JPS63161972A - エイズウイルス分離濃縮用の再生セルロ−ス多孔膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 日本における献血人口はおよそ８００万人（昭和５９年
）であり、医療に必要な血液としてはまだ不足である。

特に血漿分画製剤用は充血と輸入血漿によって賄われて
いる。輸入血漿を経由して、日本においてもエイズ（後
天性免疫不全症候群）患者が発生しはじめている。その
ため血漿分画製剤を製造する工程においてエイズウィル
スを除去するか、あるいは不活化する必要がある。一方
、エイズ治療および予防としてエイズワクチンの開発が
切望されている。

本発明は、血漿分画製剤用血漿（プール血漿）および血
液成分製剤としての血漿成分よりエイズウィルスを除去
するためのフィルターを提供し、またワクチン製造に不
可欠なエイズウィルスの濃線用フィルターを提供するも
のである。なお本発明でいうエイズウィルスとは１　ｙ
　ｍ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｎｏｐａｔｈｙ　　ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ（ＬＡＶ）、ｈｙｍａｎ　　
Ｔ−１ｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　　ｖｉｒｕｓ　　ｔｙ
ｐｅ　　ｍ（ＨＴＬＶ−ｍ）およびＡＩＤＳ−ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｄ　　ｒｅｔｒｏｖｉ　ｒｕｓ　（ＡＲＶ）
と命名されているウィルスを意味する。

（従来技術） エイズはエイズウィルスが主として血液や唾液などの体
液を媒介して伝染する。そのため、たとえばプール血漿
からの血漿分画製剤の製造工程中に加熱滅菌する方法が
採用されている。この方法の外に実験室規模では、化学
反応を利用してウィルスを傷つけて不活化する方法、ア
ルカリ水溶液あるいは紫外線等で滅菌処理する方法、さ
らに吸着剤によりウィルスを吸着除去する方法が提案さ
れている。工業的に利用されている加熱滅菌法では、エ
イズの感染防止のため、６０℃×４８時間程度の加熱処
理が一般的に採用されている。しかしこの加熱処理によ
って血漿分画製剤の生物活性の低下は避けられない。し
かもこの加熱では、確率的には十分に不活化されてない
製品も混在する恐れがある。またたとえ不活化されても
ウィルス粒子それ自体は混在するものであり、この混在
による副作用の恐れもある。

また、高分子多孔膜を用いてエイズウィルス以外のウィ
ルスを除去することも試みられたが、血液中に高濃度に
存在する蛋白質が多孔膜表面に吸着し、濾過速度が経時
的に急激に低下するため、一般的にウィルスを除去する
方法として高分子多孔膜は実用的な方法としての位置を
一保できていない。

また高分子多孔膜を用いて濾液中のウィルス粒子を濾過
前の濃度の１／１０’〜１／１０’に減少させることは
、高分子多孔膜の孔径分布を考慮すると不可能と考えら
れていた。実際、水濾過速度法で約２ｎｍの平均孔径を
持つ非対称性膜で、粒子径２４ｎｍの大腸菌ファージφ
Ｘ１７４を含む水溶液を濾過して得られた濾液中には、
濾過前の１／１０３〜１／１０’の濃度でファージが見
いだされた。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、血漿分画製剤および血漿の生物活性を低下さ
せることなく短時間でウィルスを除去する多孔膜を提供
することを第１の目的とする。また同時に活性状態のま
まウィルスを濃縮する機能を有する膜を提供することを
第２の目的とする。

（問題点を解決するための手段） 本発明の要旨は、水濾過速度法による平均孔径が１（１
〜７０ｎｍ、面内空孔率（Ｐｒｅ）が０゜２５〜０．７
０、膜厚Ｔ　（、ｕｍ単位）が（１）式の関係を満足し
かつ１０〜５００μｍであり、膜の断面構造は層状構造
で表現されかつミクロ相分離法で作製されたエイズウィ
ルス分離濃縮用の再生セルロース多孔膜 ０．００２≦Ｐ　ｒ　ｅ　／　Ｔ≦０．０５　　　　（
１）にある。

本発明多孔膜を用いて濾過した際、濾液側にはエイズウ
ィルスを含まない濾液が得られ、また膜を通過しない流
側に濃縮されたウィルスを含む液を回収できる。

本発明の第１の特徴は、高分子多孔膜が再生セルロース
で構成されている点である。再生セルロースは血液中の
蛋白質の吸着が他の高分子素材に比べて著しく小さい。

そのため、蛋白質による多孔膜の目づまりが起こりにく
い。しかし、逆にエイズウィルスを多孔膜の吸着作用に
よフて除去する効果はほとんど期待できない。さらに再
生セルロースとして蛋白質の吸着性が著しく小さいこと
、力学的性質が優れていること、親水性が優れているこ
とから銅アンモニア法再生セルロースが最も好ましい。

再生セルロースの製法には、ビスコース法、セルロース
エステルのケン化法、銅アンモニア法など、種々のもの
があるが、それぞれ製造方法の相異により物理的、化学
的な性質に差があり、ｒ再生セルロースＪとして一律に
論じられるものではない。銅アンモニア法では、不可欠
な酸処理により銅の除去に伴う微細な孔の発生と特異な
分子鎖の凝集構造の発生が認められるため、銅アンモニ
ア法再生セルロースは特異な性質を持つ。

その性質の特徴は、親水性で、かつ蛋白質の吸着性が少
ない点にある。本発明者らは、蛋白質と高分子素材との
吸着性に関する相関性を検討した結果、一般的には、親
水性素材はど、蛋白質の吸着性が小さく、本発明方法に
用いられる銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔
膜が一番小さいことを見いだした。

銅アンモニア法再生セルロースの粘度平均分子量は７Ｘ
１０’以上が好ましく、また、０゜Ｉ　ＮＮａＯＨ水溶
液中での溶解成分が少なければ、少ないほど望ましい。

４０℃、４８時間、０、ＩＮのＮａＯＨ水溶液中に浸漬
した際、この溶解分が１０ｐｐｍ以下であれば、この再
生セルロース多孔膜は血漿中よりエイズウィルスを除去
するのに最も適している。

上述のようなセルロースからなる多孔膜を作製するには
、高純度セルロースからなる原液を用いて銅アンモニア
法再生セルロースを作製するか、あるいは多孔膜を作製
後に０．ＩＮのＮａＯＨ水溶液で７２時間以上洗浄処理
すれば良い。高純度セルロース原料を用いれば、上記溶
解分が著しく減少するので、より好ましい。ここで、「
高純度セルロース原料」とは、α−セルロース含量率が
９°５　ｗ　ｔ％以上で、重合度が５００以上の木綿リ
ンターおよび木材バルブを指す。これらの原料について
、ブリーチング、洗浄工程中での分解および酸化を防止
しつつ、不純物の混入を避けるため、常に精製された水
を用いると良い。

本発明の第２の特徴は、特定された平均孔径範囲と特定
された面内空孔率（Ｐｒｅ）とを持つミクロ相分離法で
作製された多孔膜を用いる点にある。エイズウィルスの
直径が約１１００ｎであるので、高分子多孔膜の平均孔
径が１１００ｎ以下であることがまず、推測できる。た
だし、濾液中のエイズウィルス濃度を濾過前の１／１０
’以下にするのに必要な平均孔径ははたして存在するか
どうか不明である。しかし、ミクロ相分離法で作製され
た多孔膜で、かつ水濾過速度法による平均孔径が１０ｎ
ｍ以上７０ｎｍ以下であり、面内空孔率（Ｐｒｅ）が０
．２５以上０．７０以下である再生セルロース多孔膜で
は、濾液中のエイズウィルス濃度を濾過前の１／１０’
以下にすることが可能であることを本発明者らは見出し
た。

ミクロ相分離法以外の製法、たとえば、異種化合物を混
入し、製膜後、該混入物を除去して得られた多孔膜では
、上述のウィルス除去能を達成できない。本実験事実の
発見によって、本発明は初めてなされたものである。ミ
クロ相分離の生起は紡糸中あるいは平膜の流延過程中の
膜の失透現象によって直接肉眼観察するか、あるいは、
製膜後の多孔膜の電子顕微鏡観察により、直径１μｍ以
下、０．０２μｍ以上の粒子の存在で確認できる。平均
孔径が１０ｎｍ未満でＰｒｅが０゜２５μｍ未満の多孔
膜では、濾液中のウィルス濃度は字となるが、濾過速度
は非常に小さく、実用的にはほとんで利用出来ない。し
かも濾液中の蛋白質濃度も濾過前のそれの１／３以下と
なる。一方、平均孔径が１０ｎｍ未満でＰｒｅが０゜２
５以上の多孔膜では、濾過速度はＰｒｅにほぼ比例して
増加するが、Ｐｒｅが０．８以上のものを作製すること
ができないため、プール血漿の濾過あるいは血漿製剤用
としての実用的な濾過速度を得ることが出来ない。また
、濾液中の蛋白質濃度は濾過前のそれに比べて１／２以
下である。平均孔径が７０ｎｍを越える多孔膜では、膜
厚が５００μｍ以下では濾液中エイズウィルス濃度を濾
過前の１／１０’以下にすることはできない。

平均孔径が１０ｎｍ以上で７０ｎｍ以下の膜における濾
過速度については、平均孔径およびＰｒｅが大きければ
、大きいほど良い。しかし、Ｐｒｅと平均孔径が大きく
なるに従って、濾液中のウィルス濃度が増大する。Ｐｒ
ｅが０．７を越えると平均孔径もＰｒｅと共に必然的に
増大し、濾液中のウィルス濃度も増大する。濾液中のエ
イズウィルス濃度を濾過前のそれの１７１０’以下でし
かも原液中の蛋白質の生物活性を低下させないためには
、平均孔径として、１５ｎｍ以上で３５ｎｍ以下である
多孔膜が好適である。

本発明の第３の特徴は、膜厚Ｔ（μｍ単位）が１０μｍ
以上で５００ｕｍ以下でかつ、（１）式を満足し、しか
も膜の断面構造が層状構造をとる点にある。

０．００２≦Ｐ　ｒ　ｅ　／　Ｔ≦ｏ、ｏ５　　　　　
（１）多孔膜の膜厚は薄ければ薄いほど一般に濾過速度
が大きくなるので実用面では好ましい。しかし、膜厚が
１０μｍ未満になるとおそらくは多孔膜内部にピンホー
ルが多発し、エイズウィルス粒子が原液中に漏れ出てく
る。

この際、原液中のエイズウィルス濃度を低下させるには
、Ｐｒｅが大きいときは、Ｔを大きくする必要がある。

膜の断面構造が層状構造を持つ多孔膜は、膜厚が大きく
なるに従ってエイズウィルスの阻止率は急激に上昇する
。Ｐ　ｒ　ｅ　／　Ｔが０．０５を越えると原液中にエ
イズウィルスが波山する確率が急激に高まり、また多孔
膜の力学的性質が低下する。

Ｐ　ｒ　ｅ　／　Ｔが０．０２未満とすると、濾過速度
が低下する。膜の断面構造が層状構造を持つ多孔膜とは
、膜表面に平行な面内では「均質」な構造を持ち、ある
孔径分布と平均孔径、面内空孔率Ｐｒｅが定義されるが
、膜表面からの距離を異にする面の相互については孔径
分布、平均孔径、Ｐｒｅのいずれもが膜表面からの距離
に依存して変化する膜を意味する。

すなわち「均質」とは膜表面から等しい距離にある平行
な数組の面の任意の２個所で、平均孔径を電子顕微鏡で
測定した場合、後述の（４）式で算出される３次の平均
半径〒３の値の差が相対値として２０％以内で一致する
ことを意味する。また膜表面に垂直な断面の構造は直径
０．１〜１μｍの粒子の堆積物で近似される。層状構造
を持つ膜では、後述の（２）式で算出される平均孔直径
りは、膜表面の孔半径７３以下である特徴を持つ。

このような膜は、たとえばミクロ相分離を膜表面から内
部に向かってゆっくりと進行させることによって作製で
きる。ミクロ相分離法以外の方法では現在作製すること
は出来ない。また、ミクロ相分離法でもミクロ相分離を
生起させる原因物質を原液中に混在させたり、あるいは
温度変化によってのみ相分離させる場合には層状構造を
持つ膜は得られない。

多孔膜の形状として中空繊維状が単位体積当たりの有効
面積を大きくする点、力学的性質の点で好ましい。また
、中空繊維の内部に被濾過液体（血漿）を制御された速
度で流すことにより目づまりが防止できる点でも中空繊
維が優れている。

また多孔性中空繊維の壁厚方向の層状構造として、膜厚
（壁厚）方向に沿って面内空孔率が極小値を少なくとも
１個以上持つことが好ましい。極小部が２個あれば特に
好ましい。

銅アンモニア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維
の特徴は、内壁面から外壁面への膜厚方向に垂直な面に
おける孔径を面内平均孔径で表す時、前記膜内貫通孔の
入口から出口にわたって面内平均孔径が、極小の部分、
該極小の部分より大きい部分、極小の部分の順に配列さ
れた構造が、中空繊維の膜厚方向に存在する点にある。

従って、従来の多孔質中空繊維にくらべて、銅アンモニ
ア法再生セルロースからなる多孔性中空繊維のウィルス
の阻止率を高くすることができる共に、濾過速度を高く
することができる。これに対して、面内平均孔径の極小
部が２つ以上存在しない従来の多孔質中空繊維の場合に
は、阻止率を９９．９９％以上にするためには、透過速
度を著しく小さくせざるを得ない。

本発明で好ましい例として用いられる銅アンモニア法再
生セルロースからなる多孔性中空繊維は、該中空繊維の
内壁面から外壁面への膜厚方向に層状構造を有し、かつ
蛋白質の透過性、ウィルスの阻止性を支配する極小部を
有している。その極小部分の膜厚方向での厚みは、該多
孔性中空繊維が、ミクロ相分離法で作製されるため、セ
ルロース濃厚相粒子の直径に相当する。この粒子径は２
μｍ以下であるので、したがって、その厚みは２μｍ以
下である。

本発明方法の好適な例として用いられる銅アンモニア法
再生セルロースからなる多孔性中空繊維の製造方法とし
ては、例えば、セルロースリンター（α−セルロース含
有量９６％以上、平均分子ｆｆ１２．６Ｘ１０’　）を
公知の方法で調整した銅アンモニア溶液中に８ｗｔ％の
濃度で溶解したものを紡糸原液として用いる。この紡糸
原液に対して、アセトン／アンモニア／水系混合溶液を
凝固剤および中空剤として用いてミクロ相分離を生起さ
せ、その後、凝固、再生することにより得られる。ここ
で、ミクロ相分離とは、溶液中に高分子の濃厚相あるい
は希薄相が直径０．０２〜数μｍの粒子として分散し、
安定化している状態を意味する。ミクロ相分離の生起は
、紡糸中の糸の失透現象によって直接肉眼観察するか、
あるいは紡糸後の糸の電子顕微鏡観察により、直径１μ
ｍ以下、０．０２μｍ以上の粒子の存在で確認される。

本発明による実施例を説明するに先立ち、本明細書中に
用いられる主な技術用語（物性値）の定義とその測定方
法を以下に示す。

ｒ水流速平均孔径」 多孔膜の水の流出量を測定し、（２）式から水Ｖ：流出
量（ｍｌ／ｍ１ｎ） Ｔ；膜厚（μｍ） へＰ：圧力差（ｍｍＨｇ） Ａ：膜面積（ｒｎ′） Ｐｒｐ；空孔率（−） μ：水の粘性率（ｃＰ） 空孔率Ｐｒρは水膨潤時の見掛は密度ρａＷ、ポリマー
の密度ρｐより（３）式で求めた。セルロースの場合ｐ
ｐ＝１．５６１ｇ／ｍｕを用いた。

Ｐｒｐ（％）＝（１−ρａｗ／ρｐ）ｘｌＯＯ（１）ｒ
面内空孔率Ｊ 再生セルロースからなる多孔性膜をアクリル樹脂で包埋
後、ウルトラミクロトーム（ＬＫＢ社（スウェーデン）
製Ｕ　Ｉ　ＴＲＡＴＯＭＥｍ８８００型）に装着したガ
ラスナイフをもちいて、膜表面から膜厚方向に沿って厚
さ約１μｍの試料を順に切り出す。その試料切片の電子
顕微鏡写真を撮影する。注目する切片の１ｃｒｎ”当た
り、孔半径が（ｒ）〜（ｒ＋ｄｒ）に存在する孔の数を
Ｎ　（ｒ）ｄｒと表示する。３次および４次の平均孔半
径（それぞれ〒３および７４）は次式で定義される。

〒３＝碧伺汗Ｉ＋ヒ　　　（４） ７４、七卓モ峠モＨ−（ゝ Ｊ、′ 平均孔半径は２「〒−ｒτｒ４−で（４）式および（５
）式から計算される。それぞれの切片の電子顕微鏡写真
より平均孔径を計算し、面内平均孔径を定める。面内空
孔率Ｐｒｅは（６）式で求められる。

「エイズウィルス濃度」 濾過前の原液、濾過後の原液（残液）および濾液中のエ
イズウィルス濃度を以下の３方法で評価した。

既知濃度のウィルスが混入されている濾過前の原液とそ
れを１／２．１／４．１／１６．１／３２．１／６４の
濃度に希釈したものとウィルスの存在しない培養液（コ
ントロール）を標準液とし、これらの標準液、濾過前の
原液、残液および濾液の一定量を一定濃度（約Ｉ　Ｘ　
１０６個／ｍｌ）のＭＴ−４生存細胞を含む培養液に混
入し、６日間培養した。

（１）生細胞比率：培！１２日め以降の培養液中の生細
胞と死細胞をトリパン青で染色することによりそれぞれ
の細胞数を光学顕微鏡下で計数し、全細胞数に対する生
細胞の比率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ；％）を求めた。

（２）抗原陽性細胞比率：間接蛍光抗体法により評価し
た。すなわち、培養２日め以降の培養液中の細胞をガラ
スプレート上にアルコール固定し、健常人血清あるいは
エイズ患者血清で処理した後、蛍光標識抗ヒトＩｇＧを
反応させ蛍光顕微鏡下で抗原陽性細胞数を計測し、抗原
陽性細胞比率を求めた。

一方、濾過前の原液、濾過後の原液（残液）および濾液
中にエイズウィルスのタイターを以下の方法で測定した
。

（３）プラーク形成法：ポリーＬ−リジン処理により単
層に成育させたＭＴ−４細胞上に１０倍希釈シリーズで
希釈した濾過前の原液、残液あるいは濾液のいずれかの
０．１ｍｌを散布し、３７℃で５〜６日間培養した後、
形成されたプラークを計数して濾過前の原液、残液ある
いは濾液のそれぞれのタイター（ＰＦＵ／ｍｌ）を測定
した。

次に、本発明を実施例によって説明する。

（実施例１） セルロースリンター（α−セルロース含有量９６％以上
、平均分子ｆｆ１２．６Ｘ１０’　）を公知の方法で調
整した銅アンモニア溶液中に４〜１０ｗｔ％の各種濃度
で溶解し、濾過説泡を行い、紡糸原液とした。その紡糸
原液を環状紡出口の外側紡出口（外径２ｍｍφ）より２
．６ｍｌ／ｍｉｎで、一方中空剤として、アセトン４５
ｗｔ％／アンモニア０．５７５ｗｔ％／水５４．４２５
ｗｔ％の混合溶液（中空剤）を中央紡出口（外径０．６
ｍｍφ）より１．４ｍｌ／ｍｉｎでそれぞれアセトン４
５ｗｔ％／アンモニア０．５７５ｗｔ％／水５４．４２
５ｗｔ％の混合溶液（凝固剤）中に直接吐出し、１０ｍ
／ｍｉｎの速度で巻き取った。なお、吐出直後の透明青
色状の繊維状物は次第に白色化し、ミクロ相分離を生起
し、引き続き凝固が起こり、繊維としての形状が維持さ
れていた。そのｆｌｔ　２　ｗ　ｔ％の硫酸水溶液で再
生し、その後水洗、乾燥した。このようにして得られた
銅アンモニア法再生セルロース多孔性中空繊維の構造特
性を表１に示す。

表１．多孔性中空繊維の構造特性 これらの中空繊維をそれぞれ５００本、長さ１０ｃｍに
束ねてモジュールに成型した。モジュールは濾過使用前
に蒸蒐誠菌し、その後中空繊維内部をＰＢＳで洗浄した
。エイズウィルスを含む原液を中空繊維内部に注入し、
圧力２００　ｍ　ｍ　ＨＨの一定圧力で濾過し、濾液を
回収した。濾過１）「の原液、濾過後の原液（残液）と
濾液中のウィルス濃度を生細胞比率と抗し’Ｘ陽性細胞
数比率から評価した。結果を表２−１、表２−２に、ま
た、希釈による比較例を表３に示す。表２−１、及び表
２−２より明らかなようにいずれの＃！液液中もエイズ
ウィルスは検出できなかった。

（実施例２） 実施例１で使用した濾過前の原液、得られた残液と濾過
のタイターをプラーク法で測定した。結果を表４に示す
。表４から明らかなようにいずれの濾液中にもエイズウ
ィルスは検出され、濾液中のウィルス濃度を濾過前の原
液の１７１０’以下にすることが可能である。また、残
液のタイターは、濾過前の原液の約２倍であり、濾過に
よりエイズウィルスが活性を低下することなく残液中に
濃縮された。

（以下空白） （発明の効果） 本発明多孔膜によれば、血漿中のエイズウィルスを１７
１０’以下の濃度にすることが可能であり、またウィル
スの活性を低下させることなく濃縮回収できる。血漿の
濾過速度が大きく、特に濾液中の蛋白質濃度が高く、蛋
白質の生物活性を維持させることが可能である。濾過速
度の経時変化は僅かであり、濾過速度の低下率は酢酸セ
ルロース多孔膜の低下率の１／３以下である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）濾過法で粒子を捕捉する水濾過速度法による平均
   孔径が１０〜７０ｎｍ、面内空孔率 （Ｐｒｅ）が０．２５〜０．７０、膜厚Ｔ（μｍ単位）
   が（１）式の関係を満足しかつ１０〜５００μｍであり
   、膜の断面構造は層状構造で表現されかつミクロ相分離
   法で作製されたエイズウィルス分離濃縮用の再生セルロ
   ース多孔膜。 ０．００２≦Ｐｒｅ／Ｔ≦０．０５（１）
2. （２）平均孔径が１５〜３５ｎｍで、再生セルロースが
   銅アンモニア法再生セルロースである特許請求の範囲第
   １項記載のエイズウィルス分離濃縮用の再生セルロース
   多孔膜。
3. （３）膜の断面構造として、膜厚方向に沿って面内空孔
   率が極小値を持ち、かつ多孔膜の形状が中空繊維である
   特許請求の範囲第１項または第２項記載のエイズウィル
   ス分離濃縮用の再生セルロース多孔膜。