JPH0259158B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、米国保建教育福祉省の認可、すなわ
ち補償のもとに行われた業務の最中に生じたもの
である。 本発明は、変性無機重合体並びにその変性無機
重合体の製造法に関し、更に前記無機変性重合体
を支持構造として用いるポリヌクレオチドの製造
法に関するものである。 ［従来技術およびその問題点］ 順序の一定したオリゴヌクレオチドを合成する
有効な方法論を求めて多くの試みがなされて来
た。しかし、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌク
レオチドの段階的な合成法は、依然として、多く
は収率の低い困難で時間のかかるものに止つてい
る。公知技術の一つでは、ポリヌクレオチドの合
成に際して有機重合体を支持体として用いてい
る。支持重合体による合成法の主な問題点は、元
来支持重合体の性質に固有のものであつて、その
ような合成に用いられた種々の公知技術に属する
重合体は： (1) 支持体中に活性化したヌクレオチドが拡散す
る速度が遅いこと、 (2) 細孔径の大きい多孔質で低架橋度の、種々の
支持体重合体における膨潤が過剰であること、 および (3) 重合体中に反応物質が不可逆的に吸収される
こと などの理由により、不充分なものであつた。 参考文献：V.Amarnath及びA.D.Broom，
Chemical Reviews、77巻、183―217頁（1977
年）。 変性無機重合体は公知技術において、例えば、
液体クロマトグラフイーの吸着剤としての用途で
元来知られているものである。トリチル結合基を
用いてシリカゲルにヌクレオシド燐酸塩を結合さ
せることが公知資料（H.Koster，Tetrahedron
Letters，1527―1530頁、1972年）に記載されて
いるが、この方法は明らかにピリミジンヌクレオ
シドにのみ使用可能なものである。シリカ支持体
からのヌクレオシドの離脱分離はプリンヌクレオ
シドを侵すような酸を用いなければ不可能であ
る。 オリゴチミジレートのホスホトエステル誘導体
の製造について、公知文献（R.L.Letsingerおよ
びW.B.Lunsford，Journal of the American
Chemical Society，98：12、3655―3661頁）に
記載されているが、これは5′―Ｏ―保護チミジン
を用いたホスホロジクリダイトの反応に引続いて
生成物を3′―Ｏ―保護チミジンと反応させ、次い
で得られたホスフアイトをホスフエートに酸化
し、さらに保護基（以下「封鎖基」というを除去
してホスホトリエステルを得るものである。この
方法を用いて、テトラマーとペンタマー、すなわ
ち、dTpTpTpT及びdTpTpTpTpT（Ｔはチミジ
ン）が得られている。残念ながらこの方法では、
各段階毎に生成物の分離精製がヌクレオシドの正
しい付加順序を保証するために必要とされる。沈
殿操作および沈殿物の洗滌を含む分離技術が各反
応段階を実施するために必要である。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は新規で有用な無機重合体を提供するも
ので、またそのような無機重合体の製造法をも提
供する。一般的に本発明の変性無機重合物支持体
は、ヌクレオシドが化学的に結合した無機重合体
からなり、ヌクレオシドの重合体に対する化学結
合はヌクレオシドの反応基と反応する重合体上の
反応基によるものである。かかる反応基の代表的
な組合せは、ヌクレオシドと支持体をアミド結合
で結ぶアミノ基とカルボキシル基、或は各々をエ
ステル結合で結ぶヒドロキシル基とカルボキシル
基である。 所望の化学結合を行わせるには、各反応成分が
勿論必要な反応基を含んでいなければならない。
従つて支持重合体はヌクレオシドのヒドロキシル
及び／又はアミノ基と反応するカルボキシル末端
基を有するものとするが、或は二塩基性カルボン
酸によつてヌクレオシドのヒドロキシル及び／又
はアミノ基をアシル化してヌクレオシドにカルボ
キシル基による官能性を与え、支持重合体のヒド
ロキシル基又はアミノ基と反応させる事が可能で
ある。無機支持体上にヒドロキシル基又はアミノ
基が存在しない場合には、公知の方法によつてこ
れ等の基を導入して反応性を与える事ができる。
例えばシリカ支持体の場合アミノアルキルシリル
ハライドと反応させて、アミノ官能基を導入する
事ができる。 勿論本発明の変性無機重合体のヌクレオシド部
分は２個以上のヌクレオシドを含み得るもので、
幾つかのヌクレオシドをオリゴヌクレオチドの形
に縮合させてそのオリゴヌクレオチドが例えばエ
ステル結合の様な単一の化学結合によつて無機重
合物支持体に結合している形態を採る事もでき
る。 この様にして変性した無機重合物支持体は以下
に記載する一連の工程により、支持体上のヌクレ
オシド部分にヌクレオシド又はオリゴヌクレオチ
ドを段階的に付加するのに用いられる。次いでこ
の様にして形成されたポリヌクレオチドを、支持
体とポリヌクレオチド間の化学結合のアルカリ加
水分解を含む一連の工程により、支持重合体から
分離し回収する。 本発明はデオキシヌクレオチド、ヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチド及びポリデオキシヌクレオ
チド並びにポリペプチドを含有するデオキシリボ
核酸（DNA）及びリボ核酸（RNA）の化学合成
に特に有用であり、天然のDNA及びRNA、更に
新規なDNA及びRNAの合成が可能である。 本発明には広汎な種類の無機重合体が使用で
き、例えばシリカ、多孔質ガラス、アルミノシリ
ケート類、ボロシリケート類、アルミナや酸化ニ
ツケルのような金属酸化物、及び種々の粘土鉱物
がこれらに含まれる。重合体は使用する反応溶媒
に実質的に不溶性で、支持体に最終生成物のポリ
ヌクレオシドを結合させる下記の出発ヌクレオシ
ドに対する化学結合を形成するための化学反応性
を当然除外すれば、工程中に用いる薬品に対して
比較的に化学的不活性なものでなければならな
い。 本発明の方法は、ヌクレオチド又はヌクレオシ
ドで変性した無機重合物支持体を、一連の順序に
従つた工程で処理して、各工程で変性支持体上に
ヌクレオチドが付加結合されて、最終的に所望の
順序のヌクレオチドが得られる様にして行われ
る。 一連の工程とは以下の通りである。 (a) 支持重合体と結合したヌクレオシド、即ちヌ
クレオシド変性支持体、に対する所望のヌクレ
オシドのホスフアイト結合によるカツプリン
グ、 (b) 必要に応じ、但し好ましくは支持重合体に結
合したヌクレオチドの未反応ヒドロキシル基の
保護（以下「封鎖」という） (c) 段階(a)で形成したホスフアイト結合の酸化に
よるホスフエート結合の生成、および (d) 段階(a)に記載した所定のヌクレオシドの封鎖
基除去により、これ等の工程からなる次のサイ
クルのための反応基の再生。 段階ａ、ｂ、ｃ及びｄを最終のオリゴヌクレオ
チドが得られるまで反復することによつて、各ヌ
クレオシドが支持重合体上に順次に付加され、そ
の後加水分解反応によつてオリゴヌクレオチドを
支持体から取外すと同時にオリゴヌクレオチド分
子から封鎖基も除去する。封鎖基の除去と支持体
からのオリゴヌクレオチドの加水分解脱離を２段
階に分けて行うこともでき、又その方が好ましい
が、これを一回の加水分解反応で行うこともでき
る。 ヌクレオシド変性支持体は、出発ヌクレオシド
の3′―又は5′―OHにより、適宜のカツプリング
剤を用いて無機重合体にヌクレオシドを共有結合
でカツプリングして生成する。これは出発ヌクレ
オシドの3′―又は5′―OHを封鎖して行い、封鎖
してない方のヒドロキシル基によつてヌクレオシ
ドと支持重合体をカツプリング剤で結合する。縮
合が終了してから残余の反応基、例えばカルボキ
シル基等未反応のものは適宜な手段、例えば、カ
ルボキシル基を単純なアミンと反応させてカルボ
キシアミドとすることによつて封鎖することがで
きる。封鎖した3′―又は5′―ヒドロキシル基は後
で封鎖基を除去して遊離のヒドロキシル基とし、
この遊離ヒドロキシル基を用いて、上記の段階(a)
におけるようにホスフアイト結合基を含む所望の
ヌクレオシドと縮合させ得る。 カツプリング剤又は支持重合体上のカツプリン
グ基の一種を、支持重合体と出発ヌクレオシド又
はオリゴヌクレオチドと共有結合させるために用
いる事ができる。代表的な基としては中でもアミ
ノ基、特に一級アミノ基、ヒドロキシル基、チオ
ール基、スルホン酸基、亜燐酸基及び燐酸基、特
にその酸ハロゲン化物、就中塩化物及び臭化物、
およびカルボキシル基がある。これ等の反応基
は、通常二価のアルキレン又はフエニレン基でそ
の原子価位置の一方が鎖状結合で占められ他方が
反応基に着いているものが好適である。そのよう
な基は約10以下の炭素原子、好ましくは約６まで
の炭素原子を含むものが良く、アルキレン基は通
常主鎖中に２―４の炭素原子を含むものが好まし
い。 支持重合体にヌクレオシドを結合する反応基の
性質は、必ずというわけではないが、合成工程の
最後に、容易に加水分解して支持重合体からオリ
ゴヌクレオチドを離脱せしめるものが好ましい。 必要ならば、上記のカツプリング剤は、支持重
合体上の反応基、例えばヒドロキシル基又はアミ
ノ基と反応するようにヌクレオシド上に存在させ
ることもできるが、通常はカツプリング基は支持
重合体上にあることが好ましい。 本発明の方法及びこれに用いる新規で且つ有用
なヌクレオシド変性無機重合体は、特にオリゴヌ
クレオチドの迅速な合成工程並びに高収率、高純
度を特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する点
において優れている。各々のモノヌクレオチド付
加には、最大２〜３時間を要するが、収率は95％
又はそれ以上が得られる。更に、オリゴヌクレオ
チドの分子量が増大してもこれ等の収率は変るこ
とはない。 本発明は種々の無機重合体を用いて行う事がで
きるが、以下ではシリカゲルを支持重合体として
用いてより詳細にその説明を行う。特に好ましい
シリカゲルは高性能液体クロマトグラフイー
（hplc）に用いる開口の大きい多孔質シリカであ
る。更に本発明の説明はデオキシヌクレオチドを
用いて行うが、リボヌクレオチドを代りに用いて
も同様の結果を得ることができる。 以下の説明に用いる用語、ヌクレオシド、ヌク
レオチドおよびオリゴヌクレオチドは、2′位置の
ヒドロキシル基が無いという点のみが相違するデ
オキシ類を含むものとして用いる。従つてこれ等
の用語は2′位置の置換基がＨ又はOH（以下の説明
では、式、、において置換基Ａとして示
す）である構造のものを含む。 (A) 〔ヌクレオシド変性支持体の製造〕 シリカゲル支持体は、好ましくは水酸化アン
モニウムのような弱塩基で容易に加水分解し得
る結合によつてシリカゲル支持体に結合してい
ることが望ましい。このような結合は、支持体
にカルボキシル反応基を先づ結合させるか、或
はエステル化によつてヌクレオシドにエステル
結合を前以つて形成し、次いでエステル化酸部
分によつて支持体にエステル化ヌクレオシドを
縮合させる事により達成する。 これらの実施方法の１つは以下の工程により行
う。 (1) シリカゲルを、これに共有結合で結合したア
ミノアルキル基又はヒドロキシアルキル基を含
むマトリツクスに変える； (2) アミノアルキルシリカ又はヒドロキシアルキ
ルシリカをジカルボン酸と反応させて、アミド
結合又はエステル結合並びにカルボキシル基に
よる反応性を形成する； (3) 未反応のシラノールOH基を封鎖する； (4) シリカの遊離カルボキシル基と所定のヌクレ
オシドの遊離ヒドロキシル基（3′―又は5′―）
を結合させる；および (5) 未反応のカルボキシル基を、非反応性誘導体
例えばアミドの形態にして封鎖する。 他の実施方法は次のような手順で行う。 (1) シリカゲルをアミノアルキル基又はヒドロキ
シアルキル基を含むマトリツクスに変える； (2) 未反応のシラールOH基を封鎖する； (3) 得られた変性シリカゲルに、ジカルボン酸の
半エステルを含むように変性した所定のヌクレ
オシドの遊離カルボキシル基をアミド結合又は
エステル結合により結合させる；および (4) 支持体シリカゲル上の未反応アミノ基又はヒ
ドロキシル基を、例えば無水酢酸で封鎖する。 同一の反応物質から出発すれば両方法は共に同
じ生成物を生するが、第二の方法の方がシリカゲ
ル上に付着するヌクレオシドの量の制御がより容
易であるので好ましい。更に、第二の方法では、
シリカゲルに付着するヌクレオシドの量が多くな
る（第一の方法が10〜40μmol／ｇであるのに対
し約100〜120μmol／ｇである） ヌクレオシドのシリカゲルに対する結合は、
5′―OHよりも3′―OHで行い、次のヌクレオシド
とホスフアイトにより5′―OHで結合できるよう
にすることが好ましい。そうすれば、付加するヌ
クレオシドの結合は3′―で起り、5′―OHは更に
付加するべきヌクレオシドとの結合に用いられ
る。 従つて夫々3′―OH及び5′―OHで所望の結合を
生成するためには、上記のカツプリング反応によ
り出発ヌクレオシドを3′―OHでシリカゲルに結
合させる。これは5′―OHを、例えば、ジメトキ
シトリチル基のようなトリチル基を用いて封鎖す
る事で達成できる。トリチル基は3′―OHカツプ
リング反応が起つた後で容易に除去できるので好
ましい。 出発ヌクレオシドがアミノ基を含む場合、例え
ばグアノシン、アデノシン、シチジン、デオキシ
グアノシン、デオキシアデノシン及びデオキシシ
チジンの場合は、アミノ基を例えば酢酸、安息香
酸、イソ酪酸又は同類の酸を用いて公知のアシル
化法により封鎖することが好ましく、そのような
封鎖基は都合の良い時に、通常最終オリゴヌクレ
オチドが得られた後で、除去する事ができる。 アミノアルキル基をシリカゲル上に導入するに
は、アミノアルキル―トリアルコキシシラン反応
による。この反応は例えばトルエンのような溶剤
中で還流しながら数時間行うのが普通である。適
当な反応剤としては、アミノプロピルトリエトキ
シシラン、４―アミノブチルトリメトキシシラ
ン、４―アミノブチルトリエトキシシラン、２―
アミノエチルトリエトキシシラン等がある。 シリカゲルとデオキシヌクレオシド間のエステ
ル結合の形成に用いるジカルボン酸は、コハク
酸、グルタル酸、アジピン酸、フタル酸、マレイ
ン酸、その他好ましくは炭素原子数10迄の脂肪族
並びに芳香族ジカルボン酸の如何なるものでも良
い。ジカルボン酸によるステル化はモノエステル
化が確実に起こるように酸無水物を用いることが
最適である。 生成物、即ちヌクレオシド変性シリカゲルは以
下の式によつて示すことができる： 式中Ｂはプリンまたはピリミジン構造を有する
ヌクレオシド又はデオキシヌクレオシド塩基で、
Ｐは支持体シリカと共有結合基を表わし、次の
式： （シリカゲル）―（CH₂）_oNHCOZCO― で表わされるもので、式中ｎは１―５の整数で、
Ｚは炭素原子数10迄のアルキル、アルケニル、シ
クロアルキル、アリル及びアラルキル等を含む２
価のヒドロカルビル基である。ＡはＨ又はOR
で、ＲはＨまたは例えばトリチル、メトキシトリ
チル、ジメトキシトリチル、ジアルキルホスフア
イト、ピバリルイソブチロキシカーボニル、ｔ―
ブチルジメチルシリル、その他の封鎖基である。 〔ホスフアイト結合オリゴヌクレオシドの形成〕 デオキシヌクレオシド変性シリカゲルと所定の
ヌクレオシドを結合する場合、シリカゲル上のデ
オキシヌクレオシドの5′―OHと所定のヌクレオ
シドの3′―OHの間のトリエステルホスフアイト
結合によつて縮合させる。ホスフアイト結合は先
ずシリカゲル上のヌクレオシドの5′―OHにホス
フアイト基を導入し、次いで付加するヌクレオシ
ドと3′―OHにより縮合させることにより行う。 更に、より好ましくは、付加するヌクレオシド
の3′―OHにフオスフアイト基を導入し（5′―OH
は予めトリチル化して封鎖しておく）、得られた
ヌクレオシドホスフアイトをシリカゲル上のヌク
レオシドの5′―OHと反応させる。 デオキシヌクレオシド変性シリカゲルは、シリ
カゲル上のデオキシヌクレオシドの3′―OHと所
定のヌクレオシドの5′―OHとの間にトリエステ
ルホスフアイト結合を形成する事によつても所定
のヌクレオシドと縮合させる事ができる。ホスフ
アイト結合はシリカゲル上のヌクレオシドの3′―
OHに、先ずホスフアイト基を導入し、次いで付
加するヌクレオシドの5′―OHと縮合させる事で
出来る、或いは、より好ましくは、ホスフアイト
基を付加するヌクレオシドの5′―OH（3′―OHは
予めトリチル化して封鎖しておく）に導入し、次
いで得られたヌクレオシドホスフアイトをシリカ
ゲル上のヌクレオシドの3′―OHと反応させる。 反応は以下の様に一般化して示すことができ
る。 好ましい反応は以下の通りである。

【式】 【式】

式中Ａ、Ｂ及びは前記の定義の通りであり、
Ｒは前記定義による封鎖基、R₁は炭素数10以下
の低級アルキル基またはヘテロ原子置換低級アル
キル基、例えば、シアノエチル基などで、Ｘはハ
ロゲン、好ましくはC₁又はBr、或はアミノ窒素
により結合した二級アミノ基である。置換基Ｘで
示される二級アミノ基は、好ましくは、環状構造
内に不飽和結合を含む窒素複素環化合物の核窒素
から水素を除去して形成したものが良い。窒素含
有複素環類は、テトラゾール、ニトロイミダゾー
ルなどの置換イミダゾール、インドール、ピラゾ
ール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、イソ
インドール、ピロール、トリアゾール、ジオキサ
ゾールなど及び類似の複素環類、更にそれらの類
似物質を含む。 Ｘがそのような二級基である場合には、生成物
は、反応性に富み、常温では不安定である。本製
法によれば、これらの化合物は適宜新たに得るも
のとする。あるいは、封止容器内に、常に０℃以
下、通常−20℃程度の低温に保ち、単離した状態
で保存する。 封鎖基Ｒを除去すると、さらに反応式のヌク
レオシドの反応が起こる。繰返し反応を行うと、
共有結合基、例えば、エステル基によりシリカゲ
ルに付着した一連のヌクレオチド類からなるポリ
ヌクレオチドが得られる。 ホスフアイト結合基は（本明細書に既に定義さ
れた様に）ハイドロカルビルホスホロジクロリダ
イト、例えば、メチルホスホロジクロリダイトと
の反応により、好ましくは、有機アミン等の塩基
の存在下に付加されたヌクレオシドの5′―OH位
又は3′―OH位置において、シリカゲルのヌクレ
オシド部分に導入される。反応式の生成物は、
窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガスの雰囲
気中で、約１週間、及び−20℃の低温で溶媒中に
保存することができる。 反応式と反応式の化合物の反応は、有機ア
ミン等の塩基、好ましくは、ピリジン、ルチジン
及び類似するアミン類等の第３級有機アミンの存
在下で行なわれる。 〔封鎖反応〕 所定のヌクレオシドが、シリカゲル支持体に付
着したヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドにホ
スフアイト結合により縮合された後は、シリカゲ
ルに付着したそのヌクレオシド又はオリゴヌクレ
オシド（少量ではあるが、約１〜５％）は追加さ
れたヌクレオシドと反応しない。好ましくは、こ
の未反応部分は、異質の配列のデオキシオリゴヌ
クレオチドの生成を防止するために、密封又は封
鎖されると良い。この密封又は封鎖工程は、非常
に反応性に富む亜燐酸と反応させ、5′―ホスフア
イトエステル基、すなわち比較的非疎水性のトリ
エステルを形成する。例えばジエトキシトリアゾ
リルホフフインはジエチルホスフアイト―5′―デ
オキシヌクレオシドトリエステルを得るのに使用
することができる。相当するジ低級アルコキシ窒
素含有複素環ホスフインは、テトラゾイル、イミ
ダゾイル及び４―ニトロイミダゾイルホスフイン
等のトリアゾイルホスフインの代りに使われ、相
当するジ低級アルキルトリエステルを生成する。
このような窒素複素環ホスフインは相当する塩化
ホスフイニルから作る。当然ながら、塩化ホスフ
イニルはヌクレオシドをホスフイニル化するのに
使われるが、窒素複素環ホスフインの方が収率が
高くなるので好ましい。 無水酢酸のような酸無水物及びフエニルイソシ
アネートのようなアリールイソシアネートは従来
の封鎖基又は密封基として使用することができ
る。しかし、これらは未封鎖5′―ヒドロキシル基
に対する反応性が低い。無水酢酸等の酸無水物と
の酢酸化が、第３級アミン、特にジ低級アルキル
アミノピリジン、例えばジメチルアミノピリジン
の雰囲気中で行なわれると、急速にアシル化が進
み、この反応は特に5′―ヒドロキシル基の封鎖に
適している。ジアルキルホスフエート密封基も使
うことができる。生成されたトリエステルは、比
較的非疎水性を有し、好ましい精製法としては、
非疎水性副産物を、疎水性5′―Ｏ―ジメトキシト
リチル基を含有する生成物から確実に分離する逆
相高性能液体クロマトグラフイーを使用すること
である。 ヌクレオシドを加える前に、シリカゲルの未反
応シラノールヒドロキシ基を封鎖するには、好ま
しくは、炭素原子数10以下のヒドロカルビルモノ
カルボン酸類、例えば酢酸、安息香酸、イソ酪酸
及びナフトエ酸によるアシル化によつて封鎖する
ことができるが、好ましくは、塩化トリアルコキ
シシリルを使う方がよい。 〔亜燐酸から燐酸への酸化〕 酸化は通常ヨウ素を酸化剤として用い、標準の
方法により行う。あるいは、酸化は過酸化tert―
ブチル、過酸化ベンゾイル等の過酸化物およびヒ
ドロパーオキシド類等との反応により行うことも
できる。過酸化水素の使用は、不要な副産物を生
成するので好ましくない。 最良の収率を得るために、ヌクレオシドの縮合
を更に行う前に酸化を行う。すべての縮合反応が
完了するまで酸化工程を延期すると、不要な副産
物の生成により収率が低下する。 封鎖基の除去は、室温であつても、または高温
であつても、水酸化アンモニウム等の弱い塩基を
用い公知の方法により行う。 段階的に封鎖基を取除く場合、まずジオキサン
又はテトラヒドロフラン等の溶媒中で、トリエチ
ルアンモニウムチオフエノキシドを用い、メチル
等のアルキル基をホスフオトリエステルから除去
する。その後、この生成物を室温（20℃）にて、
水酸化アンモニウムで処理し、オリゴヌクレオチ
ドと支持体を結合するエステル基を加水分解す
る。さらに、アセチル基、ベンゾイル基およびイ
ソブチリル基等のＮ―アシル封鎖基は約12時間、
50℃に加熱し除去する。 トリチル封鎖基の除去は、AlCl₃、BF₃、TiCl₄
等のルイス酸によつても効果的に行ない得るが、
特に臭化亜鉛を使うと便利である。この反応に
は、テトラヒドロフランや、ニトロメタンとメタ
ノールなどの低級アルコールの混合液が溶媒とし
て使われるが、通常は溶媒としてニトロメタンを
使う。さもなければ、トルエン―スルホン酸等の
プロトン酸を封鎖基の除去に使用する。プリンヌ
クレオシド含有生成物の場合には、しかしなが
ら、プロトン酸類を使用すると脱プリン化が生ず
る。従つて封鎖基をプリン含有生成物から除去す
る場合には、ルイス酸類を使用することが好まし
い。 上記の方法により、10〜30ヌクレオシド単位迄
のヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを製造
できる。オリゴヌクレオチドは、T₄―リガーゼ
及びＴ―４キナーゼにより周知の酵素学上DNA
配列を形成することができる。 加水分解後得られた生成物は、無機支持重合体
と分離した後、標準の方法により精製する。最終
精製は、好ましくは、上記のように5′―Ｏ―ジメ
トキシトリチルオリゴヌクレオチドの逆相hplcに
より行ない、次に、酢酸等の低級脂肪酸を使用し
ジメトキシトリチル基を除去する。 添付の図面は本発明の装置の概略的工程を示す
ものである。 より詳細に、かつ図面を参照し、装置を以下に
説明する。カラム１０には固体シリカゲルマトリ
クス１２を充填し、本明細書に記載のように誘導
体化する。 弁１４は、弁制御装置１５により適宜にプログ
ラムされ、容器１６，１８，２０及び２２の４種
の活性反応物質、並びに容器２４及び２６の洗滌
溶媒を選択する。順序に従い他の容器に関係な
く、個別の容器を弁１４により選択することがで
きる。従つて、例えば、容器１６から反応物質を
選択し、その直後に容器２４から洗滌溶媒を選択
する。これらの反応物質は、本発明の方法によれ
ば、生成物鎖を長くするために必要であり室温に
保持されている。 弁２８は、容器３０，３２，３４，３６及び３
８中の５種のヌクレオシド―活性ホスフアイトト
リエステル、及び容器４０の洗滌溶媒とを適宜選
択するように制御装置１５′によつてプログラム
されている。再記するが、弁２８は、上記のよう
に（混合による汚染を防止するように）独立した
選択が可能である。 さらに、容器３０〜３８は付加物を−78℃に保
持し、この温度において弁２８は中の物質の通過
が可能であるように設計されている。 弁４２は、容器４４と４６の溶離剤と容器４８
の洗滌溶媒とを選択するようにプログラムされた
制御装置１５″によつて制御されている。これら
の反応物質と溶媒は、カラム１０の支持体マトリ
ツクス１２からオリゴヌクレオチドを溶離するの
に必要であり、室温に保持される。 弁５０は、ポンプ５６と協働して、溶媒、反応
物質、又は付加物を弁１４，２８、及び４２から
弁５２へ選択的に通す。そして、この弁５２は、
弁制御装置（図示せず）の適切な制御によつて、
カラム１０と紫外線検出器５８を介する流路、あ
るいはカラム１０を介するリサイクル処理を選択
する。紫外線検出器５８は適切な帰還制御手段
（図示せず）によつて、システムを制御するのに
使用される。 システムのプログラム動作を概略的に以下の表
１に示す。このプログラムは、１つのヌクレオシ
ドを付加し、支持体１２からヌクレオシド鎖を脱
離する方法を示す。システムは１つ以上のヌクレ
オシドを付加するように拡大及び／又は変更する
ことができ、またシステム全体は、適切にプログ
ラムされたマイクロプロセツサコンピユータによ
り動作されることが望ましい。 本装置は、自動化された操作に特に適用される
が、その詳細は当業者に自明である。

【表】

〔支持体からオリゴデオキシヌクレオチドの除去および生成化合物の特徴〕

オリゴデオキシヌクレオチド〔ｄ（Ｔ）₇、ｄ
（Ｔ）₉、ｄ（Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｔ―
Ｔ〕を保護基から遊離させ、単離し、特徴を調べ
る。トリエチルアンモニウムチオフエノキシドの
ジオキサン溶液を使用してホスホトリエステルか
らのメチル基を除去する。この工程の後、濃
NH₄OHで処理し、シトシンからＮ―ベンゾイル
基を除去し、かつ支持体からオリゴヌクレオチド
を遊離させた。高速液体クロマトグラフイーによ
れば、各合成の主生成物は上記の七量体および各
九量体であることが解つた。最初に支持体に結合
してチミジンの量から、ｄ（Ｔ）₉の単離収率は約
25％であつた。ｄ（Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ
―Ｔ―Ｔ）の同様の収率は約23％であつた。 九量体および七量体を生化学的に試験を行つ
た。これらのすべての化合物は、スネーク・ベノ
ム（Snake Venom）ホスホジエステラーゼによ
り完全に分解することが解つた。各九量体の合成
により単離したオリゴヌクレオチドは、〔5′―
³²P〕ATPおよびT4―キナーゼを用いてホスホ
リル化し、次にゲル電気泳動を行ない、後にスネ
ーク・ベノム・ホスホジエステラーゼにより部分
的に分解することによつて分析した。この分析に
より、オリゴヌクレオチドは均一であり、９個の
ヌクレオチド単位を含有していることを確認し
た。〔5′―³²P〕ｄ（pT―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ
―Ｔ―Ｔ）の連続を確認するために、サンプルを
二次元ホモクロマトグラフイーで分析した。連続
プロフイルは期待した結果の〔5′―³²P〕ｄ（pT
―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｔ―Ｔ）に一致し
た。最後に、〔5′―³²P〕ｄ（pT）₉をT4―リガーゼ
およびポリデオキシアデノシンの存在下に重合さ
せた結果、〔5′―³²P〕ｄ（pT）₉は、ポリデオキシ
アデノシンにより倍量体を生成し、この倍量体
は、T4―リガーゼにより確認された。従つて、
ｄ（Ｔ）₉およびｄ（Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ｔ―
Ｔ―Ｔ）は試験した範囲に関する限り、生化学的
に活性であつた。 実施例中において、シトシン、アデニンおよび
グアニンなどのアミノ基を保護する。これらの基
を保護することは本工程において必要なことでは
ないが、ヌクレオシドの適宜の溶媒に対する溶解
度を高める。ベンゾイル、トリチル（前記の如
き）またはイソブチリル基は適当な保護基を形成
する。しかしこの工程を変化させずに他の基を使
用することもできる。良好な収率で生成し得る保
護されたヌクレオシドは5′―Ｏ―ジメトキシトリ
チル・デオキシチミジン〔DMTrd（Ｔ）〕、5′―Ｏ
―ジメトキシトリチル―Ｎ―ベンゾイルデオキシ
シチジン〔DMTrd（bzC）〕、5′―Ｏ―ジメトキシ
トリチル―Ｎ―ベンゾイルデオキシアデノシン
〔DMTrd（bzA）〕、および5′―Ｏ―ジメトキシト
リチル―Ｎ―イソブチリルデオキシグアノシン
〔DMTrd（ibG）〕。デオキシアデノシンによる典
型的な合成工程は次の通りである。 実施例 ５ この実施例では、プリンデオキシヌクレオチド
の使用について説明する。 DMTrd（bzA）（0.66ｇ、１ｍmol）を乾燥
THF（３ml）に加えたものをメチルジクロロホス
フアイト（0.113ml、1.2ｍmol）および２，４，
６―トリメチルピリジン（0.633ml、4.8ｍmol）
を含むTHF（３ml）溶液中に撹拌しつつ−78℃で
アルゴン雰囲気中において滴下する。−78℃で10
分間経過した後、反応液を焼結ガラス斗で過
し、真空中で濃縮して溶剤を除去する。生成した
粘物質をトルエン：THF（２ml、２：１）の混合
液に溶解することによつて、過剰のメチルホスホ
ジクロリダイトを除去し、真空中で再蒸発して粘
物質を得る。ジクロリダイトの除去を確実にする
ために、この工程を数回繰返す。ヌクレオシドク
ロリダイトはテトラゾライドに変える。最終の再
蒸発により得た粘物質をTHF（２ml）に溶解す
る。テトラゾール（0.063ｇ、0.9ｍmol）のTHF
（２ml）溶液を次にヌクレオシドホスホモノクロ
リダイトに、撹拌しつつ−78℃で滴下する。−78
℃で10分間処理した後、溶液を遠心分離管へ移
し、低速で回転させて、上澄液を除去する。この
溶液は活性化ヌクレオシドメチルホスホモノテト
ラゾライドを含有する。もし直ぐに使用しない場
合には、このテトラゾライドは、乾燥ペンタン中
に滴下して沈澱させ、沈澱を集めて真空中で乾燥
し、アルゴンまたは他の不活性ガスと共に封管中
に入れ、−20℃で貯蔵することにより長期貯蔵が
可能になる。全ての操作は酸化を防止する為に、
不活性雰囲気中において行なう。活性剤は空気に
触れさせない。 上記の処理は活性化チミジン、デオキシシチジ
ンおよびデオキシアデノシンヌクレオチドの調製
に有用である。活性化デオキシグアノシンヌクレ
オチドの調製は、化学量以外については同様であ
る。DMTrd（ibG）；メチルジクロロホスフアイ
ト；２，４，６―トリメチルピリジンおよびテト
ラゾールのモル比は１：0.9：3.8：0.7である。変
性シリカゲル支持体の１つのヌクレオチドを付け
るために必要な工程は次の通りである。ヌクレオ
チドからジメトキシトリチル基を除去すること
は、変性シリカゲル支持体を0.1MZnBr₂のニト
ロメタン溶液に15から30分接触させることにより
行なう。次に支持体をブタノール：２，６―ルチ
ジン：THF（４：１：５容量）の混合液で最初洗
滌し、後にTHFで洗滌する。この工程はヌクレ
オシドの亜鉛エステルを除去するために使用する
ので、溶剤比は重要ではない。この工程は省略で
きるが収率が低下する。BF₃、AlCl₃およびTiCl₄
などの他のルイス酸がZnBr₂の代りに使用でき
る。しかしZnBr₂が好ましい。またプロトン酸も
使用できる。プロトン酸の量をジメトキシトリチ
ル基を除去するための最少限にしても、各プリン
の約３〜５％の脱プリンが起こる。この工程の次
の処理は保護され活性化したヌクレオチドを支持
体に共有結合したヌクレオシドまたはオリゴヌク
レオチドにすることである。これは10〜15当量の
活性モノテトラゾライドを用い、約１時間反応さ
せることにより行う。溶剤は無水THFである。
この工程は活性化モノクロリダイト、トリアゾラ
イドおよびニトロイミダゾライドの付加にも使用
できる。しかし、テトラゾライドが最も良い結果
をもたらす。次の工程は未反応5′―ヒドロキシル
基のブロツキングである。これは無水酢酸、ジメ
チルアミノピリジン、ピリジンおよびTHFの溶
液を使用することにより達成できる。また、２，
６―ルチジン／THF（１：５容量）中の0.33Mジ
メチルモノトリアゾールホスフアイト溶液を用い
ることにより達成できる。反応時間は５分であ
り、後にTHFで洗滌する。他の方法としてはフ
エニルイソシアネート／ルチジン（45：55容量）
の溶液を用いて90分反応させることにより行な
う。この溶液は次にTHFとアセトニトリルとで
洗滌することにより変性シリカから除去する。最
初の方法が好適である。この工程は省略すること
ができ、また5′―ヒドロキシル基に反応し化学的
に同等な他の物質で置き換えることもできる。し
かしこの工程を実施することによつて、所望のオ
リゴヌクレオチドの最終精製が容易になる。この
ことは、支持体に対する全合成物質の結合がかな
り少なくなるからである。各サイクルの最終工程
はホスフアイトをホスフエートに酸化することで
ある。種々の比率のものが使用できるが0.1MI₂
の水／2.6ルチジン／THF（１：１：３）溶液が
好適である。更にＮ―クロロスクシンイミド又は
アリールあるいはアルキルパーオキシドなどの他
の酸化剤を使用できる。ｔ―ブチルパーオキシド
は酸化剤として好ましい。所定の工程により適宜
の活性化ヌクレオチドを付加した後、上記のｄ
（Ｔ）₉の合成に記載した如くにして支持体からデ
オキシオリゴヌクレオチドを除去する。 本明細書における式の化合物は、窒素複素環
式化合物の第二級アミノ窒素のＨ原子を除去して
生成した第二級アミノ基Ｘを有する新規な化合物
であり、必要なリン化合物を生成するために一部
有用である。これらの化合物は、反応性があり、
従つてＸがハロゲンである同様の化合物よりも有
効である。これらの化合物はＸがハロゲンである
化合物から容易に調製することができる（例えば
実施例５に記載したように）。または所定のヌク
レオシドとハロ（2゜アミノ）―アルコキシホスフ
インとの反応で得ることができる。 以下の実施例に複素環式アミノホスフイン化合
物の用途を例示する。特に実施例５においてはテ
トラゾライドの調製および必要なリン酸結合の生
成における使用について説明する。 本発明の方法を採用することにより、各種のヌ
クレオシドと共にテトラゾール、ニトロイミダゾ
ールおよびトリアゾールを用いて、種々の化合物
が得られ、対応するヌクレオシドホスホノモノア
ミンを得る。特にこれらの化合物はヌクレオシド
ベースのチアミン、シトシン、アデノシンおよび
グアニンを含み、必要があればブロツキング基例
えばシトシンとアデニンのアミノ基に対するベン
ゾイル基、グアニンのアミノ基に対するイソブチ
リル基などで保護される。 実施例 ６ 本実施例はプリンデオキシヌクレオチドの使用
について説明する。 Ａ HPLC級のシリカゲル（２ｇ、バイダツク
TP―20、分離用、表面積100m²／ｇ、細孔径
300Å、粒径20μｍ）を約24時間相対湿度15％
（飽和LiCl）に接触させた。次にシリカ（2.0
ｇ）を20で12時間３―トリエトキシシリルプロ
ピルアミン（2.3ｇ、0.01Mトルエン溶液）で
処理し、ドリエライト（Drierite）乾燥管によ
り12時間還流した。この反応は磁気撹拌棒では
シリカゲルを粉砕してしまうので振とう機で行
なつた。シリカは遠心分離により分離し、トル
エン、メタノールおよびエーテルで各２回づつ
洗滌し、次に空気中で乾燥させた。 Ｂ このようにして生成したシリカ（２ｇ）とコ
ハク酸（2.5ｇ、0.025M）を水中で撹拌しカル
ボン酸基を導入した。2MNaOHを添加するこ
とによりPHを２〜６に調節した。カルボキシル
化反応の進行状態はピクラートサルフエートテ
ストにより試験した。シリカの一部（約２mg）
を0.5mlの0.1Mピクラートサルフエート飽和ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（PH10）で処理した。最
初のシリカは10分以内に淡黄色になつたがアシ
ル化した生成物は白いままであつた。無水コハ
ク酸反応は、ピクラートサルフエートテストで
シリカゲルが白いままになるまで継続した。通
常全反応時間は１時間であり、二度目の無水コ
ハク酸の添加が必要であつた。順次に２回づ
つ、水、0.1Mトリクロロ酢酸、水、メタノー
ルおよびエーテルで生成物を洗滌した後、この
化合物２を空気中で乾燥し、真空中で乾燥し、
更に25℃で24時間、トリメチルシリルクロリド
（1.25ml、0.01M）を含むピリジン（７ml）で
処理し、その生成物をメタノール（４回）およ
びエーテルで洗滌した。カルボキシル化の程度
の分析は２工程からなる。試料の一部を正確に
秤量し、ジシクロヘキシルカルボジイミド
（DCC）およびｐ―ニトロフエノールのピリジ
ン溶液で処理する。テトラヒドロフランで数回
洗滌して未反応ｐ―ニトロフエノールを除去し
た後、シリカゲルに10％ピペリジンのピリジン
溶液を添加し遊離したｐ―ニトロフエノールの
量を、ｐ―ニトロフエノキシドの吸収率として
1.57×10⁴を用いて410nmで測定した。カルボ
ン酸の付加量は200μmol／ｇであつた。 Ｃ DCCを使用し、デオキシヌクレオシドを前
記生成物と混合した。乾燥ピリジン（21ml）中
で5′―Ｏ―ジメトキシトリチルチミジン（1.1
ｇ、2.16ｍmol）、DCC（２ｇ、0.01mol）、およ
び２（４ｇ、0.8ｍmolカルボン酸）を２日間撹
拌した。更にｐ―ニトロフエノール（1.4ｇ、
0.01mol）を添加し、その混合物を更に１日間
撹拌し、モルホリン（１ml、0.011mol）で反
応を停止した。メタノールおよびエーテルで洗
滌した後、シリカゲルの未反応カルボン酸を分
析した。通常最初のブロツキング処理で残つて
いる微量の遊離カルボン酸（＜10μmol／ｇ）
を完全にブロツクするためにDCC（２ｇ、
0.01mol）およびｐ―ニトロフエノール（1.4
ｇ、0.01mol）乾燥ピリジン（20ml）溶液およ
び最後にモルフオリン（１ml）を用いる二次処
理が必要であつた。 5′―Ｏ―ジメトキシトリチルチミジン、5′―
Ｏ―ジメトキシトリチル―Ｎ―ベンゾイルデオ
キシシチジン、5′―Ｏ―ジメトキシトリチル―
Ｎ―イソブチリルデオキシグアノシンおよび
5′―Ｏ―ジメトキシトリチル―Ｎ―ベンゾイル
デオキシアデノシンを以下の方法により必要な
ホスホリルクロリド基を導入して活性ヌクレオ
シドに変えた。 5′―Ｏ―ジメトキシトリチルチミジン（1.6
ｇ、2.9ｍmol）の無水テトラヒドロフラン
（５ml）溶液を、CH₃OPCl₂（0.33ml、2.5ｍ
mol）およびコリジン（1.86ml、14.1ｍmol）
の無水テトラヒドロフラン（５ml）溶液中に−
78℃で撹拌しつつ滴下した。滴下中に白色の沈
澱が生じた。混合物を−78℃で15分間撹拌した
後、焼結ガラス斗で過してコリジンハイド
ロクロリドを除去した。コリジンハイドロクロ
リドは無水テトラヒドロフラン（１ml）で洗滌
した。液を次に乾燥トルエンで希釈し粘物質
になるまで濃縮した。乾燥アルゴンを装置に入
れた後、トルエン：テトラヒドロフラン（２：
１）の溶液を加えて粘物質が溶液中に完全に溶
解するまで放置した。溶媒は真空中で濃縮して
除去した。トルエンとテトラヒドロフランを用
いる再濃縮を３回繰返した。最後の濃縮の後、
粘物質を乾燥テトラヒドロフラン（３ml）に溶
解し、−78℃に冷却し、テトラゾール（0.18ｇ、
2.6ｍmol）の無水テトラヒドロフラン（３ml）
溶液を滴下した。この添加中に、コリジンハイ
ドロクロライドの白色沈澱が生成した。この混
合物を−78℃で更に10分間撹拌し、次にアルゴ
ンを満した遠心分離管に、アルゴンの圧力と注
入管を用いて混合物を移した。遠心分離の後に
回収した上澄液はテトラゾリルホスフアイト生
成物を含有しており、デオキシオリゴヌクレオ
チドの合成に直接使用することができる。ま
た、テトラゾリルホスフアイトは沈澱として保
存し必要に応じて再生成することができる。 前記のホスフアイトすなわち、活性化ヌクレオ
チドは添付図面に示した自動化装置によつてデオ
キシオリゴヌクレオチドを合成するために使用す
ることができる。 〔デオキシオリゴヌクレオチドの合成〕 装置はミルトン・ロイ・ミニポンプ、アルテツ
クス（Altex）三方スライド弁、リサイクル弁
（アルテツクス弁の変形）および注入ループ（ア
ルテツクス三方弁）からなる。全ての結合はテフ
ロン管で行い、リサイクル系中の管の容量を最少
にしてある。塔は11mmのエース（Ace）ガラスカ
ラムであり、１mlの容積になるように短くしてあ
る。シリカ属を支持するためにセルロースフイル
ターを使用した。使用する前に、無水酢酸および
ピリジン（１：１容量）の混合液を用い、50℃で
４時間フイルターをアセチル化した。この装置の
リサイクル系の全容量は約2.5mlであつた。テト
ラヒドロフラン容器は窒素泡立器によつて空気か
ら遮断し、ZnBr₂溶液はドリエライト（Drierite）
管により湿気から保護した。 シリカに１つのヌクレオチドを付加するために
行なうべき各種の化学操作を次の表に示す。

【表】

〔デオキシオリゴヌクレオチドの単離〕

以下の方法により完全に保護を外したデオキシ
オリゴヌクレオチドを単離した。保護された形態
のデオキシオリゴヌクレオチドトリエステルを含
有するシリカゲルの一部（10mg）を先ずチオフエ
ノール：トリエチルアミン：ジオキサン（１：
１：２、ｖ／ｖ）で処理する。45分間緩慢に振と
うした後、遠心分離によりシリカゲルを回収し、
メタノール（４回）およびエチルエーテルで洗滌
した。空気乾燥の後、20゜で水酸化アンモニウム
により３時間処理し、遠心分離することによつ
て、支持体からデオキシオリゴヌクレオチドを除
去した。塩基性保護基は、封管内で上澄液を50゜
で12時間加温することによつて除去した。5′―Ｏ
―ジメトキシトリチルデオキシオリゴヌクレオチ
ドは、加水分解物を真空中で濃縮し、残渣を
0.1Mトリエチルアンモニウムアセテート（PH
7.0）に溶解し、その物質をC₁₈逆相高速薄層クロ
マトグラフイーカラム（ウオーター・アソシエー
ツ（Water Associates）で分離することにより
得た。溶出緩衝液は26％のアセトニトリルを含有
するトリエチルアンモニウムアセテートであつ
た。5′―Ｏ―ジメトキシトリチルデオキシオリゴ
ヌクレオチドを含有するピークを真空中で濃縮し
残留物を酢酸―水（４：１、ｖ／ｖ）の混合液を
用いて20゜で15分間処理し、5′―Ｏ―ジメトキシ
トリチル基を除去した。完全に保護を取り去つた
デオキシオリゴヌクレオチドは、真空中で酢酸溶
液を濃縮し、残留物を25ｍＭの重炭酸トリエチル
アンモニウム（PH７）に溶解し、水飽和エーテル
でジメトキシトリタノール（diethoxytritanol）
を抽出することにより得た。 〔デオキシオリゴヌクレオチドの特定〕 各デオキシオリゴヌクレオチドの5′―ヒドロキ
シルを〔5′―³²P〕ATPおよびT4―キナーゼを用
いてホスホリル化した。ホスホリル化反応に使用
したデオキシオリゴヌクレオチドの量は、吸光度
を測定し、淡色効果がデオキシオリゴヌクレオチ
ドにはないものとして吸光係数計算値を使用し
た。10ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（PH
７）を溶出剤として使用し、Ｇ―50―40セフアデ
ツクス（Sephadex）カラムで脱塩することによ
り、過剰のATPからホスホリル化オリゴヌクレ
オチドを分離した。標準方法により、ポリアクリ
ルアミド上でのゲル電気泳動および二次元分析を
行つた。 〔ｄ（Ｃ―Ｇ―Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｃ―Ａ―Ａ―Ｔ―Ａ）
の合成〕 5′―Ｏ―ジメトキシトリチルチミジン（0.25
ｇ、50ｍ／ｇ）で変性したシリカゲルをカラムに
供給し、シリカゲルをニトロメタンで洗滌し、
5′―ジメトキシトリチル基をZnBr₂で除去するこ
とによりサイクルを開始した。各縮合中に、前記
のように約10倍量の活性ヌクレオシドホスフアイ
ト（0.1ｍＭ）を使用して伸長した。合成はデオ
キシオタクヌクレオチド、ｄ（Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｃ―
Ａ―Ａ―Ｔ―Ｔ）が完成するまで継続した。この
点で、シリカゲルをほぼ等しく二分割した。一方
は標準的方法でデオキシデカヌクレオチドまで延
長した。支持体に結合しているジメトキシトリチ
ル基の量に基く全収率は64％であり、逆相高速液
体クロマトグラフイーカラムから分離されたもの
の収率は30％であつた。 〔ｄ（Ａ―Ｃ―Ｇ―Ｃ―Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｃ―Ａ―Ａ
―Ｔ―Ｔ）〕 ｄ（Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｃ―Ａ―Ａ―Ｔ―Ｔ）の残部
は標準的方法で伸長し、デオキシドデカヌクレオ
チドを生成した。支持体に結合したジメトキシト
リチル基に基く全体収率は55％であつた。単離収
率は正確に測定できなかつた。 上記の工程により、次のオリゴヌクレオチドを
調製した。 5′―ｄ（Ａ―Ａ―Ｔ―Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｃ―Ｃ―
Ｇ―Ｔ―Ｇ） 5′―ｄ（Ｃ―Ｇ―Ｔ―Ｇ―Ｔ―Ｔ―Ｇ―Ａ―
Ｃ―Ｔ） 5′―ｄ（Ａ―Ｔ―Ｔ―Ｔ―Ｔ―Ａ―Ｃ―Ｃ―
Ｔ―Ｃ―Ｔ） 5′―ｄ（Ｇ―Ｇ―Ｃ―Ｇ―Ｇ―Ｔ―Ｇ―Ａ―
Ｔ―Ａ） 5′―ｄ（Ａ―Ｔ―Ｇ―Ａ―Ｇ―Ｃ―Ａ―Ｃ） 5′―ｄ（Ａ―Ａ―Ｔ―Ｔ―Ｇ―Ｔ―Ｇ―Ｃ） 5′―ｄ（Ｔ―Ｃ―Ａ―Ｔ―Ｔ―Ａ―Ｔ―Ｃ―
Ａ） 5′―ｄ（Ｃ―Ｃ―Ｇ―Ｃ―Ｃ―Ａ―Ｇ―Ａ―
Ｇ） 5′―ｄ（Ｇ―Ｔ―Ａ―Ａ―Ａ―Ａ―Ｔ―Ａ―
Ｇ―Ｔ―Ｃ―Ａ） 5′―ｄ（Ａ―Ｃ―Ａ―Ｃ―Ｇ―Ｃ―Ａ―Ｃ―
Ｇ―Ｇ―Ｔ―Ｇ） 一連の工程中に所望の点に所望のヌクレオシド
部分を入れるという簡単な方法により、前記実施
例の方法は、混合ヌクレオシド、デオキシヌクレ
オシド、オリゴヌクレオシドなどを合成するため
に使用できる。従つて、この方法は、各ヌクレオ
シドの連続からなるオリゴヌクレオチドの製造に
有用であるばかりではなく、天然物として未知の
合成オリゴヌクレオチドを調製する場合にも使用
できる。これらはポリヌクレオチドの研究および
合成に、場合によつては生物学上のシステムで用
いる遺伝子の製造に使用することができる。 本発明の好ましい実施例は、5′―Ｏ―トリチル
ヌクレオシド、デオキシヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、オリゴデオキシヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドの
脱トリチル化をルイス酸、特に臭化亜鉛を用いて
行うことであるが、例えば、四塩化チタンなどの
他のルイス酸も使用することができる。5′―Ｏ―
位置からトリチル基を除去する場合に、ルイス酸
はプロトン酸よりも好適である。これは、反応が
非常に速くかつ脱プリンが起こらないからであ
る。この方法は5′―Ｏ―トリチル基に対して特定
的であるから、3′―Ｏおよび5′―Ｏ―ジトリチル
化合物と反応させることにより3′―Ｏ―トリチル
封鎖ヌクレオチドを製造することができる。 本方法においては、単に反応物質を、望ましく
は溶媒中で、接触させることが必要であり、脱ト
リチルは短い反応時間中に起こる。ルイス酸は通
常反応溶媒中に懸濁しており、溶媒は、ルイス酸
と反応してプロトン酸が生ずることを防ぐために
水を含有しない。現在の経験から言うと、例え
ば、ジオキサンおよびテトラヒドロフラン、それ
らの混合物、その他アセトン、メチレンクロリド
などの各種の溶媒を使用することができるが、ニ
トロメタンが好適な溶媒である。 脱トリチル速度を測定し、その比較データを表
に示す。

【表】 各種のトリチルチミジンに臭化亜鉛を室温で用
いた場合の結果を表に示す。

【表】 更に０℃の結果を表に示す。

【表】

【表】 脱トリチルはポリマー支持体合成のみに限定さ
れるものではなく、反応中にトリチル基の使用が
含まれる溶液合成工程においても有用である。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明を実施するための装置の系統図で
ある。 １０…カラム；１２…シリカゲルマトリツク
ス、１４，２８，４２，５０，５２，５４…弁、
１５，１５′，１５″…制御装置、１６，１８，２
０，２２，２４，２６，３０，３２，３４，３
６，３８，４０，４４，４６，４８…容器、５６
…ポンプ、５８…紫外線検出機。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の式で表わされる化合物、 上式中、Ｂはプリンまたはピリミジン構造を有
   するヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシド塩
   基；ＲはＨまたは保護基；ＡはＨまたはOR；R₁
   は炭素数10以下の低級アルキル基またはヘテロ原
   子置換低級アルキル基；およびＸはハロゲン原子
   またはジ―低級アルキルアミノ基および不飽和窒
   素複素環化合物の核窒素から水素を除去した基か
   らなる群から選ばれた第二級アミノ基である。 ２ 次の式で表わされる特許請求の範囲第１項に
   記載の化合物、 上式中Ｂ、Ｒ、Ａ、R₁およびＸは、それぞれ
   特許請求の範囲第１項における定義と同じであ
   る。 ３ 第二級アミノ基はテトラゾリル、ニトロイミ
   ダゾリルまたはトリアゾリル基である特許請求の
   範囲第１項または第２項に記載の化合物。 ４ Ｂはチミン、シトシン、アデニンおよびグア
   ニンである特許請求の範囲第１項または第２項に
   記載の化合物。 ５ Ｒはトリチル基である特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の化合物。 ６ Ｒはジ―ｐ―アニシルフエニルメチルまたは
   ｐ―アニシルフエニルメチル基である特許請求の
   範囲第１項または第２項に記載の化合物。 ７ Ａは水素原子Ｈである特許請求の範囲第２項
   に記載の化合物。