特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記Ｎ−保護基をヒドラジンで除去する特許請求
   の範囲第１１項記載の方法。 １４、前記末端ブロッキング基がトリチル基である特許
   請求の範囲第８項記載の方法。 １５、アデノシンおよびグアノシンがジイソブチルアミ
   ノメチレンであるＮ−保護基を有する特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １６、シトシンが保護ベンゾイルまたは置換ベンゾイル
   基を有する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７、最後のヌクレオチドの付加後であるが、存在する
   場合キャッピング基の除去の前に、前記末端ブロッキン
   グ基を酸安定性、塩基不安定性ブロッキング基で置換す
   る追加の工程を含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 １８、酸安定性、塩基不安定性基がカルボキシレートで
   ある特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、前記酸安定性、塩基不安定性基がホスフェートで
   ある特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０、末端がブロックされたアミノ酸を使用し、末端が
   ブロックされたＯ−、Ｓ−およびＮ−保護されたアミノ
   酸の順次的付加によりポリペプチドを製造し、ここで生
   長するポリペプチドは選択的に切離し可能な結合を介し
   て支持体へ結合されており、各々順次的付加に次いで末
   端ブロッキング基を除去し、そして次のアミノ酸を付加
   し、最後のアミノ酸の付加後、末端ブロッキング基およ
   び存在する場合保護基を除去し、そしてポリペプチドを
   支持体から切離することからなるポリペプチドの製造方
   法において、 各順次的付加前に、末端ブロッキング基および支持体へ
   の結合を保持しながら、ブロッキングされていない末端
   基を選択的に除去可能なキャッピング基でキャッピング
   し、 最後のモノマーの付加後、支持体への結合を保持しなが
   ら、キャッピング基および酵素加水分解妨害性保護基を
   除去し、そして 末端ブロッキング基の除去および支持体からの切離し前
   に、末端ブロッキング基を欠くポリペプチドを酵素的に
   加水分解する、 ことを特徴とする方法。 ２１、前記末端ブロッキング基がＮ−オキシカルボニル
   基である特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、前記キャッピング基が環式イミドを形成できるジ
   アシル基である特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、次の工程： 前もって決定した配列において、（１）カルボン酸エス
   テル結合を介して支持体へ接合しかつ（２）遊離末端ヒ
   ドロキシル基を有する生長するヌクレオチドに、Ｏ−ブ
   ロックされたヌクレオシジルホスホルアミダイトを順次
   に付加してホスファイトトリエステルを形成し、前記ホ
   スファイトトリエステルをホスフェートエステルに酸化
   し、そして遊離ヒドロキシル基を活性化カルボン酸と反
   応させてカルボキシレートエステルを形成することによ
   り、失敗した配列をキャッピングし、 Ｏ−ブロッキング基を除去し、そして末端ヌクレオシジ
   ルホスホルアミダイトの付加まで、上の工程を反復し、 ホスフェートエステル保護基を除去し、 アミン保護基およびキャッピング基を除去し、そして ポリヌクレオチド鎖を支持体から除去することからなる
   ポリヌクレオチドを製造する方法において、 ヌクレオシジルホスホルアミダイトとして、保護された
   アデノシンおよびグアノシン（ここで環の外にあるアミ
   ンはＮ，Ｎ−二置換アミノメチレン置換されてホルムア
   ミジンを形成する）、並びに保護されたシトシン（ここ
   で前記環の外にあるアミンはアロイル基で置換されてア
   ミドを形成する）を使用し、 ヒドラジンと共に５員ないし６員環の環を形成すること
   ができるオキソ置換脂肪族カルボン酸でキャッピングし
   、 アミン保護基およびキャッピング基をヒドラジンで除去
   し、そして 末端Ｏ−ブロッキング基の除去前に、失敗の配列をホス
   ホジエステラーゼで消化する、 ことを特徴とする方法。 ２４、前記Ｎ，Ｎ−二置換アミノメチレンがＮ，Ｎ−ジ
   アルキルである特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、前記アロイル基がベンゾイルである特許請求の範
   囲第２４項記載の方法。 ２６、前記キャッピング基がレブリネートである特許請
   求の範囲第２３項記載の方法。 ２７、前記ヒドラジンをピリジニウム塩を含有するピリ
   ジン溶媒中で使用する特許請求の範囲第２３項記載の方
   法。 ２８、次の工程： ホスフェートエステルの除去前であってかつ末端ヌクレ
   オシジルホスホルアミダイトの付加前に（ここでＯ−ブ
   ロッキング基はトリチル基である）前記トリチル基をお
   だやかな酸性条件下に除去し、そして ブロッキングされないヒドロキシルを第三アミンまたは
   ホスホリル化剤の存在下に無水アロイルと反応させるこ
   とにより再ブロッキングする、ことを含む特許請求の範
   囲第２３項記載の方法。 ２９、前記ホスホリル化剤がＯ，Ｏ′−ジシアノエチル
   ホスホルアミダイトであり、次いでホスフェートへの酸
   化を実施する特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ３０、前記末端ヌクレオシジルホスホルアミダイトがベ
   ンゾエートまたはホスフェートでブロッキングされたヌ
   クレオシジルホスホルアミダイトである特許請求の範囲
   第２３項記載の方法。 ３１、窒素が１〜６個の炭素原子のアルキル基０〜２個
   で置換されているＯ，Ｏ′−ジシアノエチルホスホルア
   ミダイト。