JPS63196267A - サ−マス属に属する新菌株、新規なβ−ガラクトシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なβ−ガラクトシダーゼを産生ずるサーマ
ス属に属する新菌株及び新規なβ−ガラクトシダーゼ並
びにその製造法に関する。

〔従来の技術〕

β−ガラクトシダーゼは、ラクトース（乳Ｆｉ）をグル
コースとガラクトースとに分解する酵素であり、乳糖分
解乳又は乳糖分解液などの食品の製造に利用されている
。このβ−ガラクトシダーゼは動植物をはじめとして、
かび、酵母、細菌などの微生物に至るまで広く存在する
が、現在、食品工業で使用されている酵素は主としてか
びあるいは酵母に由来する比較的耐熱性の低いβ−ガラ
クトシダーゼである。これらのβ−ガラクトシダーゼに
ついては背公昭５３−２４０９４号公報（先例１）、特
開昭５２−４４２８７号公報（先例２）に開示されてい
る。

一方、耐熱性を有するβ−ガラクトシダーゼについては
、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリン
グ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎ
ｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ）＋　２６巻、　１１４１真、　
１９８４年（先例３）、ジャーナル・オブ・アプライド
・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）＋　２巻。

３９０頁、　１９８０年（先例４）、カナディアン・ジ
ャーナル・オブ・マイクロバイオロジー（ｃａｎａｄｉ
ａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）＋
　２２巻、８１７頁、　１９７６年（先例５）、特開昭
５６−１５４９９１号公報（先例６）及びジャーナル・
オブ・バタテリオロジ−（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）＋　１１０巻、６９１頁、　１９
７２年（先例７）に開余されている。しかしながら後述
するように（第２表参照）、これら従来のβ−ガラクト
シダーゼはいずれもが、低い耐熱性、至適ｐＨ域の狭小
あるいは反応生成物による酵素作用の阻害の１以上を有
している。従って実用に供されていないのが実情である
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述のように、現在工業的規模で食品の製造に使用され
ているβ−ガラクトシダーゼは比較的耐熱性が低い酵素
である。このため乳糖分解処理工程は一？一般に５５℃
以下で行なわれており、また、原料である牛乳又は乳糖
液が細菌の栄養源として良好なものであるため、処理中
の雑菌汚染による腐敗及び固定化されたβ−ガラクトシ
ダーゼにあっては、製造終了後充分な洗浄殺菌ができな
い等、製造上の重大な問題となっている。こうした問題
を解決するため、耐熱性β−ガラクトシダーゼを用いて
雑菌が増殖し難い高温での目的物の処理、あるいは洗浄
、殺菌が望まれており、工業的に使用しうる耐熱性β−
ガラクトシダーゼの開発が強く要望されている。

このような要望に対処するため、前記のように耐熱性の
β−ガラクトシダーゼを検索する試みがなされ、種々の
耐熱性β−ガラクトシダーゼが発見された。しかしなが
ら、従来得られた耐熱性β−ガラクトシダーゼには工業
的に使用する上で必要と考えられる次の■〜■に記載す
る酵素学的性質をすべて備えたものは存在せず、未だ実
用化の域には達していない。

■　耐熱性が充分であること：牛乳および脱脂乳の熱凝
固は７８〜８０℃でおこるため、酵素処理はこの温度以
下で可及的に高温であることが望ましい。従って７０〜
７５℃付近での酵素の熱安定性が充分であることが要求
される。

■　中性〜酸性に至適温度を有すること：β−ガラクト
シダーゼによる加工の対象となる原料としては、牛乳、
脱脂乳、チーズホエー、乳糖液等が想定される。これら
は中性（ｐＨ６，５）〜酸性（ｐＨ４，５）の原料であ
るから、その範囲で充分な酵素活性を有することが要求
される。

■　反応生成物による酵素活性の阻害度が低いこと：β
−ガラクトシダーゼを乳糖に作用させたときの反応生成
物であるガラクトースおよびグルコースによる酵素活性
の低下が少ないことが要求される。

本発明者等は上記の性質を有するβ−ガラクトシダーゼ
を創製することを企図し、そのようなβ−ガラクトシダ
ーゼを産生ずる微生物を自然界から純粋に単離すること
を試みた。その結果、多数のβ−ガラクトシダーゼを産
生ずる微生物の中から高度好熱菌の一種であるサーマス
属に属する微生物が上記の性質を有するβ−ガラクトシ
ダーゼを産生す４・ことを見出し、本発明を完成した。

〔発明の目的及び要約〕

本発明の目的は高い耐熱性を有し、中性から酸性領域に
至適ｐＨを有し、かつ反応生成物による酵素活性の低下
が少ない新規なβ−ガラクトシダーゼ（以下、本酵素と
記載する）を産生ずる新規な微生物を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、本酵素及び本酵素を製造する方法
を提供することにある。

本発明は７５〜８５℃の至適作用温度を有し、４．５〜
６．５の至適ｐＨを有し、かつ５０ミリモルのガラクト
ース及びグルコースによって酵素活性が実質的に低下し
ない新規なβ−ガラクトシダーゼを産生ずることを特徴
とするサーマス属に属する新菌株、７５〜８５℃の至適
作用温度を有し、４．５〜６．５の至適ｐＨを有し、か
つ５０ミリ毎ルのガラクトース及びグルコースによって
酵素活性が実質的に低下しないことを特徴とする新規な
β−ガラクトシダーゼ及び７５〜８５℃の至適作用温度
を有し、４．５〜６．５の至適ｐＨを有し、かつ５０ミ
リモルのガラクトース及びグルコースによって酵素活性
が実質的に低下しない新規なβ−ガラクトシダーゼを産
生ずるサーマス属に属する菌株を培養し、β−ガラクト
シダーゼを採取することを特徴とする新規なβ−ガラク
トシダーゼの製造法である。

〔問題を解決するための手段〕

＋１）微生物の取得 本発明者等は、全国各地の土壌からバージエズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａ−
ｔｉｃ　Ｂａｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第１＠（以下マニュ
アルと記載する）に従ってβ−ガラクトシダーゼを産生
ずることが知られている微生物を多数分離した。

そして、それらの微生物を培養し、β−ガラクトシダー
ゼを産生せしめ、培地からβ−ガラクトシダーゼを単離
し、その理化学的性質について検討した。その結果、目
的とするβ−ガラクトシダーゼを産生ずる３菌種ＺＫ−
００１，ＺＫ−００２及びＺＫ−００３を分離し、これ
らを前記マニュアルに従って同定すると、いずれも好気
性無胞子桿菌で、運動性がなく、グラム染色陰性、カフ
ラーゼ陽性であり、生育温度４０〜８０℃、生育適温６
５〜７５℃、生育至適ｐＨが中性付近であることから、
サーマス属に属する微生物であることは明らかであり、
また２％ＮａＣｊ！含有液体培地での生育及び糖の資化
性より公知のサーマス属に属する微生物とは異なる新規
な微生物と判定された。本発明者等はこれらの微生物を
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託し、サーマス・
エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ、　）　ＺＫ−００１
について微工研菌寄第９１８４号、サーマス・エスピー
（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ、　）　ＺＫ−００２について
微工研菌寄第９１８５号及びサーマスーエスピー（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ　ｓｐ、）ＺＫ−００３について微工研菌寄
第９１８６号なる寄託番号が付された。これらの微生物
の菌学的性質は第１表に示すとおりである。

傘リトマスミルクを除き、次の組成の培地（ｐＨ７，６
）を基礎培地として使用した。

０、１％酵母エキス、０．１％トリプトン、１０．０％
の無機塩液（溶液１β中に１．０ｇニトリロ三酢酸、０
．６ｇ　ＣａＳＯ４・２Ｈｚ０．１．Ｏｇ　Ｍｇ５ｏ、
、　４７Ｈｚ０゜０．０８ｇ　ＮａＣ１、１，０３ｇ　
ＫＮＯ３，６，８９ｇ　ＮａＮＯ３，１，１１ｇ　Ｎａ
２ＭｏＯ４を含む）、１．０％の塩化第二鉄溶液（溶液
ｌｌ中に０．２８ｇ　ＦｅＣ１３−６ＨｚＯを含む）、
ｉ、ｏ％の微量元素液（溶液１１中に０．５　ｒａｔ　
ＨｚＳＯ＊。

２．２ｇ　Ｍｎ５Ｏｔ　ｌ　ｕ２ｏ、　　０．５ｇ　Ｚ
ｎ５Ｏｔ　・７ＨｚＯＩ０．５ｇＨＪＯ３，０，０１６
ｇ　　Ｃｕ５Ｏｔ　”　５ｆｂＯ９０，０２５ｇ　Ｎａ
２ＭｏＯ４・２Ｈｚ０．０．０４６ｇ　ＣｏＣ１ｚ　　
・６１ｚＯを含む）、０．００１％チアミン塩酸塩、０
．００１％ニコチン酸アミド、０．００１％ビオチン、
０．００１％バラアミノ安息香酸 （２）本酵素の取得 本酵素産生菌を後述する培地に接種し、５０〜８０℃よ
り好ましくは、６５〜７５℃にて１２〜４８時間好気的
に培養する。

培地としては、炭素源、窒素源の他、必要に応じて、無
機塩、微量栄養素を含んでいる。炭素源としては、従来
公知の各種材料を使用することができ、例えば、グルコ
ース、マルトース、シュクロースあるいは可溶性澱粉な
どを典型例として例示できる。また窒素源としても特に
制限はなく、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカー、アミノ酸液、大豆粕などの有機能窒
素、あるいは硫安、尿素、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウムなどの無機能窒素などが安価かつ入手容易なも
のとして例示できる。尚有機態窒素源は炭素源となるこ
とはいうまでもない。更にこのような炭素源、窒素源の
他、一般に使用されている各種の塩、例えば、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタ
ミンなどを添加することも可能である。好適な培地を例
示すれば０．２％のグルコース、０．２％の酵母エキス
、０．２％のトリプトン、１０．０％の無機塩液（溶液
１１中に１．０ｇ−＝−トリロ三酢酸、０．６ｇ　Ｃａ
５Ｏａ　・２１１ｇ０．１．０ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈｚ
Ｏ，０，０８ｇ　ＮａＣｊ！、　　１．０３ｇ　　ＫＮ
Ｏ３゜６．８９ｇ　ＮａＮ０：＋、　　１．１１ｇ　Ｎ
ａｚｌｌＰＯ４を含む）、１．０％の塩化第二鉄溶液（
溶液１１中に０．２８ｇ　ＦｅＣ１３・６）１□０を含
む）、１．０％の微量元素液（溶液１１中に０．５　ｔ
Ｍ　ＨｇＳＯ４，２，２ｇ　Ｍｎ５Ｏａ　・ｌｈｏ、　
０．５ｇ　ＺｎＳＯ４・７１１ｚＯ１０，５ｇ　ＩＩＪ
Ｏ３１０，０１６ｇ　　ＣｕＳＯ４−５！１．０．０．
０２５ｇ　ＮａｚＭｏＯａ　　’　２ＨｚＯ，０，０４
６ｇ　Ｃｏ（ｌ　ｚ・６８２０を含む’）　、０．００
１％のチアミン塩酸塩、０．００１％のニコチン酸アミ
ド、０．００１％のビオチン、０．００１％のパラアミ
ノ安息香酸を含有し、そのｐＨをＮａＯＨによりｐＨ７
，６に調整した液体培地である。本酵素の分離精製は例
えば次のようにして実施することができる。まず培養液
中の菌体を遠心分離、濾過などで集菌し、得られた菌体
を緩衝液（例えば、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，０）
中で常法により破砕して抽出処理する。その抽出液の上
清をとり、常法のイオン交換、ゲル濾過等のクロマトグ
ラフィーにかければ、本酵素が得られる。

本酵素の好ましい取得法を例示すれば、次の通りである
。サーマス・エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐ、）ＺＫ
−００１を例えば上記のような培地５１に植菌し、７０
℃にて２４時間好気的に培養して得られる培養液を１２
．０００ｇ、　　２０℃にて３０分間遠心分離し、菌体
を集菌し、５５ｇの菌体を得た。

この菌体に約３００　ｍＺの抽出用リン酸緩衝液（１０
ｍＭ　　ｐ　Ｈ７，０）を加え、ミルにより磨砕し、酵
素を抽出した。抽出液を４０．０００ｇ、　　６０分間
遠心し、上清を採取した。沈澱に更に２００　ｔｎｌの
上記抽出用リン酸緩衝液を加え、再度抽出した後、同様
に遠心し、上清を採取した。これを最初の上滑に合わせ
、粗酵素抽出液４８０　ｍＺを得た。この粗酵素液に硫
酸アンモニウム１８７ｇを加え６０％飽和とし、１晩静
置し、沈澱を生成せしめた。

沈澱を３０，０００ｇ、　　６０分間の遠心分離により
集め、約２００　ｒＩｉの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）に溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析し
た酵素液中の沈澱を４０，０００ｇ、　　６０分間の遠
心により除去したのち、この酵素液を１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＲ−ＴＯＹＯＰ
ＥＡＲＬカラムに吸着させた。次いでＯ〜０．５ＭのＮ
ａＣ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の濃
度勾配法によって酵素を溶出した。溶出した活性画分を
集め、限外濾過膜を用いて濃縮した後、０．１ＭのＮａ
Ｃ１を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用い
て一夜透析し　（た。この酵素液を０．１ＭのＮａＣＩ
ｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化
したセファクリルＳ−３００のゲル濾過カラムにかけ３
つの活性画分を分離した。集めた３つの活性画分をそれ
ぞれ１０１リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）を用いて一夜
透析したのち、同緩衝液で平衡化したパラアミノフェニ
ルベーターディチオガラクトピラノシド（ｐ−ａｍｉｎ
ｏ　ｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐ
ｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を共有結合させたセファローズ４
Ｂカラムに吸着させた。このカラムを１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で充分に洗った後、０．１Ｍホウ酸
緩衝液（ｐ　Ｈ１０，０）を流し酵素を溶出し、活性画
分を分離した。かくして得られた３つの活性画分はポリ
アクリルアミドゲルディスク電気泳動（ゲル濃度７．５
％。

ｐＨ９，５）においてそれぞれ単一であった。得られた
酵素標品は３つの酵素合計で３．４　ｍｇであり、活性
収率は１２％であった。尚他の２菌株についても培養条
件を種々変更して上記と同様にして本酵素を取得するこ
とが可能である。

３）本酵素の性質 本発明の方法により製造した本酵素の酵素化学的性質は
次のとおりである。

（ａ）作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに
分解する。

（ｂ）基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロ
ース、メリビオース、　ラフィノ ース、マルトース、セロビオース及び ゲンチオビオースは分解しない。

（ｃ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは４．５〜
６．５であり、５５℃で２４時間保持の条件ではＰＨ４
，０〜８．０の範囲内で安定である（第１図の本酵素の
作用ｐＨ曲 線参照）。

（ｄ）温度に対する安定性：ｐＨ７，０において８０℃
で１時間加熱後１００％の活性が残存し、８５℃で１時
間加熱後、８５％の活性が残存する。

（ｅ）作用適温の範囲：７５〜８５°Ｃに至適作用温度
を有する（第２図の本酵素の作用温度曲 線参照）。

（ｆ）無機塩の作用＝１ミリモルの塩化第二鉄、塩化マ
ンガン、塩化カルシウム及び硫酸 マグネシウムにより酵素活性は変化し ないが、１ミリモルの塩化亜鉛及び硫 酸銅によりそれぞれ１０％及び３０％の酵素活性が低下
する。

（ｇ）反応生成物による阻害：５０ミリモルのガラクト
ース及びグルコースによる酵素活性 の低下はいずれも１０％以下である（第３図の本酵素の
反応生成物による阻害 に関する図参照）。

（ｈ１分子量：本酵素についてセファクリルＳ−３００
カラムクロマトグラフイー（１，６Ｘ　１００ｃｍ）を
使用し、ゲル濾過法により分子量を測定したところ、５
５，０００±５．０００ダルトン、ｉｔ、ｏｏｏ±１０
，０００ダルトン及び４４，０００±５０，０００ダル
トンに相当した。

本酵素及び従来公知の微生物由来のβ−ガラクトシダー
ゼ（前記先例１〜６の酵素）の理化学的性質並びに酵素
化学的性質を比較して第２表に示す。

尚、β−ガラクトシダーゼの活性測定法並びに活性表示
法は次のとおりである。

すなわち、１．５０％のＯ−ニトロフヱニルーβ−Ｄ−
ガラクトピラノシド（以下０ＮＰＧと記載する）を含有
するＯ、　１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　２．４　
ｍｌに本酵素液０．１　ｍｌを加え、７０℃、１０分間
反応させた後、１０％Ｎａ２ＣＯ３液２．５−を加え反
応を停止する。生成したＯ−二トロフェノールの量を４
２０ｎｍにおける吸光度より求め、１分間に１μｍｏｌ
のＯ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１単位とし
た。

（本頁以下余白） 第２表に示す如く、本酵素の酵素化学的及び理化学的性
質は、公知の何れのβ−ガラクトシダーゼとも異なって
おり、特に高い熱安定性、広範な至適ｐＨの範囲及び低
い反応生成物による阻害度の特性を兼ね備えており、従
来の酵素にない優れた特性を有している。従って本酵素
は牛乳、脱脂乳、チーズホエーあるいは乳糖液等の多く
の乳糖含有食品を高温で処理することに適しており、工
業的に有用なβ−ガラクトシダーゼである。

次に実施例を示し、本発明につき更に具体的に説゛明す
るが、本発明は以下の実施例によって何等制限されるも
のではない。

実施例１ サーマス・エスピーＺＫ−００１（Ｔｈｅｒ＋ａｕｓ　
ｓｐ、ＺＫ−００１：微工研菌寄第９１８４号）を、０
．２％グルコース、０．２％酵母エキス、０．２％トリ
プトン、１０．０％の無機塩液（溶液１１中に１．０ｇ
ニトリロ三酢酸、０．６ｇ　ＣａＳＯ４・２Ｈ！０．１
．Ｏｇ　Ｍｇ５Ｏｎ　・７　ＨｚＯ，０，０８ｇＮａＣ
ｌ　。

１．０３ｇＫＮＯｘ、　６．８９ｇ　ＮａＮＯ３，１，
１１ｇ　ＮａｚｌｌＰＯ４を含む）、１．０％の塩化第
二鉄溶液（溶液ｌｌ中に０．２８ｇＦｅＣｌ　３　’　
６Ｈ！０を含む）、１．０％の微量元素液（溶液ｌｌ中
に０．５　ｍｆ　ＨｚＳＯａ、２．２ｇ　ＭｎＳＯ４・
Ｈｚｏ。

０．５　ｇ　ＺｎＳＯ４・７８！０．　０．５ｇ　ＨＪ
Ｏｚ、０．０１６　ｇ　ＣＬＩＳＯ４・５１１ｚ０，０
．０２５ｇ　ＮａｚＦＩｏＯａ　・２１１２０．　０．
０４６ｇＣｏＣｊ！　ｚ・６Ｈ２０を含む）、０．００
１％のチアミン塩酸塩、０．００１％のニコチン酸アミ
ド、０．００１％のビオチン、０．００１％のパラアミ
ノ安息香酸を含有し、Ｎａ０）ｌによりＰＨ７，６に調
整した液体培地１０Ａに植菌し、２１１容のジャーファ
ーメンタ−内で７０℃で２４時間通気培養した。培養液
の酵素活性は、培養液１−当たり０．８４単位であった
。

この培養液を、２０℃にて１２．０００ｇ、　３０分間
遠心分離し、菌体を集菌し、１０７ｇの菌体を得た。こ
の菌体に約６００−の抽出用リン酸緩衝液（１０ｍＭ、
　ｐ１７．０）を加え、ミルにより磨砕し酵素を抽出し
た。

抽出液を４０．０００ｇ、　　６０分間遠心し上清を採
取した。

沈澱に更に４００−の上記抽出用リン酸緩衝液を加え再
度抽出した後、同様に遠心し上清を採取した。

これを最初の上清に合わせ粗酵素抽出液９７５−をえた
。この粗酵素液に硫酸アンモニウム３８０ｇを加え６０
％飽和とし、−晩装置し沈澱を生成せしめた。次に沈澱
を３０．０００ｇ、　　６０分間の遠心分離により集め
、約３０−の１０ｓ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
溶解したのち、同緩衝液で透析した。透析した酵素液中
の沈澱を４０．０００ｇ、　　６０分間の遠心により除
去したのち、酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液　（ｐＨ７
，０）で平衡化したＤＩ！ＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカ
ラム（５Ｘ４５ｃｓｅ）に吸着させた０次いで０〜０．
５ＭのＮａＣ１を含む１０−ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）の濃度勾配法によって酵素を抽出した。溶出した活
性画分４８．０−を限外濾過膜（アミコン社製ＰＭ−１
０）を用いて約１０−に濃縮した後、０．１ＭのＮａＣ
Ｉｔを含む１０＋ｓＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用
いて一夜透析した。この酵素液を０．１１のＮａＣ１を
含む１０＋ｉＭリン酸緩衝液　（ｐＨ７，０）で平衡化
したセファクリルＳ−３００のゲル濾過゛カラム（２，
６Ｘ　９５Ｃ１ｌ）に通液し、３つの活性画分を分離し
た。３つの活性画分を合わせ、１０＋ｗＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）を用いて一夜透析したのち、同緩衝液で
平衡化したバラアミノフェニル′ベーダーディチオガラ
クトピラノシド（ｐ−ａｍｉｎｏ　ｐｈｅｎｙｌ−β−
Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を
共有結合させたセファローズ４Ｂカラム（１，０Ｘ１５
．０ｃｍ）に吸着させた。

このカラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で充
分に洗った後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０，０）
を流し、酵素を溶出し、活性画分を分離した。かくして
本酵素約８．５■を得た。

実施例２ サーマス・エスピーＺＫ−００２（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓ
ｐ、ＺＫ−００２：微工研菌寄第９１８５号）を実施例
１の培地のグルコースを０．２％の可溶性デンプンに変
えた培地に１０１に植菌し、実施例１と同一条件で培養
し、０゜６４単位／−の培養液を得た。以下実施例１と
同様の方法で情製し、本酵素約６．８■を得た。

実施例３ サーマス・エスピーＺＫ−００３（Ｔｈｅｒａ＋ｕｓ　
ｓｐ、ＺＫ−００３：徽工研菌寄第９１８６号）を実施
例１で述べた組成の培地１ｉに植菌し、実施例１と同一
条件で培養し、０．６８単位の培養液を得た。以下実施
例１と同様の方法で精製し、本酵素約７．３　ｎｒを得
た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、耐熱性が高く、かつ作用ｐＨ域が広く
、さらに反応生成物による阻害度の低いβ−ガラクトシ
ダーゼを得ることができる。本酵素は牛乳、脱脂乳、チ
ーズホエーおよび乳糖液などの乳糖含有食品を雑菌が腐
敗し難い高温で処理することを可能にする。このことは
、これらの食品の加工時における製造工程管理をより筒
便にせしめるものであり、食品工業において極めて有意
義なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の作用ｐＨ曲線、第２図は本酵素の作用
温度曲線、第３図は本酵素の反応生成物による阻害に関
する図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）７５〜８５℃の至適作用温度を有し、４．５〜６
   ．５の至適ｐＨを有し、かつ５０ミリモルのガラクトー
   ス及びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しな
   い新規なβ−ガラクトシダーゼを産生することを特徴と
   するサーマス属に属する新菌株。
2. （２）新菌株が少なくとも次に記載する菌学的性質を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載する
   サーマス属に属する新菌株。 （ａ）形態学的性質 形状　桿菌 運動性　− グラム染色　− 鞭毛　− 胞子　− 抗酸性　− 大きさ　０．４〜０．６×２〜７μｍ （ｂ）各種培地での生育 寒天平面培地　円形ないしは周辺不規則、 隆起状ないしは偏平状、 淡黄色〜橙色 寒天斜面培地　平滑、淡黄色〜橙色 液体培地　生育菌体の沈澱を生ず リトマスミルク　変化なし ５％ＮａＣｌ含有液体培地　− ２％ＮａＣｌ含有液体培地　＋ （ｃ）生育のｐＨと温度 生育ｐＨ　５．５〜８．５ 生育温度　４０〜８０℃ （ｄ）生化学的性質 硝酸塩の還元　＋ 脱窒反応　± ＶＰテスト　− インドールの生成　− 硫化水素の生成　− デンプンの加水分解　± クエン酸の利用　− 無機窒素源の利用　＋（ＮＨ＿４） 色素の生成　生成する（黄色、橙色） ウレアーゼ　− オキシダーゼ　＋ カタラーゼ　＋ Ｏ−Ｆテスト　Ｏ 酸素要求性　嫌気条件下では生育 せず （ｅ）糖の資化性 Ｄ−グルコース　＋ Ｄ−マンノース　＋ Ｄ−フラクトース　＋ マルトース　＋ シュクロース　＋ ラクトース　＋ トレハロース　＋ グリセリン　− デンプン　−
3. （３）新菌株が微工研菌寄第９１８４号、微工研菌寄第
   ９１８５号及び微工研菌寄第９１８６号からなる群より
   選択される菌株であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項又は第２項のいずれかに記載のサーマス属に属す
   る新菌株。
4. （４）７５〜８５℃の至適温度を有し、４．５〜６．５
   の至適ｐＨを有し、かつ５０ミリモルのガラクトース及
   びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しないこ
   とを特徴とする新規なβ−ガラクトシダーゼ。
5. （５）β−ガラクトシダーゼが次の理化学的性質を有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の新規
   なβ−ガラクトシダーゼ。 （ａ）作用：ラクトースをガラクトースとグルコースに
   加水分解する作用を有する。 （ｂ）基質特異性：ラクトースを分解するが、シュクロ
   ース、メリビオース、ラフィノ ース、マルトース、セロビオース及 びゲンチオビオースは分解しない。 （ｃ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは４．５
   〜６．５であり、５５℃、２４時間保持の 条件ではｐＨ４．０〜８．０の範囲内で 安定である。 （ｄ）加熱に対する安定性：ｐＨ７．０において８０℃
   、１時間加熱後１００％の酵素活性が残 存し、８５℃で１時間加熱後８５％の酵 素活性が残存する。 （ｅ）作用適温の範囲：７５〜８５℃に至適作用温度を
   有する。 （ｆ）無機質の作用：１ミリモルの塩化第二鉄、塩化マ
   ンガン、塩化カルシウム及び硫 酸マグネシウムにより酵素活性は変 化しないが、１ミリモルの塩化亜鉛 及び硫酸銅によりそれぞれ１０％及び ３０％の酵素活性が低下する。 （ｇ）反応生成物による阻害：５０ミリモルのガラクト
   ース及びグルコースによる酵素活 性の低下はいずれも１０％以下である。 （ｈ）分子量：ゲル濾過法による測定で５５，０００ダ
   ルトン、１１０，０００ダルトン及び４４０，０００ダ
   ルトンにピークを示す。
6. （６）７５〜８５℃の至適作用温度を有し、４．５〜６
   ．５の至適ｐＨを有し、かつ５０ミリモルのガラクトー
   ス及びグルコースによって酵素活性が実質的に低下しな
   い新規なβ−ガラクトシダーゼを産生するサーマス属に
   属する菌株を培養し、β−ガラクトシダーゼを採取する
   ことを特徴とする新規なβ−ガラクトシダーゼの製造法
   。
7. （７）培養が５０〜８０℃の温度で好気的に行なわれる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の新規な
   β−ガラクトシダーゼの製造法。
8. （８）培養が６〜８．５のｐＨで行なわれることを特徴
   とする特許請求の範囲第６項又は第７項のいずれかに記
   載の新規なβ−ガラクトシダーゼの製造法。
9. （９）サーマス属に属する菌株が微工研菌寄第９１８４
   号、微工研菌寄第９１８５号及び微工研菌寄第９１８６
   号ならびにこれらの混合菌株であることを特徴とする特
   許請求の範囲第６項乃至第８項のいずれかに記載の新規
   なβ−ガラクトシダーゼの製造法。