DK167774B1

DK167774B1 - Stamme tilhoerende slaegten thermus, beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling af beta-galactosidasen ved hjaelp af stammen samt anvendelse af beta-galactosidasen til fremstilling af galactose og/eller glucose

Info

Publication number: DK167774B1
Application number: DK067188A
Authority: DK
Inventors: Mitsunori Takase; Kouki Horikoshi
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Japan Res Dev Corp; Rikagaku Kenkyusho
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1993-12-13
Also published as: EP0279778A3; DE3888989T2; JPH0761265B2; EP0279778B1; DK67188A; JPS63196267A; EP0279778A2; DK67188D0; DE3888989D1

Description

DK 167774 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt stamme af slægten Thermus, hidtil ukendt β-galactosidase, en fremgangsmåde til fremstilling af /3-galactosidasen samt anvendelse af β-galactosidasen til fremstilling af galactose og/eller gluco-5 se ud fra lactose.

β-galactosidase er et enzym, som nedbryder lactose til glucose og galactose og anvendes til produktion af levnedsmidler og foder, såsom lactosehydrolyseret mælk, lactosehydrolyseret opløsning osv. jS-galactosidasen er vidt udbredt fra dyr og plan-10 ter til mikroorganismer, såsom svampe, gær og bakterier, og de enzymer, der nu anvendes i levnedsmiddelindustrien, er forholdsvis lidt termostabile j8-galactosidaser, der hovedsageligt er afledt fra svampe eller gær. Disse j8-galact os idaser er beskrevet i den officielle gazette af japansk patentpublikation 15 nr. 24094/ 1978 (kendt teknik 1) og i den officielle gazette af fremlagt japansk patentansøgning (Kokai) nr. 44287/1977 (kendt teknik 2).

På den anden side er termostabile /3-galactosidaser beskrevet i Biotechnology and Bioengineering (bind 26, side 1141 (1984)) 20 (kendt teknik 3) , Journal of Applied Microbiology (bind 2, side 390 (1980)) (kendt teknik 4), Canadian Journal of Microbiology (bind 22, side 817 (817)) (kendt teknik 5), fremlagt japansk patentansøgning (Kokai) nr. 154991/1981 (kendt teknik 6) og Journal of Bacteriology (bind 110, side 691 (1972)) 25 (kendt teknik 7) . Imidlertid har alle disse konventionelle /?-galactosidaser en eller flere ulemper, såsom lav varmestabilitet, snævert område for optimal pH-værdi og at reaktionsproduktet inhiberer den enzymatiske virkning, hvilket vil blive beskrevet senere (se tabel 2) . Det er således en kendsgerning, 30 at de konventionelle Ø-galactosidaser ikke har fundet praktisk anvendelse.

Som beskrevet ovenfor, er de jS-galactosidaser, der nu anvendes til produktion af levnedsmidler i en industriel målestok, forholdvis lidt termostabile enzymer, således at lactosenedbryd-

Ulv ΙΟ///q- D I

2 ningsbehandlingen gennemføres i almindelighed ved 55°C eller derunder. Desuden er mælk eller lactoseopløsning som råmateriale en foretrukket næringskilde for bakterier. Derfor er forrådnelse på grund af saprofytforurening under behandlingen et 5 alvorligt problem ved produktion af levnedsmidler og foder. Desuden giver immubiliseret /3-galactosidase også et alvorligt problem ved fremstilling af levnedsmidler og foder, hvis det bliver utilstrækkeligt vasket og steriliseret efter produktionens afslutning. For at løse disse problemer, er det ønskeligt 10 at behandle et objekt under anvendelse af en termostabil β-galactosidase eller vask og sterilisering ved en høj temperatur, hvor saparofytter har vanskeligt ved at formere sig, og der er et kraftigt behov for udvikling af en industriel anvendelig termostabil |S-galactosidase.

15 For at opfylde et sådant behov, er der foretaget en eftersøgning efter ovennævnte termostabile galactosidase, og der blev fundet forskellige termostabile /3-galactosidaser. Imidlertid er der ingen konventionelt opnået termostabil /3-galactosidase, som har alle de enzymologiske egenskaber, der beskrives i føl-20 gende punkter (1) til (3) , som behøves til industriel anvendelse. Dvs. der er ingen termostabil β-galactosidase, der når et praktisk anvendeligt niveau: (1) Har tilstrækkelig termostabilitet: da varmekoaguleringen af mælk eller affedtet mælk sker ved 78 25 til 80°C er det ønskeligt, βΧ. den enzymatiske behandling gennemføres ved en temperatur, der ligger så højt som muligt under nævnte temperatur. Således fordres det, at enzymet har en tilstrækkelig termostabilitet i nærheden af 70 til 75°C. 1

Har en optimal pH-værdi i området fra neutralitet til sur-30 hed: som råmaterialer, der skal behandles med jS-galactosidase, kan man tænke sig mælk, affedtet mælk, ostevalle, lactoseopløsning osv. Disse råmaterialer er i det neutrale (pH 6,5) til sure (pH 4,5) område, og der behøves derfor tilstrækkelige enzyma- 3 DK 167774 B1 tiske aktiviteter i dette område.

(3) Lav inhibering af enzymatisk aktivitet af reaktionsprodukterne : der fordres, at nedsættelse af enzymaktiviteten af galactose 5 og glucose, som reaktionsprodukter, er lille, når β-galactosi-dase indvirker på lactose.

Med den hensigt at skabe en /?-galactosidase med de ovenfor beskrevne egenskaber, har det været forsøgt fra naturen i ren form at isolere en mikroorganisme, der producerer en sådan 10 /3-galactosidase. Som et resultat deraf har det vist sig, at en stamme af slægten Thermus, som er valgt blandt FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr. 9184), FERM BP-1679 (Bikoken-kinki nr. 9185) og FERM BP-1680 (Bikoken-kinki nr. 9186), producerer β-galactosidase med en optimal temperatur fra 75 til 85°C, en 15 optimal pH-værdi fra 4,5 til 6,5 og en enzymatisk aktivitet, der ikke sænkes væsentligt ved tilstedeværelsen af 50 mM af hver af galactose og glucose.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en hidtil ukendt mikroorganisme, der producerer en hid-20 til ukendt β-galactosidase (i det følgende betegnet som "det omhandlede enzym") med en høj varmestabilitet, et optimal pH-værdi i det neutrale til sure område og en enzymatisk aktivitet som ikke sænkes af reaktionsprodukterne.

Opfindelsen angår også tilvejebringelsen af det omhandlede 25 enzym samt en fremgangsmåde til fremstilling af enzymet.

Dvs. den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en stamme, der hører til slægten Thermus, karakteriseret ved at den valgt blandt FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr. 9184), FERM BP-1679 (Bikoken-kinki nr. 9185) og FERM BP-1680 30 (Bikoken-kinki nr. 9186) og fremstiller en hidtil ukendt β-ga-lactosidase med en optimal temperatur på 75 til 85°C, en optimal pH-værdi på 4,5 til 6,5 og en enzymaktivitet, som ikke 4 ulv ib///**· b i sænkes væsentligt ved tilstedeværelse af 50 mM galactose og 50 mM glucose, en hidtil ukendt /3-galactosidase, der er karakteriseret ved at være identiske med det enzym, der dannes ved dyrkning af den ovennævnte stamme af slægten Thermus, og ved 5 at have en optimal temperatur på 75 til 85°C, en optimal pH-værdi på 4,5 til 6,5 og en enzymatisk aktivitet, som ikke sænkes væsentligt ved tilstedeværelse af 50 mM galactose og/ eller 50 mM glucose, samt en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af den nævnte β-galactosidase, som er ejendom-10 melig ved at man dyrker den ovennævnte stamme af slægten Thermus, som producerer en hidtil ukendt Ø-galactosidase med en enzymaktivitet, som ikke sænkes væsentligt, når der er 50 mM galactose og/eller 50 mM glucose til stede og opsamler /3-ga-lactosidasen.

15 Ifølge den foreliggende opfindelse kan der opnås en /3-ga-lactosidase med en høj termostabilitet, et bredt virksomt pH-område og med en lav inhibering af reaktionsprodukterne.

Dvs. det omhandlede enzym er i stand til at behandle lac-toseholdige levnedsmidler og foderstoffer, såsom mælk, affed-20 tet mælk, ostevalle, lactoseopløsninger osv. ved en høj temperatur, hvor der vanskeligt kan fremkaldes forrådnelse ved hjælp af saprofytter. Denne virkning gør administrering af produktionsprocessen på det tidspunkt, hvor de ovennævnte levnedsmidler og foderstoffer forhandles simplere, hvilket har 25 stor betydning for levnedsmiddel- og foderindustrien.

I det følgende beskrives tegningen.

fig. 1 er en kurve, der viser virkningen af pH på det omhandlede enzym, fig. 2 er en kurve, der viser temperaturens indvirkning på det 30 omhandlede enzym, og fig. 3 er en kurve, der viser inhiberingen af det omhandlede enzym ved hjælp af reaktionsprodukter sammenlignet med inhibe- DK 167774 B1 5 ringen af nogle kendte enzymer.

(1) Erhvervelse af mikroorganisme.

Til den foreliggende opfindelse blev et stort antal mikroorganismer, der vides at producere /3-galactosidaser, isoleret fra 5 jordprøver opsamlet i alle dele af landet i overensstemmelse med Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (bind 1/ i det følgende betegnet som "manualen"). Disse mikroorganismer blev dyrket til udvikling af /3-galactosidaser, og de producerede β-galactosidaser isoleredes fra medierne. Som et resultat af un-10 dersøgelsen af deres fysisk-kemiske egenskaber isoleredes 3 stammer, som producerer den ønskede /3-galactosidase, dvs. ZK-001, ZK-002 og ZK-003. Identifikationen af disse stammer i overensstemmelse med ovennævnte manual viste, at de alle var aerobe og ikke-sporedannende baciller, var immobile, gram-ne-15 gative og catalase-positive og havde en væksttemperatur på 40 til 80°C, en optimal væksttemperatur fra 65 til 75°C og en optimal vækst-pH-værdi omkring neutralitet, hvoraf det klart fremgik, at stammerne var mikroorganismer hørende til slægten Thermus. På grundlag af prøveresultaterne vedrørende deres 20 vækst på flydende medier indeholdende 2% NaCl og deres assimilering af sukker, blev de imidlertid bedømt til at være hidtil ukendte mikroorganismer, som afviger fra de kendte mikroorganismer, der hører til slægten Thermus. De omhandlede stammer er deponeret hos Fermentation Research Institute; Agency 25 of Industrial Science and Technology, og stammerne har fået følgende deponeringsnumre: FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr.

9184) for Thermus sp. ZK-001, FERM BP-1679 (Bikoken-kinki, nr.

9185) for Thermus sp. ZK-002 og FERM BP-1680 (Bikoken-kinki, nr. 9186) for Thermus sp. ZK-003. Disse mikroorganismers bak- 30 teriologiske egenskaber er vist i tabel 1.

6 uiv lb///^- b i t_ «

ε r- I

a a T3 .x a t- s_ i *r~ (1) cm o tn I— I— W O) X o) a a ra c • ·«- o> οι ε Q. E in Φ Φ Φ £- W a. I I I I tn tn tn i— 73 t n æ > > i— c tn a to ει—ι—φ« am r— r- o £- ε o i— o φ - - +j Φ c £_ O -I- i C173 73 01 Ό Φ Φ I O *3 Φ Π3 (C AC r— ΟΙ

SI iC <0- C. i— i— » 8 C

t— NI CQ O 3) 4- IL. > 4- M

ε i a I 73 •ro a li- -t-> ? tn tu cm ε tn φ tn οι X t- 1 to c • 4- a ε το. ε οι tu s- tn a I I I I -1—1—73 t n s_ - a r- c in ato ffi φ to) φ ffi a CM i— 1—73 O L- B o i— o a c - +> φ c S_o -r- ; .X Φ 73 tn 73 1! øl o c. <o ro .v >— oi C x: ro- -r- +j r- jb fB a t—i (— m co o o tn u- > η- n _j---

LU

cq ε t < 3 I 73 f— *ro a c- Ή i tn tu cm ε in • φ tn o o. x t_ φ Φ ro c tn 4- C3i οι ε ·γ- ε c c tu s- tn a i i i i - ro ro r— 73 a ι-t t n £_ C- L- 1— c ε o a to ffiootuffi S. O i— - i— O S-

ΦΙ I— O 3 - - +» <D C

SI -r- i JX Φ 73 tn 73 Φ (— N 0*3· £- 73 10 Q<£ — O) ro- -i-cr-ææc

CQ O O Φ U. >4- M

£_ Φ

SI

ro φ jx O) tn ·>- c i— Φ ΓΙΟΙ φ ε φ ε ε a tn a a ·γ- φ O) £_ -i- ·γ- 73 -X C Ο 73 73 Φ tn ·γ- 4- φ φ ε .χ •r- φ +j c c. εε ι- ιοι tn φ > φ <TO73*roro s Ο 1— 4-> £_ >— Ω.* ro £-73 £ τ— φ ·ι- ffl ι— I- £- ϊ— -X C tn Ο i- r— 4— Φ φ -η φ ο. tn φ a 4- ε s-τ- ε π) c tnv- l. s_ 73 ε s_ t_ q X! ro ro o .x 73 ro ro > .x oo+jot-r- ω,κφο) o)·— ro 2:u-tQs;c3U-cn>H< <u_ _i

t-t CM

DK 167774 B1 7 r-— «S- 3 X Ol o z ro LO O >—' in -o > I + 00 CO +,,111,, I + I— I + + ? } +l +l -in o - v +j in ro a sz (0

Q

••tf X o-* O Z ·— in o —- 3 «•O O) I + 00 CO + +| 1 I I +| +, + —- 1 + + > l in o * - >+ +> ω ro c c (0

Q

*+ <D

X CO

o z c in o ·— ro -o S_ i + æco + +i i i i +i i + oi+ + i ? m o - «+ +> in ro c c ro α c s. o ni ro ·· ro tn I I 4J s_ +> tn T- rororo rom — roe σ-os- o ro ro in ro c c ro ro ro c ro ·- σι ·>- ·γ- o. m s. c ro ro i- ro >— — s ro ro ro > +j o ro so e o ro s. c c di o i— +> 3 i— 3 ro 3 ro +> 3 ro o c o o > ro •i- z ·γ- z i 4j οι ·γ· ·- ro ·γ- i. c μ- ro c o -o ro ro +> s_ WH-oorooc ro ro é? σι i- m ro r- r- > 3 .-ro s m s cm o ro ro 3 o ro 3 .c ro ro ·>- -d o. m o ·- c tn in s- in m '^- rorororoxxεtnro^-roccro>>·-co ro 00 00 CLQ.ro··- s_ ·γ- > ro ro in in ro ro +· ro in c c c c i i+<e+>i_QOuir-c+>Diinro(nro roro ro ro +· +> +· ro ro +> £-·— o ro o -p o ro en ro·— 0000 tn tn in m s_ ·- cl o s_ > c. >s_ > ro o ro > 1— >r- m m m o + c 1 00 ·.- +> c +j s_ ro ··- +> «— o «— o ft! $ « -r- ·γ- ro a c >»+>·!- o ·>- ro sl x ro u-x:ii.^:>>>mza>»-iX(/)uxcii.xoi^ CO Ί+ DK Ίο///4 bl 8 ί_ 0 Ό Ό r-C O 3 XT i_

+J O

j*: »*-

OM I 1 .. .. + + + + + + + + I 1 I I

ffi 0 +1+1 +1

> -Ω O

C £-0 0 o) ro c c m ro i_ 0 -Ό Ό i— C O 3 x £_ U O M 4-

O .M I I + + + + + + + + + + I + + I I

æ ø > Λ

O

C s-0 0 o) ro c c w ro j_ 0 Ό Ό r— C O 3 -C £_ 4-» O M U—

O .X IIII + + +I + +I + 1IIII

» 0

> £2 O

C I_ 0 0 O) ro c c m ro 0 4-> £_ ro i_ 0 3

M

D) C 4-•r- Π3

C

+j cn > r- c 0 0 OØ-I-M ØM 0 i— i—

øx: E £- O ØØMO M ØOO

>0 MØCØMMO+J O M+'+'t— r-0 <S £S Cr--r-(0OO+'OØt-ØO*^*r-OOtn L. C ‘i— **— _Q O O C O (C t/1 (0 M '— £2C+J £_ r— Q.0 +J Eror-3 C3r— OXOroS-C-r- 00 i o) ro-i-t_>i— (0t_ro+-’o+-'xoroM o> LL > >— MroXDJEH-0)t-000ME0>-t- ix ømi i i i i i ro ro ro x- i i c i— +-> o o o<_iqoooqs:c/5_ii-ooi-ioc/5

lO

DK 167774 B1 9 I tabel 1 betyder *, at der blev anvendt medier med pH 7,6 med følgende sammensætning som essentielt medium, bortset fra lak-musmælk: 0,1% gærekstrakt, 0,1% trypton, 10,0% uorganisk saltopløsning 5 (indeholdende 1,0 g nitrilotrieddikesyre, 0,6 g CaS04.2H20, 1,0 g MgS04.7H20, 0,08 g NaCl, 1,03 g KN03, 6,89 g NaN03 og 1,11 g Na2HP04 per 1 opløsning), 1,0% ferrichloridopløsning (indeholdende 0,28 g FeCl3.6H20 per 1 opløsning), 1,0% sporgrundstof opløsning (indeholdende 0,5 ml H2S04, 2,2 g 10 MnS04.H20, 0,5 g ZnS04.7H20, 0,5 g H3B03, 0,016 g CuS04.5H20, 0,025 g Na2Mo04.2H20 og 0,046 g CoCl2.6H20), 0,001% thiamin-hydrochlorid, 0,001% nikotinamid, 0,001% biotin og 0,001% p-aminobenzoesyre.

(2) Erhvervelse af det omhandlede enzym.

15 Stammer, der producerer det omhandlede enzym podes på medier, som vil blive beskrevet senere og dyrkes aerobt ved 50 til 80°C, fortrinsvis ved 65 til 75°C i 12 til 48 timer.

Medierne indeholder uorganiske salte, spornæringsstoffer ud over en carbonkilde og en nitrogenkilde efter behov. Som en 20 carbonkilde kan der anvendes forskellige konventionelle kendte materialer. F.eks. kan der nævnes glucose, maltose, saccharose eller opløseligt stivelse som typiske eksempler. Som nitrogenkilde er der heller ingen specielle begrænsninger. F.eks. kan der nævnes organisk nitrogen, såsom gærekstrakt, pepton, kød-25 ekstrakt, majsstøbevand, aminosyreopløsning, soyamel osv. eller uorganisk nitrogen, såsom ammoniumsulfat, urinstof, ammoniumnitrat, ammoniumchlorid osv.,, som billige og let tilgængelige kilder. Det er desuden unødvendigt at nævne, at organiske nitrogenkilder bliver til en carbonkilde. Ved siden 30 af sådanne carbonkilder og nitrogenkilder som dem, der er nævnt ovenfor, er det endvidere muligt at tilsætte forskellige almindeligt anvendte salte, f.eks. uorganiske salte, såsom magnesiumsalt, kaliumsalt, phosphat, jernsalt osv.; vitaminer; UIV ΙΟ// /‘r Dl 10 osv. Som et velegnet medium kan nævnes et flydende medium, der indeholder 0,2% glucose, 0,2% gærekstrakt, 0,2% trypton, 10,0% uorganisk saltopløsning (indeholdende 1,0 g nitrilotrieddike-syre, 0,6 g CaS04.2H20, 1,0 g MgS04.7H20, 0,08 g NaCl, 1,03 g 5 KNO3, 6,89 g NaN03 og 1,11 g Na2HP04 per 1 opløsning) , 1% fer-richloridopløsning (indeholdende 0,28 g FeCl3.6H20 per 1 opløsning), 1,0% sporgrundstof opløsning (indeholdende 0,5 ml H2S04, 2,2 g MnS04.H20, 0,5 g ZnS04.7H20, 0,5 g H3BO3, 0,016 g CuS04.5H20, 0,025 g Na2Mo04.2H20 og 0,46 g CoC12.6H20), 0,001% 10 thiamin-hydrochlorid, 0,001% nikotinamid, 0,001% biotin og 0,001% p-aminobenzoesyre og med en pH-værdi indstillet til 7,6 med NaOH.

Isoleringen og oprensningen af det omhandlede enzym kan f.eks. gennemføres på følgende måde. Cellemasser i et dyrkningsmedium 15 opsamles ved centrifugering, filtrering osv., og de opnåede cellemasser sprænges i en puffer (f.eks. 10 mM phosphatpuffer på pH 7,0) på sædvanlig måde og underkastes derefter ekstraktion. Den ovenstående væske underkastes kromatografering, sædvanlig ionbytning, gelfiltrering osv., hvorved det om-20 handlede enzym opnås.

En foretrukken metode til opnåelse af det omhandlede enzym kan eksemplificeres på følgende måde. Thermus sp. ZK-001 podes f.eks. i 5 liter af et medium som beskrevet ovenfor og dyrkes aerobt ved 70°C i 24 timer. Det opnåede dyrkningsmedium cen-25 trifugeres ved 12.000 x g ved 20°C i 30 min. for at opsamle cellemasserne, hvorved der opnås 55 g cellemasse.

Til de opnåede cellemasser sættes ca. 300 ml phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0) til ekstraktion. De således behandlede cellemasser sprænges i en mølle til et enzymekstrakt. Det opnåede 30 ekstrakt centrifugeres ved 40.000 x g i 60 min., og den resulterende ovenstående væske bibeholdes. Derefter ekstraheres et bundfald ved tilsætning af 200 ml af ovennævnte phosphatpuffer til ekstraktion, den opnåede ekstrakt centrifugeres på samme måde, og den ovenstående væske bibeholdes. Derved opnås 480 ml DK 167774 Bl 11 rå enzymekstrakt indbefattet den tidligere opnåede ovenstående væske. Denne rå enzymopløsning mættes til 60% ved tilsætning af 187 g ammoniumsulfat dertil og henstilles natten over til dannelse af et bundfald. Bundfaldet opsamles ved centrifuge-5 ring af den således udfældede rå enzymopløsning ved 30.000 x g i 60 min. Det opsamlede bundfald opløses i ca. 200 ml 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) og dialyseres derefter mod denne puffer. Efter bortkastning af et bundfald i den dialyserede enzymopløsning ved centrifugering af opløsningen ved 40.000 x g 10 i 60 min. fyldes den således behandlede enzymopløsning på en kolonne af DEAE-TOYOPEARL ækvilibreret med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0). Derefter elueres enzymet i overensstemmelse med koncentrationsgradientmetoden med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0 til 0,5 M NaCl. De eluerede aktive frak-15 tioner opsamles og koncentreres med et ultrafilter, hvorefter der dialyseres natten over under anvendelse af 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1 M NaCl. Den således behandlede enzymopløsning underkastes gelfiltrering under anvendelse af en kolonne af Sephacryl S-300 ækvilibreret med 10 mM phos-20 phatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1 M NaCl til isolering af 3 aktive fraktioner. De respektive opsamlede 3 aktive fraktioner dialyseres natten over under anvendelse af 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) og fyldes på kolonner af Sepharose 4B, hvortil p-aminophenyl-/?-D-thiogalactopyranosid ækvilibreret med den 25 nævnte puffer er kovalent bundet. Efter omhyggelig vask af kolonnerne med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0), føres 0,1 M borat-puffer gennem kolonnerne, hvorved de aktive fraktioner elueres og isoleres. De således opnåede respektive 3 aktive fraktioner viser sig at være oprenset til at give enkle bånd ved polya-30 crylamid-gelelektroforese (gelkoncentration: 7,5%, pH: 9.5). Udbyttet af opnået enzympræparat udgør 3,4 mg af de 3 enzymer i alt, og aktivitetsudbyttet deraf når 12%. Med hensyn til de øvrige 2 stammer kan det omhandlede enzym også opnås på samme måde, som beskrevet ovenfor, men med forskellige ændringer ved 35 dyrkningsbetingelserne.

(3) Egenskaber ved det omhandlede enzym.

UK Ίθ///4 b l 12

De enzymologiske egenskaber ved det omhandlede enzym fremstillet i overensstemmelse med den omhandlede fremgangsmåde er som følger: A. Virkning: hydrolyserer lactose til galactose og glucose.

5 B. Substratspecificitet: hydrolyserer lactose, men hydrolyserer ikke saccharose, melibiose, raffinose og maltose.

C. Optimalt pH-område og stabilt pH-område: optimalt pH er 4,5 til 6,5. Stabil indenfor pH-området fra 10 4,0 til 8,0 under betingelser med 55°C i 24 timer. (Se den kurve, der viser virkningen af pH på aktiviteten af det omhandlede enzym på fig. 1).

D. Varmestabilitet: ved pH 7,0 bibeholdes 100% aktivitet efter 1 times opvarm-15 . ning til 80°C, og der bibeholdes 85% aktivitet efter 1 times opvarmning til 85°C.

E. Optimalt temperaturområde: har en optimal temperatur indenfor området fra 75 til 85°C (se den kurve, der viser temperaturens virkning på aktivi-20 teten af det omhandlede enzym på fig. 2).

F. Virkning af uorganiske salte: enzymaktiviteten ændres ikke af en mængde på 1 mM af hver af ferrichlorid, manganchlorid, calciumchlorid og magnesiumsulfat, men sænkes af en mængde på 1 mM af hver af zink-25 chlorid og kobbersulfat med henholdsvis 10% og 30%.

G. Inhibering forårsaget af reaktionsprodukter: nedsættelse af enzymaktiviteten med 50 mM af hver af galactose og glucose er 10% eller mindre (se den kurve, der viser inhibering af det omhandlede enzym som følge reak- 30 tionsprodukt på fig. 3).

DK 167774 B1 13 H. Moleky1vægt: bestemmelse af det omhandlede enzyms molekylvægt i overensstemmelse med gelfiltreringskromatografi under anvendelse af Sephacryl S-300-kolonne (1,6 cm x 100 cm) giver 5 værdier svarende til 55.000 ± 5.000 dalton, 110.000 + 10.000 dalton og 440.000 ± 40.000 dalton.

De fysisk-kemiske og enzymologiske egenskaber hos det omhandlede enzym og hos β-galactosidase udvundet fra de konventionelt kendte mikroorganismer (enzymer ifølge kendt teknik 1 til 10 7) er opstillet til sammenligning i tabel 2.

De anvendte metoder til måling og indikering af aktiviteten er som følger.

0,1 ml af den foreliggende enzymopløsning sættes til 2,4 ml 0,1 M phosphatpuffer (pH 6,5) indeholdende 1,50% O-nitrophe-15 nyl- /3-D-galactopyranosid (i det følgende betegnet som "ONPG") og omsættes ved 70°C i 10 min. Derefter blev reaktionen afbrudt ved tilsætning af 2,5 ml 10% Na2C03-opløsning. Mængden af dannet O-nitrophenol blev bestemt ud fra absorbansen ved 420 nm, og den mængde enzym, som frigiver l ptmol O-nitrophenol 20 per min. tages som en enhed.

UK ΉθΙ//Q B I

1 4 ΙΟ ' Il O) ·«- i o o ω c ϋ in -p ja ε

CO 0» -P T-(0C~ O) O τ E

ε Φ £- O C C ffi £ in φ .y ε > α> oj ·ι~ o τι— c m 0)t (0 <u > Φ o S- (0 t r-c+j £_ Τ·τ-ό9> - Φ O) Ό S 10 Jj; -P tO CO jQ æ Φ μ- © tn JiUNQC t Σ n £ o τ+>ιη ω (øo c τ χ r ε ιο φ ο 3 J2 c LO 0)τ ε o. cm øiid o ε -ρ ε τ co o £- t w σι c o >*σ l. < ω φ o o τ ο o N C Φ τ-Ι æ "U £- > CM a? 13 S- 3 ^ C Φ £ I JlC CM φ Φ t CM φ <D OJ >— *3· LU Jc: (— «ΐ M C- > Ε -Ρ τ K) E 01 ΰ Dl 13) c

CM T -Ρ -P

£_ LO Φ Φ ni nc ω ri w > > θ)τ tn > - φ <u i— C 3 t T «3- £_ i_ D jc *— +> nc .y μ- ω r— _y o xtn in τ -Ρ τ O (øo Ω. φ Φ O) φ o co ja ja ε -p £- (ø o t m >Ό φ n in · Φ 0 IM C Ω. > æ 13 C yt Λ£ C <1) 1/1 t. Οφτ y ϋ UJ y < O in > Ε Μ Μ σ> ι c c

t—ι T τ 73 · -P

£- Ο Φ C φ ·Ρ ω Μ (Λ Φ Η « > ·Γ > Φ Γ-ισίτφ > Ο Ε φ > — C Ο τ τ Ο Ο) t- £_ Φ I S y > -Ρ τ-ι C Ο Λ£ Ο Η- φ Ε Ο τ ,-ι J m y cm ·- +j ο ο «ο ο ο l. φ ιη i_tn ο c ο ο Φ τ to ja Φ —ιε·ΡΦ·ι- ο τιη> ϋ LU > "Ο > +-> ιη · ·Γ- Ο φ CQ Ν C > Ο ί ae 13 C -Ρ ο y φ < c φ — ro ο ιη ® τ j; ιη χ y y I- UJ y y ι— «3· *3- > Ε (Π ιη Ο. ι-ι y Μ σ> ι

C ·Γ- I

Φ τ +j Λϋ ι σ> ι ι οοο 13 £. (0 Φ C C Ο Ο οοο Φ Φ τ-ι c υ Ε ιη τ τ (ο ο οοο ι—I * > τ φ τ - ε 1_ μ— (— 13 iC α. tt>+j id id ισ ισ r- tn ο ο

Ctn -PC £..00)0) τ—ι -3- (0 Ο Φ Ο) T-l ι φ Τ ε +1+1+1 φ ο <σ ο o c τ—jcsm-o) οοο ε 3 ο CIDCTT ιη ι— C Ο (0 Ο ΟΟΟ 0 ε Ε ιη ·- co μ ί- Φ·ι-ιη οοο ,>s_ C0 Φ Ο "3- £-Φ ...

-Ρ ν φ i ae 13 · > ο ae φ -ο φ in moo Φ c χ: ιη ιηφφτο χ ο £- Φ > Ο Φ ιη ι-ι «3- Q Φ Η- t- t-l > Ε -Ρ CO Ο. HØ £Χ + II)

ίο I

£_ ι μ- c 3 φ τ •Ρ £_ ·Γ- -Ρ (0 1 13 y £- y Ο ί. 3 φ ιη ε S c 13 Ω.τ £- > Ο Ο ε -ρ φ ι τ s.

Φ (0 -Ρ-Ρ X +-> Ο. ·Ρ +-> Ε Φ Ο. y t n Ο) > (Λ -Ρ (0 CD) as'-"

ι— Ν -P-ι- I— φ OC > C

Φ (ØCC Φ Γ— (DC τ ·Γ- >0 ε εφο ε·>- εε -ρ c y +- ε -ι- -ι- > ja τ > y φ φ ·— (0 +->£.+-1 Ν (0 -ΡΝ (0 jQ I— (0 Ρ ο. ο i C -Ρ CL C φτ 013 ιη ο μ- φ ω ιη ο© cc sc ε — DK 167774 Bl I o 15

c ro ° ' i I

C- -r-CCO

i- O T- U "jj

ω Λ£ (UCO-Ό SrS'cS

° g’S.-S^

ί-φ 3 O io\c W O

Si O So?ie α I®«® O S

>TS t ro · <0 o ‘H10 O-S ro S

N C Φ 3 09 XS C > CO m _. ° ® c φ Γσ ΐΛΦτ-.r· ™ ω m m ro m^nro ‘°>E+J^ SeSJa*

c i , IS

» i « ·φ °'s

£_ O C C > O U -H

φ Λ£ U) O CM t T3 t t o O

i i~*2eSS. - S

^ I io^Sc^-r o ·- +j ιο α o ro o 03 c ··- φ ε ? T< ^ ro η m

30 O C O O - - > to CO &l-P S

e= 4J £ £ LO ··- <J> t- C O ' « ° σ>7; O

>13 c c CO · φ o φ O) io u> ‘H η h ro ° NC Φ Φ ! a?13C>oO)Cr-I ·

c <u .c s: to o o -i- -i- lo c ·γ- c: co m (i) c» m iS

ω * h -p c- w > e ^ co h c. -r α σ> C · r- I o

LO I (/) ’·" O) c T-I

(0 3 S- O C I ·γ- Φ .y φ i— Φ 0 -1-313Φ C4 O) -r- +· -r- > O ^ ™ ff 2 2

t— C V) £Z ·ι- CO *tf Φ OH £ O

i s y ο. -p ' os c- +j 4- φ U) O O y Ό <° Μ- Σ σ> o cvj ·ι— 4j 3 ε o (o φ · i _c ε 03 c ro

i— C LO C>c O c o o v- ^ O

_I c: 4_J i— Q; CO *r- 'Γ“ ·» ·ι-τΗ1-(0 O

LU > X5 -r- JC 03 £ «3 „ ® " 1 ° CO NC OP 09 £3 é9-OWi3 · <r C Φ (0 O O -I- O X O Φ O " 2 lo |— LU OiC CQ O ID i- ri Q. N ε U O £ O) O) C C 1 ^ μ- v- ε I 33 p l o oi o in i ε ro ·- φ m v Φ o O Φ LO ® o O) O) > C3-r- >LO> Δ O Φ I— c (0 (0 T (0 i. T T -r- r-1 4- O) Z-

Q I— I— P Φ P -C3 (0 O -3C

4- φ r- -r- O ^ Ό E y O CO W

•i- P ··- .C o <0 Φ t (0 o O -t- Φ ί_ φ Φ j_ q. o c > +J c o - ε Φ tn δ ε 4-1 CO O C0 ·“ -i-t-l. LO c > o > Ό XJ Ό 03 LO Φ 0) OlO ·4 Φ Φ NC r- ·γ- d? C LO d9 "O E X O) C O 0) c Φ (0 υ O -Γ- O Φ -r- Q. C ··“ 4- (0 O 0£ lu Λϋ o ro in l t in > +> ·“1 i- ro i o n

ίο I

j_| 4- C

3 Φ · P C +> ro i xj oc i- Od O S- 3 φ cn E flj C Ό

Cl ·Γ- i- > O O

g 4J φ I ·Γ- £_ φ (0 P P X4JQ. Ή +j Ε Φ cl .y cn 03 cn +j ro c 03 8) r— n p t- I— φ o c >c φ rocc Φ·— roe ··- -r- >o

Ε£ΦΟΕ·γ- Ε Ε Δ S- OC-P

s * ·.- » Λ -Γ- > Λί Φ ΦΓ- (0 4J I- P N CO *P N (0ώ r-ro 4J Q. O y C 9 Q- C Φ··- 013 to o 4- ro lu tn ΟΦ x .c

urv I O/ / /4- D I

16

Som vist i tabel 2 er de enzymologiske og fysisk-kemiske egenskaber hos det omhandlede enzym forskellig fra egenskaberne hos alle de kendte /3-galactosidaser. Det omhandlede enzym forener egenskaber med særlig høj varmestabilitet, bredt opti-5 malt pH-område og lav reakt ionsprodukt inhibering. Dvs. det omhandlede enzym har fremragende egenskaber, som de konventionelle enzymer ikke har. Således er det omhandlede enzym velegnet til højtemperaturbearbejdning af forskellige lactosehol-dige levnedsmidler og foderprodukter, såsom mælk, affedtet 10 mælk, ostevalle, lactoseopløsning osv., og det er således en industriel anvendelig jS-galactosidase.

Supplerende forsøg.

Inhiberingen med reaktionsproduktet måltes under anvendelse af et substrat med 1,50% ONPG indeholdende enten 25 eller 50 mM 15 glucose eller galactose. De øvrige forsøgsbetingelser var analoge med dem, der anvendtes ved bestemmelse af /3-galactosi-daseaktiviteten. Inhiberingsresultaterne er indføjet i tabel 2 - 2 og er vist grafisk på fig. 3, hvor den relative enzymatiske aktivitet er opstillet i forhold til sukkerkoncentratio-20 nen. Det fremgår, at galactosidasen ifølge opfindelsen afviger væsentligt fra enzymerne afledt af de stammer, der er kendt fra kendt teknik 3, 6 og 7 med hensyn til inhibering ved reaktionsproduktet som vist på fig. 3, og enzymet ifølge opfindelsen har således overlegne egenskaber sammenlignet med de fra 25 de kendte stammer udviklede enzymer. 1 det følgende vil den foreliggende opfindelse blive be- skrevet mere specifikt med reference til eksempler.

Eksempel 1

Thermus sp. ZK-001 (FERM BP-1678) podedes i 10 1 flydende me-30 dium indeholdende 0,2% glucose, 0,2% gærekstrakt, 0,2% tryp-ton, 10,0% uorganisk saltopløsning (indeholdende 1,0 5 nitri-lotrieddikesyre, 0,6 g CaS04.2H20, 1,0 g MgS04.7H20, 0,08 g DK 167774 B1 17

NaCl, 1,03 g KN03< 6,89 g NaN03 og 1,11 g Na2HP04 per 1 opløsning), 1% ferrichloridopløsning (indeholdende 0,28 g FeCl3.6H20 per 1 opløsning), 1,0% sporgrunds tof opløsning (indeholdende 0,5 ml H2S04, 2,2 g MnS04.H20, 0,5 g ZnS04.7H20, 5 0,5 g H3B03, 0,016 g CuS04-5H20, 0,025 g Na2Mo04.2H20 og 0,046 g CoC12.6H20), 0,001% thiamin-hydrochlorid, 0,001% nikotinamid, 0,001% biotin og 0,001% p-aminobenzoesyre og med en pH-værdi indstillet på 7,6 med NaOH, og dyrkedes under beluft-ning i et gæringskar på 20 1 ved 70°C i 24 timer. Dyrkningsop-10 løsningens enzymatiske aktivitet var 0,84 enheder/ml.

Denne dyrkningsopløsning centrifugeredes ved 12.000 x g ved 20°C i 30 min. til opsamling af cellemasser, hvorved der blev opnået 107 g cellemasse. Til den opnåede cellemasse sattes ca.

600 ml phospha tpuf fer (10 mM, pH 7,0) til ekstraktion. Den så-15 ledes behandlede cellemasse blev sprængt i en mølle til eks-trahering af et enzym. Ekstrakten centrifugeredes ved 40.000 x g i 60 min., og den resulterende ovenstående væske blev bibeholdt. Efter ekstrahering af et bundfald ved tilsætning af 400 ml af ovennævnte phosphatpuffer til ekstraktion centrifugere-20 des ekstrakten på lignende måde, og den ovenstående væske blev bibeholdt. Derved blev der opnået 975 ml rå enzymekstrakt indbefattet den tidligere opnåede ovenstående væske. Denne rå enzymopløsning mættedes til 60% ved tilsætning af 380 g ammoniumsulfat og henstilledes natten over til dannelse af et bund-25 fald. Derefter opsamledes bundfaldet ved centrifugering ved 30.000 x g i 60 min. Det opsamlede bundfald opløstes i ca. 30 ml 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0), og dialyseredes derefter mod den nævnte puffer. Efter eliminering af et bundfald i den dialyserede enzymopløsning ved centrifugering af enzymopløsningen 30 ved 40.000 x g i 60 min., blev den resulterende enzymopløsning ført på en kolonne (5 cm x 45 cm) af DEAE-TOYOPEARL ækvilibre-ret med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0).Derefter elueredes enzymet i overensstemmelse med koncentrationsgradientmetoden med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0 til 0,5 M NaCl.

35 48,0 ml elueret aktiv fraktion koncentreredes til ca. 10 ml ved anvendelse af et ultrafilter (PM-10 fremstillet af Amicon 18 UIV ΙΟ// /Hr Dl

Corp.), og det resulterende koncentrat dialyseredes natten over under anvendelse af 10 τηΜ phosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1 M NaCl. Den således behandlede enzymopløsning førtes gennem en gel fil treringskolonne (2,6 cm x 95 cm) af Se-5 phacryl S-300 ækvilibreret med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0) indeholdende 0,1 M NaCl for at isolere 3 aktive fraktioner. Disse 3 fraktioner blev kombineret, dialyseret natten over under anvendelse af 10 mM phosphatpuffer og fyldtes derefter på en kolonne af Sepharose 4B, hvortil paminophenyl-/3-D-thioga-10 lactopyranosid ækvilibreret med den nævnte puffer var kovalent blindet. Efter omhyggelig vask af denne kolonne med 10 mM phosphatpuffer (pH 7,0), førtes 0,1 M boratpuffer gennem kolonnen for at eluere og isolere aktive fraktioner. Derved blev der opnået ca. 8,5 mg af det omhandlede enzym.

15 Eksempel 2

Thermus sp. ZK-002 podedes i'10 1 af samme medium som i eksempel 1 bortset fra, at der blev anvendt 0,2% opløselig stivelse i stedet for glucose. Dyrkningen gennemførtes under samme betingelser som i eksempel 1, hvorved der blev opnået en kultur-20 opløsning indeholdende 0,64 enheder/ml. Derefter gennemførtes oprensningen på samme måde som i eksempel 1, hvorved der blev opnået ca. 6,8 mg af det omhandlede enzym.

Eksempel 3

Thermus sp. ZK-003 podedes i 10 1 medium med samme sammensæt-25 ning, som beskrevet i eksempel 1 og dyrkedes under de samme betingelser som i eksempel 1, hvorved der blev opnået en kulturopløsning indeholdende 0,68 enheder/ml. Derefter gennemførtes oprensningen på samme måde som i eksempel 1, hvorved der blev opnået ca. 7,3 mg af det omhandlede enzym. 1 I nærværende beskrivelse og krav betyder symbolet "M" molari-tet (molar opløsning), dvs. koncentrationen udtrykt i mol per 1.000 ml opløsning, som det normalt anvendes indenfor det ke-

Claims

1. Stamme af slægten Thermus, kendetegnet ved, at den er valgt fra gruppen bestående af FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr. 9184), FERM PH-1679 (Bikoken-kinki nr. 9185) og FERM BP-1680 (Bikoken-kinki nr. 9186) og producerer en /3-galactosi- 10 dase med en optimal temperatur fra 75 til 85°C, en optimal pH-værdi fra 4,5 til 6,5 og en enzymatisk aktivitet, der ikke sænkes væsentligt ved tilstedeværelsen af 50 mM af hver af galactose og glucose.

2.

/3-galactosidase, kendetegnet ved, at den er 15 identisk med det enzym, der dannes ved dyrkning af en stamme af slægten Thernus valgt fra gruppen bestående af FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr. 9184), FERM BP-1679 (Bikoken-kinki nr. 9185) og FERM BP-1680 (Bikoken-kinki nr. 9186), og har en optimal temperatur fra 75 til 85°C, en optimal pH-værdi på 4,5 20 til 6,5 og en enzymatisk aktivitet, som ikke sænkes væsentligt i nærværelse af 50 mmol af hver af galactose og glucose. 1 Fremgangsmåde til fremstilling af jS-galactosidase ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man dyrker en stamme hørende til slægten Thermus, der er valgt fra gruppen be- 25 stående af FERM BP-1678 (Bikoken-kinki nr. 9184) , FERM BP-1679 (Bikoken-kinki nr. 9185) og FERM BP-1680 (Bikoken-kinki nr. 9186) , og som producerer en /3-galactosidase med en optimal temperatur på 75 til 85°C, en optimal pH-værdi på 4,5 til 6,5 og en enzymaktivitet, som ikke sænkes væsentligt ved 50 mM af 30 hver af galactose og glucose, og opsamler den dannede jS-ga-lactosidase. uiv lb///^- b i

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at dyrkningen gennemføres aerobt ved en temperatur på 50 til 80°C.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, kendetegnet 5 ved, at dyrkningen gennemføres ved en pH-værdi på 6 til 8,5.

6. Anvendelse af β-galact os idasen ifølge krav 2 til fremstilling af galactose og/eller glucose ud fra lactose.