JPS63109780A

JPS63109780A - ウイルスの固定化方法

Info

Publication number: JPS63109780A
Application number: JP25379586A
Authority: JP
Inventors: Yukiko Matsuda; 松田　由紀子; Hideki Iijima; 秀樹飯島
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1986-10-27
Filing date: 1986-10-27
Publication date: 1988-05-14
Anticipated expiration: 2010-05-24
Also published as: JPH0746991B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ウィルスが存在する液体を多孔性膜で、実質
的に垂直濾過し、ついで凍結乾燥して膜孔中にウィルス
を蛋白質などのコーティング剤なしで固定化するウィル
スの固定化方法に関する。

本発明における固定化とは、膜上に蛋白質などをコーテ
ィングすることにより達成されるようなものではなく物
質を多孔質膜の孔中に閉じ込め、１ケ所に保留して動か
ぬようにすることを意味する０本発明方法は、ウィルス
の検査１例えば肝炎ウィルスやエイズウィルスなどの免
疫検査や、複数のウィルスが混在したウィルス掖から目
的とするウィルスあるいはウィルス群を固定化すること
に利用できる。

（従来技術）ウィルスは細胞内でのみ増殖し、潜在的に病原性をもつ
感染性の実体で、次のような属性をもつものである。■
核酸としてＤＮＡかＲＮＡのどちらか一方を持つ、■遺
伝物質のみ複製される。■二分裂では増殖しない、■エ
ネルギー産生系を欠く、■宿主のりポゾームを蛋白質合
成に利用する。

現在ウィルスの濃縮方法には１粒子の大きさによる分画
遠心法、溶解度差を利用した等電点処理法、有機溶媒に
よる処理法、吸着溶出を利用した方法、粒子の形、密度
を利用した密度勾配遠心法、酸素処理による方法等があ
り、それぞれのウィルスに適した方法を選択している。

これらのうち膜を用いたウィルスの濃縮方法には、吸着
溶出を利用した方法と濾別による方法とアルギネート膜
による保留溶解による方法がある。

吸着溶出を利用した方法とは、適当な条件を与えウィル
ス粒子の表面荷電により吸着剤をコーティングした膜に
ウィルス粒子を吸着させ、次に塩濃度などの条件を変え
ることによってウィルス粒子をコーティングした膜より
溶出させることができることを利用した濃縮方法である
０例えばｒＡｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、ｖｏｌ、
２３　（４）　７６　（１９７２）　　、　、Ｗａ　ｌ
　ｌ　ｉ　ｓ　。

Ｃ，ｅｔ　　ａｌ、Ｊに記載されているように下水など
の水に浮遊している腸内ウィルスではあらかじめ試料に
除菌、除蛋白を行い、ＭｇＣｆＬ２あるいはＡ　文Ｃｌ
　ｘを加え、ウィルスをフィルターに吸着濾過させた後
、溶出させている。また、ウィルス培養液では液中の吸
着阻止物質をプロタミンなどで除去しＰＨを５．０に修
正し濾過すると、ウィルスがフィルターに吸着し、次い
でウシ胎児血清を濾過すると、ウィルスが溶出し、６０
−１００倍の濃縮液が得られている。しかし、一般にウ
ィルス粒子を吸着させ、適当な溶出液で溶出する場合は
、ウィルスの感染性の低下を起こしやすい、そのうえウ
ィルス毎に条件を決める必要があり、非常に操作が煩雑
である。また吸着量に限界があり、濃縮率は低い。

次に、濾別による方法であるが、これは限外濾過による
濃縮である。ｒＣａｎａｄ、Ｊ　、Ｃｈｅｍ、、ｖｏ　
ｌ　、３３．１４５２　（１９５５）、Ｇｏｒｄｏｎ、
Ｊ、Ｌ、＆Ｍａｓｏｎ、Ｓ、Ｇ、Ｊに記載されているよ
うに、培養液などの試料を循環ポンプでフィルターに平
行に流し、吸引でウィルス以外の成分をフィルターで濾
過しウィルスを濃縮させるものである。これはフィルタ
ーに蛋白質が吸着するため目づまりがしやすく、ウィル
スの濃縮速度は遅い、また、種々の形や大きさを持つウ
ィルスに適した孔径の膜を選択することはできない。

次にアルギネート膜による方法であるが、「“Ｔｒａｎ
ｓｍｉｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｖｉｒｕｓｅｓ　　　ｂ
ｙ　　　ｔｈｅ　　　ＷａｔｅｒＲｏｕｔｅ”（Ｅｄ、
Ｇ、Ｂｅｒｇ）　　、ｐ、１２１　　　Ｉｎｔｅｒｓｃ
ｉｅｎｃｅ、　　（１９６７）　　、Ｇａｒｔｎｅｒ、
Ｈ，Ｊに記載されているように、この膜はアルギン酸ナ
トリウムの溶液にＬａ　（ＮＯ３）　３　　・６Ｈ２０
，Ａ立Ｃｌ　１　・６Ｈ２０を加えてゲル化したも（７
）テ、三層（ｃａｐｉ　１ｌａｒｙｚｏｎｅ、ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａｔｅｌａｙｅｒ、ｐｒｉｍａｒｙ　　ｇｅ
ｌ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ）からなるものである、ウィル
スを、このフィルターに保留させ融解して回収し、動物
または培養細胞によるウィルス分離を行うものである。

このフィルターにおいてウィルスは中間層に保留される
。しかし、ゲル状であるため、もろく、非常に取り扱い
にくく、保留できるウィルス量は限定されてくる。しか
も、濾過後保留されたウィルスを乾燥状態で保存してお
くことは不可能である。またフィルターを融解してウィ
ルスを回収しなければならず、ウィルスの感染性の低下
も起こしやすい、このように、アルギネート膜による方
法は実用的ではないといえる。

（発明が解決しようとする問題点）ウィルスの濃縮を行う場合、従来の方法ではウィルスの
感染性を維持することと濃縮効率を高めることの２つを
同時に満足することは難しかった。かつウィルスは多く
の場合液体中で浮遊状態にあり、常に空気中への飛散の
可能性があるが、有害ウィルスを取り扱う場合において
人体に対する安全性は考慮されていなかった。

本発明の目的は、ウィルスの種類にかかわらず、ウィル
スの感染性を維持しながら濃縮でき。

しかも、取り扱い操作がより簡単で安全性の高いウィル
スの固定化方法を提供することである。

（問題点を解決するための手段）本発明方法は、ウィルスの存在する液体を、銅アンモニ
ア法再生セルロースからなる多孔性膜で実質的に垂直濾
過し、しかる後、凍結乾燥して、膜孔中にウィルスを固
定化することを特徴とする。

再生セルロースの製法には、ビスコース法、セルロース
エステルのケン化法、銅アンモニア法など、種々のもの
があるが、それぞれ、製造条件の相違により物理的、化
学的な性質に差があり。

「再生セルロース１として一律に論じられるものではな
い、銅アンモニア法では、不可欠な酸処理により銅の除
去に伴う微細な孔の発生と特異な分子鎖の凝集構造の発
生が認められるため、銅アンモニア法再生セルロースは
特異な性質を持つ。

その性質の特徴は、親水性で、かつ蛋白質の吸着性が少
ない点にある０本発明者らは、蛋白質と高分子素材との
吸着性に関する相関性を検討した結果、一般的には、親
水性素材はど、蛋白質の吸着性が小さく、本発明方法に
用いられる銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔
性中空ｌａｍが１番手さいことを見いだした。

銅アンモニア法再生セルロースの粘度平均分子量は７　
Ｘ　１０’　以上が好ましく、またＯ、１ＮＮａＯＨ水
溶液中での溶解成分が少なければ少ないほど望ましい、
４０℃、４８時間、０．ｌＮＮａＯＨ水溶液中に浸漬し
た際、この溶解分が１０ｐｐｍ以下であれば、この中空
ｔａｒｔａはウィルスを濃縮するのに最も適している。

上述のようなセルロースからなる膜を作製するには、高
純度セルロース原液を用いて銅アンモニア法再生セルロ
ースを作製するか、あるいは膜を作製後に０．ＩＮ　　
ＮａＯＨ水溶液で７２時間以上洗浄処理すれば良い、高
純度セルロース原料を用いれば、上記溶解分が著しく減
少するので、より好ましい、ここで、ｒ高純度セルロー
ス原料１とは、α−セルロース含有量が９５ｗｔ％以上
で、重合度が５００以上の木綿リンターおよび木材パル
プを指す。これらの原料について、ブリーチング、洗浄
工程中での分解および酸化を防止しつつ、不純物の混入
を避けるため、常に精製された水を用いると良い。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性膜でのウ
ィルス固定化に際して、ウィルス径■（ｎｍ）、膜の水
流速平均孔径Ｄ　（ｎｍ）、膜厚の条件を満たすことが
好ましい。

ここで、ウィルス径Ｖとは、球状ウィルスではその直径
を、また、非球状ウィルスでは、楕円体に近似したとき
の短軸の直径を差す、（１）式の値が９．５以上である
と、膜のウィルス阻止率が高く、膜孔中にウィルスが浸
入することができない。

また、（１）式の値が１より小さいとウィルスの損失が
多く、多孔性膜を構成する物質（ウィルスの媒体とよぶ
、原液では水が、膜中に捕捉されたウィルスでは膜を構
成する再生セルロースが媒体である）１ｇ当たりのウィ
ルス密度をウィルス原液１ｇ（＝１ｍｌ）あたりのウィ
ルス密度より大きくすることが出来ない。

膜によるウィルス粒子の分離機構としては、膜の孔径の
大きさと分離すべきウィルス粒子の粒子径との違いによ
りふるい分けるｒふるい機構１と、膜表面にウィルス粒
子を吸着させるｒ＠着機構」がある、銅アンモニア法再
生セルロースからなる多孔性膜では、蛋白質の吸着性が
他の高分子素材にくらべて、最も小さいという本発明者
らの検討結果を考慮すれば、銅アンモニア法再生セルロ
ースからなる多孔性膜によるウィルス分離は。

殆ど「ふるい機構ｊであると考えられる。

多孔性膜としては、平膜でも中空ｌａ！１にでも使用で
きるが、好ましくは中空繊維である。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
において、内壁面から外壁面への膜厚方向に垂直な面に
おける孔径を面内平均孔径で表す時、Ｍ内質通孔の入口
及び出口における面内平均孔径の間に、極小の部分、該
極小の部分より大きい部分、もうひとつの極小の部分の
順に配列された構造が、中空繊維の膜厚方向に少なくと
も１組存在するものを用いるとよい、ここで言う極小と
は、数学的意味での極小をさす、すなわち１本発明にお
いては、膜表面の面内平均孔径がそのすぐ゛内側面の面
内平均孔径より小さいような膜は、「膜表面は極小の部
分」とはいわない。

この構造により、従来の多孔質中空ｔａ雄にくらべて、
・銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊
維のウィルスの阻止率を高くすることができ、孔中にウ
ィルスを捕捉できると共に、濾過速度を速めることがで
きる。これに対して、面内平均孔径の極小部が少なくと
も１組以上存在しない多孔性中空繊維の場合では、阻止
率を９０％以上にするには、透過速度を遅くせざるを得
す。

またウィルスを中空繊維孔中に捕捉し、濃縮することは
できない。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
において、極小面内空孔率は１０％以上であることが好
ましい、１０％未満では、限外濾過速度は急激に低下す
る。好ましくは３０９６以上である。限外濾過速度に及
ぼす面内空孔率の影響は、１０％未満では極小面内空孔
率の５乗、１０〜３０％では約２乗、３０％を越えると
約１乗に比例して限外濾過速度は増加する。一方、極小
面内空孔率が８０％を越えると、多孔性中空繊維の力学
的性質は著しく低下し、ピンホール等の欠陥部が生じた
り、中空繊維を構成するセルロース分子が、濾液中ある
いは被濾過液中に脱落分散する恐れがある。

中空ｍ維の膜厚は薄ければ薄いほど、一般的には濾過速
度が大きくなるので好ましい、しかしながら、膜厚が１
０路ｍ未満になると、中空繊維にはピンホールが多発し
、ウィルス粒子が濾液中に漏れ中てくる。また膜厚が１
１００１Ｌ以上になると、濾過速度が大きく低下してし
まう、極小面内空孔率が大きくなれば膜厚をより厚く設
計する方が被捕捉ウィルス数が増加して良い。

本発明方法に用いられる銅アンモニア法再生セルロース
からなる多孔性中空繊維は、該中空繊維の内壁面から外
壁面への膜厚方向に層状構造を有し、蛋白質の透過性、
ウィルスの阻止性、ウィルスの捕捉性をより支配する極
小部を有している。

その極小部分の膜厚方向での厚みは、該多孔性中空繊維
が、ミクロ相分離法で作製されるため、セルロース濃厚
相粒子の直径に相当する。したがって、その厚みは２ｐ
ｍ以下である。

本発明方法で用いられる銅アンモニア法再生セルロース
からなる多孔性中空繊維の製造方法としては、例えば、
セルロースリンター（α−セルロース含有量９６％以上
、平均分子量２．６Ｘ１０５）を公知の方法で調整した
銅アンモニア溶液中に８ｗｔ％の濃度で溶解したものを
紡糸原液として用いる。この紡糸原液に対して、アセト
ン／アンモニア／水系混合溶液を凝固剤および中空剤と
して用いてミクロ相分離を生起させ、その後、凝固、再
生することにより得られる。ここで、ミクロ相分離とは
、溶液中に高分子の濃厚層あるいは希薄層が直径０．０
２〜数ＪＬｍの粒子として分散し、安定化している状態
を意味する。ミクロ相分離の生起は、紡糸中の糸の失透
現象によって直接肉眼観察するか、あるいは紡糸後の糸
の電子顕微鏡観察により、直径１ルｍ以下、０．０２Ｊ
Ｌｍ以上の粒子の存在で確認される。

本発明方法による実施例を説明するに先立ち、本明細書
中に用いられる主な技術用語（物性値）の定義とその測
定方法を以下に示す。

［水流速平均孔径］銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空ａｍ
のモジュールを作製し、そのモジュール状態で、中空繊
維の水の流出量を測定し、（２）式から水流速平均孔径
を求めた。

Ｖ二流出量（ｍｌ／ｍ１ｎ）Ｔ　：　ＩＩ厚（ルｍ） ΔＰ：圧力差（ｍｍＨｌｒ）Ａ：１５を面積（ｍ″）Ｐｒｐ：空孔率（−）ル：水の粘性率（ｃＰ）空孔率Ｐｒρは水膨潤時の見掛は密度ρａＷ、ポリマー
の密度ρｐより（３）式で求めた。セルロースの場合ρ
ｐ３ｉ、ｓｅｔを用いた。

Ｐｒｐ　（％）＝　（１−ρａｗ／ｐｐ）ｘｔｏｏ　　
（３）［平均分子量］銅アンモニア溶液中（２０℃）で測定された極限粘度数
［η］　　（ｍｌ／ｇ）を（４）式に代入することによ
り平均分子量（粘度平均分子量）Ｍｖを算出する。

ＭＶ＝　［ηｌ　Ｘ３．２ＸＩ　Ｏ’　　　　　　（４
）［極小面内空孔率］銅アンモニア油再生セルロースからなる多孔性中空繊維
をアクリル樹脂で包埋後、ウルトラミクロトーム（ＬＫ
Ｂ社（スウェーデン）製Ｕｌｔｒａｔ　ｏｍｅｍ８８０
０型）に装着したガラスナイフをもちいて、外壁面から
膜厚方向に沿って厚さ約ＩＩＬｍの試料を順に切り出す
、その試料切片をクロロホルムで脱包埋後、それぞれの
切片の電子顕微鏡写真をとる。注目する切片のＬｃｒｎ
’当たり、孔半径が（ｒ）〜（ｒ＋ｄｒ）に存在する孔
の数をＮ（ｒ）ｄｒと表示する。３次および４次の平均
孔半径（それぞれ１３およびｒ４）は次式で定義される
。

平均孔径は２ｍで（５）式および（６）式から計算される。それぞれの切片の電子顕微鏡
写真より平均孔径を計算し、面内平均孔径の内壁面から
の距離に対する図示より、極小面内孔径を示す面を決定
する。その決定された面の空孔率を極小面内空孔率と定
義する。その極小面内空孔率は（７）式で求められる。

［ウィルス阻止係数］濾過しようとする水溶液単位体積当たりのウィルスの数
Ｎｏ、膜を透過した濾液単位体積当たりのウィルスの数
Ｎのとき下記（８）式で定義される。

φ＝　−ｌ　　ｏ　ｇ　　（Ｎ／Ｎ　ｏ）　　　　　　
　　（８）（発明の効果）本発明によれば、ウィルスが存在する液体から、ウィル
スの感染性を低下させることなく、かつ人体により安全
に、ウィルスを固定化して濃縮することが出来る。そし
て、血清肝炎ウィルスやエイズウィルスのような感染す
るウィルスの免疫検査を中空ｍａｔ、の孔中にウィルス
を固定した状態で行える。また、複数のウィルスが混在
したウィルス液から目的とするウィルスあるいはウィル
ス群を分別あるいは固定化濃縮することに利用できる。

（実施例）以下、本発明方法によるウィルスの固定化方法の実施例
を示す。

（実施例１）セルロースリンター（α−セルロース含有ｍ　９６％以
上、平均分子量２．６Ｘ１０　　）を公知の方法で調整
した銅アンモニア溶液中に８ｗｔ％の濃度で溶解し、濾
過脱泡を行い、紡糸原液とした。その紡糸原液を環状紡
糸口の外側紡出口（外径２ｍｍφ）より２．５ｍｌ／ｍ
ｉｎで、一方中空剤として、アセトン４５ｗｔ％／アン
モニア０．５７５ｗｔ％／水５４．４２５ｗｔ％の混合
溶液（中空剤）を中央紡出口（外径０　、８ｍｍφ）よ
り１．７ｍｌ／ｍｉｎでそれぞれアセトン４５ｗｋ％／
アンモニア０．５７５ｗｔ％／水５４．４２５ｗｔ％の
混合溶液（凝固剤）中に直接吐出し、１２ｍ／ｍ１ｎの
速度で巻き取った。なお、吐出直後の透明青色状の繊維
状物は次第に白色化し、ミクロ相分離を生起し、ひきつ
づいて凝固が起こり、繊維としての形状が維持されてい
た。その後、２ｗｔ％の硫酸水溶液で再生し、その後、
水洗した。水洗後の中空ｍｉｓをアセトンで、中空ｍ線
内部の水分を置換し、その後、１０％延伸した状態で真
空乾燥した（２５℃×１．５時間）、このようにして得
られた銅アンモニア法再生セルロース多孔性中空繊維の
内径は３００゜２ｇｒｎ、膜厚は２８．５μｍ、水流速
平均孔径は１０．８ｍｍ、極小面内空孔率は２８％であ
った。（１）式より計算された値は９．４であった。

大腸菌ファージφＸ１７４　（ＩＦＯ２０００９、ウィ
ルス径２５ｎｍ）を大腸菌（Ｉ　ＦＯ１３８９８）に感
染させファージ原液を調製した。

ファージ濃度を寒天重層法によりプラーク形成数から測
定したところ、１　、９　Ｘ　１０９（Ｐ　Ｆ　Ｕ　／
　ｍｌ）であった、上記銅アンモニア法再生セルロース
中空繊！１１００本よりなるガラス製ミニモジュールの
入口より上記ファージ原液を中空繊維中空部に送入し、
中空部出口を閉じた状態で、ファージ原液１１ｍ１を圧
力２００ｍｍＨｇで濾過し、＊液５ｍｌを得た。濾液１
ｍｌ中のファージ濃度をプラーク法で定量したが、ファ
ージは確認されなかった。従って、φは９．２以上であ
った。続いてモジュール出口を開き、生理食塩水をペリ
スタリックポンプで毎分１０ｍ１の流量でモジュールに
送入しながら、Ｈにかかる圧力が約２００ｍｍＨｇにな
るよう調節して中空部および孔内を十分に洗浄した。洗
浄終了直前の濾液および中空部を通過した洗浄液中には
プラーク形成法により７アージは確認されなかった。モ
ジュール洗浄後、中空ｍ１Ｉｌを凍結乾燥した。

中空Ｈ１１！孔中に捕捉されたファージ量を測定するた
めに、凍結乾燥した中空繊維的１００ｍｇ（中空繊維で
４０本）を０．５％セルラーゼ溶液（ｐＨ５，０，０，
ＩＮ＃酸緩衝液にヤクルト製オノズカＲ−１０を溶解）
１０ｍｌ中に３７℃で浸漬してセルロースを分解し、ｐ
Ｈを７．０に調整後１分解液を９００Ｏｒ、ｐ、ｍで１
０分間遠心し、上澄液中のファージ濃度をプラーク法で
測定したところ、３．８Ｘ１０７　（ＰＦＵ／ｍｌ）で
あった、したがって中空部ｍ１ｇ中に３．８×１０”Ｐ
ＦＵのファージが存在しており、媒体１ｇ中のウィルス
密度は原液より高くなっていた。

（比較例１）セルロース濃度１０％、アンモニア濃度７％、銅濃度３
．６％の組成と２０００ボイズの粘度を有する銅アンモ
ニア再生セルロース原液を、２重環状紡口の外側紡出口
（外径５ｍｍ）から２０ｍ１／ｍｉｎで押し出し、同時
に中央の直径ｉｎｍの管からパークロルエチレンを５ｍ
ｌ／ｍｉｎで押し出した０次に押し出された線状紡糸原
液を直接空気中に３００ｍｍ自由落下させ、次いで１１
ｗｔ％ＮａＯＨ水溶液に導入し、８ｍの凝固浴を巻き取
り速度１００ｍ／ｍｉｎで通過させた。凝固浴から引き
出した糸は水洗後、３％硫酸で再生し、再び水洗した。

その後１３０℃で乾燥し、つづいて中空部内の有機溶媒
を押し出した。このようにして得た中空繊維の内径は２
６５１Ｌｍ、膜厚２５１Ｌｍ、水流速平均孔径は８ｍｍ
、面内空孔率は１０％以下であった。（１）式から計算
した値は９．７であった。

実施例１と同様のファージ原液を濾過し、濾液５ｍｌを
得た。濾液中にはプラーク法によりファージは確認され
なかった。実施例と同様にセルラーゼ処理で中空繊維を
分解し、遠心上澄みのファージ濃度をプラーク法で定量
したところ。

ファージは確認されなかった。従って、ファージは中空
８Ｍ１孔中にはほとんど捕捉されていなかった。

（実施例２）以下の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度；７％、中空側組成；アセトン／ア
ンモニア／水＝、４０１０．５６１５９．４４．凝固剤
組成；中空側組成と同じ、中空剤吐出速度；　２−２　
ｍ　１　／　ｍ　１　ｎ　＊紡糸原液吐出速度；　２　
、２　ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ　、　、紡糸速度１０ｍ
／　ｍ　ｌ　ｎ　−ａ得られた中空繊維の内径は２３８
゜４ｕ−ｍ、！！！厚は２９．０ｕｍ、平均孔径４８．
６μｍ、極小面内空孔率は３０．２％であった。

（１）式より計算した値は１．２であった。

実施例１と同様にφｘ１７４のファージ原液（ファージ
濃度７．３ＸＩＯ″　ＰＦＵ／ｍｌを濾過した。濾液中
のウィルス濃度は７　、　Ｉ　Ｘ　１０’Ｐ　Ｆ　Ｕ　
／　ｍ　１であった。したがって８、φは１．０１であ
った。実施例１と同様に生理食塩水で十分に洗浄した後
、凍結乾燥した。洗浄終了時の濾液中にはファージが確
認されなかった。

実施例１と同様にセルラー２ゼ処理をし、中空繊維孔中
に捕捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上
澄液中のファージ濃度は７．９×ぢ１０　　ＰＦＵ／ｍｌであった。したがって中空繊維１
ｇ中に７．９Ｘ１０″７　ＰＦＵのファージが存在して
いた。従って、媒体１ｇ中のファージ密度は原液より高
くなっていた。

（実施例３）以下の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度；８％、中空側組成；アセトン／ア
ンモニア／水＝４５１０．５７５１５４．４２５、凝固
剤組成；中空側組成と同じ、中空剤吐出速度；１．７ｎ
ｘｌ／ｍｉｎ、紡糸原液吐出速度；　２．５ｍｌ／ｍｉ
　ｎ　＋１紡糸速度１０ｍ／ｍ１ｎ、＊得られた中空繊
維の内径は３１０．８４１Ｌｍ、膜厚は２２．９１Ｌｍ
、平均孔径２０．９ｕｍ、極小面内空孔率は２７．５％
であった。（１）式より計算した値は４．４であった。

実施例１と同様にφ×１７４のファージ原液（ファージ
濃度１　、ｌＸｌ０”　ＰＦＵ／ｍｌ）を濾過した。濾
液中のウィルス濃度は７．９Ｘ１０　　ＰＦＵ／ｍｌで
あった。したがって、φは４．１であった。実施例１と
同様に生理食塩水で十分に洗浄した後、凍結乾燥した。

洗浄終了時の濾液および中空部を通過した洗浄液中には
ファージが確認されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維構造体
中に捕捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離
上澄液中のファージ濃度は２．１Ｘ　１０３　ＰＦＵ／
ｍ　１であった。従って、中空槽！ｉ１ｇ中に２．ｌＸ
１０　　ＰＦＵのファージが存在していた。従って、媒
体１ｇ中のファージ密度は、原液より高くなっており、
ファージは中空繊維孔中に法線されて捕捉されていた。

（実施例４）実施例２と同様の多孔性中空繊維を用いた。大腸菌ファ
ージとしてＴ４ファージ（ＩＦＯ２０００４）宿主菌と
して大腸菌（ＩＦ０１３１６８）を用いた。Ｔ４のウィ
ルス径’Ｌ±８５　ｎ　ｍとした。

従って、（１）式より計算した値は１．３であった。フ
ァージ原液のファージ濃度は９　、５　Ｘ　１０ｑ（Ｐ
ＦＵ／ｍｌ）であった、この原液を実施例１と同様に濾
過した。Ｓ液中のウィルス濃度は４゜３Ｘ　１０６　（
ＰＦＵ／ｍ　ｌ）　であった、従ッテ、φは３．３であ
った０分離に引き続いて実施例１と同様に生理食塩水で
十分に洗浄した後、凍結乾燥した。洗浄終了時の濾液お
よび中空部を通過した洗浄液中にはファージが確認され
なかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維孔中に
捕捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上澄
液中のファージ濃度は３．７×１０９　ＰＦＵ／ｍｌで
あった。従って、中空＃ａｍｔｇ中に３．７Ｘ１０’　
　ＰＦＵのファージが存在していた。

（比較例２）以下の条件で実施例１と同様に多孔性中空繊維を作製し
た。セルロース濃度；７％、中空側組成；アセトン／ア
ンモニア／水＝４０１０．５６／５９．４４、凝固剤組
成；中空剤組成と同じ、中空剤吐出速度；　３．５ｍｌ
／ｍｉ　ｎ　、紡糸原液吐出速度；　２　、２ｍ　ｌ／
ｍｉ　ｎ　、、紡糸速度１０ｍ／　ｍ　ｉ　ｎ　−６得
られた中空繊維は膜厚は１９．２＃Ｌｍ、平均孔径５６
．３ｍｍであった。（１）式より計算した値は０．５で
あった。

実施例１と同様にφ×１７４のファージ原液（ファージ
濃度６．３Ｘ１０’　　（ＰＦＵ／ｍｌ）を濾過した。

濾液中のウィルス濃度は１．８Ｘ１０’　　（ＰＦＵ／
ｍｌ）であった、したがって、φは０．５であった。実
施例１と同様に生理食塩水で十分に洗浄した後、凍結乾
燥した。洗浄終了時の濾液および中空部を通、過した洗
浄液中にはファージが確認されなかった。

実施例１と同様にセルラーゼ処理をし、中空繊維孔中に
捕捉されたファージ量を測定したところ、遠心分離上澄
液中のファージ濃度は３．３×１０９Ｐ　Ｆ　Ｕ　／　
ｍ　１であった。したがって中空縁！１ｇ中に３．３Ｘ
１０’ＰＦＵのファージが存在していた。媒体１ｇ中の
ファージ密度は原液より低くなった。

（実施例５）セルロースリンター（α−セルロース含有１ｋ　９６％
以上、平均分子量２．６Ｘ１０’）を公知の方法で調整
した銅アンモニア溶液中に８ｗｔ％の濃度で溶解した。

この溶液を２５℃のアセトン／アンモニア蒸気雰囲気下
に置かれたガラス板上に均一に流延し、該雰囲気下に１
分間から１０分間放置した後、２０℃のアセトン２５ｗ
ｔ％／２゜８％アンモニア水２ｗｔ％／水７３ｗｔ％の
混合溶液にガラス板ごと１０分間から６０分間浸漬し、
その後２０℃の２ｗｔ％硫酸水溶液中に１０分間浸漬後
、水洗し、しかる後、水分をろ紙ですい取り、２０℃の
アセトン（１００ｗｔ％）中に１５分間浸漬し、膜中の
水分をアセトンで置換し、ろ紙にはさんで風乾し、平均
孔径を異にする再生セルロース多孔平膜を得た。

得られた膜は、平均孔径６３ｎｍ、膜厚１３３ｇｍであ
った。（１）式より計算した値は４．０であった。この
膜をミリポア製ステンレスフィルターホルダーに装着し
、実施例４と同じＴ４７７−ジの原ｔｒｉ　（２Ｘ　１
０ｖ７ＰＦＵ／ｍ　ｌ）を圧力２００ｍｍＨｇで垂直濾
過し、濾液５ｍｌを得た。１１！液中のウィルス濃度は
３．２Ｘ１０　　（ＰＦＵ／ｍｌ）、φは４．８であっ
た０次いで生理食塩水で十分に水洗した後、凍結乾燥し
た。洗浄時の濾液中にファージは確認されなかった。実
施例１と同様にセルラーゼ処理して、膜中に捕捉されて
いるファージ量を定量したところ、１１ｇ中に３．９Ｘ
ＩＯ′７　ＰＦＵのファージが捕捉されていた。

Claims

【特許請求の範囲】（１）ウィルスの存在する液体を、銅アンモニア法再生
セルロースからなる多孔性膜で実質的に垂直濾過して、
該ウィルスを該膜孔中に捕捉し、しかる後に凍結乾燥し
て孔中に該ウィルスを固定化することを特徴とするウィ
ルスの固定化方法。（２）ウィルス径Ｖ（ｎｍ）のウィルスの存在する液体
を濾過する多孔性膜が、水流速平均孔径Ｄ（ｎｍ）、膜
厚Ｔ（μｍ）で（１）式を満足する多孔性中空繊維であ
る特許請求の範囲第１項記載のウィルスの固定化方法。９．５＞０．５×１０＾［（３．０１×１０＾−＾３・
Ｖ−２．３４×１０＾−＾２・Ｄ）］×Ｔ≧１（１）（３）多孔性膜が、膜厚内貫通孔の入口および出口にお
ける面内平均孔径の間に、極小の部分、該極小の部分よ
り大きい部分、もうひとつの極小の部分の順に配列され
た構造を膜厚方向に少なくとも１組有する銅アンモニア
法再生セルロースからなる多孔性中空繊維である特許請
求の範囲第１項又は第２項記載のウィルスの固定化方法
。（４）多孔性膜が極小面内空孔率Ｐｒ（％）が１０≦Ｐ
ｒ≦８０、膜厚Ｔ（μｍ）が１０≦Ｔ＜１００を満足す
る銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊
維である特許請求の範囲第１〜第３項のいずれか１つに
記載のウィルスの固定化方法。