JPH0327395A - ポリヌクレオチド合成用支持体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、米国保健教育福祉省の認可、すなわち補償の
もとに行われた業務の最中に生じたものである。

本発明は、変性無機重合体並びにその変性無機重合体の
製造法に関し、更に前記無機変性重合体を支持構造とし
て用いるポリヌクレオチドの製造法に関するものである
。

［従来技術およびその問題点］ 順序の一定したオリゴヌクレオチドを合成する有効な方
法論を求めて多くの試みがなされて来た．しかし、ポリ
ヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドの段階的な合成
法は、依然として、多くは収率の低い困難で時間のかか
るものに止っている。

公知技術の一つでは、ポリヌクレオチドの合戒に際して
有機重合体を支持体として用いている。

支持重合体による合成法の主な間運点は、元来支持重合
体の性質に固有のものであって、そのような合成に用い
られる種々の公知技術に属する重合体は二 （１）支持体中に活性化したヌクレオチドが拡散する速
度が遅いこと、 （２）細孔径の大きい多孔質で低架橋度の、種々の支持
体重合体における膨潤が過剰であること、および （３〉重合体中に反応物質が不可逆的に吸収されること などの理由により、不充分なものであった。

参考文献：ｖ．＾ｍａｒｎａｔｈ及び＾．Ｄ．　Ｂｒｏ
ｏｎ＋，Ｃｈｅ＋＋＋ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　７
７巻，　１８３−２１７頁　（１９７７年）。

変性無機重合体は公知技術において、例えば、液体クロ
マトグラフィーの吸着剤としての用途で元来知られてい
るものである。トリチル結合基を用いてシリカゲルにヌ
クレオシド燐酸塩を結合させることが公知資料　（Ｈ．
　Ｋｏｓｔｅｒ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒ
ｓ．　１５２７−１５３０頁、１９７２年）に記載され
ているが、この方法は明らかにピリミジンヌクレオシド
にのみ使用可能なものである。シリカ支持体からのヌク
レオシドの離脱分離はプリンヌクレオシドを侵すような
酸を用いなければ不可能である．オリゴチミジレートの
ホスホトリエステル誘導体の製造について公知文献（　
Ｒ．　Ｌ．　ＬｅｔｓｉｎｇｅｒおよびＶ４．　Ｂ．　
Ｌｕｎｓｆｏｒｄ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　
ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ．
　９８：１２、３６５５−３６６１頁）に記載されてい
るが、これは５゜−〇一保護チミジンを用いたホスホロ
ジクロリダイトの反応に引続いて生成物を３″一〇一保
護チミジンと反応させ、次いで得られたホスファイトを
ホスフェートに酸化し、さらに保護基を除去してホスホ
トリエステルを得るものである．この方法を用いて、テ
トラマーとベンタマー、すなわち、ｄＴｐＴｐＴｐＴ及
びｄＴｐＴｐＴｐＴｐＴ（Ｔはチミジン）が得られてい
る．残念ながらこの方法では、各段階毎に生成物の分離
精製がヌクレオシドの正しい付加順序を保証するために
必要とされる．沈殿操作および沈殿物の洗滌を含む分離
技術が各反応段階を実施するために必要である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は新規で有用な無機重合体を提供するもので、ま
たそのような無機重合体の製造法をも提供する。一般的
に本発明の変性無機重合物支持体は、ヌクレオシドが化
学的に結合した無機重合体からなり、ヌクレオシドの重
合体に対する化学結合はヌクレオシドの反応基と反応す
る重合体上の反応基によるものである。かかる反応基の
代表的な組合わせは，ヌクレオシドと支持体をアミド結
合で結ぶアミノ基とカルボキシル基、あるいは各々をエ
ステル結合で結ぶヒドロキシル基とカルボキシル基であ
る． 所望の化学結合を行わせるには、各反応成分が勿論必要
な反応基を含んでいなければならない。

従って支持重合体はメクレオシドのヒドロキシル及び／
又はアミノ基と反応するカルボキシル末端基を有するも
のとするか、あるい二塩基性力ルボン酸によってヌクレ
オシドのヒドロキシル及び／又はアミノ基をアシル化し
てヌクレオシドにカルボキシル基による官能性を与え、
支持重合体のヒドロキシル基又はアミノ基と反応させる
ことが可能である。無機支持体上にヒドロキシル基又は
アミノ基が存在しない場合には、公知の方法によってこ
れ等の基を導入して反応性を与えることができる。例え
ば、シリカ支持体の場合アミノアルキルシリルハライド
と反応させて、アミノ官能碁を導入することができる。

勿論本発明の変性無機重合体のヌクレオシト部分は２個
以上のヌクレオシドを含み得るもので、幾つかのヌクレ
オシドをオリゴヌクレオチドの形に縮合させて、そのオ
リシヌクレオチドが例えばエステル結合のような単一の
化学結合によって無機重合物支持体に結合している形態
を採ることもできる。

このようにして変性した無機重合物支持体は以下に記載
する一連の工程により、支持体上のメクレオシド部分の
ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドを段階的に付加
するのに用いられる。次いで、このようにして形成され
たポリダクレオチドを支持体とポリヌクレオチド間の化
学結合のアルカリ加水分解を含む一連の工程により、支
持重合体から分離し回収する。

本発明は、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリ
ヌクレオチド及びポリデオキシヌクレオチド並びにポリ
ベプチドを含有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリ
ボ核酸（ＲＮＡ）の化学合成に特に有用であり、天然の
ＤＮＡ及びＲＮＡ、更に新規なＤＮＡ及びＲＮＡの合成
が可能である．本発明には広範な種類の無機重合体が使
用でき、例えば、シリカ、多孔質ガラス、アルミノシリ
ケート類、ポロシリケート類、アルミナや酸化ニッケル
のような金属酸化物，及び種々の粘土鉱物がこれらに含
まれる。重合体は使用する反応溶媒に実質的に不溶性で
、支持体に最終生成物のポリメクレオシドを結合させる
下記の出発ヌクレオシドに対する化学結合を形成するた
めの化学反応性を当然除外すれば、工程中に用いる薬品
に対して化学的に比較的不活性なものでなければならな
い．本発明の方法は、ヌクレオチドまたはメクレオシド
で変性した無機重合物支持体を、一連の順序に従った工
程で処理して、各工程で変性支持体上にヌクレオチドが
付加結合されて、最終的に所望の順序のヌクレオチドが
得られるようにして行なわれる。

一連の工程とは以下の通りである。

（ａ）支持重合体と結合したヌクレオシド、即ちヌクレ
オシド変性支持体、に対する所望のヌクレオシドのホス
ファイト結合によるカップリング、（ｂ）必要に応じ、
但し好ましくは支持重合体に結合したヌクレオチドの未
反応ヒドロキシル基の保護、 （Ｃ）段階（ａ）で形成したホスファイト結合の酸化に
よるホスフエート結合の生成、および（ｄ）段階（ａ）
に記載した所定のヌクレオシドの保護基除去により、こ
れ等の工程からなる次のサイクルのための反応基の再生
。

段階ａ，ｂ，ｃ及びｄを最終のオリゴヌクレオチドが得
られるまで反復することによって、各ヌクレオシドが支
持重合体上に順次に付加され、その後加水分解反応によ
ってオリゴヌクレオチドを支持体から取外すと同時に、
オリゴヌクレオチド分子から保護基も除去する。保護基
の除去と支持体からのオリゴヌクレオチドの加水分解脱
離を２段階に別けて行なうこともでき、又その方が好ま
しいが、これを一回の加水分解反応で行なうこともでき
る． ヌクレオシド変性支持体は、出発ヌクレオシトの３″一
又は５゜−ＯＨにより、適宜のカップリング剤を用いて
無機重合体にヌクレオシドを共有結合でカップリングし
て生成する。これは出発ヌクレオシドの３゛一又は５’
　−　Ｏ　Ｈを保護して行い、保護してない方のヒドロ
キシル基によってヌクレオシドと支持重合体をカップリ
ング剤で結合する。縮合が終了してから残余の反応基、
例えばカルボキシル基等未反応のものは、適宜な手段、
例えばカルボキシル基を単純なアミンと反応させてカル
ボキシアミドにすることによって保護することができる
。保護した３゛一又は５゛−ヒドロキシル基は後で保護
基を除去して遊離のヒドロキシル基とし、この遊離ヒド
ロキシル基を用いて、上記の段階（ａ）におけるように
ホスファイト結合基を含む所望のヌクレオシドと縮合さ
せ得る。

カップリング剤又は支持重合体上のカップリング基の一
種を、支持重合体と出発ヌクレオシド又はオリゴヌクレ
オチドと共有結合させるために用いることができる。代
表的な基としては、中でもアミノ基、特に一級アミン基
、ヒドロキシル基、チオール基、スルホン酸基、亜燐酸
基及び燐酸基、特にその酸ハロゲン化物、就中塩化物及
び臭化物およびカルボキシル基がある。これ等の反応基
は、通常二価のアルキレン又はフエニレン基でその原子
価位置の一方が鎖状結合で占められた方が反応基に着い
ているものが好適である。そのような基は約１０以下の
炭素原子、好ましくは約６までの炭素原子を含むものが
よく、アルキレン基は通常主鎖中に２〜４の炭素原子を
含むものが好ましい．支持重合体にヌクレオシドを結合
する反応基の性質は、必ずという訳ではないが、合成工
程の最後に、容易に加水分解して支持重合体からオリゴ
ヌクレオチドを離脱せしめるものが好ましい。

必要ならば、上記のカップリング基は、支持重合体上の
反応基、例えばヒドロキシル基又はアミノ基と反応する
ようにヌクレオシド上に存在させることもできるが、通
常はカップリング基は支持重合体上にあることが好まし
い。

本発明の方法及びこれに用いる新規でかつ有用なヌクレ
オシド変性無機重合体は、特にオリゴヌクレオチドの迅
速な合成工程並びに高収率、高純度を特徴とするオリゴ
ヌクレオチドを提供する点において優れている。各々の
モノヌクレオチド付加には最大２〜３時間を要するが、
収率は９５％又はそれ以上が得られる。更に、オリゴヌ
クレオチドの分子量が増大してもこれ等の収率が変わる
ことはない。

本発明は種々の無機重合体を用いて行なうことがでるが
、以下ではシリカゲルを支持重合体として用いて、より
詳細に説明を行う。特に好ましいシリカゲルは高性能液
体クロマトグラフィ（ｈｐｌｃ）に用いる開口の大きい
多孔質シリカである。更に本発明の説明はデオキシヌク
レオチドを用いて行なうが、リボヌクレオチドを代わり
に用いても同様の結果を得ることができる。

以下の説明に用いる用語、メクレオシド、ヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチドは、２゛位置のヒドロキシル
基がないという点のみが相違するデオキシ類を含むもの
として用いる。従って、これ等の用語は２゜位置の置換
基がＨ又はＯＨ（以下の説明では、式工、■、■におい
て置換基Ａとして示す）である構造のものを含む。

（Ａ〉　〔ヌクレオシド変性支持体の製・造〕シリカゲ
ル支持体は、好ましくは水酸化アンモニウムのような弱
塩基で容易に加水分解し得る結合によってシリカゲル支
持体に結合していることが望ましい。このような結合は
、支持体にカルボキシル反応基を先づ結合させるか、あ
るいはエステル化によってヌクレオシドにエステル結合
を前以て形成し、次いでエステル化酸部分によって支持
体にエステル化ヌクレオシドを縮合させることにより達
成する。

これら実施方法の１つは以下の工程により行う．（１）
シリカゲルを、これに共有結合で結合したアミノアルキ
ル基又はヒドロキシアルキル基を含むマトリックスに変
える； （２）アミノアルキルシリカ又はヒドロキシアルキルシ
リカをジカルボン酸と反応させて、アミド結合又はエス
テル結合並びにカルボキシル基による反応性を形成する
； （３）未反応のシラノールＯＨ基を保護する；（４）シ
リカの遊離力ルボキシル基と所定のヌクレオシドの遊離
ヒドロキシル基（３゛一又は５゛−）を縮合させる；お
よび （５）未反応のカルポキシル基を、非反応性誘導体、例
えばアミドの形態にして保護する。

他の実施方法は次のような手順で行う。

（１〉シリカゲルをアミノアルキル基又はヒドロキシア
ルキル基を含むマトリックスに変える；（２）未反応の
シラノールをＯＨ基を保護する；（３）得られた変性シ
リカゲルに、ジカルボン酸の半エズテルを含むように変
性した所定のヌクレオシドの遊離力ルボキシル基をアミ
ド結合又はエステル結合により結合させる；および （４）支持体シリカゲル上の未反応アミノ基又はヒドロ
キシル基を、例えば無水酢酸で保護する。

同一の反応物質から出発すれば、両方法は共に同じ生成
物を生ずるが、第二の方法の方がシリカゲル上に付着す
るヌクレオシドの量の制御がより容易であるので好まし
い。更に、第二の方法では、シリカゲルに付着するメク
レオシドの量が多くなる（第一の方法が１０〜４０μｍ
ｏｌ／ｇであるのに対し約１　０　０　〜１　２　０　
μｍｏｌ／ｇである）。

ヌクレオシドのシリカゲルに対する結合は、５’　−　
Ｏ　Ｈよりも３゜−ＯＨで行ない、次のヌクレオシドと
ホスファイトにより５’−ＯＨで結合できるようにする
ことが好ましい。そうすれば、付加するヌクレオシドの
結合は３゜一で起こり、５゜−ＯＨは更に付加すべきメ
クレオシドとの結合に用いられる． 従って、夫々３゜−ＯＨおよび５’−ＯＨで所望の結合
を生成するためには、上記のカップリング反応により出
発ヌクレオシドを３″−ＯＨでシリカゲルに結合させる
。これは５’−ＯＨを、例えば、ジメトキシトリチル基
のようなトリチル基を用いて保護することにより達成で
きる。トリチル基は３’　−　Ｏ　Ｈカップリング反応
が起こった後で容易に除去できるので好ましい。

出発メクレオシドがアミノ基を含む場合、例えば、グア
ノシン、アデノシン、シチジン、デオキシグアノシン、
デオキシアデノシン及びデオキシシチジンの場合は、ア
ミノ基を、例えば、酢酸、安息香酸、イソ酪酸又は同類
の酸を用いて公知のアシル化法により保護することが好
ましく、そのような保護基は都合のよいときに、通常、
最終オリゴヌクレオチドが得られた後に除去することが
できる。

アミノアルキル基をシリカゲル上に導入するには、アミ
ノアルキルートリアルコキシシラン反応による。この反
応は、例えばトルエンのような溶剤中で還流しながら数
時間行うのが普通である。

適当な反応剤としては、アミノブロビルトリエトキシシ
ラン、４−アミノブチルトリメトキシシラン、４−アミ
ノブチルトリエトキシシラン、２一アミンエチルトリエ
トキシシラン等がある。

シリカゲルとデオキシヌクレオシド間のエステル結合の
形成に用いるジカルボン酸は、コハク酸、グルタル酸、
アジビン酸、フタル酸、マレイン酸、その他，好ましく
は炭素原子数１０迄の脂肪族並びに芳香族ジカルボン酸
の如何なるものでもよい．シカルボン酸によるエステル
化はモノエステル化か確実に起こるように酸無水物を用
いることが最適である。

生成物、即ちヌクレオシド変性シリカゲルは以下の式に
よって示すことができる： あ 式中Ｂはプリンまたはピリミジン構造を有するメクレオ
シド又はデオキシヌクレオシド塩基であり、Ｐは支持体
シリカと共有結合基を表わし、次の式：（シリカゲル）
→Ｃ｝＋２）　。ＮＨＣＯＺＣＯ　−で表わされるもの
で、式中ｎは１〜５の整数で、Ｚは炭素原子数１０迄の
アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリル及びア
ラルキル等を含む２価のヒドロカルビル基である。Ａは
ＨまたはＯＲで、ＲはＨまたは例えばトリチル、メトキ
シトリチル、ジメトキシトリチル、ジアルキルホスファ
イト、ピバリルイソブチロキシカルボニイル、ｔ−プチ
ルジメチルシリル、その他の保護基である。

（ホスファイト結合オリゴヌクレオシドの形成）デオキ
シヌクレオシド変性シリカケルと所定のヌクレオシドを
結合する場合、シリカゲル上のデオキシヌクレオシドの
５’−ＯＨと所定のメクレオシドの３″一〇Ｈの間のト
リエステルホスファイト結合によって縮合させる。ホス
ファイト結合は先ずシリカゲル上のヌクレオシドの５’
　−　Ｏ　Ｈにホスファイト基を導入し、次いで付加す
るヌクレオシドと３’　−　Ｏ　Ｈにより縮合させるこ
とにより行なう．更に、より好ましくは、付加するヌク
レオシドの３’−ＯＨにホスファイト基を導入し（５’
−ＯＨは予めトリチル化して保護しておく）、得られた
メクレオシドホスファイトをシリカゲル上のヌクレオシ
ドの５’　−　Ｏ　Ｈと反応させる。

デオキシヌクレオシド変性シリカゲルは、シリカゲル上
のデオキシヌクレオシドの３’　−　Ｏ　Ｈと所定のヌ
クレオシドの５’　−　Ｏ　Ｈとの間にトリエステルホ
スファイト結合を形或することによっても所定のヌクレ
オシトと縮合させることができる。

ホスファイト結合はシリカゲル上のメクレオシドの３’
　−　Ｏ　Ｈに、先ずホスファイト基を導入し、次いで
付加するメクレオシドの５’　−　Ｏ　Ｈと縮合させる
ことによりできる。あるいは、より好ましくは、ホスフ
ァイト基を付加するヌクレオシドの５゜−０｝１　（３
゜−ＯＨは予めトリチル化して保護しておく）に導入し
、次いで得られたヌクレオシドホスファイトをシリカゲ
ル上のヌクレオシドの３’−ＯＨと反応させる。

反応は以下のように一般化して示すことができる。

好ましい反応は以下の通りである。

ゐ 式中Ａ，Ｂ及び■は前記の定義の通りであり、Ｒは前記
定義による保護基、Ｒ．は炭素数１０以下の低級アルキ
ル基またはへテロ原子置換低級アルキル基、例えば、シ
アノエチル基などで、Ｘはハロゲン、好ましくはＣｌ又
はＢ『あるいはアミノ窒素により結合した二級アミノ基
である。置換基Ｘで示される二級アミノ基は，好ましく
は、環状構造内に不飽和結合を含む窒素複素環化合物の
核窒素から水素を除去して形成したものがよい。

窒素含有複素環類は、テトラゾール、ニトロイミダゾー
ルなどの置換イミダゾール、インドール、ビラゾール、
イミダゾール、ペンゾイミダゾール、イソインドール、
ピロール、トリアゾール、ジオキサゾールなど及び類似
の複素環類、更にそれらの類似物質を含む。

Ｘがそのような二級基である場合には、生成物は反応性
に富み、常温では不安定である。本製法によれば、これ
らの化合物は適宜新たに得るものとする．あるいは、封
止容器内に常に０℃以下、通常−２０℃程度の低温に保
ち、単離した状態で保存する。

保護基Ｒを除去すると、さらに反応式■のメクレオシド
の反応が起こる。繰り返し反応を行なうと、共有結合基
、例えば、エステル基によりシリカゲルに付着した一連
のヌクレオ・チド類からなるポリヌクレオチドが得られ
る。

ホスファイト結合基は、（本明細書に既に定義されたよ
うに）ハイドロカルビルホスホロジクロリダイト、例え
ば、メチルホスホロジクロリダイトとの反応により、好
ましくは、有機アミン等の塩基の存在下に付加されたヌ
クレオシドの５゜−ＯＨ位置又は３゜−ＯＨ位置におい
て、シリカゲルのヌクレオシド部分に導入される。反応
式■の生？物は、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性
ガスの雰囲気中で、約１週間，及び−２０℃の低温で溶
媒中に保存することができる。

反応式工と反応式Ｈの化合物の反応は、有機アミン等の
塩基、好ましくは、ビリジン、ルチジン及び類似するア
ミン類等の第三級有機アミンの存在下で行われる。

（保護反応） 所定のヌクレオシドがシリカゲル支持体に付着したヌク
レオシド又はオリゴヌクレオチドにホスファイト結合に
より縮合された後は、シリカゲルに付着したそのヌ■ク
レオシド又はオリゴヌクレオシド（少量ではあるが、約
１〜５％）は追加されたヌクレオシドと反応しない。好
ましくは、この未反応部分は、異質の配列のデオキシオ
リゴヌクレオチドの生成を防止するために保護するとよ
い。

この保護工程は、非常に反応性に富む亜燐酸と反応させ
、５゛−ホスファイトエステル基、すなわち比較的非疎
水性のトリエステルを形成する。例えば、ジエトキシト
リアゾリルホスフィンはジエチルホスファイト−５゛−
デオキシヌクレオシドトリエステルを得るために使用す
ることができる。相当するジ低級アルコキシ窒素含有複
素環ホスフィンは、テトラゾイル、イミダゾイル及び４
−ニトロイミダゾイルホスフィン等のトリアゾイルホス
フィンの代わりに使われ、相当するジ低級アルキルトリ
エステルを生成する。このような窒素複素環ホスフィン
は相当する塩化ホスフィニルから作る。当然ながら、塩
化ホスフィニルはヌクレオシドをホスフィニル化するの
に使われるが、窒素複素環ホスフィンの方が収率が高く
なるので好ましい。

無水酢酸のような酸無水物及びフェニルイソシネートの
ようなアリールイソシアネートは従来の保護基すなわち
封鎖基として使用することができる。しかし、これらは
未保謹５゛−ヒドロキシル基に対する反応性が低い。無
水酢酸等の酸無水物との酢酸化が，第三級アミン、特に
ジ低級アルキルアミノビリジン、例えば、ジメチルアミ
ノピリジンの雰囲気中で行なわれると、急速にアシル化
が進み、この反応は特に５゜−ヒトロキシル基の保護に
適している。ジアルキルホスフェート保護基も使うこと
ができる。生成されたトリエステルは、比較的非疎水性
を有し、好ましい精製法としては、非疎水性副産物を、
疎水性５゛一〇一ジメトキシトリチル基を含有する精製
物から確実に分離する逆相高性能液体クロマトグラフィ
ーを使用することである。

ヌクレオシドを加える前に、シリカゲルの未反応シラノ
ールヒドロキシ基を保護するには、好ましくは、炭素原
子数１０以下のヒドロカルビルモノカルボン酸類、例え
ば、酢酸、安息香酸、イソ酪酸及びナフトエ酸によるア
シル化によって保護することができるが、好ましくは、
塩化トリアルコキシシリルを使う方がよい。

〔亜燐酸から燐酸への酸化〕

酸化は通常ヨウ素を酸化剤として用い、標準の方法によ
り行う。あるいは、酸化は過酸化ｔｅｒｔ−ブチル、過
酸化ベンゾイル等のＡ酸化物およびヒドロパーオキシド
類等との反応により行なうこともできる。過酸化水素の
使用は、不要な副産物を生成するので好ましくない。

最良の収率を得るために、メクレオシドの縮合を更に行
う前に酸化を行う。すべての縮合反応が完了するまで酸
化工程を延期すると、不要な副産物の生成により収率が
低下する。

保護基の除去は、室温であってもまたは高温であっても
、水酸化アンモニウム等の弱い塩基を用い公知の方法に
より行なう。

段階的に保護基を取り除く場合、まずジオキサン又はテ
トラヒドロフラン等の溶媒中で、トリエチルアンモニウ
ムチオフェノキシドを用い、メチル等のアルキル基をホ
スホトリエステルから除去する。その後、この生成物を
室温（２０℃）にて水酸化アンモニウムで処理し、オリ
ゴヌクレオチドと支持体を結合するエステル基を加水分
解する。

さらに、アセチル基、ベンゾイル基およびイソブチル基
等のＮ−アシル保護基は、約１２時間、５０℃に加熱し
除去する。

トリチル保護基の除去は、Ａｌ（；．１３、ＢＦ３、Ｔ
ｊＣｌ４等のルイス酸によっても効果的に行ない得るが
、特に臭化亜鉛を使うと便利である。この反応にはテト
ラヒドロフランや、ニトロメタンとメタノールなとの低
級アルコールの混合液が溶媒として使われるが、通常は
溶媒としてニトロメタンを使う。

あるいは、トルエンスルホン酸等のプロトン酸を保護基
の除去に使用する。プリンヌクレオシド含有生成物の場
合には、しかしながら、プロトン酸類を使用すると脱プ
リン化が生ずる。従って保護基をプリン含有生成物から
除去する場合には、ルイス酸類を使用することが好まし
い。

上記の方法により、１０〜３０メクレオシド単位迄のヌ
クレオシドを含むオリゴヌクレオチドを製造できる。オ
リゴヌクレオチドはＴ４−リガーゼ及びＴ−４キナーゼ
により周知の酵素学上ＤＮＡ配列を形成することができ
る。

加水分解後得られた生成物は、無機支持重合体と分離し
た後、標準の方法により精製する。最終精製は、好まし
くは上記のように５゜−０−ジメ］・キシトリチルオリ
ゴヌクレオチドの逆相ｈｐｌｃにより行ない、次に酢酸
等の低級脂肪酸を使用しジメトキシトリチル基を除去す
る。

添付の図面は本発明において使用する装置の概略的工程
を示すものである。

より詳細に、かつ図面を参照し、装置を以下に説明する
。カラム１０には固体シリカゲルマトリックス１２を充
填し、本明細書に記載のように誘導体にする。

弁１４は弁制御装置１５により適宜にプログラムされ、
容器１６、１８、２０及び２２の４種の活性反応物質並
びに容器２４及び２６の洗浄溶媒を選択する。順序に従
い他の容器に関係なく、個別の容器を弁１４により選択
することかできる。

従って、例えば、容器１６から反応物質を選択しその直
後に容器２４から洗浄溶媒を選択する。

これらの反応物質は、本発明の方法によれば、生成物の
鎖を長くするために必要であり、室温に保持されている
。

弁２８は、容器３０、３２、３４、３６及び３８中の５
種のヌクレオシド−活性ホスファイトトリエステル及び
容器４０の洗浄溶媒を適宜に選択するように、制御装置
１５゛によってプログラムされている。再記するが、弁
２８は上記のように（混合による汚染を防止するように
）独立した選択が可能である。

さらに、容器３０〜３８は付加物を−７８℃に保持し、
この温度において弁２８は中の物質の通過が可能である
ように設計されている。

弁４２は、容器４４と４６の溶離剤と容器４８の洗浄溶
媒とを選択するようにプログラムされた制御装置１５“
によって制御されている。これらの反応物質と溶媒は、
カラム１０の支持体マトリックス１２からオリゴヌクレ
オチドを溶離するために必要であり、室温に保持される
。

弁５０は、ボンブ５６と協働して、溶媒、反応物質又は
付加物を、弁１４、２８、及び４２から弁５２へ選択的
に通す。そして、この弁５２は、弁制御装置（図示せず
）の適切な制御によって、カラム１０と紫外線検出器５
８を介する流路、あるいはカラム１０を介するリサイク
ル処理を選択する。紫外線検出器５８は適切な帰還制御
手段（図示せず）によって、システムを制御するのに使
用される。

システムのプログラム動作を概略的に以下の表１に示す
。このプログラムは、１つのヌクレオシドを付加し、支
持体１２からヌクレオシド鎖を脱離する方法を示す。シ
ステムは１つ以上のヌクレオシドを付加するように拡大
及び／又は変更することができ、またシステム全体は、
適切にプログラムされたマイクロプロセッサコンピュー
タにより動作させることが望ましい。

本装置は、自動化された操作に特に適用されるが、その
詳細は当業者に自明である。

本発明の変性シリカケ゜ル製造に釦ける出発物質として
使用されるシリカケ゜ルは特に限定されない。

粒径が５μｍ〜約１．０００μｍの範囲のシリカケ゛ル
粒子を用いることができるが、１０μｍ〜約５０μｍの
粒径の粒子のものが望筐しい。同様に細孔径も特に限定
されないが、５０λ〜２，　０００　Ｘの範囲であるこ
とが望１しい。

本発明の変性シリカグルによれば：（ｌ）活性化された
ヌクレオチドを比較的迅速に拡散することができ；（２
）膨潤を防ぐことができ：（３）反応物質を吸収しない
。さらに，本発明の変性シリカｒ／Ｌ−は，（１）殆ど
の溶媒に不溶であり；（２）支持体マトリックスとして
使用された時に、溶媒や不要な反応物質金マトリックス
から容易に溶離する一方、所望の反応生或物を所定の場
所に保持し，かつ所望の反応を継続させることができる
。

出発反応物質を生或するために、　オリコ９ヌクレオチ
ド鎖の出発ヌクレオシドと反応する変性シリカグルは当
業者にとっては周知の方法により得られる。出発ヌクレ
オシドのヒドロキシル基（　３’−又は５゛一）と反応
するに適したシリカｒルの表面上に多種の官能基を有す
る生成物は、米国特許第３，５１９，５３８号、第３，
４１９，５１７号、＠；３，６５２，７６１号及び第３
，６６９，８４１号に記載された方法等の公知の方法に
より得られる。

本発明の好１しい方法によれば、アミノアルキルシラン
誘導体と反応させることによって、例えば、トリエトキ
シー３−７’ロピルシラ／のようなトリアルフキシー３
−アミノデロピルシランをシリカ支持体と反応させるこ
とによって、シリカにアミノ官能基を導入して以下の共
有結合を生成し、ＯＥｔ １ アミノ基を二塩基性カルポン酸の一つのカルポキシル基
と反応させてカルポキシル官能性を付与すると、アミノ
基とカルボキシル基の縮合が起る。次に，適宜の保護剤
、例えば、トリメチルクｏａシランヤトリメチルブロモ
シランのようなトリアルキルハロシランによって反応さ
れていないシラノ−ル基を保護するようにシリカｆ　Ａ
−　ｆ処理する。

これにより得たカルポキシル化シリカｒルを、更に付加
したヌクレオシドの水酸基（３′一又ハ５’−）と反応
させることができる。

普たは，上記のように、二塩基性カルポン酸を選択され
たヌクレオンドと反応させて３′−Ｏ位又ぱ５’−０位
にモノエステルを生成し、エステル化基の遊離カルＭキ
シル基を含み、これにより得られたエステルをアミノ化
シリカと縮合させて、ヌクレオンドとシリカ支持体間に
同一の共有結合を生成することも可能である。アミノ化
シリカｒルの未反応アミノ基は、酢酸、安息香酸、イソ
酪酸等のモノカルボン酸によるアシル化によって保護す
ることが望１しく、これには通常のアシル化の条件下に
酸無水物を使用することにより行なう。

第一ヌクレオシドとシリカ支持体との間の共有結合構造
は、特に限定されるものではなく，以降に行なうヌクレ
オシド付加サイクルにふ・いてヌクレオシドを保持する
ように実質上安定な共有結合が生成されればよい。従っ
て共有結合は、それ以降の反応条件に対して安定したも
のでなくてはならないが，適宜容易に加水分解でき，ヌ
クレオンドの付加完了後に生成オリゴヌクレオチドを回
収できるものである。エステル結合及びアミド結合は、
特に所望の安宅性を得るのに効果的であり，同時に、ヌ
クレオシド付加完了後の容易な加水分解を弱塩基又は強
塩基で行い得る。

本明細書において、ヌクレオチド及びポリヌクレオチド
の記号は、「ＩＵＰＡＣ＝ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏ
ｎ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔ
ｕｒｅ　Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ　　（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｔｓ−ｔｒｙ，　　９巻，　４０２２頁，　１
９７０年》」に準拠する。

以下に実施例により本発明を更に説明する実施例Ｉ Ａ．カルボン酸基で官能化したポリマー支持体金シリカ
グルを用いて調製した。

分離用シリカｒルは粒径２０μｍで、細孔径３ｏｏＸの
・｛イダック（　Ｖｙｄａｋ　）　ＴＰシリヵであり，
これを出発物質として使用した。シリカヶ゛ル’ｊ（Ｌ
ＬＣＩ飽和溶液入りのデシケーター上に２４時間置いた
。工程の最初の処理は、乾燥トルエン中にてシリヵグル
（　２．６　Ｐ　）と３−アミノグロビルトリエトキシ
シラン（　２．３　５’、０．ＯＩＭ）を還流させてシ
リル化することである。この場合、約１２時間還流させ
、シリル化が実質的に完了した後，反応混合物を冷却し
トルエン溶液を除去した。このようにして得たシリル化
シリカケ゛ルを次にトルエン、エタノール、更にエーテ
ルで順次に洗滌し、次に空気乾燥した。無水コノ・ク酸
（２．５？，　０．０２５Ｍ）の水溶液を、次にシラン
変性シリカデルと反応させて、共有結合で結合したシラ
ン側鎖の末端にカルＭン酸官能性を与えた。この後者の
反応中に、例えば、２Ｎの水酸化ナトリウムなどの塩基
を添加してｐＨｉ４から６の間に保った。この反応を約
６時間進めた後、側鎖にカルポン酸官能基を有する変性
シリカｒルを水で洗滌した。次にメタノール釦よびエー
テルで洗滌し、最後に室温の真空中で乾燥した。変性シ
リカｒルは、次に無水ピリジン中のトリメチルシリルク
ａライド（　（ＣＭ３）３ＳｉＣｌ１１．０９　ｆ，　
０．０１　Ｍ　）で，約１２時間還流させながら処理し
た。得られた変性シリカｒルは、次に５％トリクロロ酢
酸水溶液で洗滌し、次に水で、更にエタノールかよびエ
一テルで洗滌した。真空中で乾燥した後、変性シリカケ
゛ルのカルポン酸官能性の生成率は約２５０μｍｏ　１
　／　ｆであった。

８．　５’−　０−ジメトキシトリチルｒオキシチミデ
ン（１．１７ｆ，　０．００２Ｍ）ふ・よび上記Ａ工程
で得た変性シリカｌ”ｋ（４１、Ｏ．ＯＯＩＭカルｒｔ
ｅ　ン酸官能基）ｔ１ジシクロヘキシカルがノイミド（
　２．０６　ｆ、Ｏ．　Ｏｆ　Ｍ　）を縮合剤として使
用して、無水ピリノン中で約４０時間反応させた。変性
シリカｒルの残余のカルボン酸基は、ｐ　−　二｝　ａ
フェノール（１．４５’、０．　０１　Ｍ　）を添加し
、次に１０％ビペリジンを含むピリノンを添加（２５分
）することによってプロノクした。次に反応生成物を、
テトラヒドロフラン、メタノールおよび最後にエチルエ
ーテルで順次に洗滌した。

次に、未反応カルポン酸が完全にブロックされているこ
とを確実にするために、生成物をジシクロへキシルカル
ボ・ノイミドおよびｐ−ニトロフェノールで最初処理し
、ピリジン中のビペリノンで更に２回処理した。０．ｌ
Ｎｐ−｝ルエンスルホン酸のアセトニトリル溶液を使用
して、ジメトキシトリチル基を除去した後、支持体に付
いたチミノンの収率は、分光創光により、約４０μｍｏ
ｌ／ｆであることが解った。

実施例２ Ａ．ＬｉＣ１の飽和溶液の入ったデシケーター中に、シ
リカゲル（パイダックＡ１　２５５’）を、約２４時間
入れた。シリカグルを５００ｍ／の丸底フラスコに移し
、トルエン（２５０Ｉ＋！／）およびアミノプロピルト
リエトキシシラン（１３ｚ／）を添加した。フラスコを
強固にシールした後、室温で懸濁液を約１２時間穏かに
振とうした。懸濁したシリカグルを入れたフラスコを次
に１８時間還流させた。還Ｒ″ｆ！：始める前に、沸石
を１つ溶液に入れた。還流処理の後、シリカグル懸濁液
を遠心分離容器に入れ、シリカｒルを低速回転でペレッ
ト状にした。上澄液は静かに注ぎ出し、シリカデルをト
ルエン（　各Ｂｏｚｇ　３　回）、メタノール（各８０
ｍｌ３回）釦よび１：１メタノール水溶液（各８０ａｔ
Ｊ？２回）で洗滌した。次に８０ｒｎｌの５０％メタノ
ール水溶液中にシリカグルを懸濁サせ、室温で一夜振と
うした。再度、シリカグル懸濁液を遠心分離容器に入れ
、低速回転させて分離ヲ行った。次にシリカｒルをメタ
ノール（　各８０　ｍｌ２回）およびエチルエーテル（
各８０６！／３回）で洗滌した。最後に，シリカヶ゛ル
を６時間空気乾燥し次に真空中で乾燥した。

シリカグルを丸底フラスコに入れた。無水ピリジン（５
０Ｊ１！／）およびトリメチルシリルクロライドの溶液
を添加し、その懸濁液を室温で一夜振とうした。シリカ
グルは低速遠心分離によって分離した。次にシリカグル
をメタノール（各８０ｍ／５回）およびエチルエーテル
（各８０ｒ！Ｌ／３回）で洗滌した。

シリカグルを６時間空気乾燥し、更に真空中で乾燥した
。

Ｂ．無水ピリジン（５ｘ／）およびＮ，Ｎ−ノメチルア
ミノピリジン（　０．３　ｆ　）からなる溶液中に、５
’−０−ジメトキシトリチルおよびＮ一保護デオキシヌ
クレオシド（２．５ｍｏｌ）を添加した。無水コハク酸
（２．ｏｍｍｏｌ，　０．２ｔ）を加え、その溶液を室
温で１２時間攪拌した。アセトニトリル：水（９：１、
ｖ／ｖ）Ｏ薄層クロマトグラ７イーを、反応を追跡する
ために使用することができる。未反応ヌクレオシドのＲ
，はほぼ０．８であり、一方生或物はＲ（０．３からＲ
％−５である。反応が完了した後、ロータリーエ・｛ポ
レーダー中で溶媒金除去し、乾燥したがム状物質をトル
エン（１０ｍ／）に再溶解した。ａ一タリー工・ぐポレ
ーターでトルエンを除去し、このトルエン共蒸発処理を
繰り返した。ピリジンおよびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピ
リジンを含１ない乾燥ガム状物［ｔ−メチレンクロライ
ド（３０１Ｉｃ０中に溶解した。この溶液を抽出漏斗に
移し，１０％の水冷クエン酸金加えた。激しく振とうし
、抽出した後、有機相を水（各１５１Ｉｔ／）で２回洗
滌し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥した。硫酸ナトリウ
ム上で乾燥している間に脱トリチル化が起ることを最小
限に止めるために、約０．３ｒｔｔｌのピリジンをメチ
レンクロライド溶液に添加した。このメチレンクａライ
ド溶液を１０ｒｘｌに濃縮し、ヘキサン：エーテル（　
１　：　１，　　ｖ／ｖ，　２５０＊／　）で、クエン
酸化ヌクレオンドを沈澱により分離した。沈澱は遠心分
離で集め真空中で乾燥した。

二トロフエニルエステルｔ−ｉルたメニ、クエン酸化ヌ
クレオシド（　１　ｍｏｌ　）　？、ピリジｙ（０．３
ａ＋ｊ）を含む無水ジオキサン（　３　ｍｌ　）中に溶
解した。次にＤＣＣ（１０ｍｍｏｌ，　０．２２Ｆ）＞
よびｐ　−　二｝　ａフェノール（０．１４Ｐ、ｌｍｍ
ｏｌ）を添加し、溶液を２時旬振とウした。ゾシクロヘ
キシル尿素を遠心分離により除去した。アセトニトリル
：Ｈ．０（９：１，ｖ／ｖ　）中の薄層クロマトグラフ
ィーによる分析の結果、生収物のＲｆは０．８であった
。この・ノシクロヘキ７ル尿素を含有しない上澄液はシ
リカグノレに直接結合させるために用いることができる
。

この実施例の人工程で得たソリカグル（５０μｍｏｌヌ
クレオシド／２を望む場合には５　ｆ，　１００μｎｏ
ｔヌクレオンド／２を望む場合には２．５ｆ）を乾燥Ｄ
ＭＦ中に懸濁させた。ｐ−ニトロフエニルフノ・ク酸化
したヌクレオシド誘導体（上記により調製した上澄液）
をシリカグルに加え、その懸濁液を２時間振とうした。

このンリカグルの一部（約１ａｐ）Ｔｈ分析用に採取し
た。これをＤＭＦ　（　２回），メタノール（３回）お
よびエチルエーテル《２回》で洗滌した後、アセトニト
リル（　１　．ｙｔｌ　）に０．１Ｍのトルエンスルホ
ン酸を加たもの金添加した。シリカから放出されたトリ
チルは赤橙色であった。この分析は必要であれば定量的
に行うこともできる。もしこの分析結果が満足すべきも
のであれば（２ｐちトｌチル陽性テスト）、シリカケ０
ル全体ｉ　ＤＭＦ　（各１０ｍｌ，　３回）、ジオキサ
ン（各１０ｍｌ，３回）、メタノール（各ｌｏｌ＋！／
１３回）訃よびエチルエーテル（各Ｌｏｗ／，　３回）
で洗滌する。次に未反応のｎープロビルアミノシリル基
を無水酢酸（０．７！ｔ）ト乾燥ビリジン（　５　ａｔ
　）の溶液でグａノクした。シリカｒルは遠心分離によ
り単離し、上澄液をとり、メタノール（各１０ｒｔｔｔ
，　４回）′！！．−よびエチルエーテル（各１０ａ！
ｌ，　２回）で繰返し洗滌した。

ｎ−７’ｏピルアミノ基のプロッキングの完全さの測定
は以下の通りである。

以下の試料（１岬）を採る： （１）誘導体にしてない・ぐイダック（ｖｙｄａｃ　−
Ａ　）。

（２）アミノｆ．ピルトリエトキシシランで誘導体にし
たパイグック。

（３）ヌクレオシドを付加し，次に無水酢酸でブロック
した・ぐイダック。

次に各試料を０．２１９／ｔｌの硫酸ピクリルを含有す
る２５０μｔの飽和ホウ酸ナトリウムで処理した。この
試料を遠心分離した。誘導体にしない・ぐイダツクは白
いま１でなければならない。アミノデロピルシリル・ぐ
イダックは明るい赤橙色である。プロックした・ぐイダ
ックは淡い橙黄色である。これは多分硫酸ピクリルとヌ
クレオシドの環内窒素との反応によるものと思われる。

ある場合には、フノ・ク酸化したｎ−プロピルアミノ基
ぱコハク酸の存在により起こる。このフＩ・ク酸ハ、コ
ハク酸化に３いて全ての蝿水フノ・ク酸が消費されなか
った場合、あるいはクエン酸による水性抽出中にフハク
酸が除去できなかった場合に生ずる。もしフ・・ク酸化
ｎ−プロビルアミノ基が存在する場合には、次のような
方法でグロックすることができる。コノ・ク酸化ヌクレ
オシドを含む保護したシリカグル（５Ｆまたは２．５　
？　＞をＤＣＣ（０．２８Ｆ）とｐ−ニトロフェノール
（　０．　１６　Ｐ　）とを含有する乾燥ピリジン（　
５　ＦＩＥｔ　）中に懸濁させ、室温で一夜振とうした
。次にモルホリン（０．２ａ＋／）を添加し、懸濁液を
１０分間振とうした。遠心分離知よび上澄液の除去によ
りシリカグルを分離し、メタノール（各１０ｍｌ１４回
）、ＴＨＦ（各１０ｙｔｌ，　３回）ふ・よびエチルエ
ーテル（各１０Ｉ＋！／、３回）でシリカグルを洗滌し
た。空気乾燥の後シリカグルを真空中で乾燥した。

トリチルカチオンの定量分析、ヌクレオシドのシリカケ
０ルへの付与は次の通りに行なう。

ｌ．約１ｑの乾燥シリカケ９ルを正確に秤量する。

２．　　０．１Ｒｌルエンスルホン酸０７セ｝ニトリル
溶液１ｍ／１ｋ添加する。

３．　　４９８　ｎｍで吸光度を測定する。もし吸光度
が２．０に近付いた場合には希釈して再測定する。

付着量は次の式により計算する。

もし５ｆのシリカグルを使用した場合には、付着量は約
４０μｍｏｌ／Ｐである。もし２．５２のシリカグルを
使用した場合には付着量は約１００μｍｏｌ／Ｐである
。

実施例３ ０．８当量のメチルホスホａノクロリダイトフ・よび５
当量のコリジンのＴＨＦ溶液に−７８°Ｃ　テ１．０当
量の５′一〇−ジメトキシトリチルチミノンを添加する
ことにより、デオキシチミジンホスホモノクロリダイト
を合威した。生或した化合物かよびチミジン変性シリカ
グル母体はオリゴヌクレオチドの合成に使用する。第一
工程ではガラス塔にチミジン変性シリカケ１少を充填す
る。この塔には一連の弁とパイプを経てポングおよびイ
ンジェクタールーｆを取付ける。この装置は反応剤を筒
中をリサイクルさせ、渣たは排出したり採取したりでき
るようになっている。支持体に付けるチミジルチミジン
の合成工程は次の通りである。

（１）　ＴＨＦおよびコリジン中のデオキシチミ・ゾン
ホスホモノクロリダイトを変性シリカケ０ル塔に一時間
通して還元する：（２）水／２．６ルチジン／ＴＨＦ中
の０．ＯＩＭＩ，２でポリマーに支持されたジヌクレオ
ンドホスファイトをホスフェートに酸化する（３０号）
：（３）　ＴＨＦ中の７エニルイソシアネートかよび２
，６ルチノン’ｉ　１．５時間塔にリサイクルする（こ
の反応剤は、ホスホリル化してないヌクレオシドヒドロ
キシル基と反応することによる不都合を除去すル）　：
　（４）　｝ルエンスルホン酸のアセトニトリル溶液で
塔を２分間洗滌する。これらの全工程は室温で行なった
。各工程の後の各種の洗滌サイクルを含み、１つのヌク
レオチドの付加に要する時間は約４時間である。シリカ
グル母体に付けた二つのオリゴヌクレオチドａ　（Ｔ）
７およびｄ（Ｔ），の収率を良くするために、この４工
程を何回か繰返す。

上記と同様の工程はｄ（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ）を調製するために使用される。このシトシンを
含有するホスホモノクロリダイトは５′一〇−ジメトキ
シトリチルーＮ−ペンゾイルデオキシシチジンから調製
する。

実施例４ 〔支持体からオリゴデオキシヌクレオテドの除去および
生成化合物の特徴〕 オリゴｒオキシヌクレオチド（ｄ（Ｔ）７、ｄ（Ｔ）９
、ｄ（　Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ　）を保
護基から遊離させ、単離し、特徴７ｒｙＡべる。トリエ
チルアンモニウムチオフェノキシドのノオキサン溶液を
使用してホスホトリエステルからメチル基を除去する。

この工程の後，　＠ＮＨ４０Ｈで処理し、シトシ／から
Ｎ−ペンゾイル基を除去し、かつ支持体からオリゴヌク
レオチドを遊離させた。高速液体クロマトグラフィーに
よれば、各合或の主生或物は上記の七量体および各九量
体であることが解った。最初に支持体に結合してチミ・
ゾンの量から、ｄ（Ｔ），の単離収率は約２５％であっ
た。ｄ　（Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ　−Ｔ−Ｔ　）
の同様の収率ぱ約２３％であった。

九量体および七量体を生化学的に試験を行った。

これらのすべての化合物は、スネーク・ベノム（Ｓｎａ
ｋｅＶｅｎｏｍ）ホスホジエステラーゼにより完全に分
解することが解った。各九量体の合成により単離したオ
リゴヌクレオチドは、（５″−３２ｐ　）　ＡＴＰおよ
びＴ４−キナーゼを用いてホスホリル化し、次にｒル電
気泳動を行ない、後にスネーク・ペノム・ホスホ・ノエ
ステラーゼにより部分的に分解することによって分析し
た。この分析により、オリゴヌクレオチドは均一であり
、９涸のヌクレオチド単位を含有していることを確認し
た。〔５″−３２Ｐ）ｄ（ｐＴ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ　）の連続を確認するために、サンプルを二
次元ホモクロマトグラフィーで分析した。連続デａフィ
ルは期待した結果の（　ｓ’−　３２ｐ　）ｄ（　ｐ’
ｒ−ｃ−’ｒ−ｃ−’ｒ−ｃ−’ｒ−’ｒ−’ｒ　）に
一致した。最後に、〔５′一町）ｄ（ｐＴ）ｇをＴ４−
リガーゼふ・よびポリデオキシアデノシンの存在下に重
合させた結果、〔５一３２Ｐ　）　ｄ　（ｐＴ），ぱ、
ポリデオキシアデノシンにより倍量体を生成し、この倍
量体は、Ｔ　４　−　ＩＪガーゼにより確認された。従
って，　　ｄ（Ｔ），ｋよびｄ（Ｔ一Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ　）は試験した範囲に関する限り、生化
学的に活性であった。

実施例中に釦いて，シトシン、アデニン釦よびグアニン
などのアミノ基を保護する。これらの基金保護すること
は本工程において必要なことではないが、ヌクレオシド
の適宜の溶媒に対する溶解ｆｆｔ−高める。ペンゾイル
，トリチル《前記の如き》［たはイソプチリル基は適当
な保護基を形或する。

しかしこの工程を変化させずに他の基を使用することも
できる。良好な収率で生成し得る保護されたヌクレオシ
ドは５−０−ソメトキシトリチル・デオキシチミジン（
　ＤＭＴ　ｒｄ　（Ｔ）　）、５′一〇−ジメトキシト
リチルーＮ−ペンゾイルデオキシシチノン（ＤＭＴｒｄ
（ｂｚｃ））、５’−０−ジメトキシトリチルーＮ−ペ
ンゾイルデオキシアデノシン（　ＤＭＴ　ｒｄ　Ｃｂｚ
Ａ）　）、釦よび５’−０−・ゾメトキシトリチルーＮ
−イングチリルデオキシグ７ノシン（　ＤＭＴ　ｒｄ　
（ｉ　ｂＧ）　）。デオキシアｒノシンによる典型的な
合或工程は次の通りである。

実施例５ この実施例では、プリンデオキシヌクレオチドの使用に
ついて説明する。

ＤＭＴ　ｒｄ（ｂｚＡ）　（０．６６　ｆ，　１　ｍｍ
ｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３ｍｇ）に加えたものをメチルジ
クｏｏホスファイト（　０．１１３ｍＪ％１．２ｍｍｏ
ｌ）および２，４．６−　トリメチルピリジン（０．６
３３ｍｌ，　４．８ｍｍｏｌ）ｔ−含むＴＨＦ（３ｍ０
溶液中に攪拌しつつ−７８°Ｃでアルゴン雰囲気中に釦
いて滴下する。−７８°Ｃで１０分経過した後、反応液
を焼結ガラスＦ斗でｐ過し、真空中で濃縮して溶剤を除
去する。生成した粘物質をトルエン：　ＴＨＦ（２ＩＩ
１／，２：１）の混合液に溶解することによって、ａ　
Ｉ１のメチルホスホジクａリダイトを除去し、真空中で
再蒸発して粘物質を得る。ジクロリダイトの除去を確実
にするために，この工程を数回繰返す。ヌクレオンドク
クリダイトはテトラゾライドに変える。最終の再蒸発に
より得た粘物質ｆ７！−ＴＨＦ（２ｍ０に溶解する。テ
トラゾール（０．０６：ｌ’、０．９ｍｍｏｌ　）のＴ
ＨＦ　（　２ｚｌ）溶液を次にヌクレオシドホスホモノ
クロリダイトに、攪拌しつつ−７８°Ｃで滴下する。−
７８°Ｃで１０分間処理した後、溶液を遠心分離管へ移
し、低速で回転させて、上澄液を除去する。この溶液は
活性化ヌクレオシドメチルホスホモノテトラゾライな含
有する。もし直ぐに使用しない場合には、このテトラゾ
ライドは、乾燥ペンタン中に滴下して沈澱させ、沈澱を
集めて真空中で乾燥し、アルゴン１たは他の不活性ガス
と共に封管中に入れ、−２０’Ｃで貯蔵することにより
長期貯蔵が可能になる。全ての操作は酸化を防止する為
に，不活性雰囲気中にふ・いて行なう。活性剤は空気に
触れさせない。

上記の処理は活性化チミジン，デオキシシチゾンかよび
デオキシアｒノシンヌクレオチドの調製に有用である。

活性化デオキシグアノシンヌクレオチドの調製は、化学
量以外については同様である。ＤＭＴ　ｒｄ（ｉｂＧ）
　；メチルソクロロホスファイト；２，４．６−　｝リ
メチルピリ・ゾンおよびテトラゾールのモル比は１　：
　０．９　：　３．８　：　０．７である。変性シリカ
ゲル支持体に１つのヌクレオチドを付けるために必要な
工程は次の通りである。ヌクレオチドからジメトキシト
リチル基を除去するととは，変性シリカｒル支持体ｆ　
０．１ＭＺｎＢｒ２のニトロメタ／溶液に１５から３０
分接触させることにより行なう。

次に支持体をプタノール＝２１６−ルチジン：　ＴＨＦ
（４：１：５容量）の混合液で最初洗滌し，後にＴＨＦ
で洗滌する。この工程はヌクレオシドの亜鉛エステルを
除去するために使用するので，溶剤比は重要ではない。

この工程は省略できるが収率が低下する。ＢＦ３　，　
ＡＩ　Ｃ１３＞よびＴｉＣｌ４などの他のルイス酸がＺ
　ｎ　Ｂ　ｒ２の代りに使用できる。しかしＺ　ｎＢ　
ｒ２が好１しい。またプロトン酸も使用できる。

７”　ａ　｝ン酸の量をジメトキシトリチル基を除去す
るための最少限にしても、各プリンの約３〜５％の脱プ
リンが起こる。この工程の次の処理は保護され活性化し
たヌクレオチドを支持体に共有結合したヌクレオシド筐
たはオリゴヌクレオチドにすることである。これは１０
〜１５当量の活性モノテトラゾライドを用い、約１時間
反応させることにより行う。溶剤は無水ＴＨＦである。

この工程は活性化モノクロリダイト、トリアゾライドお
よび二トロイミダゾライドの付加にも使用できる。しか
し、テトラゾライドが最も区い結果をもたらす。

次の工程は未反応５゛−ヒドａキシル基のプロッキング
である。これは無水酢酸、ジメチルアミノピリジン、ピ
リジンおよびＴ｝ＩＦの溶液を使用することにより違或
できる。筐た、２，６−ルチジン／　Ｔ　Ｈ　Ｆ（ｌ：
５容量）中の０．３３Ｍジメチルモノトリアゾールホス
ファイト溶液を用いることにより達戒できる。反応時間
は５分であり、後にＴＨＦで洗滌する。

他の方法としてはフェニルイソンアネート／ルチジン（
４５：５５容ｔ）の溶液を用いて９０分反応させること
により行なう。この溶液は次にＴＨＦとアセトニトリル
とで洗滌することにより変性シリカから除去する。最初
の方法が好適である。この工程は省略することができ、
！た５゛−ヒドａキシル基に反応し化学的に同等な他の
物質で置き換えることもできる。しかしこの工程を実施
することによって、所望のオリゴヌクレオチドの最終精
製が容易になる。このことは、支持体に対する全合成物
質の結合がかなり少なくなるからである。各サイクルの
最終工程はホスファイトヲホスフェートに酸化すること
である。種々の比率のものが使用できるが０．１ＭＩ２
の水／２．６ルチジン，／ＴＨＦ（１　：　１　：　３
　）溶液が好適である。更にＮ−クロ口スクシンイミド
又はアリールあるいはアルキル／４’−オキシドなどの
他の酸化剤も使用できる。ｔ−ブチル・ぞーオキンドは
酸化剤として好筐しい。所定の工程により適宜の活性化
ヌクレオチドを付加した後、上記のｄ（Ｔ），の合或に
記載した如くにして支持体からデオキシオリゴヌクレオ
チドを除去する。

本明細書に釦ける式■の化合物は、窒゛素複素環式化合
物の第二級アミノ窒素のＨ原子を除去して生戊した第二
級アミノ基Ｘを有する新規な化合物であり、必要なリン
化合物を生成するために一部有用である。これらの化合
物は、反応性があり、従ってＸがハａケ゛ンである同様
の化合物よりも有効である。これらの化合物はＸがハａ
）ｆンである化合物から容易に調製することができる（
例えば実施ｆＩ１５に記載したように）。１たは所定の
ヌクレオンドとハａ（２’アミノ）一アルコキシホスフ
インとの反応で得ることができる。

以下の実施例に複素環式アミノホス７イ／化合物の用途
を例示する。特に実施例５においてはテトラゾライドの
調製かよび必要なリン酸結゜合の生或に釦ける使用につ
いて説明する。

本発明の方法を採用することにより、各種のヌクレオン
ドと共にテトラゾール，ニトａイミダゾール督よびトリ
アゾールを用いて、種々の化合物が得られ、対応するヌ
クレオシドホスホノモノアミンｔ−得る。特にこれらの
化合物はヌクレオシドベースのチアミン、シトシン、ア
デノシンおよびグアニンを含み、必要があればプ０７キ
ング基飼えばシトシンとアデニンのアミノ基に対十るベ
ンゾイル基、グアニ／のアミノ基に対するインプチリル
基などで保護される。

実施例６ 本実施例はプリンデオキシスクレオチドノ使用について
説明する。

Ａ．ＨＰＬＣ級（Ｄシリカ’ｙ”ル（２ｆ，ハ，（ダノ
ク↑Ｐ　−　２０１分離用、表面積１００ｔｙ／／ｆ、
細孔径３００　芙、粒径２ｏμｍ）を約２４時間相対湿
度１５％（飽和ｔ，ｔｅｌ）に接触させた。次にシリカ
（２．Ｏｆ）を２０°で１２時間３−トリエトキシシリ
ルデロピルアミン（２．３ｔ，　０．０１Ｍ｝ルエン溶
液）で処理し、ドリエライト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　）乾
燥管により１２時間還流した。この反応は磁気攪拌棒で
はシリカｒルを粉砕してし１うので振とぅ機で行なった
。シリカは遠心分離により分離し、トルエン，メタノー
ルおよびエーテルで各２回づつ洗滌し、次に空気中で乾
燥させた。

Ｂ．　このようにして生成したシリカ（２？）とフノ・
ク酸（　２．５　？１０．０２５Ｍ）　ｉ水中で攪拌し
カルボン酸基を導入した。２ＭＮａＱ｝ｉを添加するこ
とによりｐｌ｛１ｋ２〜６に調節した。カル♂キシル化
反応の進行状態ハピクラートサルフェートテストにより
試験した。シリカの一部（約２η）を０．５ｘｔｌの０
．１Ｍピクラートサル７エート飽和ホウ酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０）で処理した。最初のシリカは１０分以
内に淡黄色になったがアシル化した生或物は白い１プで
あった。無水コノ・ク酸反応は、ピクラートサル７エー
トテストでシリカｒルが白いま普になる壕で継続した。

通常全反応時間は１時間であり、二度目の無水コノ＼ク
酸の添加が必要であった。順次に２回づつ、水，０．１
Ｍ｝ＩＪクロロ酢酸、水、メタノールおよびエーテルで
生成物を洗滌した後、この化合物２を空気中で乾燥し、
真空中で乾燥し、更に２５°Ｃで２４時間、トリメチル
シリルククリド（１．２５ｍ／、０．０１　Ｍ　）　？
含むピリジン（７ａｔ／）で処理し、その生成物をメタ
ノール（４回）およびエーテルで洗滌した。カルポキシ
ル化の程度の分析は２工程からなる。試料の一部金正確
に秤量し，ゾシクロヘキシルカルゴジイミド（ＤＣＣ）
およびＰ−ニトロフェノールのピリノン溶液で処理する
。テトラヒド口フランで数回洗條して未反応ｐ−ニトロ
フェノールを除去した後、シリカｒルに１０％ピペリノ
ンのピリジン溶液を添加し遊離したｐ−二｝ｏ７エノー
ルの量を、ｐ−ニトロフェノキシドの吸収率として１．
５７　Ｘ　１０’を用いて４１０ｎｍで測定した。カル
村ン酸の付加量は２００μｍｏ　ｌ　／　ｆであった。

Ｃ．　　ＤＣＣを使用し、デオキシヌクレオンドを前記
生成物と混合した。乾燥ピリジン（２１Ｉ＋！／）中で
５″一〇−ジメトキシトリチルチミジン（　１．１　？
、２．１６ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ　（２ｆ１０，Ｏｌｍｏ
ｌ　），＄−よび２（４タ、０．８ｍｍｏｌカルボン酸
）を２日間攪拌した。更にｐ−ニトロフェノール（１．
１’、０．０１ｍｏｌ）ｅ添加し，その混合物を更に１
日間攪拌し、モルホリン（ｌｍ／，０．０１１ｍｏｌ）
で反応を停止した。メタノールおよびエーテルで洗滌し
た後、シリカグルの未反応カルポン酸を分析した。通常
最初のグロッキング処理で残っている微量の遊離カルポ
ン酸（（　１０μｍｏｌ／Ｓ’）を完全にプロックする
ためにＤＣＣ　（　２　ｆ％０．０１ｍｏｌ）ふ・よび
ｐ−ニトロフェノール（１．４ｆ，　０．０１ｍｏｌ）
乾燥ピリノン（２Ｑ１！Ｌｔ）溶液釦よび最後にモルフ
ォリン（ＩＪ！０を用いる二次処理が必要であった。

５’−０−ノメトキシトリチルチミジン、５″一〇−ジ
メトキシトリチルーＮ−ペンゾイルデオキシシチノ７．
５’−０−ノメトキシトリチルーＮ−インプチリルデオ
キシグアノシンおよび５’−０−ノメトキシトリチルー
Ｎ−ペンゾイルデオキシアデノシ／を以下の方法により
必要なホスホリルクロリド基を導入して活性ヌクレオシ
ドに変えた。

５′一〇一ジメトキシトリチルチミジン（１．６ｆ、２
．９ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン（５ｍ／）溶
液を、ＣＨ３０ＰＣＩ２（０．３３１Ｉｔｌ，　２．５
ｍｍｏｌ　）およびコリジン（　１．８６ｍ／，１４．
１　ｍｍｏｌ　）の無水テトラｔ：　｝ｏ７ラン（５ｊ
！／）溶液中に−７８°Ｃで攪拌しつつ滴下した。滴下
中に白色の？：Ｊ：．澱が生じた。混合物を−７８°Ｃ
で１５分間攪拌した後、焼結ガラスＦ斗でＦ遇してコリ
ノンハイドロクａリドを除去した。コリ・ノンハイドロ
クａリドは無水テトラヒドロフラン（ｌｆｆｉ０で洗滌
した。Ｆ：ａ．を次に乾燥トルエンで希釈し粘物質にな
るまで濃縮した。乾燥アルゴンを装置に入れた後，トル
エン：テトラヒドロフラン（２：１）の溶液を加えて粘
物質が溶液中に完全に溶解する普で放置した。溶媒は真
空中で濃硝して除去した。

トルエンとテトラヒド口フランを用いる再濃縮を３回繰
返した。最後の＠縮の後、粘物質を乾燥テトラヒドロフ
ラン（３ｍＯに溶解し、−７８°Ｃ．に冷却し、テトラ
ゾール（０．１８Ｐ，　２．６ｍｍｏｌ　）の無水テト
ラヒドロフラン（３ｍ７！）溶液を滴下した。この添加
中に、フリジン・・イドロクロライドの白色沈澱が生成
した。この混合物を−７８°Ｃで更に１０分間攪拌し、
次にアルゴンを満した遠心分離管に、アルゴンの圧力と
注入管を用いて混合物を移した。

遠心分離の後に回収した上澄液はテトラゾリルホスファ
イト生成物を含有しており、デオキシオリゴヌクレオチ
ドの合成に直接使用することができる。壕た、テトラゾ
リルホスファイトは沈澱として保存し必要に応じて再生
成することができる。

前記のホスファイトすなわち、活性化ヌクレオチドぱ添
付図崩に示した自動化装置によってデオキシオリゴヌク
レオチド金合成するために使用することができる。

〔デオキシオリゴヌクレオチドの合成〕装置ハミルトン
・ａイ・ミニポンプ、アルテックス（Ａｌｔａｘ）三方
スライド弁、リサイクル弁（アルテックス弁の変形）か
よび注入ループ（アルテックス三方弁）からなる。全て
の結合はテフロン管で行い、リサイクル系中の管の容量
を最少にしてある。塔は１１ｗｍのエース（Ａｃｅ）ガ
ラスカラムであり、１−の容積になるように短くしてあ
る。シリカ層ｋ支持するためにセルロースフィルターを
使用した。使用する前に、無水酢酸かよびピリジン（１
：１容量）の混合液を用い、５０°Ｃで４時間フィルタ
ーをアセチル化した。この装置のリサイクル系の全容量
は約２．５ｘｔｌであった。テトラヒドロフラン容器は
窒素泡立器によって空気から遮断し、Ｚ　ｎ　Ｂ　ｒ２
溶液ぱドリエライト（　Ｄｒｉｅｒｉｔｅ　）管により
湿気から保護した＠ シリカに１つのヌクレオチドを付加するために行なうべ
き各種の化学操作を次の表■に示す。

０．２５ｔの３　（　１０／ｊｍｏｌチミノン）をカラ
ムに供給し、シリカをニトロメタンで洗滌した。飽和Ｚ
　ｎ　Ｂ　ｒ２（約０．１Ｍ）のニトロメタン溶液ｆ　
ｌ　！ＩＬｔ／　ｍ　ｉ　ｎのボンｆ流速で供給してカ
ラムをフラッシングし（３０分間）、ｓ’−ｏ−・ノメ
トキシトリチル基を除去した。

保護基の離脱状態は、淡橙色のジメトキシトリチルカチ
オンの生成を肉眼あるいは分光分析により測定すること
により追跡した。４９８　ｎｍで吸光度を測定すること
により、前の縮合工程の完全さを測定した。この工程に
続いてｎ−ブタノール：２，６−ルチジン：テトラヒド
ａフラン（４：１：５）の溶液で５分間流速：　２１Ｉ
ＬＩ１！／　ｍｓｎで洗滌した。次の工程では乾燥テト
ラヒドロフランで５分間（５ｘｌ／ｍｉｎ）洗滌した。

この洗滌工程の間、リサイクル弁かよび注入口に乾燥テ
トラヒドロフランを流し、この洗滌の効果を２５４ｎｍ
で分光光度計を用いて試験した。

次に、乾燥テトラヒドロフランを使用して再生した活性
ヌクレオチドを用いて縮合工程を完了した。

再生物の溶液はアルゴン中でドライアイス／アセトン浴
中に保存したが縮合反応は室温で行なった。

再生した場合に、活性ヌクレオチドをこのようにして保
存すると数日間安定である。０．５から０．８ｍｌのテ
トラヒドロフラン中の約１０当量の活性ヌクレオチド（
　０．２５　ｆの４に対し１００μｍｏｌ）を装置に注
入し、機器をリサイクルモードに切換えた。活性ヌクレ
オチドはポンプ速度２　ａｔ／　ｍ　ｉ　ｎで１時間シ
リカｒル中を循環した。活性ヌクレオチドの一部を無水
メタノールかよび水の中へ採取した。前記のような分析
により、系中に活性ヌクレオチドが存在するか否かを示
した。通常は存在するが、時には（約１０回に１回）、
デオキシヌクレオチドのビスメチル，ホスファイトはこ
の分析では観察されない。その場合には、不完全な反応
を防止するために，縮合工程を反復する。次の工程では
、ジエトキシトリアゾイルホスフィン（０．３Ｍのテト
ラヒドロフラン溶液１ｘ／）を活性ヌクレオテドの溶液
に直接添加して、ポンプ速度２ｍｔ／ｍｉｎで５分間リ
サイクルモードを継続して、未反応の５′一〇−ヒドロ
キシルのキャッピング（　ｃａｐｐｉｎｑ　）　ｔ−行
なう。

残余の活性ヌクレオチドおよびキャッピング剤ハ、テト
ラヒドａ７ラン（５ｘｌ／ｍｉｎで２分間）ｆ！−使用
して装置から流す。この工程の次に，０．２ＭのＩ２を
含有するテトラヒドロフラン：２，６−ルチジン：水（
２：１：１）の溶液を使用してホスファイトの酸化を行
なう。この溶液を５分間（　２ｒｎｌ／　ｍｉ　ｎ　）
装置へ流す。最後に、乾燥テトラヒドロ７ランを３分間
（５ｍｌ７ｍｉｎ）およびニトロメタンを２分間（５ｔ
ｔｌ／ｍｉｎ）系に流すことによりサイクルを完了する
。

このサイクルは、所望の処理を完了するために適宜の回
数繰返見す。

（ｒオキシオリゴヌクレオチドの単離〕以下の方法によ
り完全に保護を外したデオキシオリゴヌクレオチドを単
離した。保護された形態のデオキシオリゴヌクレオチド
トリエステルヲ含有するシリカケ０ルの一部（ｌｏｗ）
ｔ先ずチオフェノール：トリエチルアミン：ジオキサン
（１：１：２、ｖ／ｖ）で処理する。４５分間緩慢に振
とうした後、遠心分離によりシリカグルを回収し、メタ
ノール（４回）かよびエチルエーテルで洗滌した。空気
乾燥の後、２０’で水酸化アンモニウムにより３時間処
理し、遠心分離することによって、支持体からｒオキシ
オリゴヌクレオチドを除去した。塩基性保護基は、封管
内で上澄液ヲ５０°で１２時間加温することによって除
去した。５’−０−ジメトキシトリチルデオキシオリゴ
ヌクレオチドは、加水分解物を真空中で！ＩＩＬ、残渣
を０．１Ｍ｝リエチルアンモニウムアセテート（ｐｌ｛
７．０）に溶解し、その物質″ｋ　Ｃ１８逆相高速薄層
クロマトグラフィーカラム（ウォーター・アソシエーツ
（　ｗａｒ：ｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　）で分離す
ることにより得た。溶出緩衝液は２６％のアセトニトリ
ルを含有スるトリエチルアンモニウムアセテートであっ
た。５’−０−ジメトキシトリチルデオキシオリゴヌク
レオチドを含有するピークを真空中で濃縮し残留物を酢
酸一水（４：ｌ％ｖ４）の混合液を用いて２０’で１５
分間処理し、５’−０−ジメトキシトリチル基を除去し
た。完全に保護を取り去ったデオキシオリゴヌクレオチ
ドは、真空中で酢酸溶液を濃縮し、残留物’ｉ２５ｍＭ
の重炭酸トリエチルアンモニウム（　ｐＨ　７　）に溶
解し、水飽和エーテルでジメトキシトリタノール（　ｄ
ｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔａｎｏｌ　　）を抽出するこ
とにより得た。

〔デオキシオリゴヌクレオテドの特定〕各デオキシオリ
ゴヌクレオチドの５ａ−ヒドロキンルヲ〔ミ″−３２Ｐ
）ＡＴＰ釦よびＴ４−キナーゼを用いてホスホリル化し
た。ホスホリル化反応に使用したデオキシオリゴヌクレ
オチドの量は、吸光度を測定し、淡色効果がデオキシオ
リゴヌクレオチドにはないものとして吸光係数計算値を
使用した。

１０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）Ｔｈ
溶出剤として使用し、Ｇ−５０−４０セファデックス（
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）カラムで脱壇することにより、
過剰のＡＴＰからホスホリル化オリゴヌクレオチドを分
雛した。標準方法により、ポリアクリルアミド上でのｒ
ル電気泳動かよび二次元分析金行った。

（　ａ（ｃ−ｃ−Ｔ−ｃ−ｘ−ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ）の
合或〕５−０−ノメトキシトリチルチミジン（　０．２
５　ｆ，５０ｍ／ｆ）で変性したシリヵｒルをカラムに
供給し、シリカケ゛ルをニトロメタンで洗滌し、５″−
ジメトキシトリチル基ｔ”　ＺｎＢｒｚで除去すること
によりサイクルを開始した。各縮合中に，前記のように
約１０倍ｔの活性ヌクレオシドホスファイ｝（０．１ｍ
Ｍ）を使用して伸長した。合成はデオキシオクタスクレ
オチド、ｄ（’ｒ−Ｃ−Ａ−Ｃ”Ａ−Ａ−’ｒ−Ｔ）が
完成する１テＨｈｃした。この点で、シリカｒルをほぼ
等しく二分割した。一方ハ標準的方法でｒオキシデヵヌ
クレオチド壕で延長した。支持体に結合している・ノメ
トキシトリチル基の量に基く全収率は６４％であり、逆
相高速液体クロマトグラフイーカラムからｆ＋離された
ものの収率は３０％であった。

（　ａ（Ａ−ｃ−ｃ−ｃ−Ｔ−ｃ−Ａ−ｃ−ｘ−Ａ−Ｔ
−Ｔ）　）ｄ（Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ）の残
部は標準的方法で伸長し、デオキシドデヵヌクレオチド
を生成した。支持体に結合したジメトキシトリチル基に
基く全体収率は５５嘩であった。単離収率は正確に測定
できなかった。

上記の工程により、次のオリゴヌクレオチドを調製した
。

５　’　−ｄ　（　Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｔ−Ｇ　）５　’　−ｄ（Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ
−Ｇ−Ａ＜−Ｔ）５　’　−ｄ　（Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ　）５’−ｄ（Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−’ｒ−Ａ）５’−ｄ（Ａ−Ｔ−Ｇ
−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ）５’−ｄ（Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ
−’１’−Ｇ−Ｃ）５’−ｄ（Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−Ａ）５●−ｄ（Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ
−Ａ−Ｇ）５’−ｄ（Ｇ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ
−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ）５’−ｄ（Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ
−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ）一連の工程中の所望の点に
所望のヌクレオシド部分を入れるという簡単な方法によ
り、前記実施例の方法は、混合ヌクレオシド、デオキシ
ヌクレオシド、オリゴヌクレオシドなどを合成するため
に使用できる。従って、この方法は、各ヌクレオシドの
連続からなるオリゴヌクレオチドの製造に有用であるば
かりではなく、天然物として未知の合或オリゴヌクレオ
チドｔ−調製する場合にも使用できる。これらはポリヌ
クレオチドの研究釦よび８−戊に、場合によっては生物
学上のシステムで用いる遺伝子の製造に使用することが
できる。

本発明の好壕しい実施例は、ぎー〇−トリチルヌクレオ
ンド、ｒオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オ
リゴデオキシヌクレオチド、ポリスクレオチド訃よびポ
リデオキシヌクレオチドの脱トリチル化をルイス酸、特
に臭化亜鉛を用いて行うことであるが、例えば、四埴化
チタンなどの他のルイス酸も使用することができる。５
’−０一位置からトリチル基を除去する場合に、ルイス
酸はプロトン酸よりも好適である。これは、反応が非常
に速くかつ脱プリンが起こらないからである。この方法
＃ｉ５’−０−｝リテル基に対して特定的であるから、
３’−０釦よび５′−６−ジトリチル化合物と反応させ
ることにより３’−０−｝リテル保謹ヌクレオシドを製
造することができる。

本方法においては、単に反応物質を、望筐しくは溶媒中
で、接触させることが必要であり、脱トリチルは短い反
応時間中に起こる。ルイス酸は通常反応溶媒中に懸濁し
ており、溶媒は、ルイス酸と反応してプロトン酸が生ず
ることを防ぐために水を含有しない。現在の経験から言
うと、例えば，ジオキサンシよびテトラヒドロフラン、
それらの混合物、その他アセトン、メチレンクロリドな
どの各種の溶媒を使用することができるが、ニトロメタ
ンが好適な溶媒である。

脱トリチル速度を測定し、その比較データを表■に示す
。

各種のトリチルチミノンに臭ｆヒ亜鉛を室温で用いた場
合の結果を表Ｖに示す。

更に０°Ｃの結果を表Ｖに示す。

脱トリチルはポリマー支持体合成のみに限定されるもの
ではなく、反応中にトリチル基の使用が含オれる溶液合
成工程においても有用である。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明を実施するための装置の系統図である。 １０・・・・カラム； １２・・・・シリカｒルマトリックス １４．２Ｂ　．　４２　，　５０　，　５２　．　５４
・・・・・弁１５　．　１５’，　１５”・・・・・制
御装置１６　，１８，２０．２２，２４　，２６，３０
，３２，３４，３６　，　３８　，　４０　，　４４　
．　４６　，　４８・・・・・容器５６・・・・・ポン
プ ５８・・・・・紫外線検出機

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造方法、 （イ）ポリマーをカップリング剤−ポリマーに変性し、 （ロ）カップリング剤−ポリマーとヌクレオシドとを結
   合させてヌクレオシド−変性支持体を生成し、 （ハ）ヌクレオシド−変性支持体を活性化して、ヌクレ
   オシド−変性支持体に対するヌクレオチドのカップリン
   グに供し、さらに （ニ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
2. （２）保護基はジメトキシトリチルである特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。
3. （３）カップリング剤の存在下に、ヌクレオシド−変性
   支持体に更にヌクレオチドを添加し、かつ変性支持体上
   のヌクレオチドの未反応ヒドロキシル基を保護基で保護
   することからなる特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造に使用する変性無機ポリマ
   ー支持体の製造方法、 （イ）ポリマー支持体を供給し、 （ロ）ヌクレオシド上の反応基と反応し得る反応基を有
   するカップリング剤を使用し、該ポリマー支持体を該カ
   ップリング剤で処理し、 （ハ）処理したポリマーをヌクレオシドまたは保護ヌク
   レオシドと結合し、ヌクレオシド−支持体あるいは保護
   ヌクレオシド−支持体からなる変性無機ポリマー支持体
   を生成する。
5. （５）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造方法、 （イ）ポリマーを準備し、 （ロ）該ポリマーにアミノ基を有する化合物を反応させ
   てアミノポリマー支持体を生成し、 （ハ）該アミノポリマーをアミノ結合ジメトキシトリチ
   ルポリマー支持体に変性し、 （ニ）ポリマー支持体からジメトキシトリチル基を除去
   し、 （ホ）得られた支持体にヌクレオチドをカップリングさ
   せ、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
6. （６）カップリング剤の存在下に、得られた支持体にヌ
   クレオチドを添加することからなる特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。
7. （７）工程（ニ）および（ホ）を反復して、既にカップ
   リングされたヌクレオチドに追加のヌクレオチドをカッ
   プリングすることからなる特許請求の範囲第５項に記載
   の方法。
8. （８）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造に使用する変性無機ポリマ
   ー支持体の製造方法、 （イ）ポリマー支持体を準備し、 （ロ）ヌクレオシドの活性化エステルを準備し、 （ハ）ポリマー支持体とヌクレオシドの活性化エステル
   を結合してポリマー支持ヌクレオシドを生成する。
9. （９）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用い
   るオリゴヌクレオチドの製造方法、 （イ）ポリマーを準備し、 （ロ）該ポリマーをアミノポリマーに変性し、 （ハ）ヌクレオシドを準備し、 （ニ）アミノポリマーとヌクレオシドとを結合してヌク
   レオシド変性支持体を生成し、 （ホ）ヌクレオシド変性支持体にヌクレオチドを結合し
   、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。
10. （１０）下記の工程からなる、ホスファイト化合物を用
    いるオリゴヌクレオチドの製造方法、 （イ）デオキシヌクレオシドを準備し、 （ロ）該デオキシヌクレオシドを処理してデオキシヌク
    レオシドの活性化エステルを生成し、 （ハ）アミノポリマー支持体を準備し、 （ニ）アミノポリマー支持体と活性化デオキシヌクレオ
    シドエステルとを結合してデオキシヌクレオシド変性支
    持体を生成し、 （ホ）デオキシヌクレオシド変性支持体にヌクレオチド
    を結合し、さらに （ヘ）反応生成物からオリゴヌクレオチドを単離する。