JPS63175000A - ウシ血液からのオリゴペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウシ血液から得られるオリゴペプチド、その
製造方法およびその使用に関する。

ウシの血液から、呼吸増強作用ないしは代謝賦活作用を
イーする作用物質を製造できることは以前から知られて
いる。たとえば、ＤＥ−ＰＳ　　１０７６　８８８号に
は、血液を酵素的に分解するかまたは＾分子成分を除去
するために分別除蛋白したのち水もしくｔよアルコール
で透析し、ついで透析液から溶媒を除去して注意深く乾
燥することによる、ウシ血液からこのような呼吸増強物
質を取得する方法が＆！載されている。この方法で製造
された濃縮物はヒト臓器におけるＰａ素利用を改善し、
Ｆｌ？素欠乏の除去を要するすべての患者に適用できる
。西独では、ウシ血液透析物は、たとえば８ｙｋＧｕｌ
ｄｅｎおよび５ｏｌｃｏ社から、アクヂヘミル（へＣ口
ｂａｅｍｙｌ）あるいはソルコセリル（５ｏｌｃｏｓａ
ｒｙｌ　）の名で販売されていて、中枢性Ｊ３よび未梢
竹の面ｔｊ陣害Ｊ３よびそれに基づく疾！ムに適用され
ている。しかしイ１から、このような血液透析物やその
個の臓器抽出部には、常に、このような抽出物の組成が
その製法方法の条件に署しく依存し、したがって変動し
や寸いという問題がある。しかし、このようなペプチド
の組成および構造が個々に明らかにされた例は、現在ま
できわめ′Ｃ稀ぐある。構造が解明されれば標準化が可
能であり、また場合によっては作用物質の合成も可能に
なる。ざらに、透析物中に存在する多数のペプチドにつ
いて、それぞれの化合物の作用おＪ：び作用強度を明ら
かにし、その最も強力な作用化合物の濃縮、標準化を行
うことがとくに望ましい。

本発明は、このような課題に基づき、このような製品に
求められる再現性ある組成を有する、ウシ血液透析物か
らの新規なオリゴペプチドを開発づるものである。

この課題を解決するため、本発明は、シリカゲル上、溶
出液としてｎ−ブタノール、氷酢酸、水４：１：１を用
い、ＩＩＳクロマトグラフィーで４時間展開分離し、０
．１％ニンヒドリン溶液で処０．４０．０．４４．０．
５２．０．６６および０．８を示すことを特徴とする、
除蛋白ウシ血液透析物からのオリゴペプチド混合物を提
供する。

このオリゴペプチドは、獣医学的に監査されたウシの血
液、とくにその１１菌敗が＃ｉしって検査された血液か
ら製造される。このウシ血液に３倍がの無菌蒸留水を加
えて希釈し、ついで塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ
を７．０に調整する。混合物を４０℃に加温し、ペプシ
ンおよびパパインを加えて４０℃で１５時間Ｓ酵さＵる
。酵素を不活性化するために全混合物を９０℃に３０分
間加熱し、濾過し、約２０℃に冷却したのち、２倍量の
少なくとも９５（ｖ／）％のエタノールを加え、■ 冷却し、少なくとも１２時間１１ｉ置する。次に、混合
物を濃縮し、４倍重端の９５％エタノールを新たに加え
、５〕時間攪拌し、少なくとも１２時間冷ｕ１する。最
後に、混合物からエタノールを除去して濃縮し、残った
水溶液を透過限界分子Ｉ！ｔ２．０００以下の膜を通し
て限外濾過する。この限外濾過液を１空中で濃縮乾固す
る。黄色結品性の吸湿竹粉末が得られる。その１％水溶
液はｐ１１６〜７を示す。１％溶液の浸透圧は０．０７
〜０．０８ａｓｒａ／に９である。この物質の溶液はト
リクロロ酢酸およびスルホサリチル酸によって沈殿を生
ぜず、これは検知できるだけの聞の′ｆｌｌ１１１アミ
ノ酸が含まれていないことを示唆する。

このようにして製造されたペプチド混合物は、吸着相と
してシリカゲル、溶出液としてｎ−ブタノール、氷ＭＭ
および水４：１：１、展開時間４時間、展開距離１５ａ
Ｒ１飽和室内の条件を用いたＩｉ！層り０マドグラフイ
ーによって同定される。検出は０．１％ニンヒドリン試
薬を用いて１１０℃に１５分間加熱して行う。ポリペプ
チド混合物は、Ｒｆ！＋ｎＯ，００４５，０，１９６，
０，２４５，０，４，０，４４，０，５２，０，６６お
Ｊ：び０．８を示す。

ペプチド混合物を２４時間加水分解して切断すると以下
の７ミノ酸含ｍ（ｍｉｏｌ／９）を示す。

アスパラギンＦａ　　　　　　　　　２８０スレオニン
　　　　　　　　　　２７０セリン　　　　　　　　　
　　　３００グルタミン酸　　　　　　　　　２４０ブ
ＬＪリン　　　　　　　　　　２８０グリシン　　　　
　　　　　　　３４０アラニン　　　　　　　　　　　
５７０シスチン　　　　　　　　　　　　　　９．０バ
リン　　　　　　　　　　　３１５ メチオニン　　　　　　　　　　７１．０イソロイシン
　　　　　　　　　４２．５０イシン　　　　　　　　
　　５４０ ヂロシン　　　　　　　　　　１２０ フェニルアラニン　　　　　　２５０ オルニチン　　　　　　　　　　１５ リジン　　　　　　　　　　　２８５ ヒスチジン　　　　　　　　　２４０ アルギニン　　　　　　　　　１１５ 本発明の生成物はまたクロマトグラフィーによって、公
知のｈ払で製造された製品と明瞭に区別される。ＦＰＬ
Ｃは、ＰｈａｒｌａＣｉａ社の装置により、５０００ダ
ルトンまでのペプチド範囲の分離にとくに適した酸性ト
ｌＲ５１５を使用して実施した。

展開条件はずべての物質について同一とし、ＷＩｉ液と
してはＰＢＳ　（ｐＨ７、２）を加え、溶出速度は１ａ
ｌＩ／分とした。本発明の生成物を１：２に希釈してり
Ｏマドグラフィーに付した。同時に、比較のため、公知
の方法によって製造された市販製品のソルコセリルおよ
びアクヂヘミルについても、同様に１：２に希釈してク
ロマトグラフィーを行った。第１図として添付した曲線
の形状から、その差異が明らかに確認される。

マウス肝臓ホモシネニドの酸素消費の増加を測定するワ
ールブルグ試験において、本発明のＡリゴベプチドは対
照に対して約２５０％の秤吸の増強を示した。これは従
来市販されている通常の製品の値、約１００〜１５０％
のオーダに比し明らかに浸れている。

本発明の方法によって製造された乾燥ペプチド濃縮物は
、それ自体公知の方法により、経口または経静脈的に使
用される薬剤にざらにｗ４製することができる。経口投
与用剤型としては、慣用方法により担体物質およびその
他の補助剤を添加して糖衣錠を製造でき、これにより他
の経口投与用剤型よりも高い安定性を得ることができる
。しかしながら、活性物質がペプチドである場合には、
乾燥物質をそれ自体公知の方法でさらに水溶液に調製し
た注射用溶液の剤型とした製剤が好ましい。

この場合、注射用溶液の防腐剤としては、ベンジルアル
コールを添加することが好ましい。用けは、活竹物質混
合物約５０〜２００ｊＩｉＦの範囲とすることが好まし
い。

本発明のペプチド混合物は、代謝の進行をとくに臓器独
立に促進し、また微小循環の改善をもたらす。したがっ
て、末梢性および中枢性の血行障害、およびたとえば火
傷後もしくはａｌ！瘍形成時のようなｆｆＪ　Ｉの治癒
の改善、ならびに体細胞の放射線耐性のノは強Ｊ３よび
皮膚移植にお番ノる適合性の改善に適している。

本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説明する。

例１　ペプチド混合物の８゛− ウシ山Ｗｔ９５０１をＩＩ菌数が２３以下であることを
確認したのち、無菌蒸留水で１：３に希釈する。この溶
液のｐＨを測定し、１Ｎ塩酸または１Ｎ水酸化ノ”トリ
ウムを加えてｐＨを７に調整する。希釈血液を４０℃に
加熱し、約９．／ｌのペプシンおよびパパイン、ならび
に防腐のために０．０５％のベンジルアルコールを加え
て攪拌下に混合する。完全に混合したのち、ざらにｐｔ
ｌを再検査してｐｔｌを７に調整する。連続的に攪拌し
ながら、１５時間酵素作用を続けさせる。ついでＥｌＨ
値の調整をあらたに行う。次に溶液を９０℃に加熱し、
この温度に３０分聞保持して酵素を不活性化する。熱時
、溶液を濾過して澄明化する。

乾燥残留物の吊を調べて、溶液を濃縮または無ｒｔＪ悉
留水で希釈して水１０４中に乾燥物質１に！Ｉが含まれ
るように調整する。このようにして得られた溶液８００
１を鮒えず攪拌しながら１時間以内に少なくとも９５（
ｖ／）％のエタノール１゜■ ６００１を加え、２０℃で５時間！拌する。この溶液を
４℃の冷室に一夜放置する。要目、この溶液を１〜１，
５気圧で加圧下に、濾過して澄明化する。

このアルコール溶液を、適当な減圧下、４０℃で約１６
０１に濃縮し、ついで再びｐＨを７に調整する。溶液の
聞を測定し、２０℃で攪拌しながら１時間以内に４倍虫
準の９５％エタノールを加え、さらに５時間攪拌する。

ついで、冷室中４℃に少なくとｔｔ１２時間放置したの
ら、溶液を１〜１５気圧に加圧下再び濾過して澄明化す
る。続いて、アルコールを蒸発させて除去する。得られ
た水溶液を加圧下１、分子１１２０００以下の分離限界
を有する膜を透過させて限外濾過する。限外濾過された
水溶液を真空中で濃縮乾固する。濃縮物を乾燥器に入れ
て残った湿気を除去する。

抽出物は、黄色、結晶性の吸湿性粉末である。

限外濾過液の乾燥物質の収量は約２８故である。

２　注射用゛の　Ｖ〜 例１に従って！ＩＴ１されたエタノール抽出物８゜８０
０に！ｌとベンジルアルコール２，２００都を攪１￥下
に、注射用滅菌水２１２．６３０＃中に溶解する。ｐＨ
ｖｌを５．８に調整する。続いて、孔径０．２μの硝酸
セルロースフィルター上、滅菌濾過し、滅菌アンプル中
に窒素保護下に充填し、融１１１する。

例３　ベプヂ泥合　の同つ 蛍光指示薬を含まないシリカゲル６０　（ＨｅｒＣｋ社
ｙｊ）上、展開溶媒としてｎ−ブタノール、氷酢酸、水
４：１：１を用いて薄層り０マドグラフイーを実施する
。展開時開は４時間、負荷Ｍは１−とする。０．１％ニ
ンヒドリン検査試薬により１１０℃で１５分周毛理して
発色ざＵる。着色クロマトグラムは、以下のＲｆ値、０
．００４５．０．１９６．０．２４４．０．４０．０．
４４．０．５２．０．６６および０．８を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のオリゴペプチド混合物（１）ならび
に公知の方法によって製造された市販製品、ソルコむリ
ル（ノオよびアクヂヘミルイ３ンのりａマドグラフィー
（いずれも１：２に希釈）の結東を示す図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シリカゲル上、溶出液としてｎ−ブタノール、氷
   酢酸、水４：１：１を用い、４時間展開する薄層クロマ
   トグラフィーで分離し、０．１％ニンヒドリン溶液で処
   理して１１０℃に１５分間加熱して検出すると、Ｒｆ値
   ０．００４５、０．１９６、０．２４４、０．４０、０
   ．４４、０．５２、０．６６および０．８を示すことを
   特徴とする除蛋白ウシ血液透析物からのオリゴペプチド
   混合物。
2. （２）２４時開加水分解後のアミノ酸総含量（ｍｍｏｌ
   ／ｇ）は、 アスパラギン酸　２８０ スレオニン　２７０ セリン　３００ グルタミン酸　２４０ プロリン　２８０ グリシン　３４０ アラニン　５７０ バリン　３１５ シスチン　９．０ メチオニン　７１．０ イソロイシン　４２．５ ロイシン　５４０ チロシン　１２０ フェニルアラニン　２５０ オルニチン　１５ リジン　２８５ ヒスチジン　２４０ アルギニン　１１５ を示す特許請求の範囲第１項に記載のオリゴペプチド混
   合物。
3. （３）ウシ血液を３倍量の水で希釈したのち４０℃に加
   熱し、ペプシンおよびパパインと４０℃において１５時
   間醗酵させ、３０分間９０℃に加熱して酵素を不活性化
   し、濾過し、少なくとも９５ｖ／ｖ％のエタノール２倍
   量を加え、冷却して少なくとも１２時間放置し、濃縮し
   、再び４倍重量のエタノール９５ｖ／ｖ％を加え、攪拌
   し、少なくとも１２時間冷却し、限外濾過する特許請求
   の範囲第１項および第２項に記載のペプチド混合物の製
   造方法。