JPS63181998A

JPS63181998A - 新規物質ａｇ５５

Info

Publication number: JPS63181998A
Application number: JP1349487A
Authority: JP
Inventors: Haruo Seto; 治男瀬戸; Tadashi Noguchi; 野口　忠
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1987-01-23
Publication date: 1988-07-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕本発明は新規物質に、さらに詳しくはストレプトマイセ
ス・トルロサスに属する菌株１３６８−ＭＴ工株によっ
て産生される抗腫瘍性を有する新規物ｗＡＧ５５に、関
する。

抗腫瘍性物質に関してはすでに多数のものが医薬として
実用化されている。一般に、化学物質の生理活性はその
化学構造に依存するところが大きいから、抗腫瘍性を有
する新規な化合物に対しては不断の希求があるといえよ
う。

〔発明の概要〕

本発明は上記の希求に応えるものである。

すなわち、本発明による新規物質ＡＧ５５は、次式で示
されるものである。

〔発明の詳細な説明〕

新規物質ＡＧ５５１）　化学構造本発明による新規物質ＡＧ５５は、前記の式（１）で示
される化学構造を有する。

この化学構造は、次のようにして決定されたものである
。　・ＡＣ５５は後記したように、分子式はＣ３ｏＨ３４Ｎ４０６Ｓ４である。

ＡＣ３５はメタノール中で、酸存在下、Ｚｎで環元する
と、分子量３３８の物質となることから、ＡＣ５５はジ
スルフィド結合でつながったダイマーであることが分る
。

また、　Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの解析、■ さらに’Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲにおいてＬ　
Ｓ　Ｐ　Ｄ　　（Ｌｏｎｇ　ｒａｎｇｅ　５ｅｌｅｃｔ
ｉｖｅ　ｐｒｏｔｏｎｄｅｃｏｕｐｌ　ｉｎｇ）実験を
行うことにより、ＡＣ５５は次の部分構造を持つことが
分る。

＊−ＣＨ３＊　　　＊＊（ただし＊は４級炭素あるいはへテロ原子）さらに、　
Ｈ−ＮＭＲとＩＳＣ−ＮＭＲの間でＨＭ　Ｂ　Ｃ（Ｈｅ
ｔｅｒｏ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｂｏｎ
ｄｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）実験を行うことにより、
上記部分構造間の結合が朋らかになり、五Ｃ５５１よ式
（］）のよう１こ決淀−さ゛わ、光。

２）　物理化学的性状ＡＣ５５は下記の物理化学的許状を有する。

（１）外観　黄色粉末（２）元素分析分析値（％）Ｃ５３，１８Ｈ５，５５０１４，６３Ｎ　　　　　　８．２８Ｓ　　　　１８．６２計算値（％）Ｃ５３，４１Ｈ５，０４０１４，２４Ｎ　　　　８．３１３　　１８．９９分子式　Ｃ３ｏＨ３４Ｎ４０６Ｓ４（３）分子量（計算値）　６７４（４）融　点　　６９〜７２℃（分解）（Ｃ−１、メタ
ノール中）（６）紫外部可視部吸収スペクトル０、ＩＮ塩酸−９０９６メタノール中０、ＩＮ水酸化ナトリウム−９０％メタノール中２１Ｂ（７１７）（７）赤外吸収スペクトル　第１図に示す通り（ＫＢｒ
錠）（８）’Ｈ−ＮＭＲスペクトル　第２図に示す通り（４
００ＭＨｚ、重メタノール中内部標準テトラメチルシラン）（９）　１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルδｐｐｍ（１００Ｍ
Ｈｚ、重メタノール中、内部標準テトラメチルシラン）２３．１　（ｑ）３３．６　（ｔ）３４．４　（ｑ）４０．４（ｔ）７４．３　（ｄ）７４．８　（ｓ）８０．８　（ｄ）１１７、　２　　（Ｓ）１１７．　５　　（ｄ）１１９、　６　　（ｄ）１３１、　０　　（ｄ）１３３、　６　　（ｄ）１５９、　７　　（ｄ）１７２、　７　　（ｓ）１７６、　５　　（ｓ）（ｑはメチル、ｔはメチレン、ｄはメチン、Ｓは４級炭
素を示す。）Ａｒｔ　５７１５）　、展開溶媒　クロロホルム−メタ
ノール（１０：１））（１１）溶解性メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、クロロ
ホルム、酢酸エチルに可溶水、ヘキサンに難溶（１２）Ｆ　Ａ　Ｂ　（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ　Ｂｏｍｂ
ａｒｄｍｅｎｔ　）　７ススペクトルｍ／ｚ　　６７５　　　（Ｍ＋Ｈ）” （１３）安定性　　酸に不安定（１４）呈色反応　ニドヒドリン試薬に陰性リンモリブ
デン酸で青色を呈するＡＣ５５の製造概要ＡＣ５５は現在のところ微生物の培養によってのみしか
得られていないが、類縁化合物の合成化学的または微生
物学的修飾によって製造することも、あるいは全合成化
学的に製造することもできよう。

微生物の培養による場合の菌株としてはストレプトマイ
セス属に属するＡＧ５５生成能を有するものが使用され
る。具体的には、本発明者らの分離したストレプトマイ
セス・トルロサス１３６８−ＭＴ１株がＡＣ５５を生産
することが本発明者らによって明らかにされているが、
その他の菌株については、抗生物質生産菌単離の常法に
よって適当なものを自然界より分離することが可能であ
る。また、ストレプトマイセス・トルロサス１３６８−
ＭＴ工株を含めてＡＧ５５生産菌を放射線照射その他の
処理に付して、ＡＣ３５の生産能を高める余地も残され
ている。さらにまた、遺伝子組換え技術が発達したこと
から、この菌株のＡＣ５５をコードする遺伝子を他の菌
株に導入して、この形質転換株にＡＣ５５を生産させる
こともできる。

ストレプトマイセス・トルロサス１３６８−Ｍ　Ｔ　１
株ＡＧ５５生成能を有するストレプトイセス属の菌株とし
て本発明者らの見出している１　３６８−Ｍ　Ｔ　１株
は、下記の内容のものである。

１）　由来および寄託番号１３６８−ＭＴ工株は山ロ県山ロ市で採取した土壌から
分離されたものであり、昭和６２年１月２１日に工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されて「微工研菌寄第
９１４４号」の番号を得ている。

２）　菌学的性状および生理学的性質（イ）　形態基土菌糸は、分枝しながら伸展し、桿菌状または球菌状
に分断しない。気中菌糸は、単軸分枝し、長くゆるいコ
イル状（５〜１０回転）または不規則ら旋状で、１０〜
６０個からなる胞子鎖を着生する。胞子は、幅０，３〜
０．５または０．５〜０．７μｍ１長さ０．９〜１．２
μｍの円筒形または長円形で、特異な層状表面を呈し、
非運動性である。胞子のう、菌核などは形成せず、全菌
体加水分解物中のジアミノピメリン酸はＬＬ−型である
。

（ロ）　　各種培地上の生育状態各種培地上で２７℃で３週間培養したときの性状は、表
１に示す通りである。

（ハ）　生理的性質１３６８−ＭＴ１株生理的性質は、表２に示す通りであ
る。

（ニ）　炭素源の同化性１３６８−、ＭＴ工株の炭素源の同化性は、表３に示す
通りである（ブリドハム・ゴトリーブ寒天培地上）。

！！２　１３５ビニＭ工υシυＬ乃ユ性−−生育温度範
囲　　　　　　　　　１０〜４５℃最適温度　　　　　
　　　　　３５〜４０℃メラニン様色素の生産チロシン寒天培地　　　　　　　　士ペプトン・イースト鉄寒天培地　　十トリプトン・イースト液体培地　　十スターチの加水分解　　　　　　　　十ゼラチンの液化
　　　　　　　　　　十脱脂牛乳のペプトン化　　　　
　　　十脱詣牛乳の凝固　　　　　　　　　　−硝酸塩
の還元　　　　　　　　　　　十表３　１３６８−ＭＴ
工株の炭素源の同化性炭素源　　判定Ｌ−アラビノース　　　＋Ｄ−キシロース　　　　＋Ｄ−グルコース　　　　＋Ｄ−フラクトース　　　＋シュクロース　　　　　＋イノシトール　　　　　＋Ｌ−ラムノース　　　　＋ラフィノース　　　　　＋　　　十生育するＤ−マンニ
トール　　　　　　　−生育しない以上の諸性状に基ず
いて、１３６８−ＭＴ１株の所属をストレプトマイセス
灰中の既知の種について検索したところ、これはＳ、ト
ルロサス（Ｓ。

ｔｏｒｕｌｏｓｕｓ　）が最も近縁の種であると予想さ
れた。

本株をＳ、トルロサスの標準株ＪＣＭ４８７２と比較実
験した結果、後者はＤ−マンニットを同化する点で前者
と異なるが、その他の形態、培養、生理性状は両者とも
によく一致した。Ｄ−マンニットの同化性の相違だけで
は種または亜種を分ける基準とはならないので、本株を
Ｓ、トルロサスに所属させ、ストレプトマイセス・トル
ロサス（ＳＬｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　Ｌｏｒｕｌｏｓｕ
ｓ）　１３６８−　ＭＴ　１とする。

培養／ＡＧ５５の生産ＡＧ５５はストレプトマイセス属に属するＡＧ５５生産
菌を適当な培地で好気的に培養し、培養物から目的物を
採取することにより製造できる。

培地は、ＡＧ５５生産菌が利用しうる栄養源のうち、炭
素現に関してはシュクロースが望ましい。

窒素源としては、酵母エキス、モラセス、カゼインなど
が使用できる。また、必要に応じて、無機塩類を添加す
ることができる。

発酵中の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消
泡剤、たとえばシリコーン、を添加することもできる。

培養方法としては、一般に行われている抗生物質の生産
の方法と同じく、好気的液体深部培養法が最も適してい
る。培養温度は２７〜３０°Ｃが好ましい。この方法で
ＡＧ５５の生産量は、振とう培養、通気攪拌培養ともに
培養９６時間で最高に達する。

このようにしてＡＧ５５の蓄積された培養物が得られる
。

培養物中ではＡＧ５５はほとんどが培養か液中に存在す
る。

このような培養物からＡＧ５５を採取するためには、合
目的的な任意の方法が利用可能である。

その一つの方法は抽出の原理に基づくものであって、具
体的には、たとえば、培養２戸液中のＡＧ５５について
はこれをｎ−ブタノールなどで抽出する方法がある。

培養物からＡＧ５５を採取する他の方法の一つは吸着の
原理に基づくものであって、既に液状となっているＡＧ
５５含有物、例えば培養２戸液あるいは上記のようにし
て抽出操作を行なうことによって得られる抽出液、を対
象として、適当な吸着剤ないしゲル濾過剤、例えばシリ
カゲル、「セファデックスＬＨ２０Ｊ　　（ファルマシ
ア社製）、「トヨパールＨＷ４０Ｊ　　（東洋曹達社製
）、ｒＨＰ−２０Ｊ　　（三菱化成社製）など、を用い
たカラムクロマトグラフィー、「ヌクレオシル５Ｃ１８
」（西独ナーゲル社製）などを用いた高速液体クロマト
グラフィー、その他によって目的物ＡＧ５５を吸着させ
、その後、溶離させることによってＡＧ５５を得ること
ができる。このようにして得られたＡＧ５５溶液を減圧
濃縮乾固すれば、ＡＧ５５の粗標品が得られる。

このようにして得られるＡＧ５５の粗標品をさらに精製
するためには、上記の抽出法および吸着法を必要に応じ
て必要回数行えばよい。例えば、シリカゲル、「セファ
デックスＬＨ２０Ｊなどの吸着剤またはゲル濾過剤を用
いたカラムクロマトグラフィーなどを適宜組合わせて実
施することができる。具体的には、例えば、ＡＣ３５粗
標品を少工のメタノールに溶解し、「セファデックスＬ
Ｈ２０Ｊカラムを用いて、適当な溶媒で展開して活性成
分を溶出させ、濃縮、乾固するとＡＧ５５の黄色粉末が
得られる。

ＡＣ，５５の用途本発明による新規物質ＡＧ５５は、抗腫瘍活性を有する
という点で有用である。

生理活性ＡＧ５５は腫瘍細胞に対して殺細胞活性を示した。

１）　ラット肝臓癌細胞Ｈ４ＩＩＥを１×１０５個／　
ｍｌとなるように、５％ＣＳ　（ｃａｌｌ’　ｓｅｒｕ
ｍ）　５０６Ｆ　Ｂ　Ｓ　（Ｐｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ
　ｓｅｒｕｍ）を含むＥａｇ　Ｉ　ｅ　’　ｓＭＥＭに
加えて培養した場合、ＡＧ５５　１０μｚ　／　ｍｌの
添加、４８時間の培養で１００％の癌細胞が死滅した。

２）　　Ｐ２Ｓ５、Ｅｈｒｌｉｃｈ　、　Ｅ　Ｌ　−４
，８１６等に対するＩＣ５ｏ値は次の通りである。

（方法）マウスの癌細胞を使用した。浮遊細胞については丸底９
６穴マイクロプレートを用い、培地で被験物質を順次二
段階希釈し、５．０Ｘ１０３／ｗｅｌｌの細胞を加え、
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養後
、細胞数をカウントした。コントロールの半数の細胞数
を与える濃度をＩＣ５ｏ（μｇ／　ｍｌ　）とした。付
着性の細胞は平底マイクロプレートで被験物質を同様に
希釈し、２、　　ＯＸ　１０’　／ｗｅｌｌの細胞を加
え、同様に２日間培養後、固定・染色しコントロールの
半分の付着細胞濃度を与える被験液の濃度をＩＣ５ｏ（
μｇ／ｍｌ）とした。

培地は、いずれもＲＰＭＩ　　１６４０にＦｅ２（１０
％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）　、ストレプトマ
イシン（１００μｇ／ｍｌ）　、２−メルカプトエタノ
ール（５，ＯＸｌｏ−５Ｍ）を加えたものを使用した。

肢験物質は水に難溶なので、ＤＭＳＯに溶解後、培地で
希釈した。

（結果）Ｐ２Ｓ５　　　　　　　１．　６Ｅｈｒｌｉｃｈ　　　　　　　　１．　２ＥＬ−４３，
０８１６１２，５急性毒性ＡＣ５５を１０　ｍｇ／　ｋｇの濃度でマウス腹腔内に
投与した場合、１０日間の観察でマウスは金側生存して
いた。

抗腫瘍剤このように本発明によるＡＣ５５は抗腫瘍活性を示すこ
とが明らかにされたので、ＡＣ５５は抗腫瘍剤として使
用することができる。

実施例１）　種母の調整スターチ１０＋ｒ、！、ポリペプトン１０ｇ／Ω、モラ
セス１０ｇ／ρ、ビーフェキス１０ｇ／ＩＩからなる培
地（滅菌前ｐＨ７，２）を大型試験管に１５ｍ１入れ、
殺菌後、これにストレプトマイセス・トルロサス１３６
８−ＭＴ１（ＦＥＲＭ　　Ｐ９１４４）をスラントより
１白金耳接種し、ロータリーシェーカーで２７°Ｃで２
日間振とう培養したものを種母とした。

２）　前培養グリセロール２０ｇ／Ω、モラセス１０ｇ、Ｑ。

カゼイン５ｇ／ｆ１、ポリペプトン１　ｇ／Ｒ。

Ｃａ　Ｃ０３４ｇ　／　ｆｌからなる培地（滅菌前ｐＨ
７，２）を５００ｍ１の三角フラスコに１００ｍ１入れ
、殺菌後、これに上記種母２ｍｌを植菌し、ロータリー
シェーカーで２７℃で３０間振とう培養した。

３）　本培養シュクロース２０ｇ／Ｄ、モラセス１０ｇ／４７゜カゼ
イン５ｇ／ｌ、ポリペプトン１　ｚ／１　。

ＣａＣＯ３４ｇ／ＩＩからなる培地（滅菌前ｐＨ７，２
）をジャーに３０Ω入れ、殺菌後、これに上記前培養培
養酸６００　ｍｌを接種し、２７℃、攪拌数４００ｒｌ
）ｆｆ１１通気Ｉｎ　Ｉ　Ｄ　ＩＲ−ｗｉｎで４日間培
養した。

４）　　ＡＣ３５の採取本培養培養液から遠心機により菌体を除去した上清３Ｏ
Ｎを、バッチで吸着剤ＨＰ２０　（三菱化成社製）３ｇ
に吸着させた。このＨＰ２０をカラムにつめ、５０％（
Ｖ／Ｖ　）メタノール１０ｇで洗った後、１００％メタ
ノールＩＯＲで溶出させた。

溶出液を減圧濃縮して２００ｍ１とし、塩酸を加えてｐ
Ｈを２〜３に調整した後、１００ｍ１のｎ−ブタノール
で３回抽出した。抽出物を減圧濃縮して、約１０．のセ
ライトに吸着させた。３００ｇのシリカゲル（ワコーゲ
ルＣ２００、和光紬薬社製）をクロロホルムでカラム（
直径５ｃｍ）につめ、その上にこのセライト吸着物をの
せ、１０１００Ｏのクロロホルムで洗った後、クロロホ
ルム：メタノール５０：１　２０００ｍ１で溶出させた
。この時点で、約５ｇのオイル状物質を得た。これを３
００ｇのセファデックスＬＨ２０（ファルマシア社製）
のカラム（直径３（３））で展開溶媒メタノールでクロ
マトグラフ処理し、活性画分を減圧濃縮して、約１ｇの
オイル状物質を得た。３００ｇのシリカゲル（ワコーゲ
ルＣ２００、和光紬薬社製）をクロロホルムでカラム（
直径５ｃｍ）につめ、これを吸着させた後、クロロホル
ム１．５ｇで洗った。次いで、クロロホルム：メタノー
ル２００：１の混合溶液で展開し、得られたフラクショ
ンを濃縮乾固すると、ＡＣ３５の黄色粉末１００ｍｇが
得られた。なお、ＡＣ５５の検出はＴＬＣプレート上の
ＵＶ吸収を示すスポットで行なった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＡＣ５５のＫＢｒディスク法による赤外吸収
スペクトルを模写した図である。第２図は、ＡＣ５５の重メタノール中における４００メ
ガヘルツ’Ｈ−ＮＭＲスペクトルを模写した図（内部標
準テトラメチルシラン、図示せず）である。第３図は、ＡＣ５５の重メタノール中における１００メ
ガヘルツ１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを模写した図（内部
標桑テトラメチルシラン、図示せず）である。出願人代理人　　佐　　藤　　−雄手続補正書昭和６３年４り／不川用許庁長官　小川邦夫殿１　事件の表示昭和６２年　特許願　第１３４９４号２　発明の名称新規物質Ａ０５５３　補正をする者事件との関係　　特許出願人ｉＩｔ麟麦酒株式会社４代理人７　補正の対象　　　′ 明細書の「特許請求の範囲」および「発明の詳細な説明」の各欄。８　補正の内容明細書を下記の通り補正する。（１）「特許請求の範囲」を別紙の通り補正。（２）　　第３頁第９行「Ｃ３ｏＨ３４Ｎ４０６Ｓ４」をｒ　Ｃ１５Ｈ１ｓＮ２０３　Ｓ　２　Ｊと補正。（３）　　第３頁第１０〜１３行ｒＡＧ５５〜分る。」を削除。（４）　　第５頁第５〜１２行［計算値（％）Ｃ５３，４１Ｈ５，０４０１４，２４Ｎ　　　　　　　８．３１Ｓ　　　　　　１８．９９分子式　　　Ｃ３０Ｈ３４Ｎ４０６Ｓ４（３）分子量（
計算値）６７４Ｊを「計算値（％）Ｃ５Ｂ、２５Ｈ５，３３０１４、２ＯＮ　　　　　　　　　　８．２８Ｓ　　　　　　　　１８．９３分子式　　　Ｃ１５Ｈ１８Ｎ２０３Ｓ２（３）分子量（
計算値）３３８Ｊと補正。（５）　　第７頁最下行ｒ６７５Ｊをｒ３３９Ｊと補正。（６）　　第８頁第２行「ニドヒドリン試薬」を「ニンヒドリン試薬」と補正。（７）　　第１０頁第１５行ｒ１３６８−ＭＴ　ｌ’ＪＪをｒ１３６８−ＭＴ１株■ の」と補正。（８）　　第１１頁の表下第１行ｒｃｏｒｐｏｒａｔｌｏｎ　Ａｍ１ｒｉｃａ　Ｊをｒｃ
ｏｒｐｏｒａｔｌｏｎ　ｏｆ’Ａｍｅｒｌｃａ　ｌと補
正。（９）　　第１３頁最下行「炭素現」を「炭素源」と補正。（１０）第２頁の全文を下記の通り補正。「トマイセス・トルロサスに属する菌株１３６８−ＭＴ
工株によって産生される抗腫瘍性を有する新規物質ＡＧ
５５に、関する。抗１ｄ瘍性物質に関してはすでに多数のものが医薬とし
て実用化されている。一般に、化学物質の生理活性はそ
の化学構造に依存するところが大きいから、抗腫瘍性を
有する新規な化合物に対しては不断の希求があるといえ
よう。〔発明の概要〕本発明は上記の希求に応えるものである。すなわち、本発明による新規物質ＡＧ５５は、次式で示
され、比施光度が正の値であるものである。（１）　　　　　　　　　」特許請求の範囲次式で示され、比施光度が正の値である新規物質ＡＧ５
５゜

Claims

【特許請求の範囲】次式で示される新規物質ＡＧ５５。 ▲数式、化学式、表等があります▼（１）