JPS62224363A - 吸着体の滅菌方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は吸着体の滅菌方法に関する。さらに詳しくは、
硫酸エステル基を有する体外循環治療用吸着体の滅菌方
法に関する。

［従来の技術］ 従来より体液中の有害成分を選択的に除去する目的で、
有害成分に特異的な親和性を有する物質（いわゆるリガ
ンド）を水不溶性担体に固定した吸着体を体外循環治療
に用いる試みがなされている。治療に用いるためには滅
菌が不可欠であるが、安全上の問題、使用時の取り扱い
などの点から薬剤滅菌は不適当で、高圧蒸気滅菌が好ま
しい。しかるにこれらの吸着体を高圧蒸気滅菌するとリ
ガンドの失活や脱離がおこり、事実上高圧蒸気滅菌を施
した体外循環治療用吸着体は実現していない。とくに硫
酸エステル基を有する吸着体は、高圧蒸気滅菌により脱
硫酸などの分解をおこしやすいことが知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ 硫酸エステル基を有する体外循環治療用吸着体を１２１
　”Ｃで２０分間というようなきびしい条件で滅菌する
と、硫酸エステル基や固定されている硫酸エステル基含
有化合物が加水分解してはずれたりするため、血液中の
有害成分を除去する性能が充分でなくなるという問題が
生ずる。

本発明は前記のごとき蒸気滅菌をしたばあいに生ずる問
題を解決するためになされたものである。

［問題を解決するための手段］ 本発明は、硫酸エステル基を冑する体外循環治療用吸着
体に蒸気滅菌を施すにあたり、ｐ１１５〜９にコントロ
ールされた水性溶媒中で滅菌することを特徴とする吸着
体の滅菌方法に関する。

［実施例］ 本発明における硫酸エステル基を有する吸着体とは、 （１）硫酸エステル基含有化合物を水不溶性担体に固定
してなる吸着体、 （２）水酸基含有水不溶性担体を直接硫酸エステル化し
てえられる吸着体、 （３）水酸基含有水溶性高分子を硫酸エステル化したの
ち架橋などの処理により水不溶化してえられる吸着体 などのことをいうが、これらのみに限定されるものでは
ない。

前記（１）の吸着体で用いられる硫酸エステル基含有化
合物としてはアルコール、糖、グリコールなどの水酸基
含有化合物の硫酸エステルがあげられるが、硫酸エステ
ル基のほかに水不溶性担体べの固定に利用できる官能基
を有する化合物が好ましい。そのような化合物としては
アルコールの部分硫酸エステル化物、とりわけ糖類の硫
酸エステル化物が硫酸エステル基および固定に必要な官
能基の両方を含んでいるうえに高い生体適合性と活性と
を有しているのでとくに好ましい。なかでも硫酸化多糖
類は容易に水不溶性担体に固定できることからさらに好
ましく、その代表例としては、たとえばヘパリン、デキ
ストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポ
リ硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリチン硫酸、キシラン硫酸
、カロニン硫酸、セルロース硫酸、キチン硫酸、キトサ
ン硫酸、ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸
、グリコーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン
硫酸、デンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン
硫酸、ガラクタン硫酸、レバン硫酸、メベサルフエート
などがあげられるが、これらに限定されるものではなく
、一般に体外循環治療用吸着体の製造に用いられる硫酸
化多糖類であればいかなるものも使用しうる。前記硫酸
化多糖類の具体例のうちでは、ヘパリン、デキストラン
硫酸、コンドロイチンポリ硫酸が好ましい。

前記（１）の吸着体において硫酸エステル基含有化合物
を固定するための水不溶性担体としては、たとえば通常
アフィニティークロマトグラフィーに用いられる担体で
あるアガロース、デキストラン、ポリアクリルアミドな
どの軟質ゲル、多孔質ガラス、多孔質シリカなどの無機
多孔体、合成高分子からなるポリマーゲル、多孔質セル
ロースゲルなどがあげられるが、これらに限定されるも
のではない。

前記（２）の吸着体に用いる水酸基含有水不溶性担体と
しては、前記（１）の吸着体にも用いられるアガロース
、デキストランなどの多糖類からなるゲル、合成高分子
化合物からなるポリマーゲルのうち、架橋ポリビニルア
ルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物およ
びその架橋化合物などのように式＋ＣＩ＋２−Ｃ１１＋
であられされる単位を少なくとも分子の一部に有する高
分子化合物、ポリヒドロキシメタクリレート、ヒドロキ
シメタクリレートを含む共重合体などのＨ３ ように式　　＋Ｃ）Ｉ、−Ｃ÷　　　　であられされＱ
Ｃ）１２　ＣＨ２Ｏす る単位を有する高分子化合物、ペンタエリスリトールジ
メタクリレートやグリセリンジメタクリレートなどの水
酸基含有多価不飽和化合物、またはエピクロルヒドリン
、ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのオキシラ
ン環を有する化合物を架橋剤として用いることにより水
酸基の導入された高分子化合物などからなるゲル、多孔
質セルロースゲルなどがあげられるが、これらのみに限
定されるものではない。

前記（１）および（２）の吸着体に用いられる水不溶性
担体のなかでは、充分な体液流量かえられる、詰まりを
生じにくいなどの理由から硬質ゲルが好ましく、とりわ
け多孔質セルロースゲルが（１）機械的強度が比較的高
く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり
微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填したば
あいに体液を高流速で流しても圧密化したり、目詰まり
したりしないので高流速で流すことが可能となり、また
細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい
、 （ｉ）ゲルがセルロースで構成されているため親水性で
あり、硫酸エステル基含有化合物の結合や硫酸エステル
基への変換に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異吸
着も少ない、 （至）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため、
軟質ゲルに劣らない吸着容量かえられる、ＧＶ）安全性
が合成高分子ゲルなどに比べて高いなどの優れた点をを
しており、該多孔質セルロースゲルに硫酸エステル基含
有化合物を保持させるかまたは該多孔質セルースゲルを
直接硫酸エステル化することによって、高流速で選択的
に有害成分を成行除去しうる吸着体かえられる。

なお多孔質セルロースゲルを用いた吸着体については特
願昭５８−ｆ３Ｂ１１Ｇ号および特願昭５９−２３１０
１２号各明細書に詳細に記載されている。

つぎに前記（３）の吸着体で用いられる水酸基含有水溶
性高分子の代表例としては、ポリビニルアルコール、エ
チレン−酢酸ビニル共重合体のうちエチレン含量の低い
ものをケン化してえられる高分子などがあげられるが、
これらのみに限定されるものではない。

本発明において前記（１）の吸着体は水不溶性担体に硫
酸エステル試食を化合物を固定させることによって製造
されるが、その固定方法には公知の種々の方法を用いる
ことができる。すなわち、物理的方法、イオン結合法、
共有結合法などがあげられる。固定化された硫酸エステ
ル基含有化合物は脱離しにくいことが重要であるため、
結合の強固な共有結合法が好ましく、その他の方法を用
いるにしても脱離を防ぐようにすることが好ましい。ま
た必要に応じてスペーサーを水不溶性担体と硫酸エステ
ル基含有化合物とのあいだに導入してもよい。

前記（ａおよび（３）の吸着体の製造工程における硫酸
エステル化の方法としては、クロルスルホン酸、硫酸な
どを用いる公知の種々の方法を用いることができる。

前記（３）の吸着体の製造工程において硫酸エステル化
された水酸基含有水溶性高分子化合物を架橋する方法と
しては架橋剤を用いる方法、紫外線やβ線などの照射に
よる方法など公知の種々の方法を用いることができる。

本発明においてはこのようにして製造された体外循環治
療用吸着体が、ｐＨ５〜９にコントロールされた水性溶
媒中で、通常１２１℃で２０分間程度の条件で、蒸気滅
菌法により滅菌され、使用される。

蒸気滅菌する際のｐＨが５未満になると、蒸気滅菌され
た吸着体の吸着活性の低下が著しくなったり、硫酸エス
テル基や固定された硫酸エステル基含有化合物の加水分
解による脱離が著しくなったりする。またｐｌｌが９を
こえてもｐＨ５未満と同様の現象が生じ、いずれも吸着
体性能が低下する。

蒸気滅菌するばあいに用いる水性溶媒のｐＨのコントロ
ール法にはとくに限定はなく、蒸気滅菌中にｐＨの変化
を自動的に測定しながら、自動的にｐＨ調整を行なって
もよく、また緩衝液を用いて行なってもよい。緩衝液を
用いてｐＨ調整すると、特別な装置が不要で安定にｐＨ
調整することができるとともに、滅菌された体外循環治
療用吸着体の保存中のｐＨ変化にもとづく活性低下や、
リガンドである硫酸エステル基含有化合物や硫酸エステ
ル基の脱離も抑制されるため好ましい。

緩衝液の調製に用いる緩衝剤としては、たとえばクエン
酸、リン酸、酢酸、ホウ酸、酒石酸、炭酸、マレイン酸
、グリシンなど、あるいはこれらのナトリウム塩、カリ
ウム塩、カルシウム塩などのように人体に安全なものが
好ましく、これらは単独で用いてもよく、２種以上混合
して用いてもよい。

水性溶媒のｐＨ調整に緩衝液を用いるばあいの緩衝液の
濃度にはとくに限定はなく、緩衝液として働くかぎり使
用しうるが、体外循環治療用吸着体として使用する前に
行なう洗浄が容易であるなどの理由から、ｏ、ｏｏｔ〜
１０％（重量％、以下同様）が好ましく、０．０１〜２
％がさらに好ましい。

このようにして製造された本発明により滅菌された体外
循環治療用吸着体は、たとえば入口と出口に体液成分は
通過するが吸着体は通過しないフィルター、メツシュな
どを装着したカラムに吸着体を充填し、該カラムを体外
循環回路に組み込み、血液、血漿などをカラムに通して
行なう体外循環治療などの用途に限定なく使用しうる。

つぎに本発明の方法を実施例にもとづき説明する。

製造例１ 架橋ポリアクリレートゲル（全多孔性のハードゲル）で
あるトヨパールＩＩシフ５（蛋白質の排除限界５０，０
００，０００、粒径５０〜１００通、東洋曹達■製）１
０ｍｌに飽和Ｎａ０１１水溶液６　ｍｌおよびエピクロ
ルヒドリン１５　ｍｌを加えて撹拌しながら、５０℃で
２時間反応させ、エポキシ化ゲルをえた。えられたゲル
に濃アンモニア水２０ｍ１を加えて５０　”Ｃで２時間
撹拌し、アミノ基を導入した。

一方、ヘパリン２００　ｍｇを１０ｍ１の水に溶解して
ｐｌ＋４．５に調整したのち、上記アミノ基を導入した
ゲル３ｍｌを加えた。そののち１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド　２００　ｍｇ
を１）１１を４．５に保ちながら添加し、４℃で２４時
間振盪した。反応終了後、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食
塩水溶液、水を用いてこの順に洗浄し、ヘパリン固定化
ゲル（以下、Ａ−１という）をえた。

製造例２ 架橋ポリアクリレートゲルであるトヨバールＨＷ　７５
　１０　ｍｌに、飽和ＮａＯＨ水溶液６　ｍｌおよびエ
ピクロルヒドリン１５ｍ１を加えて撹拌しながら、５０
℃で２時間反応させたのち、ゲルをアルコールおよび水
を用いてこの順に洗浄してエポキシ化されたゲルをえた
。

えられたゲル２　ｍｌに極限粘度数ｏ、ｏ５５ｄ＋／ｇ
。

平均重合度４０、硫黄含ｆｆ１１９％のデキストラン硫
酸ナトリウム０　、５　、Ｆおよび水２ｍｌを加えた（
デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約１３％）。

ついでｐＨ１２に調整して４０℃で１６時間振盪し、ゲ
ルを濾別し、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液、水
を用いてこの順に洗浄して、デキストラン硫酸ナトリウ
ムが固定されたゲル（以下、Ａ−２という）をえた。

製造例３ デキストラン硫酸をヘパリンにかえたほかは製造例２と
同様にしてヘパリンが固定されたトヨバール１１ｗ７５
（以下、Ａ−３という）をえた。

製造例４ 多孔質ガラスＰＰＧ２０００　　（平均粒径１９５０　
Ｂ、、比表面積１３ｒｒｒ／ｇ−粒径８０〜１２０メツ
シユ、和光純薬■製）を希硝酸中で３時間加熱し、水洗
乾燥後５００℃で３時間加熱したのち、γ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランの１０％トルエン溶液中に入れ
、３時間還流し、メタノールで洗浄して、γ−アミノプ
ロピル処理ガラスをえた。

一方、ヘパリン２００　ｍｇを１０　ｍｌの水に溶解し
、ｐＨ４，５に調整した。これに２ｇのγ−アミノプロ
ピル処理ガラスを加えたのち、１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド２００　ｍｇをｐ
Ｈ４，５に保ちながら添加し、４℃で２４時間振盪した
。反応終了後、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液、
水を用いてこの順に洗浄し、ヘパリンが固定された多孔
質ガラス（以下、Ｂ−■という）をえた。

製造例５ ヘパリンをコンドロイチンポリ硫酸にかえたほかは製造
例４と同様にしてコンドロイチンポリ硫酸を固定したＰ
ＰＧ２０００　　（以下、ｌ３−２という）をえた。

製造例６ デキストラン硫酸８００ｒＡｇを０．２５Ｍ　　Ｎａ１
Ｏ４水溶液１０＋ｎｌに溶解し、室温で４時間撹拌後、
エチレングリコール２００　ｍｇを加えて１時間撹拌し
た。

この溶液をｐＨ８に調整したのち、製造例４と同様にし
てえられたγ−アミノプロピル処理ＦＰＧ２０００４　
ｍｌを加え、２４時間振盪した。反応終了後、ゲルを濾
別、水洗し、これを１％Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈａ水溶液１０ｍ
１に懸濁して１５分分間光し、濾過、水洗してデキスト
ラン硫酸を固定したＰＰＧ２０００（以下、Ｂ−３とい
う）をえた。

製造例７ 多孔質ガラスＦＰＧ２０００を希硝酸中で３時間加熱し
、水洗後５００℃で３時間加熱した。これをγ−グリシ
ドキシプロビルトリメトキシシランの１０％トルエン溶
液中に入れ、３時間還流し、メタノールで洗浄してγ−
グリシドキシプロビル処理ガラスをえた。

一方、デキストラン硫酸２ｇを１０ｍ１の水に溶解し、
ｐｌ＋９．２に調整したのち、これに２ｇの上記γ−グ
リシドキシプロビル処理ガラスを加えて４５°Ｃで１６
時間反応させた。反応終了後、２Ｍ食塩水溶液、０．５
Ｍ食塩水溶液、水を用いてこの順に洗浄し、デキストラ
ン硫酸を固定した１１Ｇ２０００　　（以下、１３−４
という）をえた。

製造例８ 多孔質セルロースゲルとしてＣＫゲルＡ−３（排除限界
分子′ｔＬ５０　、０００　、０００、粒径４５〜１０
５−、チッソ■製）ｆｏｗｌに２０％Ｎａ０１１４　ｇ
　、ヘプタン１２ｇおよびノニオン系界面活性剤ＴＷＥ
ＥＮ２０を１滴加えた。４０℃で２時間撹拌後、エピク
ロルヒドリン５ｇを加えて２時間撹拌し、ゲルを水洗濾
過してエポキシ化セルロースゲルをえた。導入されたエ
ポキシ基の量はカラム体積１　ｍｌあたり３０ＭＭであ
った。

えられたゲル２　ｍｌに極限粘度数ｏ、ｏｏｄｌ／ｇ。

硫黄含量１７．７％のデキストラン硫酸ナトラム０．１
２　ｇおよび水２　ｍｌを加え（デキストラン硫酸ナト
リウムの濃度は約２．５％）　、ｐＨｌｌに調整して４
５℃で１６時間振盪した。そののちゲルを濾別して、２
Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶液および水を用いてこ
の順に洗浄し、デキストラン硫酸ナトラムが固定された
セルロースゲル（以下、Ｃ−１という）をえた。

製造例９ ＣＫゲルＡ−３を吸引濾過してｌｏｇとり、これに２０
％Ｎａ０１１４ｇおよびヘプタン１２ｇを加え、さらに
ノニオン系界面活性剤ＴＷＥＥＮ２０を１滴加えて撹拌
し、ゲルを分散させた。４０℃で２時間撹拌後、これに
エピクロルヒドリン５ｇを加えて４０°Ｃで２時間撹拌
した。静置汲上澄液をすて、ゲルを水洗濾過してエポキ
シ化ゲルをえた。これに１５ｍ１の濃アンモニア水を加
えて４０℃で１．５時間撹拌し、内容物を吸引濾過、水
洗してアミノ基の導入されたセルロースゲルをえた。

一方、・ヘパリン２００　ｍｇを１０ｍ１の水に溶解し
、これに上記アミノ基導入セルロースゲルを加えてｐｌ
＋４．５に調整した。そののち１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド２００ＩＩ１ｇ
をｐＨ４，５に保ちながら添加し、４℃で２４時間振盪
した。反応終了後、２Ｍ食塩水溶液、０．５Ｍ食塩水溶
液、水を用いてこの順に洗浄し、ヘパリン固定化ゲル（
以下、Ｃ−２という）をえた。

製造例１０ デキストラン硫酸をコンドロイチンポリ硫酸にかえたほ
かは製造例８と同様にして、コンドロイチンポリ硫酸が
固定されたＣＫゲルＡ−３（以下、Ｃ−３という）をえ
た。

製造例■１ デキストラン硫酸をヘパリンにかえたほかは製造例８と
同様にしてヘパリンの固定されたＣＫゲルＡ−３（以下
、′ｃ−４という）をえた。

製造例１２ ＣＫゲルＡ−３１０ｍ１をとり、エタノール中で臨界点
乾燥により乾燥させた。乾燥ゲルをｌｏｍｌのよく脱水
したピリジン中に懸濁させ氷冷した。これにクロルスル
ホン酸２ｍｌを撹拌下に滴下し、滴下終了後１０分間撹
拌をつづけた。反応終了後２０％カセイソーダで中和し
、ゲルを濾別しピリジンついで水で洗浄して表面に硫酸
残基が０．０５＋ｎｍｏｌ／ｍｌ導入されたＣＫゲルＡ
−３（以下、Ｃ−５という）をえた。

製造例１３ 特開昭５８−１２６５８号公報の実施例に記載されてい
る方法、すなわち酢酸ビニルｌｏｏｇ、　　トリアリル
イソシアヌレート２４．１ｇ　、酢酸エチル１２４ｇ１
ヘプタン１２４ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度５００）　
３．１ｇおよび２．２′−アソビスイソブチロニトリル
３．１ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール
１重瓜％、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．０５
　ｆｆｌｆｆｉ％およびリン酸２ナトリウム・１２水和
物１．５重量％を溶解した水４００ｍ１とをフラスコに
入れ充分撹拌したのち、５Ｇ、５℃で１８時間、さらに
７５℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合をおこない、粒状
共重合体をえた。濾過、水洗、ついでアセトン抽出を行
なったのち、カセイソーダ４６．５ｇおよびメタノール
２ｇよりなる溶媒中、４０°Ｃで１８時間、共重合体の
エステル変換反応を行なってえられたビニルアルコール
単位を主構成成分とする多孔質水不溶性硬質ゲル（排除
限界分子量約１８０万、平均粒径１５０μｍ）ｌＯｕｎ
ｌをとり、アセトン中で臨界点乾燥法により乾燥させた
。えられた乾燥ゲルをよく脱水したＮ、Ｎ−ジメチルホ
ルムアミド１０ｍｌ中に懸濁させ水冷し、これにクロル
スルホン酸１　ｍｌを撹拌下に滴下し、滴下終了後１０
分間撹拌を続けた。

反応終了後１０％カセイソーダ水溶液で中和し、ゲルを
濾別し、充分に水で洗浄して表面に硫酸残基が０．８ｆ
ｆｌｆｆｌｏｌ／ｍｌ導入された多孔質水不溶性硬質ゲ
ル（以下、Ｄ−１という）をえた。

実施例１〜２０および比較例１〜１３ 製造例１〜１３でえられた第１表に示すゲル（吸着体）
　ｌｏｇ　（湿ｒ［１量）を硬質ガラス製フラスコにと
り、第１表に示す水性溶媒１０ｍ１を加え、１２１℃で
４０分間高圧蒸気滅菌を施した。

各吸着体につき滅菌前、滅菌後の水性溶媒のＩ’ｌｌ、
リガンド孟を測定した。結果を第１表に示す。

［以下余白コ ［発明の効果］ 本発明の方法によると、体外循環治療用吸着体を通常の
条件である　ｌ　２１　’Ｃで２０分という条件よりも
きびしいｌ　２１　’Ｃで４０分間という条件で蒸気滅
菌しても、リガンドの脱離が少なく良好な品質の循環治
療用吸着体かえられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　硫酸エステル基を有する体外循環治療用吸体に蒸気
   滅菌を施すにあたり、ｐＨ５〜９にコントロールされた
   水性溶媒中で滅菌することを特徴とする吸着体の滅菌方
   法。 ２　ｐＨのコントロールされた水性溶媒が緩衝液である
   特許請求の範囲第１項記載の滅菌方法。 ３　緩衝液がクエン酸、リン酸、酢酸、ホウ酸、酒石酸
   、炭酸、マレイン酸、グリシンまたはそれらの塩の少な
   くとも１種を用いた緩衝液である特許請求の範囲第２項
   記載の滅菌方法。