JPS6310734A - リンホトキシンの安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星策上座五月±１ この発明はリンホトキシンの安定化方法に関するもので
ある。さらに詳細には、リンホトキシンにアルブミン、
グロブリンおよびゼラチンの一種または二種以上を添加
することを特徴とするリンホトキシンの安定化方法に関
するものである。

従来の　術および　明の　決しようとする１△ リンホトキシンは抗腫瘍活性を有する公知物質として知
られている（例えば、特開昭５９−８４８２７号公報、
特開昭６１−５６１９７号公報参照）。

本発明者等はリンホトキシンについて研究の途上、リン
ホトキシン、特にそれが溶液の状態にある時には不安定
で、凍結融解、凍結乾燥等の製造工程および製剤化工程
、輸送時の振動等によりその活性が著るしく低下するこ
とを見い出した。そこで、この発明者等はリンホトキシ
ンの活性低下を未然に防止し、安定化する方法の開発を
企図した。

明の　成および　果 この発明者等は種々研究の末、リンホトキシンにアルブ
ミン、グロブリンおよびゼラチンの一種または二種以上
を添加することにより、リンホトキシンの活性低下を未
然に防止し、安定性を著るしく向上できることを見い出
し、さらに鋭意研究の結果、この発明を完成した。

この発明の方法で安定化されるリンホトキシンとしては
、ヒトリンパ芽球様ｍ胞ＲＰＭＩ−１７８８細胞の培養
物から単離きれた天然型リンホトキシン（例えば特開昭
５９−８４８２７号、ザ・ジャーナル・オプ争バイオロ
ジカル・ケミストリー第２５９巻第６８６〜６９１頁お
尖び第２６０巻第２３３４〜２３４４頁参照）および遺
伝♀組′換え技術により製造されるリンホトキシン（例
えば特開昭６１−５６１９７号公報およびネイチャー第
３１２巻第７２１〜７２８頁参照）が挙げられる。天然
型リンホトキシンとしては、上記文献記載のアミン末端
ロイシンから初まりカルボキシ末端ロイシンで終わる１
７１個のアミノ酸残基からなるリンホトキシンおよびそ
のアミン末端の２３個のアミノ酸残基が欠如してアミン
末端ヒスチジンから初まりカルボキシ末端ロイシンで終
わる１４８個のアミノ酸残基からなるリンホトキシンが
挙げられ、遺伝子組換え技術により製造きれるリンホト
キシンとしては　□上記１７１個または１４８個のアミ
ノ酸残基からなるリンホトキシン、それらのアミン末端
にきらにメチオニンが結合したメチオニン・ロイシンア
ミノ末端リンホトキシン（アミノ酸残基：１７２個）お
よびメチオニン・ヒスチジンアミノ末端リンホトキシン
（アミノ酸残基：１４９個）が挙げられ、さらにこれら
のアミノ酸残基の１部が欠如および他のアミノ酸で置換
され、リンホトキシンとしての性質を保持するものが含
まれ、これらのリンホトキシンは上記文献記載の製法ま
たはこれと同様な方法で製造することができる。

アルブミンの好ましい例としてはヒト血清アルブミン、
ウシ血清アルブミン等が挙げ′られる。

グロブリンの好ましい例としてはヒトガンマグロブリン
が挙げられる。

アルブミン、グロブリンおよびゼラチンはそれぞれ単独
でまたは二種以上を組合せて、リンホトキシンの製造工
程または製剤化工程において、リンホトキシン蕊粉末ま
たはリンホトキシンを水、緩衝液等の水性媒質に溶解し
た溶液に添加すればよい、添加量は一般的には、アルブ
ミン、グロブリンおよびゼラチンの一種または二種以上
をリンホトキシンの溶液に１　ｐｐｍ以上の濃度、好ま
しくは約１（１０ｐｐｍ以上の濃度となるように添加す
ればよい。

試験管内試験法によるリンホトキシンの活性測鎖は、た
とえば、アガルワル（Ａｇｇａｒｗａｌ　）らの［ザ・
ジャーナル豐オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
２５９巻第６８６〜６９１頁（１９８４）コの方法があ
げられる。

本発明者らが用いている方法は、これを改良したもので
リンホトキシンがＬ９２９細胞（例えば、ＮＣＴＣクロ
ーン−９２９、ＡＴＣＣＣＣＬ−１として一般に入手可
能）を殺す効果を測定するものである。すなわち、９６
穴の組織培養用マイクロプレート（ファルコン社）の各
穴にそれぞれ倍（注）　　　　　　　　　　　　　　（
注）地　　Ｑ、１ｍＱを加える０次に、培地　　で適当
な濃度に希釈（たとえば、５．５ｘ１０．５×１０２．
５Ｘ１０３．５Ｘ１０’及び５×１０５倍希釈）した試
料溶液Ｑ、１ｍＱをプレートの第１列目の穴に加え連続
的に２倍希釈し、２　Ｋ　／　ＩＩＩＱのアクチ（注〉 ノマインンＤを含む培地　　で調製したＬ９２９細胞懸
濁液ｏ、ｔｍｕを加える。このマイクロプレートを５％
の炭酸ガスを含む空気中にて３７℃で１８時間培養する
。培養後、培地上清を捨て、　０．５ｗ／ｖ％クリスタ
ルバイオレットを含む２０ｖ／ｖ％メタノール溶液を加
えて細胞を固定染色する。余分なりリスタルバイオレッ
トを除いてプレートを水洗し、乾燥した後、各穴に残存
するクリスタルバイオレットを、　３Ｑｖ／ｖ％のメタ
ノールを含むｐＨ３，０の０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液
で抽出し、タイターチック・マルチスキャン（フローラ
ボラトリー社）により波長５１０ｎｍにおける吸光度を
測定する。試料を加えない対照（Ｌ９２９細胞及び培地
のみ）の吸光度を細胞生存率１００％とし、細胞生存率
５０％の値に相当するリンホトキシンの希釈率を、グラ
フ又は計算によって求め、壬の希釈率を単位（Ｕ）／１
ｌｔｌｌとする。

（注）培地：５ｖ／ｖ％のウシ胎児血清を含むイーグル
の最小必須培地、その組成は、 たとえば、「細胞培養マニュアル。

宗村庚修編、講談社、１９８２年及び １組織培養の技法」黒田行昭編、 ニューサイエンス社、１９８４年に記載きれている。

次に、この発明を実施例により説明する。

実施例１ 各種濃度のウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン及
びゼラチンをそれぞれ含むｐＨ７，４の２００ｍＭの塩
化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸緩衝液により、メチオ
ニン・ヒスチジンアミノ末端リンホトキシン（２に／躯
）の試料溶液を調製し、これらのリンホトキシン試料溶
液につき、室温で３０分間及び６０分間激しく振とうし
た後、先に記載した方法でそれぞれリンホトキシンの残
存活性を測定し、振とう前の活性に対する活性残存率（
％）を次式により求めた。

表１　振とう処理後の活性残存率 実施例２ ５ｍｇ／ｒＭ１のウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブ
ミン、ゼラチン及びヒトガンマグロブリンをそれぞれ含
むｐＨ７，４の２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液により、メチオニン・ヒスチジンアミ
ノ末端リンホトキシン（２０ｘ／ｍ１ｌ）の試料溶液を
調製し、これらのリンホトキシンの試料溶液につき、凍
結（−２０°Ｃ）及び融解の繰り返しく１０回）、並び
に凍結乾燥を行い、先に記載した方法でそれぞれ残存活
性を測定し、凍結融解前及び凍結乾燥前の活性に対する
それぞれの活性残存率を次のそれぞれの式により求めた
。

結果を表２及び表３に示した。

表２　凍結融解後の残存活性率 ＊３　凍結乾燥後の残存活性率

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リンホトキシンにアルブミン、グロブリンおよびゼラチ
   ンの一種または二種以上を添加することを特徴とするリ
   ンホトキシンの安定化方法。