KR20110017208A

KR20110017208A - 벌에서 분리된 신규한 바실러스 속 ｈｙ―２０ 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제

Info

Publication number: KR20110017208A
Application number: KR1020090074771A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 배경숙; 오현우; 김도영; 한미경; 이란희; 신동하
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-08-13
Filing date: 2009-08-13
Publication date: 2011-02-21
Also published as: KR101091150B1

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) HY-20 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제(xylanase)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 벌(Apis melifera)의 장으로부터 분리한 신규한 미생물 바실러스 속 HY-20 균주 및 상기 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제에 관한 것이다. 본 발명의 HY-20 균주 및 자일라나제는 서열 및 생화학적 특성이 차이가 있는 신규한 것으로서 자일라나제를 이용하는 여러 연구 및 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

바실러스 속(Bacillus sp.) HY-20 균주, 자일라나제(xylanase).

Description

벌에서 분리된 신규한 바실러스 속 ＨＹ―２０ 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제{Novel Bacillus sp．HY―２０ strain isolated from Apis melifera and xylanase produced from it}

본 발명은 바실러스 속(Bacillus sp.) HY-20 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제(xylanase)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 벌(Apis melifera)의 장에서 분리된 신규한 바실러스 속 HY-20 균주 및 상기 균주가 생산하는 자일라나제의 용도에 관한 것이다.

곤충은 지구상에서 가장 번성한 생물군으로서 다양한 먹이습성과 높은 생물학적 다양성을 나타내고 있다. 이러한 곤충의 생물특성을 고려한 곤충공생미생물을 유용한 생물자원으로 활용하고자 하는 연구가 증가되고 있으며, 특히 곤충의 생육과 밀접한 관련이 있는 장내 미생물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Dillon, R. J. et.al., Annu. Rev. Entomol, 49, 71-92, 2004). 특히, 식물의 목질부를 가해하는 주요 곤충인 흰개미의 장내미생물로부터 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase) 및 리그니나제(ligninase)를 분리하고자 하는 연구가 오래 전부터 집중적으로 수행되어 왔으며 다양한 연구결과들이 보고되었다(Varma, A. et.al., FEMS Microb Rev, 15, 9-28, 1994; Watanabe, H. et.al., Nature, 394, 330-331, 1998). 그 외에도 초식성 곤충의 섭식특성에 착안하여 자일라나제(xylanase) 또는 셀룰라제(cellulase)를 생산하는 균주를 분리한 사례(Teunissen, M. J. et.al., Arch. Microbiol, 156, 290-296, 1991; Watanabe, H. et.al., Nature, 394, 330-331, 1998), 동물성 먹이를 포식하는 무당거미로부터 고효율의 단백질 분해 효소를 생산하는 균주를 분리하여 산업적으로 응용하고 있는 사례(Lee, G. E. 및 H. Y. Park., Kor. J. Microbiol. 40, 269-274, 2004), 톱하늘소의 장으로부터 고효율의 lipase를 생산하는 균주를 분리하고 동정한 사례(Park, D. S. 및 H. Y. Park., Korean J. Appl. Entomol, 46, 1-9, 2007)와 그 외 나비목, 딱정벌레목을 포함하는 여러 가지 곤충에서 분자생물학적 기법을 활용한 장내 미생물의 생태적 연구들이 보고되고 있다(Egert, M. 및 Friedrich, M., Appl. Environ. Microbiol, 69, 6656-6668, 2003).

자일란(Xylan)은 식물의 세포벽을 구성하는 헤미세룰로즈(hemicellulose)의 주성분으로 셀룰로즈(cellulose) 다음으로 자연계에 풍부하며 재생 가능한 탄수화물이다. 자일란(Xylan)은 자일로피라노제(xylopyranose)의 β-1,4 결합으로 이루서진 고분자 물질로서 일반적으로 아세틸 그룹(acetyl group), L-아라비노퓨라노제(L-arabinofuranose) 및 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 등이 치환된 이질 탄 수화물로 존재하고 있다(Biely, P., Trends. Biotechnol., 3, 286-290, 1985). 그러므로 자일란(xylan)을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 엔도-1,4-β-자일라나제(endo-1,4-β-xylanase), β-자일라나제(β-xylanase), α-글루크로니다제(α-glucuronidase), α-L-아라비노퓨라노제(α-L-arabinofuranose) 및 아세틸에스테라제(acetylesterase) 등의 몇 가지 효소의 협동적 작용이 필요하다(Bachmann, S. L., et.al., Appl. Environ. Microbiol, 57, 2121-2130, 1991). 이 중 자일라나제(xylanase)는 기질에 대한 분해 양식에 따라 엔도자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(xylosidase)의 세 가지 종류로 구분되어 질 수 있으며 자일란(xylan)의 가수분해 과정에서 가장 중요한 역할을 담당한다.

자일라나제(Xylanase)는 제지의 표백공정, 사료효율 개선, 과일음료의 청징, 제빵의 고품질화 또는 농산 부산물 이용 등에서 널리 이용되고 있으며 다양한 미생물에 의해 생산된다. 제지산업에서는 표백공정에 응용하기 위한 내알칼리성 또는 내열성 자일라나제(xylanase)가 여러 세균으로부터 분리되었으며(Tenkanen, M. et.al., Enzyme. Microb. Technol, 14, 566-574, 1992), 셀룰라제(cellulase)의 활성이 없는 자일라나제(xylanase) 생산균도 다수 보고되어 제지용 셀룰라제(cellulose)의 손실을 줄이고자 하는 연구결과가 보고되었다(Khashin, A. et.al., Appl. Environ. Microbiol, 59, 1725-1730, 1993; Kosugi, A. et.al., J. Bacteriol, 183, 7037-7043, 2001). 또한, 자일라나제(xylanase)를 처리하여 빵의 품질을 개선하거나(Courtin, C. M. et.al., J. Agric. Food. Chem, 47, 1870-1877, 1999), β-자일로시다제(β-xylosidase) 및 자일라나제(xylanase)의 유전자가 도입된 효모로서 농임산 부산물을 미생물이 이용할 수 있도록 당화시키는 연구가 보고되었다(La Grange, D. C. et.al., Appl. Environ. Microbiol, 67, 5512-5519, 2001). 현재 사료산업에서는 자일라나제(xylanase)가 사료첨가용 효소로 시판되어 사용되고 있는데, 상기 효소는 곡물 사료 섭취시 헤미셀룰로즈(hemicellulose)로 인한 가축의 장내의 점질도를 낮추어주는 기능을 함으로써 가축의 소화기 질병을 예방하고 사료효율을 향상시키는 것으로 알려져 있다(McCracken, K. J. et.al., Br. Poult. Sci, 42, 638-642, 2001).

현재 알려진 국내의 자일라나제 관련 특허로는 자일라나제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 2001-0111986), 고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한민국 공개특허 2000-0034279), 바실러스 속 AMX-4(Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나제(xylanase)를 코드하는 신규한 자일라나제 유전자(대한민국 공개특허 2003-0085679) 및 신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주의 자일라나제(대한민국 공개특허 2007-0082329) 등이 있으나 실제로 국내에서 여러 분야에 사용되지 못하고 있는 실정이다. 따라서 새로운 특성을 가지는 자일라나제의 연구가 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 벌(Apis melifera)의 장에서 분리된 자일라나제를 생산하는 신규한 미생물인 바실러스 속(Bacillus sp.) HY-20 균주를 선별하여 이로부터 분리된 자일라나제를 분리 정제하고 그 특성을 확인하였으며, 자일라나제의 대량 생산을 위한 최적의 배양조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 벌(Apis melifera)의 장으로부터 분리한 신규한 미생물인 바실러스 속 HY-20(Bacillus sp. HY-20) 균주 및 상기 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제(xylanase)를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 바실러스 속 HY-20(Bacillus sp. HY-20) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제(xylanase) 효소 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다.

아울러, 본 발명은 바실러스 속 HY-20 균주를 이용하여 자일라나제를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 신규한 바실러스 속 HY-20(Bacillus sp. HY-20) 균주를 선별하였고, 상기 균주로부터 생산한 자일라나제가 비교적 넓은 범위의 온도 및 pH에서 우수한 효소 활성을 나타냄을 확인하였으며, 상기 신규한 자일라나제를 대량 생산할 수 있는 최적의 배양 조건을 확립함으로써 자일라나제를 이용하는 여러 연구 및 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 신규한 바실러스 속 HY-20(Bacillus sp. HY-20) 균주를 제공한다.

상기 균주는 벌(Apis melifera)의 장으로부터 분리된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 벌의 장을 세균 분리용 배지에 도말하여 형성된 세균 콜로니를 버치우드 자일란(birchwood xylan)이 함유된 제한배지에 접종하여 배양한 후 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 효소 활성이 가장 우수한 균주를 선별하였다.

본 발명에서는 상기 선별한 균주의 16S rDNA의 염기서열(서열번호 1)을 결정하고 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database)를 통해 검색한 결과, 바실러스 속 균주와 99%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 이에, 상기 균주는 바실러스 속인 것으로 동정하였으며 '바실러스 속 HY-20'으로 명명하였다. 상기 바실러스 속 HY-20 균주는 2008년 3월 27일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 11304BP).

본 발명에서는 상기 바실러스 속 HY-20 균주의 배양 시간에 따른 자일라나제의 생산 정도를 분광광도계를 이용하여 분석한 결과, HY-20 균주의 성장이 후기 대수기를 지날 때부터 자일라나제의 생산이 시작되어, 접종 17시간 이후에 50 U/ml의 최대 생산 활성을 나타냄을 확인하였다(도 1 참조).

따라서, 본 발명의 바실러스 속 HY-20 균주는 16S rDNA가 바실러스 속 균주와 99%의 상동성을 가지며, 벌에서 분리하였으며, 높은 자일라나제 생산능과 효소학적 특성이 있음으로써 신규한 미생물임을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 속 HY-20 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제 효소, 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다.

상기 자일라나제는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 자일라나제는 45℃ ~ 60℃ 온도에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하고, 55℃ 온도에서 최대 활성을 나타내는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 자일라나제는 pH 5.0 ~ 9.0에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하고, pH 6.0 ~ 7.0에서 최대 활성을 나타내는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 자일라나제는 Mn, Co 또는 Fe 이온에 의해 효소 활성이 증가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 바실러스 속 HY-20 균주가 생산하는 자일라나제를 정제하기 위하여 균주를 버치우드 자일란을 포함하는 액체배지에서 배양한 후, 침전제를 넣어 수용성 단백질을 침전시키고 침전물을 회수하였다. 상기 침전물을 용해시킨 후 투석막으로 투석하여 CM-양이온교환수지 컬럼크로마토그래피, 겔여과 컬럼크로마토 그래피를 단계적으로 실시하여 정제하였다.

본 발명자들은 바실러스 속 HY-20 자일라나제의 클로닝을 위해 기존에 보고된 바실러스 푸밀러스 균주들의 자일라나제 아미노산 서열을 바탕으로 축퇴 프라이머(degenerate primers)(Bp-F: CATCATCARCTKGGCAACAT; Bp-R: TTCATACATTTTRCCCATYGG)를 제작하였으며 DNA walking과 nested PCR 기법을 활용하여 상기 자일라나제의 전체 염기서열(서열번호 2) 및 아미노산서열(서열번호 3)을 결정하였다. 본 발명의 자일라나제는 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database) 검색 결과, 바실러스푸밀러스(Bacillus pumilus) 균주의 자일라나제와 97%의 아미노산 서열 상동성을 보이는 새로운 자일라나제로 판명되었다.

본 발명자들은 본 발명의 자일라나제의 최적 반응 조건을 알아하기 위하여, 반응 온도, 반응액의 pH, 및 금속이온의 영향을 알아보았다. 상기 자일라나제의 열 안정성은 50℃에서 그 활성의 1/2을 유지하였으며, 자일라나제의 최대 활성이 발휘되는 최적 온도는 55℃인 것을 확인하였다(도 2 참조). 상기 자일라나제의 최대 활성 pH는 pH 5 ~ 9에서 최대 활성을 유지하였으며, 자일라나제 활성의 최적 조건은 pH 6 ~ 7임을 확인하였다(도 3 참조). 상기 자일라나제는 Mn²⁺, Co²⁺, 또는 Fe²⁺ 이온 첨가시 그 활성이 증가하는 것을 확인하였다(표 1 참조).

따라서, 본 발명의 자일라나제는 기존의 알려진 자일라나제와 97%의 아미노산 서열 상동성을 가지며, 열 안정성, 산도 안정성 및 이온 반응성이 특이적인 신규한 효소임을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 신규한 자일라나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 HY-20 균주 및 자일라나제는 서열 및 생화학적 특성이 차이가 있는 신규한 것으로서, 상기 HY-20 균주로부터 분리한 자일라나제를 암호화하는 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제작할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 자일란(Xylan)을 포함하는 배지에서 본 발명의 바실러스 속 HY-20 균주, 또는 상기 균주 유래 자일라나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 삽입한 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 바실러스 속 HY-20 균주로부터 자일라나제를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 배지는 자일리톨(Xylitol)을 추가적으로 첨가하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 자일리톨은 버치우드 또는 옥수수 유래 자일리톨인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으면 모든 자일리톨이 사용가능하다. 상기 자일리톨은 총 배지 조성에 대한 10 내지 50 중량부를 첨가하는 것이 바람직하고, 20 내지 40 중량부를 첨가하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 침전제로는 황산 암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 상기 침전은 다양한 구멍의 크기(pore size)를 가지는 막을 이용한 한외여과법으로 대체하여 농축하는 방법으로 수행할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.

본 발명에서는 바실러스 속 HY-20 균주로부터 자일라나제를 생산하기 위한 최적의 배지 조성을 확립하기 위해, 다양한 조성의 배지를 이용하여 배양한 후 자일라나제의 활성을 측정하였다. 그 결과, 바실러스 속 HY-20 균주는 단당류 탄소원에서 높은 활성을 보였고 최고 수율을 나타내었지만, 다당류인 자일란이 배제되는 경우 급격한 활성의 감소를 보여 단당류 및 다당류를 조합한 복합 탄소원을 요구함을 알 수 있었다(표 3 참조). 또한, 자일란 기질의 경우 배양액 중 농도에 의 해 효소의 생산성이 농도의존적으로 반응하여 효소의 유도 및 탄소원으로서 가장 중요한 인자임을 알 수 있었다. 아울러, 바실러스 속 HY-20 균주의 대량 배양을 위해 자일리톨을 활용하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 배지 조성 중 자일리톨에 따른 자일라나제 생산 정도를 확인하기 위해, 발효조에서 다양한 자일리톨 농도로 균주의 증식 및 자일라나제의 생산량을 측정하였다. 그 결과, 바실러스 속 HY-20 균주는 자일리톨을 이용하면 자일라나제 생산을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 바실러스 속 HY-20 균주로부터 자일라나제를 생산하는 최적의 배지 조성을 확립함으로써, 다양한 용도로 사용되는 자일라나제를 산업적으로 대량 생산할 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해서 한정되지는 않는다.

<실시예 1> 균주의 분리 및 선별

본 발명자들은 벌(Apis melifera)을 대전 인근에서 채집하여 살아있는 상태로 연구실로 운반하여 드라이아이스로 고정시켜 사용하였다. 자일라나제를 생산하는 세균의 분리를 위해 대상 곤충을 70%(w/w) 에탄올에 1 내지 2분 정도 침지하여 살균한 다음, 충체에 묻어 있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 2회 세척하였다. 세척한 충체를 해부하여 내장을 분리한 다음 완충액(Phospate buffered saline; 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na₂HPO₄, 0.024% KH₂PO₄)을 넣고 분쇄하였으며, 여기서 얻어진 추출물을 단계적으로 희석하여 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 첨가한 고체배지에 도말한 다음 25℃에서 2일간 배양후 Congo-red 염색법(Skiper, N. et.al., Science, 230, 958-960, 1985)으로서 자라난 콜로니 주변에 투명환을 형성하는 균주를 1차적으로 선별하였다. 상기의 방법으로 선별된 균주들을 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)이 함유된 제한 배지(K₂HPO₄ 7g/L, KH₂PO₄ 2g/L, (NH₄)₂SO₄ 1g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 1.1g/L, 효모 추출물 0.6g/L) 3 ㎖에 접종하여 25℃의 진탕 배양기에서 48시간 배양 및 원심분리한 후 상등액을 회수하여 자일라나제 활성을 측정하고, 그 중 자일라나제 활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다. 상기 효소 활성은 DNS(dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller, G. L., Anal.Chem., 55, 952-959, 1959)을 사용하였고, 구체적으로는 100 ㎕의 효소용액에 100 ㎕의 기질용액(1% 버치우드 자일란이 포함된 50 mM 인산나트륨, pH 6.5)을 넣고 50℃에서 10분간 반응시킨 후 700 ㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 처리한 후 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 효소의 1유니트(unit)는 1분 동안에 1μmol의 환원당을 방출시키는 효소양으로 정하였다.

<실시예 2> 분리된 균주의 동정

본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 벌의 장으로부터 분리된 균주를 동정하기 위해, 16S rDNA의 염기서열을 조사하였다. 분리된 균주의 16S rDNA 염기서열 결정을 위하여 균주의 게놈 DNA를 분리하였으며 PCR을 위한 반응물은 다음과 같은 조성으로 50 ㎕의 반응을 실시하였다. 1 ㎕의 게놈 DNA(50 ~ 100 ng/㎕)에 10배의 Tag DNA 중합효소 완충액(MgCl₂첨가) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 2 ㎕, 10 pmol의 정방향 프라이머(27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')(서열번호: 4)와 역방향 프라이머(1492r: 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호: 5)를 각각 1 ㎕, 1 ~ 2 단위의 Tag DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하여 최종 50 ㎕ 반응액이 되도록 증류수를 더하였다. 프라이머들은 진핵세균의 16S rDNA 부위에 해당하는 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위해 합성하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간의 변성(denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초의 변성, 50℃에서 30초의 어닐링(annealing), 72℃에서 3분의 연장(extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지되었다.

그 결과, 확보된 증폭단편의 염기서열(서열번호 1)을 결정하고 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database) 검색 결과, 바실러스 속 균주와 99%의 상동성을 나타내었다.

따라서, 상기 분리균은 바실러스 sp.에 속하는 것으로 동정하였으며 '바실러스 sp. HY-20'으로 명명하였다. 상기 바실러스 sp. HY-20 균주는 2008년 3월 27일 자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 11304BP).

<실시예 3> 자일라나제의 분리 및 정제

본 발명자들은 분리 및 동정한 바실러스 속 HY-20 균주가 생산하는 자일라나제를 다음과 같이 순수 분리하였다. 구체적으로, 바실러스 속 HY-20 균주를 0.5%(wt/v) 버치우드 자일란(birch wood xylan) 및 0.5%(wt/v) 효모 추출물을 포함하는 M9 최소배지(Sigma Chem. Co.)에서 48시간 배양한 후 원심분리하여 회수한 상층액에 황산암모늄 분말을 70% 포화되게 첨가한 다음 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 상기의 침전물에 50 mM MES (pH 6.0) 완충액을 가하여 침전물을 용해시킨 다음, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전을 제거한 다음 50 mM MES 완충액(pH 6.0)로 4℃에서 12시간 투석(PIERCE, MW cutoff 10 kDa)하여 조효소액을 얻었다. 효소의 컬럼 크로마토그래피를 위하여 FPLC system(Amersham-Pharmacia Biotech)을 사용하였다. 우선, 50 mM MES 완충액으로 평형화 된 Hiprep 16/10 CM FF(Amersham Pharmacia Biotech Inc) 컬럼에 샘플을 로딩(loading) 후 0 ~ 1.0 M NaCl 선형 농도구배로서 3 ml/min의 유속으로 용출하였다. 이때 약 0.35 ~ 0.4 M의 NaCl 농도에서 용출되는 효소 활성 분획만을 취하여 50 mM MES 완충액으로 평형화된 Hiload^TM 26/60 Superdex^TM 200 pg(Amersham Pharmacia Biotech Inc) 컬럼을 이용하여 2 ml/min의 유속으로 용출하여 효소활성을 갖는 분획만을 취하였으며, 정제 여부를 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 활성 분획을 동결건조하여 -20℃에 보관하며 사용하였다.

상기 바실러스 속 HY-20 균주의 배양 시간에 따른 자일라나제의 생산 정도를 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 분석한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 바실러스 속 HY-20 균주의 성장이 후기 대수기를 지날 때부터 자일라나제의 생산이 시작되어, 접종 17시간 이후에 50 U/ml의 최대 생산 활성을 나타내었다(도 1).

<실시예 4> 자일라나제의 아미노산 서열 결정

본 발명자들은 상기 <실시예 3>에서 순수 분리된 자일라나제의 클로닝 및 서열을 결정하기 위해 바실러스 속 중 바실러스 sp. HY-20과 상대적으로 계통학적 상동성이 높았던 바실러스 푸밀러스 균주들의 자일라나제를 선별하였으며, 이들 자일라나제의 서열 분석을 통해 축퇴성 프라이머[Bp-F: CATCATCARCTKGGCAACAT(서열번호: 6); Bp-R: TTCATACATTTTRCCCATYGG(서열번호: 7)]를 제작하였고, 반복된 DNA walking 과 nested PCR 기법 (DNA walking speedup kit, Seegene)을 통해 상기 자일라나제의 전체 염기서열과 아미노산 서열을 결정하였다. PCR 증폭 조건은 Hot Start PCR kit(Roche, USA)를 사용하여 상기에 기재된 축퇴성 프라이머 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 95℃에서 30초, 40℃에서 30초 및 72℃에서 30초 반응시키고, 72℃에서 7분간 연장시켜 반응을 종결하였다.

그 결과, 본 발명의 자일라나제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서 유전자원 은행 데이타베이스(Genebank database) 검색 결과, 바실러스푸밀러스(Bacillus pumilus) 균주의 자일라나제와 97%의 아미노산 서열 상동성을 보이는 새로운 자일라나제로 판명되었다.

<실시예 5> 자일라나제의 생화학적 특성 조사

본 발명자들은 자일라나제의 최적 반응 조건을 조사하기 위하여 반응 온도, 반응액의 pH, 및 금속이온의 영향을 알아보았다.

우선, 효소 활성의 최적 온도는 35 ~ 65℃ 범위에서 5℃ 간격으로 효소 활성을 측정하였으며, 안정적으로 희석된 효소와 1.0%(wt/v) 버치우드 자일란이 포함된 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.5)으로 구성된 표준 분석 혼합물(0.5 ml)을 이용하여, 37℃ ~ 55℃의 온도에서 각각 10분간 노출시킨 후 잔존 효소 활성을 측정하는 방법을 이용하여 효소의 열안정성을 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 자일라나제의 열 안정성은 50℃에서 30 min간 그 활성의 1/2을 유지하였으며, 자일라나제의 최대활성이 발휘되는 최적온도는 55℃인 것을 확인하였다(도 2).

또한, 효소 활성의 최적 pH는 50 mM 시트레이트(citrate) 완충용액(pH 4.0 ~ 5.5), 50 mM 인산나트륨 완충용액(pH 6.0 ~ 7.5), 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0 ~ 8.5) 및 50 mM 글리신(glycine)-NaOH 완충용액(pH 9.0 ~ 10.0)을 사용하였다. 즉, 안정적으로 희석된 효소와 1.0%(wt/v) 버치우드 자일란이 포함된 완충용액으로 구성된 표준 분석 혼합물(0.5 ml)을 이용하였으며, 50℃의 온도에서 10분 동안 전처리한 후, 50℃의 온도에서 15분간 노출시킨 후 자일라나제의 pH 안정성을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 자일라나제의 산도(pH)에 따른 안정성은 pH 5 ~ 9에서 최대 활성을 유지하였으며, 자일라나제 활성의 최적 조건은 pH 6 ~ 7임을 확인하였다(도 3).

또한, 자일라나제에 대한 금속이온의 영향을 알아보기 위해, 다양한 종류의 금속이온(Sigma Chem. Co.)(1 mM) 및 화학적 시약(5 mM)를 각각 자일라나제에 첨가하여 반응시킨 후, 자일라나제의 활성을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 자일라나제는 Mn²⁺, Co²⁺ 및 Fe²⁺ 이온 첨가시 그 활성이 증가하는 것을 확인하였다(표 1).

자일라나제 활성에 대한 금속이온 및 화학시료의 영향

화합물	상대적 활성 (%)
무처리	100
HgCl₂	0
CaCl₂	93
NiSO₄	93
CuCl₂	72
ZnSO₄	100
MgSO₄	99
MnCl₂	126
SnCl₂	104
BaCl₂	105
CoCl₂	112
FeSO₄	120
N-브로모숙시니미드(N-Bromosuccinimide)	0
아이오도아세트아미드(Iodoacetamide)	97
아지드화 나트륨(Sodium azide)	128
N-에틸말레이미드(N-Ethylmaleimide)	94
EDTA	112
Tween 80 (0.5%)	100
Triton X-100 (0.5%)	117

<실시예 6> 산업적 배양을 위한 배양 조건 확립 실험

본 발명자들은 바실러스 속 HY-20 균주로부터 자일라나제의 산업적 대량 생산을 위한 배지 조성을 확립하기 위해, M9 완성 배지[2가 인산나트륨(Disodium phosphate)(Anhydrous): 6.78 g/l, 1가 인산칼륨(Monopotassium phophate): 3 g/l, 염화나트륨(Sodium Chloride): 0.5 g/l, 염화암모늄(Ammonium Chloride): 1 g/l](Sigma, St.Louis USA)를 사용하였으며, 하기 표 2의 실험 계획표에 따른 탄소원을 첨가하여 실험을 진행하였다(표 2).

	조성물 (g/L)
	A	B	C	D	E	F	G	H	I	J	K	L	M	N	O
	25
M9 배지		11	11	11	11	11	11	11	11	11	11	11	11	11	11
효모 추출물		5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5	5
버치우드 자일란(Birchwood Xylan)		5	5	5	5	5	5	5	5	5	5			F	F
말토오즈			5	10	15
글루코즈						5
갈락토즈							5
수크로즈								5
GMP											2
버치우드 자일리톨									5			5		5
옥수수 자일리톨										5			5		5
필란드 버치우드의 자일리톨 중국 옥수수의 자일리톨 F: 피딩(Feeding) 2.5 g/L

탄소원이 첨가되지 않은 대조군을 포함하여 총 15개의 실험구를 진행하였으며, 각 균주별, 각 탄소원별, 및 각 배양시간별 효소 활성을 측정하였다. 배양시간의 밑줄 친 부분은 최고 수율이 아닌 최종 발효시간을 표시하며, 효소 생산성 위주의 실험을 수행하였다.

다양한 배지에서 바실러스 속 HY-20 균주의 자일라나제 활성

	자일라나제 활성 (Unit/mL)	배양시간 (h)
A	1	48^*
B	79	21
C	81	24
D	57	24
E	59	24
F	58	24
G	55	24
H	55	18
I	135	28.5
J	139	28.5
K	64	21
L	0	-
M	0	-
N	44	36^*
O	41	36^*

그 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이 바실러스 속 HY-20 균주의 경우 단당류 탄소원에서 높은 활성을 보였고 최고 수율을 나타내었지만, 다당류인 자일란이 배제되는 경우 급격한 활성의 감소를 보여 단당류 및 다당류를 조합한 복합 탄소원을 요구함을 알 수 있었다(표 3). 또한, 자일란 기질의 경우 배양액 중 농도에 의해 효소의 생산성이 농도의존적으로 반응하여 효소의 유도 및 탄소원으로서 가장 중요한 인자임을 알 수 있었다. 아울러, 바실러스 속 HY-20 균주의 산업적 배양을 위해 자일리톨을 활용하는 것이 효과적임을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 배지조성 중 자일리톨에 따른 자일라나제 생산 정도를 확인하기 위해, 발효조를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, 쉐이크 플라스크(Shake Flask)(500 mL, Bellco)에서 증식된 바실러스 속 HY-20 균주를 발효조(Fermentor)(KO-Biotech, Korea)에 접종(종균 크기 = 1 %, v/v)하였다. 배양 배지는 M9 배지(Na₂HPO₄ 6.78 g/l, KH₂PO₄ 3 g/l, NaCl 0.5 g/l, 및 NH₄Cl 1 g/l)를 기본으로 하기 표 4와 같은 배지 조성으로 각각 수행하였으며(표 4), 각 실험군에서 균주의 증식 및 자일라나제의 생산량을 측정하였다.

배양 배지의 조성

	실험군 A	실험군 B	실험군 C
M9 배지	11.28 g/L	11.28 g/L	11.28 g/L
효모 추출물	5 g/L	5 g/L	5 g/L
버치우드 자일란	5 g/L	5 g/L	5 g/L
자일리톨(옥수수, 중국)	-	5 g/L	10 g/L

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 바실러스 속 HY-20 균주는 자일라나제 생산을 위해 자일란을 사용하는 것 뿐만 아니라 자일리톨을 활용하여 자일라나제 생산을 할 수 있음을 확인하였다(도 4).

본 발명의 바실러스 속 HY-20 균주로부터 생산되는 자일라나제는 안정성 및 우수한 활성을 가지는 신규한 효소로서, 최적의 배지 조성을 통해 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써, 자일라나제를 이용하는 여러 연구 및 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 바실러스 속 HY-20 균주(Bacillus sp. HY-20)를 버치우드 자일란 및 효모 추출물을 포함하는 M9 최소배지에서 배양한 후, 배양시간에 따른 자일라나제의 생산 정도를 나타내는 그래프이다:

●: 세포 증식(cell growth); 및

○: 자일라나제 활성.

도 2는 바실러스 속 HY-20 균주로부터 분리한 자일라나제의 생화학적 특성 중 최적 반응 온도를 알아보기 위해, 자일라나제와 버치우드 자일란이 포함된 인산나트륨 완충용액(pH 6.5)으로 구성된 표준 분석 혼합물을 이용하여, 35℃ ~ 65℃의 온도에서 각각 10분간 노출시킨 후 잔존 효소 활성을 측정하는 방법을 이용하여 자일라나제의 온도에 따른 상대적인 활성(%)을 나타내는 그래프이다:

●: 자일라나제 활성; 및

○: 자일라나제 안정성.

도 3은 바실러스 속 HY-20 균주로부터 분리한 자일라나제의 생화학적 특성 중 최적 반응 pH를 알아보기 위해, 자일라나제와 버치우드 자일란이 포함된, 시트레이트(citrate) 완충용액(pH 4.0 ~ 5.5), 인산나트륨 완충용액(pH 6.0 ~ 7.5), Tris-HCl 완충용액(pH 8.0 ~ 8.5) 및 글리신(glycine)-NaOH 완충용액(pH 9.0 ~ 10.0)을 사용하여 50℃의 온도에서 10분간 노출시킨 후 잔존 효소 활성을 측정하는 방법을 이용하여 자일라나제의 pH에 따른 상대적인 활성(%)을 나타내는 그래프이다:

●: 자일라나제 활성; 및

○: 자일라나제 안정성.

도 4는 바실러스 속 HY-20 균주를 XM 배지(●), 상기 XM 배지에 5 g/L 자일리톨을 첨가한 배지(○), 및 상기 XM 배지에 10 g/L 자일리톨을 첨가한 배지(▼) 조건에서 각각 회분식 배양(Batch Fermentation)한 후, 자일라나제 활성 및 세포 증식 정도를 나타내는 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Bacillus sp. HY-20 strain isolated from Apis melifera and xylanase produced from it <130> 9p-07-58 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1381 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 1 agcttgctcc cggatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 60 gactgggata actccgggaa accggagcta ataccggata gttccttgaa ccgcatggtt 120 caaggatgaa agacggtttc ggctgtcact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 180 tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 240 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 300 aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 360 gctctgttgt tagggaagaa caagtgcaag agtaactgct tgcaccttga cggtacctaa 420 ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 480 gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 540 cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggagagt 600 ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 660 gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 720 taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 780 agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 840 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 900 cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaaccct agagataggg ctttcccttc 960 ggggacagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattyagttg ggcactctaa 1080 ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1140 atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggctgcgag accgcaaggt 1200 ttagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1260 agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320 tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gyaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1380 a 1381 <210> 2 <211> 687 <212> DNA <213> Apis mellifera <400> 2 atgaatttaa gaaaattaag actgttgttt gtgatgtgta ttggactgac gcttatactg 60 acggctgtac cagcccatgc gagaaccatt acgaataatg aaatgggtaa ccatagcggg 120 tacgattatg aattatggaa ggattatgga aacacctcga tgacactcaa taacggcggt 180 gcatttagtg caggctggaa caatatcgga aatgctttat ttcgaaaagg aaaaaagttt 240 gattccacta gaactcacca tcaacttggc aacatctcca tcaattacaa cgcaagcttt 300 aacccagtcg ggaattccta tttatgtgtc tatggctgga cacaatctcc attagcagaa 360 tactacattg ttgattcatg gggcacatat cgtccaacag gcacacataa aggaacattt 420 tatgcagacg ggggcacata tgacatttat gaaacaaccc gtgtcaatca gccttccatt 480 atcgggatcg caaccttcaa gcaatattgg agtgtacgtc aaacgaaacg tacaagcgga 540 acggtctccg tcagtgcgca ttttaaaaaa tgggaaagct tagggatgcc aatggggaaa 600 atgtatgaaa cggcatttac tgtagaaggc taccaaagca gcggaagtgc aaatgtgatg 660 accaatcagc tgtttattgg caactaa 687 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 3 Met Asn Leu Arg Lys Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ile Leu Thr Ala Val Pro Ala His Ala Arg Thr Ile Thr Asn 20 25 30 Asn Glu Met Gly Asn His Ser Gly Tyr Asp Tyr Glu Leu Trp Lys Asp 35 40 45 Tyr Gly Asn Thr Ser Met Thr Leu Asn Asn Gly Gly Ala Phe Ser Ala 50 55 60 Gly Trp Asn Asn Ile Gly Asn Ala Leu Phe Arg Lys Gly Lys Lys Phe 65 70 75 80 Asp Ser Thr Arg Thr His His Gln Leu Gly Asn Ile Ser Ile Asn Tyr 85 90 95 Asn Ala Ser Phe Asn Pro Val Gly Asn Ser Tyr Leu Cys Val Tyr Gly 100 105 110 Trp Thr Gln Ser Pro Leu Ala Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Ser Trp Gly 115 120 125 Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Lys Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Gly 130 135 140 Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile 145 150 155 160 Ile Gly Ile Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Thr Lys 165 170 175 Arg Thr Ser Gly Thr Val Ser Val Ser Ala His Phe Lys Lys Trp Glu 180 185 190 Ser Leu Gly Met Pro Met Gly Lys Met Tyr Glu Thr Ala Phe Thr Val 195 200 205 Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asn Val Met Thr Asn Gln Leu 210 215 220 Phe Ile Gly Asn 225 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27 forward primer <400> 4 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492 reverse primer <400> 5 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bp forward primer <400> 6 catcatcarc tkggcaacat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bp reverse primer <400> 7 ttcatacatt ttrcccatyg g 21

Claims

기탁번호 KCTC 11304BP로 수탁된, 자일라나제를 생산하는 바실러스 속 HY-20(Bacillus sp. HY-20) 균주.
제 1항의 균주로부터 생산된 자일라나제(xylanase).
제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 45℃ ~ 60℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 55℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 pH 6.0 ~ 7.0에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 Mn, Co 또는 Fe 첨가시 효소활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
제 2항의 효소를 암호화하는 유전자.
제 8항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2로 기재되는 핵산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 8항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 10항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
1) 자일란(Xylan)을 포함하는 배지에서 제 1항의 바실러스 속 HY-20 균주 또는 제 11항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산방법.
제 12항에 있어서, 단계 1)의 배지는 자일리톨(Xylitol)을 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 자일라나제 생산방법.