JPS63184061A - 血液凝固第１０３因子ａ↓２ｂ↓２複合体の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト血液凝固第ＸＩＩＩ因子の免疫学的測定方
法に関し、さらに詳しくは、酵素標識抗体を用いた酵素
免疫測定法によるヒト血液凝固第■因子ａ２ｂ２複合体
の測定方法に関する。

血液凝固第■因子（以下■因子と称す）はフィブリ／安
定化因子とも呼ばれ、血漿及び血小板中に／ｌ在する。

血液が凝固する最終段階ではフィブリ７塊／がト［Ｉ７
ビ／の作用により、フィブリ／ベブグードを遊離してフ
ィブリンになり、次いでフィブリ／が凝集して不溶性の
フィブリ／塊をつくる。この一連の過程で■因子はトロ
ンビンの活性化を受はカルシウムイオ／と共にライブ９
フ分子間に（′１川して不溶性のフィブリ７塊を形成す
る。

したがって店因子が減少もしくは欠損している血液では
、血液は凝固するがその凝固物は出血を阻止するには弱
く、血液凝固本来の目的を果たしｔＪない。

血液中の■因子の測定法としては、下記の方法が知られ
ているが滴定できるものでない。すなわちクロット溶解
テスト法は、フィブリンゲルの尿素や酸に対する溶解性
を調べる試験法であり、筒便であるが定量性がない。ク
ロスリンク定量法は、フィブリンゲル中のクロスリンク
リジンを定量する方法であるが、多量の試料を必要とす
る。蛍光法は、特定の基質及び蛍光性をイｆする化合物
を必要とし、さらに蛍光強度を測定する測定装置を必要
とする。また抗原−抗体測定法として特開昭５０−１０
２０Ｅｉ１号公報には、特異的抗ヒト血液凝固第ＸＩＩ
Ｉ因子抗体を動物赤血球に感作して得た感作赤血球を用
いた受身抗体赤血球凝集反応が開示されているが、結果
が得られるまでに約２．５〜３時間を要ため、多量の検
体を処理したり、緊急を要する場合は不便である。

■因子はａ鎖及びｂ鎖と称される２つのサブユニットか
ら構成されており、血小板由来の店因子は活性を有する
ａ鎖のみからなるａ−ダイマー（ａ２）の状聾にあり、
血漿中には、ａ鎖及び安定化に寄！７すると考えられて
いるｂ鎖を含む四量体（ａ　２１）　２　）から描成さ
れている。そのため、従来法においては活性を有するａ
鎖に対する抗体を製苗し、ａ２のみを特異的に測定した
り、ａ２及びａ２　ｂ２の全てを測定していた。

店因子は播種性向管内凝固症候群（ＤＩＣ）又は肝実質
障害などで低下することが知られている。

その際、治療の一つとして店因子を補給する必要がある
が、従来の測定法では１２体のみが低下しているのか、
ａ２ｂ２複合体が低下しているのかを判別することが不
可能であった。

そこで本発明者らは、酵素免疫測定法による■因子のａ
２　ｂ２複合体のみを特異的に測定する方法について説
倉研究を行った結果、抗ＸＩＩＩ因子ａサブユニット抗
体と抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体を用いて酵素免
疫測定法を実施すると、ａ２ｔ）２複合体が特異的にし
かも感度良く測定できることを見い出し本発明を完成す
るに至った。

しかして、本発明によれば、固相化した抗ヒト血液凝固
第虐囚子ａサプユニフト抗体又は抗ヒト血液凝固第ＸＩ
ＩＩ因子ｂサブユニット抗体と検液を反応させ、次いで
該反応混合物に酵素標識した抗ヒト血、ｆＬ凝固第ＸＩ
ＩＩ因子ｂサブユニット抗体又は抗ヒ）　Ｉｆｌｌ液凝
固第ＸＩＩＩ因子ａサブユニット抗体を加えることを特
徴とする酵素免疫反応によるヒト血液凝固第鴎囚子ａ２
　ｂ２複合体の定量方法が提案される。

本発明の方法は、抗ＸＩＩＩ因子ａサブユニット抗体又
は抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体のいずれか一方を
固相化し、他方を酵素標識した抗体を用いる、それ自体
公知の酵素免疫法、例えば、石川栄治他編集：酵索免疫
Ｄ１定法第４１〜４３頁　医学占院等の文献に記載の方
法を用いて実施することができる。従って、該酵素免疫
法の詳細な操作法の説明は上記文献に委ね、ここではそ
の概要を述べるにとどめる。

（＋）ザ／トイソチ法 抗ＸＩＩＩ因子１サブユニット抗体を、免疫学的に不活
性な固相にｔｌ持し、得られる固相化抗ＸＩＩＩ因子ａ
サブユニット抗体に検体に加え反応させたのち、該固相
化抗鴎囚子１サブユニット抗体に結合した抗！！２を分
ｍする。次いで得られた該固相化抗■因子透サブユニッ
ト抗体−抗原複合体に酵素標識した抗ＸＩＩＩ因子ｂサ
ブユニット抗体を加えて再度反応させたのち、該枚合体
に結合した酵素標識抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体
と該複合体に結合しない酵累標識抗ＸＩＩＩ因子ｂサブ
ユニット抗体を分離し、次いで複合体と結合した酵詣標
識ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体に基質を加え酵素反
応を行ったのち、基質の減量、生成物の増量などをｔｉ
標として酵素活性を測定し、その測定値を標準曲線に外
ｔ１ｐすることにより、検体中の鴎因子ａ２　ｂ２複合
体を定量する。

上記方法において、固相化抗ＸＩＩＩ因子ａサブユニッ
ト抗体の代りに固相化抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗
体を、酵素標識抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体の代
りに酵素標識抗■因子ａサブユニット抗体を用い、上記
操作と同様に実施しても良い。

〔抗■因子ａサブユニット抗体又は抗ＸＩＩＩ因子ｂサブユニット抗体〕

本発明の方法に使用される抗ＸＩＩＩ因子ａサブユニッ
ト抗体（以下、抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体という）又は抗■
因子ｂサブユニット抗体（以下、抗ＸＩＩＩ因子す抗体
という）は、それ自体公知の方法、例えば１１ｉｏｃｈ
１ｍｉｃａ　Ｑｔ　［１ｔｏｐｈｙｓｉｃａ　ＡＣｔａ
　４４旦３４５　（１９７Ｇ）及びＪｏｕｒｎａｌ　　
ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ａｎｄ　　Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌＣｌｌｎｉｃａｌ　９７００２（１９Ｂ＋）な
どに記載の方法により店因子ａサプユニフトと店因子ｂ
サブユニットに分離したのち、その各々を抗ぷとして常
法により動物に免疫し、抗体力価が所望の値以」二に達
したら、抗血清をその動物から採取することによって製
造することができる。この抗原を例えばコンプリートフ
ロインドアジュバント等のアジュバントを併用するとよ
り有効に抗血ｔｎが製造される。

一方、これら抗酪で免疫することのできる動物としては
、通常、家兎、山羊、めん羊、モルモット等の吐乳動物
が使用される。

動物から採取した抗血清は、例えばアルコール沈殿又は
鴇析等の如き手段によってγ−グロブリンを分画し、抗
ＸＩＩＩ因子ａ抗体又は抗ツ囚子す抗体を得る。さらに
、得られた各抗体から非特異的凝果因子との活性部位を
除去するために、例えば、ペプシン、パパイン、トリプ
シン、キモトリプシン、トロンビン又はプラスミンの如
き蛋白分解酵素を作用させ、それから誘導されるＦ（ａ
ｂ’＞２、Ｆ　ａ　ｂ　１Ｐ　ａ　ｂ　’などの７ラグ
メントも「利に利用される。なお、これらの抗原又は抗
体は上記の方法により製造しても良く、あるいは市販品
を用いることもできる。

〔固　相〕

抗■因子ａ抗体又は抗ＸＩＩＩ因子す抗体を担持するた
めの免疫学的不１み性な固相としては、例えば、ポリス
チレン、ナイロン、ポリエチレン、ガラス、アルミナな
どの有機又は無機の固体から成る板状体、グ・ユープ、
球状体などが用いられるが、多数の検体を微量で同時に
測定できるマイクロクイター川プレートを用いるのが好
ましい。

該同相への上記各抗体の結合は物理的又は化学的のいず
れであってもよい。物理的結合は、抗体溶液と固体担体
とを接触させることにより行うことができ、また、化学
的結合は、抗体のアミンＪλ又はカルボキシル基と結合
しつるカルボキシル基又はアミ７基をイｒする固体担体
を抗体とアミド化反応させることにより行うことができ
る。

〔酊４；標識抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体又は抗ＸＩＩＩ因子
す抗体〕酵素標識抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体又は抗ＸＩＩＩ
因子す抗体は各抗体に酵素を結合したものであり、それ
臼身取知の方法で調製することができる。例えば、抗体
又はその７ラグメ／トと酵素を過ヨウ沿酸法、グルタル
アルデヒド法、マレイミド法又はピリジル・ジスルフィ
ド法などの方法により、該抗体に酵素を標識させれば、
目的とする酵素標識抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体又は抗ＸＩＩ
Ｉ因子す固体が得られる（石川栄治他編集　酵素免疫測
定法８２−１２７頁　１９８２年医学書院発行参照）。

〔酵　素〕

上記各抗体の標識に用いる酵素は、抗原−抗体反応に影
響を及ぼさずに、かつ酵素活性を失うことな（、抗体と
結合するものであれぽいずれのものでも良く、例えばパ
ーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンオキシダーゼ
などが挙げられる。

（ｌＡ　　質） 本発明で用いられる基質は酵素活性測定法により異なる
ものが用いられる。酵素活性測定法は吸光度法、蛍光法
、化学発光法及び電気化学的方法などが挙げられ、■因
子ａ２ｂ２複合体の測定にはいずれの方法も用いること
ができる。例えば、酵素にパーオキシダーゼを用いた時
は、基ａ、Ｚ−て５−７ミノサリチル酸、ｏ−フエニレ
７ジアミン、チラミン、３−（ｆ）−ヒドロキシフェニ
ル）プ［１ピオン酸、ルミノールなどが用いられ；酵、
竹がβガラクトシダーゼの場合は、１人質として。−二
トｖフェノールーβ−Ｄ−ガラクトピラノシト、４−メ
チルランベリフェリールーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
などが用いられ；アルカリホスファターゼを用いる場合
には、基質としてはｐ−二）「Ｊフ、メールリン酸又は
４−メチルウンベリフェリルリン酸などが挙げることが
できる。

本発明は、前述したように、以上に述べた酵素免疫法に
より、血液など体液中に存在しうる極微１４の店因子ａ
２ｂ２ｍ合体を極めて特異的にかつ高感度に検出拳定舟
することができる。

次に実施例を挙げて本発明をさらに説明する。

実施例１ （１）抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体及び抗ＸＩＩＩ因子す抗体
の製造市販のり因子の各サブユニット２ｎを１ｍｉ！の
生理食塩液に溶解し、それに同ｎのコンプリートフロイ
ンドアジュバントを加えて充分に混和し、家兎の皮下に
注射した。この注射を３週間隔で行い、抗体価の上昇を
確認後金採血し血清を分離した。

得られた血ｉ’＋１より硫安分画法を用い、Ｉ　ｇ　Ｇ
を分離し、そのＩｇＧにペプシンを作用させてＦ（ａｂ
′）２フラクシヨンを得た。各サブユニットのＦ（ａ　
ｂ　’＞２フラクシ−ｓ　７８Ｗｇを１％０．０５Ｍ牛
血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０含有リ
ンｆｆ１ｌＷ街液（ｐ　１１７．４）　７２　噌に溶解
し、分注したのち凍結保存した。

（２）抗虐因子ユ抗体又は抗ＸＩＩＩ因子す抗体の固相
化（２−１）　Ｊ−記（１）で得た抗■因子＾抗体を融
解し、得られた抗体ｉＳｉ＆０００ｕｉを０．０５Ｍ　
＃Ａｆｆｉナトリウムー炭酸水ｌ：ナトリウム緩衝液（
ｐ　Ｈ９，ｌ１ｉ）で６ｄ／ｎＱとなるように希釈し、
同相化抗体溶液とした。

マイクロクイタープレート■（８Ｘ１２穴、三光純蘂社
′Ａ）に上記（りで得た抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体溶液を各
ウェルにつき　１００ｕＩとなるように注入し、４゛Ｃ
で１８時間インキュベージコンした。次いでウェル内液
を吸引除去し、ラン血ＴＩ′７アルブＥ：１０．１％及
びＴｗｃｃｎ　２０　０．０５％含イｒ　Ｏ，ＩＭリン
ｆｆ１ＦＩＬ衝食ル水（ｐ　１１７．４）で５回洗浄し
、固相化抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体を得た。

（２−２＞上記（２−１）の抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体の代
りに抗ＸＩＩＩ因子す抗体を用いる以外（２−１）に示
したと金（同様な方法により固相化抗ＸＩＩＩ因子す抗
体を得た。

（３）酵素標識抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体又は抗■因子す抗
体の製造 （３−１）ホースラディツシュパーオキシダーゼ（１−
ＩＲ１’）５■を０　、３　Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液
（１）Ｈ８，１）に１８解したのちＩＩ　ＲＰのアミ７
基を保護するために１−フルオｔｊ−２，４−ジニトロ
ベンゼン（Ｆ　ｌ）　Ｎ　Ｐ　）の１％エタノール溶液
０．１ｍｌを加え室温で１［１１１間撹拌した。得られ
たＤ　Ｎ　Ｐ　−１１ＲＰにＯ’、Ｏ［ｉＭＭｎウ素酸
ソーダ　１．Ｏｍｌを加え、室温で３０分、さらにＯ，
１０Ｍエチレングリコール　１．Ｏｍｌを加え室温で１
時間［ｔＴ−したのち、Ｏ，ＯＩＭ炭酸ナトリウム暖衝
緩衝液Ｈ９，５）に対し４℃で一夜透析した。

上記（＋）で得た抗ＸＩＩＩ因子す抗体５■を炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐ　１１９．５）　１刷に溶解し、該溶
解液を」１記透析液に加え室温で２．５時間反応させた
のち、水素化ホウ素ナトリウム５■を加え４°Ｃで一夜
放置した。得られた反応液を１％ウシ血ｌ？Ｉアルノミ
ン及びＴｗｃｃｎ　２０　０．０５％含有０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐ　１１７．４）に対して４℃で一夜透析し
たのち、セフ１デツクス　Ｇ−１００を用いゲル１濾過
を行い、　ＩＩ　ＲＩ）標識抗ＸＩＩＩ因子す抗体を得
た。得られた該標識抗体を、上記透析に用いたリン酸緩
衝液で希釈して、ＩＩ　Ｒ、ｆ）標識抗ＸＩＩＩ因子す
抗体が５Δ／ｒｌＱとなるように調整した。

（３−２）　ｌ記抗ＸＩＩＩ因子す抗体の代りに抗ＸＩ
ＩＩ因子ａ抗体をＩＩ＋いること以外、（３１）と全く
同様に操作して＋１　ＲＰ標識抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体を
得た。

（４）　標　埠１由　線　の　イ乍を戊１″１１１記（
２−１）で得た抗ＸＩＩＩ因子ａ抗体を担持したマイク
ロタイターの各ウェルに各希釈列の標準曲線作成用プー
ル血５πを　１００ｄずつ加え、室温にて２時間イノキ
ュベーンコンした。次いで各ウェル内液を吸引除去し、
０．１％ウシ血清アルブミン及びＴｉＭｎｎｎ　　　９
１１　　　１１．１１！”／：　　今　イｒｎ＋　Ｍ　
リ　　ン　酪に’ｓ　　ｋ　　’１２；　　　／　　ｈ
１１７．４）の洗浄液を用い５回洗浄した。次いで、前
記（３−１＞で得られたＩＩ　ＲＰ標識抗ＸＩＩＩ因子
す抗体溶液＋００ＩＪＩを各ウェルに加え室温で２時間
インキュベーションした。ウェル内液を吸引除去し、上
記と同じ洗浄液を用い５回洗浄後、酵素基質液（０，０
３４７Ｍクエン酸−０，ＧＯ７Ｍリン酸水素ナトウリム
緩衝液（ｐ　１１５．０）を調整し、該緩衝液２０唾に
対し、０−ソ、ニレ／ジアミ／８■を溶解し、次いで３
０％過酸化水素１０ｄを添加したもの）１００Δずつを
各ウェルに加えｕ　４で１５分間イ／キュベーンフッし
た。３１Ｖｌ、［酸３０ｄ；！を各ウェルに加え反応を
停止にした後、分光光度計を用い４９２ｎｍの波長で吸
光度を測定した。

その結果を下記第１表及び第１図に示す。

第１表 （５）ヒト血漿中の店内子ａ２ｂ２複合体の測定健常な
男女各１２名の血液から血漿を１００ｕｉずつ採取し、
検体とした。前記（４）の標準曲線作成用プール血漿の
代りに上記で得た血漿を用いる以外、Ｉ前記（４）の標
準曲線の作成と全く同様な操作を行い、血漿中の■因子
ａ２　ｂ２複合体の含量の割合を求めた。その結果を第
２表に示す。表中の値は前記（４）で作成した標準曲線
より求めた含有１、ｔ（％）を示す。

尚、対照としてａ２体のみを同様な方法で測定した時の
結果も併せて示す。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は＋ｎｔ　Ｑ中のヒト血液凝固第■因子ａ２１）
２複合体の標準曲線を示す。 出願人　　帝国臓器製薬株式会社 専瓶倍数 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６１年特許願第２３１２７６号 ２、発明の名称 血液凝固第ＸＩＩＩ因子ａ２ｂ２複合体の定量方法３、
補正をする者 昭和６３年２月２３日（発送日） 「血液凝固第店因子ａ２ｂ２複合体の定量方法」と訂正
する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、固相化した抗ヒト血液凝固第ＸIII因子ａサブユニ
   ット抗体又は抗ヒト血液凝固第ＸIII因子ｂサブユニッ
   ト抗体と検液を反応させ、次いで該反応混合物に酵素標
   識した抗ヒト血液凝固第ＸIII因子ｂサブユニット抗体
   又は抗ヒト血液凝固第ＸIII因子ａサブユニット抗体を
   加えることを特徴とする、酵素免疫反応によるヒト血液
   凝固第ＸIII因子ａ＿２ｂ＿２複合体の定量方法。