JPS61268355A - 体外循環治療用リポ蛋白吸着体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は血液中の有害成分であるリポ蛋白を除去するた
めの体外循環治療用リポ蛋白吸着体およびその製法に関
する。さらに詳しくは、血液、血漿あるいは血清中から
リポ蛋白、とくに低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）　、超低密
度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）を選択的に吸着除去するための
体外循環治療用リポ蛋白吸着体およびその製法に関する
。

［従来の技術・発明が解決しようとする問題点］血液中
に存在するリポ蛋白のうち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬはコレス
テロールを多く含み、動脈硬化の原因となることが知ら
れている。とりわけ家族性高脂血症などの高コレステロ
ール症では正常値の数倍のＬＤＬ値を示し、冠動脈の硬
化などをひきおこす。

家族性高脂血症などの高コレステロール症の治療のため
、血中のＬＤＬ　、　ＶＬＤＬの低下を目的として食事
療法、プロブコール、コレスチラミンなどの薬物療法が
行なわれているが、効果に限度があり、副作用も懸念さ
れている。とくに家族性高脂血症に対しては、患者の血
漿を分離したのち正常血漿あるいはアルブミンなどを成
分とする補液と交換する、いわゆる血漿交換療法が現在
のところほぼ唯一の効果的な治療法である。

しかしながら、一般に知られているように血漿交換療法
は、（１）高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用いる必
要がある、（２）有害成分のみでなく、有効成分も同時
に除去してしまう、（３）肝炎ビールスなどの感染の慣
れがある、などの欠点を有している。

これらの欠点を解消する目的で膜による有害成分の除去
が試みられているが、選択性の点で満足できるものがな
く、また血漿蛋白の１部が同時に除去されるため、これ
を補う必要があるなどの欠点を依然として有している。

また同じ目的で抗体などを固定した、いわゆる免疫吸着
体を用いる試みがなされており、これは選択性の点でほ
ぼ満足できるが、用いられる抗体の入手が困難かつ高価
であり、また吸着体の滅菌が困難であることや、保存安
定性がわるいなど問題が多い。

さらに有害成分に親和性を有する化合物（いわゆるリガ
ンド）を固定した、いわゆるアフィニティクロマトグラ
フの原理を用いた吸着体も試みられている。この吸着体
は選択性も良好で、これに用いるリガンドもさほど高価
ではないが、体外循環治療に大量に用いるにはさらに価
格を下げる必要がある。

さらに価格を下げることを目的とした例として、硫酸エ
ステル化ポリビニルアルコールを水溶液中でγ線照射に
より架橋し、水不溶化したリポ蛋白吸着体（Ｈａａｓｋ
ａｎｔらによるもの）が知られている。

しかしながら、この例のようにあらかじめ硫酸エステル
化された水溶性の高分子を架橋反応により水不溶化した
多孔質ゲルをうる方法では、架橋反応時に導入されてい
た硫酸残基量が大幅に減少することや、硫酸エステル化
された高分子はその硫酸残基のもたらす親水性により、
架橋反応時に用いることの可能な溶媒が実質的に水に制
限され、これにより用いることの可能な架橋方法も大巾
な制限をうける。またビーズ形成が非常に困難であるな
どの問題がある。

また体外循環回路を用いた白液、血漿潅流療法（いわゆ
るプラズマフエレーシス）に用いる吸着体には、高流量
がえられるような充分な機械的強度（耐圧性）が必要で
ある。しかしながら、上記のような方法で製造されたゲ
ルは本来高分子自身の親水性が高く、たとえ架橋などに
より水不溶性ゲルを形成しても硬質ゲルとはなりえず、
体外循環に用いるとき圧密化がひきおこされ不適当であ
る。

本発明は、多孔質水不溶性硬質ゲルを製造したのち、こ
れを直接硫酸エステル化する′ことにより、［口Ｌ　、
ＶＬＤＬを選択的かつ高速で除去し、しかも安全、安価
な体外循環治療用吸着体を提供することを目的とするも
のである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分
子よりなる排除限界分子量が１００万〜１億の多孔質水
不溶性硬質ゲルであって、該ゲル表面の水酸基の少なく
とも一部が硫酸エステル化されている体外循環治療用リ
ポ蛋白吸着体、および少なくとも分子の１部に水酸基を
有する高分子よりなる排除限界分子量が１００万〜１億
の多孔質水不溶性硬質ゲルを形成したのち、該ゲルの表
面に存在する水酸基を直接硫酸エステル化することによ
り、硬質で吸着容量が大きく、かつ選択性のすぐれた体
外循環治療用リポ蛋白吸着体を製造する方法に関する。

［実施例］ 本発明においては、少なくとも分子の一部に水酸基を有
する高分子よりなる多孔質水不溶性硬質ゲルが使用さ拌
る。

前記少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子は、
結晶性の高分子であってもよく、その他の元来水不溶性
の高分子や、架橋により水不溶化された高分子のいずれ
であってもかまわない。

前記少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子の具
体例としては、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸
ビニル共重合体ケン化物などのように式ニ ー＋−ＣＨ２−ＣＨ−）−Ｔ−表わされる単位を少なく
とも分ｆｔ 子の一部に有する高分子；ポリヒドロキシエチルメタク
リレート、ヒドロキシエチルメタクリレートを含む共重
合体などのように式：％式％ で表わされる単位を有する高分子；セルロース、とドロ
キシエチルセルロースなどのように水酸基を有するセル
ロース誘導体、アガロース、デキストランなどの多糖類
などがあげられるが、これらに限定されるものではない
。これらのうちでは式：＋ＣＨ２−ＣＨ−＋−″Ｃ−表
わされる単位を少Ｈ なくとも分子の一部に有する高分子や多糖類が好ましい
。

前記水酸基はポリビニルアルコールやポリヒドロキシエ
チルメタクリレートなどのように高分子を形成するモノ
マーに由来するものであってもよく、高分子を修飾して
導入されたものであってもよく、不溶性ゲルなどを形成
するために用いられる架橋剤などに由来するものであつ
でもよく、その由来にはとくに限定はない。

前記水酸基を有するあるいは反応により水酸基を生成す
る架橋剤の代表例としては、ペンタエリスリトールジメ
タクリレート、ジアリリデンペンタエリスリット、グリ
セリンジメタクリレートなどの水酸基含有多価不飽和化
合物、エピクロルヒドリン、ブタンジオールジグリシジ
ルエーテル、グリシジルメタクリレートなどのオキシラ
ン環を有する化合物などがあげられるが、これらに限定
されるものではない。

前述のように架橋により水不溶性の高分子をうるには重
合時架橋する方法、重合後架橋する方法、それらの両方
を併用する方法があるが、本発明に用いる水不溶性ゲル
はいずれの方法によって水不溶化された高分子であって
もかまわない。さらに本発明に用いる水不溶性ゲルは硬
質であることが要求される。

ここでいう硬質ゲルとは、デキストラン、アガロース、
アクリルアミドなどの軟質ゲルに比べ溶媒による膨潤が
少なく、また圧力により変形しにくいゲルのこ・とをい
う。硬質ゲルと軟質ゲルは次の方法により区別すること
ができる。

すなわち後記参考例に示したごとく、ゲルを円筒状カラ
ムに均一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流
量との関係が、硬質ゲルではほぼ直線となるのに対し、
軟質ゲルでは圧力がある点をこえるとゲルが変形し、圧
密化して流量が増加しなくなる。本発明では、少なくと
も０−３に９／ｃ／ｒまで上記直線関係のあるものを硬
質ゲルと称する。

硬質ゲルを形成する方法には種々の方法があり、いずれ
の方法を用いてもよい。

水酸基を含有する高分子は一般的に親水性が強く、単独
で水不溶性ゲルを構成すると軟質ゲルしかえられないば
あいがある。このようなばあいには、硬質ゲルを形成し
うる他の高分子（必ずしも水酸基を含有したものである
必要はない）と組み合せることにより硬質ゲルを形成し
うる。

組み合わせの方法としては、たとえば２種類以上の高分
子を混合して用いる方法、あらかじめ形成された硬質ゲ
ルの表面に水酸基含有高分子をコートする方法などがあ
げられるがこれらに限定されるわけではない。

本明細書にいう多孔質とは空孔容積が２０％以上で比表
面積が３Ｔｄ／ｇ以上のものであることを意味する。

本発明に用いる少なくとも分子の一部に水酸基を有する
高分子よりなる多孔質水不溶性硬質ゲルに要求される性
質は、まず第１に大きな径の連続した細孔を有すること
である。すなわちＶＬＤＬ、　ＬＤＬは分子量が少なく
とも１００万以上の巨大分子であり、これを吸着除去す
るためにはＬＤｌ　１ＶＬＤＬが容易にゲル内に侵入で
きることが必要である。

細孔径の測定方法には各種の方法があり、水銀圧入法が
最もよく用いられているが、親水性のゲルのばあいには
、その細孔径の目安として排除限界分子量がよく用いら
れる。

排除限界分子量とは載置（たとえば波多野博行、花卉俊
彦著、実験高速液体クロマトグラフィ、■化学同人発行
）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラ
フィにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子
のうち最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。

排除限界分子量は対象とする化合物により異なることが
知られており、一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリ
エチレングリコールなどについてよく調べられているが
、リポ蛋白についてはほとんど調べられていない。従っ
て、最も類似している球状蛋白質（ビールスを含む）を
用いてえられた値を用いるのが適当である。

排除限界分子量の異なる種々の多孔質水不溶性硬質ゲル
を用いた本発明者らによる検討の結果、予想に反して排
除限界分子量がＬＤＬ　、　ＶＬＤＬの分子量より小さ
い１００万程度のものでもある程度の吸着能を示し、ま
た細孔径の大きいもの程能力が大きいわけではなく、む
しろ能力が低下したり、ＬＤＬ　、　ＶＬＤＬ以外の蛋
白が吸着されやすくなったりすること、すなわち最適な
細孔径の範囲が存在することが明らかになっている。

すなわち１００万未満の排除限界分子量を持つ多孔質水
不溶性硬質グルを用いたばあいには、ＬＤＬ　、　ＶＬ
ＤＬの吸着量は小さく実用に耐えないが、排除限界分子
量が１００万〜数百万とＬＤＬ　、　ＶＬＤＬの分子量
に近い多孔質水不溶性硬質ゲルを用いてもある程度実用
に供しうる吸着体がえられることが明らかになっている
。一方、排除限界分子量が大きくなるにつれてＶＬＤＬ
、　ＬＤＬの吸着量は増加するがやがて頭打ちになり、
排除限界分子量が１億をこえると、多孔質水不溶性硬質
ゲルの構成成分である少なくとも分子の一部に水酸基を
有する高分子のゲル単位体積当りの含量が少なく、した
がって水酸基の量が少なくなり、充分な硫酸基が導入さ
れず、吸着量は目立って低下する。従って本発明に用い
る多孔質水不溶性硬質ゲルの排除限界分子量は１００万
〜１億であり、好ましくは３００万〜７０００万である
。

またその多孔質構造はＬＤＬ　、ＶＬＤＬの吸着容量か
らみれば、表面のみが多孔質であるよりも全一　　１２
　一 体が多孔質であることが好ましい。

多孔質水不溶性硬質ゲルの形状としては、粒子状、繊維
状、膜状、中空糸状など任意の形状のものを選択するこ
とができる。粒子状の多孔質水不溶性硬質ゲルを用いる
ばあい、その粒子径としては、１〜５０００加であるの
が望ましい。

多孔質水不溶性硬質ゲルに存在する水酸基の少なくとも
一部を硫酸エステル化する方法としては、クロルスルホ
ン酸、無水硫酸などをピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミドなどの存在下で水酸基を有する水不溶性硬質ゲ
ルと反応させる方法、町トジメチルホルムアミドなどの
溶媒中で水酸基と硫酸とを直接反応させる方法など種々
の方法があげられ、いかなる方法を用いてもよいが、無
水の条件あるいは無水に近い条件下で行なうことが硫酸
エステル化率が大きくなるという点から好ましい。

本発明では前記のごとき方法により多孔質水不溶性硬質
ゲルが硫酸エステル化されるため、主として多孔質水不
溶性硬質ゲルの表面に存在する水酸基が直接硫酸エステ
ル化される。

導入される硫酸残基の量は本発明に用いる多孔質水不溶
性硬質ゲル１威あたり０．１μｍｏｌ〜１０ｍｍｏ　ｌ
が望ましく、１０μｍｏｌ　〜１ｍｍｏｌがさらに望ま
しい。核間が０，１μｍｏ１未満では、吸着能力が充分
でなくなる傾向が生じ、１０ｍｍｏｌをこえると非特異
吸着、とくにフィブリノーゲンなどの吸着が多すぎ、実
用に供することが困難になる傾向が生じたり、体液のｐ
Ｈを変化させる慣れが生じたりする。

本発明の吸着体を治療に用いるには種々の方法がある。

最も簡便な方法としては患者の血液を体外に導き出して
血液バッグなどに貯め、これに本発明の吸着体を混合し
てＬｔｌＬ　、　ＶＬ［ｌＬを除去したのち、フィルタ
ーを通して該吸着体を除去して血液を患者に戻す方法が
ある。この方法は複雑な装置を必要としないが、１回の
処理量が少なく治療に時間を要し、操作が煩雑になると
いう欠点を有している。

他の方法としては吸着体をカラムに充填し、体外循環回
路に組み込みオンラインで吸着除去を行なう方法がある
。処理方法には全面を直接環流する方法と、血液から血
漿を分離したのち血漿をカラムに通す方法がある。本発
明の吸着体は、いずれの方法にも用いることができ、前
述のごとくオンライン処理に最も適している。

本発明の吸着体を用いてＬＤＬ　、ＶＬＤＬを除去する
際、処理しようとする血液あるいは血漿に多価金属イオ
ンを添加することにより、除去効率、選択性を向上させ
ることができる。この目的に用いる多価金属イオンとし
ては、カルシウム、マグネシウム、バリウム、ストロン
チウムなどのアルカリ土類金属イオン、アルミニウムな
どの■族元素イオン、マンガンなどの■族元素イオン、
コバルトなどの■族元素イオーンなどがあげられる。

以下実施例により本発明の吸着体およびその製法をさら
に詳しく説明する。

参考例 両端に孔径１５μｈのフィルターを装着したガラス製円
筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０．）にアガロー
スゲル（Ｂｉｏｒａｄ社製のＢｌｏｇｅｌ　Ａ５ｍ。

る粒径５０〜１００メツシユ）、ポリマー硬質ゲル（東
洋曹達工業■製のトヨパールＨＷ６５、粒径５０〜１０
０μｍ１およびチッソ■製のセルロファインＧＣ−７０
０、粒径４５〜１０５μｌ１１）をそれぞれ均一に充填
し、ベリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧
力損失ΔＰとの関係を求めた。

結果を第１図に示す。

第１図の結果からポリマー硬質ゲルが圧力の増加にほぼ
比例して流量が増加するのに対し、アガロースゲルは圧
密化をひきおこし、圧力を増加させても流量が増加しな
いことがわかる。

実施例１ 全多孔性の硬質ゲルである架橋ポリアクリレートゲル（
東洋曹達■製のトヨパールＨ−７５、蛋白質の排除限界
分子量５０００万、粒径５０〜１００ρ）１０ｄをとり
、エタノール中で臨界点乾燥法により乾燥させた。えら
れた乾燥ゲルをよく脱水したＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド１０７中に懸濁させて氷冷し、これにりＯルスルホ
ン酸１威を攪拌下に滴下し、滴下終了後１０分間攪拌を
続けた。

反応終了後１０％カセイソーダ水溶液で中和し、ゲルを
濾別して大過剰の水で洗浄し、表面に硫酸残基が０．４
ｍｍｏｌ／ｍｅ導入された多孔質水不溶性硬質ゲルをえ
た。

実施例２ 特開昭５８−１２６５６号公報の実施例に記載されてい
る方法、すなわち酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソ
シアヌレート２４．１ｇ、酢酸エチル１２４９、ヘプタ
ン１２４ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度５００）　３．１
ｇおよび２．２°−アゾビスイソブチロニトリル３．１
ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１重量
％、リン酸２水素ナトリウム・２水和物０．０５重量％
およびリン酸２ナトリウム・１２水和物１．５重量％を
溶解した水４０〇−とをフラスコに入れ充分攪拌したの
ち、５６．５℃で１８時間、さらに７５℃で５時間加熱
攪拌して懸濁重合をおこない、粒状共重合体をえた。濾
過、水洗、ついでアセトン抽出を行なったのち、カセイ
ソーダ４６．５　ｇおよびメタノール２ｊ１よりなる溶
媒中、４０℃で１８時間、共重合体のエステル変換反応
を行なってえられたビニルアルコール単位を主構成成分
とする多孔質水不溶性硬質ゲル（排除限界分子量約１８
０万、平均粒径１５０柳）１０＃Ｉｉ！をとり、アセト
ン中で臨界点乾燥法により乾燥させた。えられた乾燥ゲ
ルをよく脱水したＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｄ
中に懸濁させ氷冷し、これにクロルスルホン酸１１ｄを
攪拌下に滴下し、滴下終了後１０分間攪拌を続けた。

反応終了後１０％カセイソーダ水溶液で中和し、ゲルを
濾別し、充分に水で洗浄して表面に硫酸残基が０．８１
１１１１１０１／−導入された多孔質水不溶性硬質ゲル
をえた。

実施例３〜４および比較例１ 実施例１および２でえられた各ゲル１ＷＩｌを試験管に
とり、これに家族性高脂血症患者の血漿６ｄを加えて攪
拌しながら３７℃で２時間インキュベートしたくそれぞ
れ実施例３および４に相当）。ツレぞレノ上澄液中（７
）ＬＤＬ　、　ＶＬＤＬ、　ＨＤＬコレステロール、フ
ィブリノーゲンの量を測定した。結果を第１表に示す。

なお、ゲル化を加えないものについてもＬＤＬ、ＶＬ［
）Ｌ、＋１［ＩＬコレステロール、フィブリノーゲンの
量を測定した（比較例１）。結果を第１表に示す。

［以下余白］ 第１表の結果から、本発明の吸着体を用いるとＬＤＬお
よびＶＬＤＬは吸着されるが、ＨＤＬコレステロール、
フィブリノーゲンはほとんど吸着されていなごとがわか
る。

［発明の効果］ 本発明の吸着体を用いると患者の体液から有害なＬ［ｌ
Ｌ　、　ＶＬ［ｌＬを選択的かつ効率よく除去すること
が可能となる。また本発明の吸着体は本発明の方法によ
り、比較的高価なリガンドを用いたアフィニティークロ
マトグラフの原理を応用した吸着体よりも安価に製造す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種ゲルを用いて流速と圧力損失との関係を調
べた結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子より
   なる排除限界分子量が１００万〜１億の多孔質水不溶性
   硬質ゲルであって、該ゲル表面水酸基の少なくとも一部
   が硫酸エステル化されている体外循環治療用リポ蛋白吸
   着体。 ２　少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子が式
   ：▲数式、化学式、表等があります▼で表わされる単位
   を 有する高分子である特許請求の範囲第１項記載の吸着体
   。 ３　少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子が多
   糖類である特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ４　少なくとも分子の１部に水酸基を有する高分子より
   なる排除限界分子量が１００万〜１億の多孔質水不溶性
   硬質ゲルを形成したのち、該ゲルの表面に存在する水酸
   基を直接硫酸エステル化する体外循環治療用リポ蛋白吸
   着体の製法。