JPS63130555A - ｌ−リンゴ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明Ｆｉｔ−ＩＪンが酸の製造法に関する。ｔ−リン
ゴ酸は、医薬用としても用いられているが将来食品用や
工業用としての利用も期待されるものである。

本発明によれば、　ｔ　−ＩＪンが酸が高い収率で純度
よく製造することができる。

先行技術 ｔ−リンが酸の製造法としてフマール酸の塩を７マラー
ゼ活性を有する微生物中の酵素フマラーゼの存在下酵素
反応させて製造することは公知である。（たとえば特公
昭３７−４５１１．特公昭４４−１１９１号公報等） この酵素法によるｔ−リンが酸の製造ておいては、フマ
ール酸とｔ−ＩＪンゴ酸との間に反応平衡が存在し、か
つ、フマール酸とｔ　−Ｕノコ９酸は化学的諸性質の似
通った二塩基酸であるため、反応液からの両者の分離は
非常に困難であシ、ｔ　−リンゴ酸の効率の高い工業的
回収法は重要々課題であった。

一方、分離方法としてフマール酸の溶解度が低いことを
利用して、大部分を除去し、カルシウムイオンを加えて
ｔ−リンフ９酸カルシウムを沈殿させて分離精製する方
法も知られている。（特開昭５１−７０８８０号公報） しかしながら、この方法によりて、ｔ−リンゴ酸カルシ
ウムからｔ−リンゴ酸を製造するては、硫酸を加えて生
成する硫酸カルシウムを除去し、活性炭処理、陽イオン
およびアニオンのイオン交換樹脂処理によシ溶存してい
る硫酸カルシウムを除いたのち、減圧濃縮、乾固すると
いった煩雑な方法が取られていた（前記特開昭５１−７
０８８０号公報）。この方法は、操作が煩雑であること
の他に、ｔ−リンゴ酸のアニオン交換樹脂への吸着によ
り回収玉が低いといった欠点もあった。

本発明者らは、かかる不都合を解決するため検討の結果
、水酸化カルシウムまたば／および酸化カルシウム水溶
液にフマール酸全添加しつつ一値を６〜９に保ち、フマ
ラーゼの存在下酵素反応せしめることにより、フマール
酸に対してもまたカルシウム化合物に対しても高い収率
でｔ−リンゴ酸カルシウムを製造する方法を見出した（
特願昭６１−１９３３８８号） 本発明は、さらに、かぐして得られたリンゴ酸カルシウ
ム反応混合物と強酸性陽イオン交換樹脂とを接触するこ
とにより高純度ｔ−リンゴ酸を有利に製造する方法を提
供するものである。本発明の方法は、公知の方法と比較
して、工程数が少なく工業的にきわめて有利な方法であ
るということができる。

（フマラーゼ） フマラーゼ源としてはフマラーゼを含有する菌体、その
破砕物これらの固定化物又は処理物が用いられる。

本発明において用いられるフマラーゼを含有する菌体と
しては、たとえば微工研に寄託されているブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ　２３３（ＦＥＲＭ　３０６８）
　（与公昭５７−２６７５５号公報参照）の菌体および
この菌よりα−７ミノ酪酸耐性株として取得したｈτＪ
−２３３−ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ　３８１２）（特公昭
５９−２８３９８号公報参照）の菌体等公知の菌体があ
る。

これらの菌体は遊離菌体のまま用いることもできるが、
更には該菌体、あるいはその含有する酵素（フマラーゼ
）を固定化したものを反応に供してもよい。

（ｔ−リンゴ酸カルシウムの製造） ｔ−リンゴ酸カルシウムは、例えば、水酸化カルシウム
または／および酸化カルシウム水溶液にフマール酸を逐
次添加し一値を６〜９の範囲で一定となるようにして反
応させることにより得られる。すなわちフマール酸の添
加を開始した初期の場合は、添加した瞬間−値は６〜９
の範囲となるが時間と共に一値が変化して約１２となり
、添加をつづけていくに従い、−値の変化する間隔は次
第に長くなり、当量の約０．７〜０．９添加した所で一
値Ｆｉ６〜９の範囲で一定となり、フマラーゼの至適−
値となる。

次に所足量の７マラーゼを添加して反応を開始する。ｔ
−リンゴ酸カルシウムの生成とともＫｐＨ値が高くなる
のでフマール酸を逐次添加して一値が６〜９となるよう
に調節する。反応の進行とともにフマール酸を添加する
間隔は長くなシ、カルシウム化合物と当量加えた所で反
応は完結する。

本反応における反応温度Ｆｉ１５〜６５℃好ましくは２
０〜５５℃である。反応時間はフマラーゼの量によって
変るが通常的０．５〜４８時間である。

水酸化カルシウムまたは／および酸化カルシウムの使用
量は特に制限はないが、一般に０．２〜２Ｍ好ましくは
０．５〜１．５Ｍである。また７マール醗は水酸化カル
シウムま九は／および酸化カルシウムの当モル以下で使
用される。オたフマラーゼの使用量も特に制限はないが
０．０５〜１０（Ｗ／Ｖ幅）好ましくは０．２〜７　（
Ｗ／Ｖチ）の範囲である。得られたｔ−リンク０酸カル
シウム反応液を強酸性陽イオン交換樹脂と接触させるこ
とにより収率よ〈高純度ｔ−リンコ０酸を製造すること
ができる。

（強酸性陽イオン交換樹脂） 本発明で使用される強酸性陽イオン交換樹脂はＨ型のも
のである。具体的には日本錬水社製ダイヤイ、ｔン５Ｋ
−ＩＢ、５Ｋ−１０２，５Ｋ−１０４，５Ｋ−１０６゜
５Ｋ−１１０，８に−１１２，５Ｋ−１１６やダイヤイ
オンＰＫ−２０８，ＰＫ−２１２，ＰＫ−２１６，ＰＫ
−２２０゜ＰＫ−２２８およびローム・アンド・ハース
社のアンバーライトＩＲ−１２０Ｂ、ＩＲ−１１６，Ｉ
Ｒ−１１８゜ＩＲ−１２２，ＩＲ−１２４やアンバーリ
スト１５などがあげられるが、ｔ−リンフ９酸カルシウ
ムとのイオン交換能をもつ強酸性陽イオン交換樹脂であ
ればメーカーおよび種類を問わない。

（ｔ−リンが酸の製造方法） ｔ　−ＩＪンが酸カルシウム反応混合物と強酸性陽イオ
ン交換樹脂との接触の方法としてパッチ式とカラ五式が
あるが、反応混合物が固液混合物であることからパッチ
式が好ましい。具体的には、１−一リンゴ酸カルシウム
反応液をその１を処理しても純度の高いｔ　−ＩＪンゴ
酸が得られるが、少量残存する未反応フマール酸を除く
Ｋは、反応混合換金口過や遠心分離などの操作により固
体分を分離し更にこれを水洗した後、強酸性陽イオン交
換樹脂で処理することにより、極めて高純度のｔ　−Ｉ
Ｊンが酸を製造することが可能となる。なおｔ−リンフ
０酸カルシウムヲノ譬ツチ式で処理する場合、必要なら
ば水を加えるなどして１０〜５０Ｗ／Ｖ％好ましくＦ１
２０〜４０Ｗ／Ｖ４の濃度でおこなうことが好ましい。

また使用する強酸性陽イオン交換樹脂の鉦は、カルシウ
ム量に対して当量以上の交換容量となるように使用する
。具体的にはカルシウム量に対して１〜３倍当量より好
ましくは１．２〜２倍当量である。パッチ式でおこなう
場合、温度は樹脂の耐熱温度以下であれば問題ないが室
温程度で十分である。また処理時間は、１０分〜１時間
位である。カルシウムイオン交換後、樹脂に吸蔵されて
いるｔ−リンフ９酸を水洗によシ回収する。

菌体を口側した後ｔ　−１７ンが酸水溶液を濃縮乾固す
ることによシｔ−リンが酸が高い収率で得ることができ
る。

実施例 次に実施例によシ本発明を具体的に説明する。

参考例 第１表に示した組成の培地１０　Ｑｍを５００１ｒｌＪ
！の三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間加圧滅
菌したものにエタノール′ｔ−２マｏＬ％無菌的に添加
し、これにブレビ・ぐクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡＢ−４１ｉ−白金耳量値菌し、３０℃にて２４時
間培養した。

この培養液２０ゴを２ｔジャーファーメンタ−中の第２
表に示した組成の培地１ｔに接種し、３３℃、ｐＨ７，
６，通気量１　ｖｖｍの条件にて攪拌しエタノール濃度
が１　＝　１．５　ｖｏｔ％に保たれるようにエタノー
ルを断続的に添加した。３０時間の培養後、培養液を遠
心分離（６０００ｒｐｍ　、１５分）して得た菌体を供
試画体とした。

該菌体２．５ｇを５０ｍ１のｐＨ６，０，０，２Ｍ、ｔ
−リンが酸ナトリウム水溶液に懸濁し、４５℃、２時間
処理した。この後、遠心分離にて集菌し、蒸留水１０１
ｎｌで２度洗浄した後、遠心集菌した。

第１表 尿素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．０　
Ｉｉ硫酸アンモニウム　　　　　　　　　　　　１４．
０，９ＫＨ２ＰＯ４０，５，９ に２ＨＰＯ４０，５ｌｌ Ｍｇ５Ｏ４−７Ｈ２００，５，９ Ｆ＠Ｓ０４’　７Ｈ２０６，Ｏ’ｎ９ Ｍｎ８０４”　４〜６Ｈ２０６，Ｏｍ９酵母エキス　　
　　　　　　　　　　　　　　１．ｏ９カデミノ酸　　
　　　　　　　　　　　　　　１．０Ｉピオチン　　　
　　　　　　　　　　　　　２００μＩチアミン塩酸塩
　　　　　　　　　　　　ｉｏｏμＩ蒸留水　　　　　
　　　　　　　　　　１０００１１７第２表 硫酸アンモニウム　　　　　　２３．０９ＫＨ２ＰＯ４
０，５９ に２ＨＰＯ４０，５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２０ｌｎ９ ＭｎＳＯ４”　４〜６Ｈ２０２０ｍ９ 酵母エキス　　　　　　　　　　　３ｇカデミノ酸　　
　　　　　　　　　　３ｇビオチン　　　　　　　　　
　　２００μＩチアミン塩酸塩　　　　　　　１００１
４蒸留水　　　　　　　　　　１００９ｍ／実施例 一計、かくはん器を備えた７ｔの反応器に水酸化カルシ
ウム２９６ｇ（４モル）および水４ｔｆ仕込んだ。４５
℃で加熱かくはんさせながらフマール酸を、−値を測定
しながら添加したところ４００Ｉ添加したところで一値
が約６．５で一定となった。つづけて参考例の方法で処
理した菌体を１２０．９添加した。反応の進行とともに
一値が高くなるためフマール酸を徐々に添加しｐＨ６，
５〜７．３の範囲で反応をおこなった。添加したフマー
ル酸は６４ｙで合計４６４　ｇ（４ｍｏｔ）となり、添
加に要した時間は３時間でさらに１時間加熱かくはんし
た。反応終了後、高温液体クロマトグラフで分析したと
ころｔ−リンゴ酸カルシウムの収率は９８．７％で未反
応フマール酸は１．３％であった。

この反応混合物を遠心分離してｔ−ＩＪンゴ酸カルシウ
ムと菌体との混合固型物１０４１’を得た。

このものを水１．５ｔで２回洗浄し遠心分離をそれぞれ
おこなった。分析の結果ｔ−Ｕンが酸カルシウムが３．
８　ｍｏｔフマール酸カルシウムが０．００１５ｍｏｔ
含まれていた。遠心分離して得た固研物〈水４ｔを加え
、かくはんしながら５ＫＩＢ−Ｈ型（日本疎水（株）　
ＨＡ　）　４．６　ｔ　を添加し３０分かくはんをつづ
けた。／、−ＩＪンが酸全抜き出した後、更に樹脂２水
４ｔで洗浄しｔ−ＩＪンが酸を回収した。菌体の混ざり
たＬ　−ＩＪンゴ酸水溶液から限外口過により除菌した
。水音減圧留去しｔ−ＩＪンが酸の結晶を得、乾燥した
。収量４８８Ｆ（３，６４モル）で収率９１憾であった
。なおフマール酸の含ｆは０．０５チ以下であった。

融点９９−１００℃

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ｌ−リンゴ酸カルシウム反応混合物と強酸性陽イオン交
   換樹脂とを接触することによる高純度ｌ−リンゴ酸の製
   造方法