JPH0513697B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は血液中の有害成分であるリポ蛋白を除
去するための体外循環治療用リポ蛋白吸着体およ
びその製法に関する。さらに詳しくは、血液、血
漿あるいは血清中からリポ蛋白、とくに低密度リ
ポ蛋白（LDL）、超低密度リポ蛋白（VLDL）を
選択的に吸着除去するための体外循環治療用リポ
蛋白吸着体およびその製法に関する。 ［従来の技術・発明が解決しようとする問題点］ 血液中に存在するリポ蛋白のうち、LDL、
VLDLはコレステロールを多く含み、動脈硬化の
原因となることが知られている。とりわけ家族性
高脂血症などの高コレステロール症では正常値の
数倍のLDL値を示し、冠動脈の硬化などをひき
おこす。 家族性高脂血症などの高コレステロール症の治
療のため、血中のLDL、VLDLの低下を目的と
して食事療法、プロブコール、コレスチラミンな
どの薬物療法が行なわれているが、効果に限度が
あり、副作用も懸念されている。とくに家族性高
脂血症に対しては、患者の血漿を分離したのち正
常血漿あるいはアルブミンなどを成分とする補液
と交換する、いわゆる血漿交換療法が現在のとこ
ろほぼ唯一の効果的な治療法である。 しかしながら、一般に知られているように血漿
交換療法は、(1)高価な新鮮血漿あるいは血漿製剤
を用いる必要がある、(2)有害成分のみでなく、有
効成分も同時に除去してしまう、(3)肝炎ビールス
などの感染の惧れがある、などの欠点を有してい
る。 これらの欠点を解消する目的で膜による有害成
分の除去が試みられているが、選択性の点で満足
できるものがなく、また血漿蛋白の１部が同時に
除去されるため、これを補う必要があるなどの欠
点を依然として有している。 また同じ目的で抗体などを固定した、いわゆる
免疫吸着体を用いる試みがなされており、これは
選択性の点でほぼ満足できるが、用いられる抗体
の入手が困難かつ高価であり、また吸着体の滅菌
が困難であることや、保存安定性がわるいなど問
題が多い。 さらに有害成分に親和性を有する化合物（いわ
ゆるリガンド）を固定した、いわゆるアフイニテ
イクロマトグラフの原理を用いた吸着体も試みら
れている。この吸着体は選択性も良好で、これに
用いるリガンドもさほど高価ではないが、体外循
環治療に大量に用いるにはさらに価格を下げる必
要がある。 さらに価格を下げることを目的とした例とし
て、硫酸エステル化ポリビニルアルコールを水溶
液中でγ線照射により架橋し、水不溶化したリポ
蛋白吸着体（Maaskantらによるもの）が知られ
ている。 しかしながら、この例のようにあらかじめ硫酸
エステル化された水溶性の高分子を架橋反応によ
り水不溶化した多孔質ゲルをうる方法では、架橋
反応時に導入されていた硫酸残基量が大幅に減少
することや、硫酸エステル化された高分子はその
硫酸残基のもたらす親水性により、架橋反応時に
用いることの可能な溶媒が実質的に水に制限さ
れ、これにより用いることの可能な架橋方法も大
巾な制限をうける。またビーズ形成が非常に困難
であるなどの問題がある。 また体外循環回路を用いた血液、血漿潅流療法
（いわゆるプラズマフエレーシス）に用いる吸着
体には、高流量がえられるような充分な機械的強
度（耐圧性）が必要である。しかしながら、上記
のような方法で製造されたゲルは本来高分子自身
の親水性が高く、たとえ架橋などにより水不溶性
ゲルを形成しても硬質ゲルとはなりえず、体外循
環に用いるとき圧密化がひきおこされ不適当であ
る。 本発明は、多孔質水不溶性硬質ゲルを製造した
のち、これを直接硫酸エステル化することによ
り、LDL、VLDLを選択的かつ高速で除去し、
しかも安全、安価な体外循環治療用吸着体を提供
することを目的とするものである。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、式：

【式】で表わされ る単位を有する高分子よりなる、または多糖類よ
りなる排除限界分子量が100万〜１億の多孔質水
不溶性硬質ゲルであつて、該ゲルの形成後に該ゲ
ル表面の水酸基の少なくとも一部が直接硫酸エス
テル化されてなる体外循環治療用リポ蛋白吸着
体、および式：

【式】で表わされる 単位を有する高分子よりなるまたは多糖類よりな
る排除限界分子量が100万〜１億の多孔質水不溶
性硬質ゲルを形成したのち、該ゲル表面に存在す
る水酸基を直接硫酸エステル化することにより、
硬質で吸着容量が大きく、かつ選択性のすぐれた
体外循環治療用リポ蛋白吸着体を製造する方法に
関する。 ［実施例］ 本発明においては、式：

【式】で 表わされる単位を有する高分子または多糖類より
なる多孔質水不溶性硬質ゲルが使用される。 前記式：

【式】で表わされる単位 を有する高分子または多糖類は、結晶性の高分子
であつてもよく、その他の元来水不溶性の高分子
や、架橋により水不溶化された高分子のいずれで
あつてもかまわない。 式：

【式】で表わされる単位を有 する高分子の例としては、ポリビニルアルコー
ル、エチレン−酢酸ビニル共重合体ケン化物など
があげれる。 前記水酸基はポリビニルアルコーやポリヒドロ
キシエチルメタクリレートなどのように高分子を
形成するモノマーに由来するものであつてもよ
く、高分子を修飾して導入されたものであつても
よく、不溶性ゲルなどを形成するために用いられ
る架橋剤などに由来するものであつてもよく、そ
の由来にはとくに限定はない。 前記水酸基を有するあるいは反応により水酸基
を生成する架橋剤の代表例としては、ベンタエリ
スリトールジメタクリレート、ジアリリデンペン
タエリスリツト、グリセリンジメタクリレートな
どの水酸基含有多価不飽和化合物、エピクロルヒ
ドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、
グリシジルメタクリレーなどのオキシラン環を有
する化合物などがあげられるが、これらに限定さ
れるものではない。 前述のように架橋により水不溶性の高分子をう
るには重合時架橋する方法、重合後架橋する方
法、それらの両方を併用する方法があるが、本発
明に用いる水不溶性ゲルはいずれの方法によつて
水不溶化された高分子であつてもかまわない。さ
らに本発明に用いる水不溶性ゲルは硬質であるこ
とが要求される。 ここでいう硬質ゲルとは、デキストラン、アガ
ロース、アクリルアミドなどの軟質ゲルに比べ溶
媒による膨潤が少なく、また圧力により変形しに
くいゲルのことをいう。硬質ゲルと軟質ゲルは次
の方法より区別することができる。すなわち後記
参考例に示したごとく、ゲルを円筒状カラムに均
一に充填し、水性液体を流した際の圧力損失と流
量との関係が、硬質ゲルではほぼ直線となるの対
し、軟質ゲルでは圧力がある点をこえるとゲルが
変形し、圧密化して流量が増加しなくなる。本発
明では、少なくとも0.3Kg／cm²まで上記直線関係
のあるものを硬質ゲルと称する。 硬質ゲルを形成する方法には種々の方法があ
り、いずれの方法を用いてもよい。 水酸基を含有する高分子は一般的に親水性が強
く、単独で水不溶性ゲルを構成すると軟質ゲルし
かえられないばあいがある。このようなばあいに
は、硬質ゲルを形成しうる他の高分子（必ずしも
水酸基を含有したものである必要はない）と組み
合せることにより硬質ゲルを形成しうる。 組み合わせの方法としては、たとえば２種類以
上の高分子を混合して用いる方法、あらかじめ形
成された硬質ゲルの表面に水酸基含有高分子をコ
ートする方法などがあげられるがこれらに限定さ
れるわけではない。 本明細書にいう多孔質とは空孔容積が20％以上
で比表面積が３m²／ｇ以上のものであることを意
味する。 本発明に用いる少なくとも分子の一部に水酸基
を有する高分子よりなる多孔質水不溶性硬質ゲル
に要求される性質は、まず第１に大きな径の連続
した細孔を有することである。すなわちVLDL、
LDLは分子量が少なくとも100万以上の巨大分子
であり、これを吸着除去するためにはLDL、
VLDLが容易にゲル内に侵入できることが必要で
ある。 細孔径の測定方法には各種の方法があり、水銀
圧入法が最もよく用いられているが、親水性のゲ
ルのばあいには、その細孔径の目安として排除限
界分子量がよく用いられる。 排除限界分子量とは成書（たとえば波多野博
行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ
イ、(株)化学同人発行）などに述べられているごと
く、ゲル浸透クロマトグラフイにおいて細孔内に
侵入できない（排除される）分子のうち最も小さ
い分子量をもつものの分子量をいう。 排除限界分子量は対象とする化合物により異な
ることが知られており、一般に球状蛋白質、デキ
ストラン、ポリエチレングリコールなどについて
よく調べられているが、リポ蛋白ついてはほとん
ど調べられていない。従つて、最も類似している
球状蛋白質（ビールスを含む）を用いてえられた
値を用いるのが適当である。 排除限界分子量の異なる種々の多孔質水不溶性
硬質ゲルを用いた本発明者らによる検討の結果、
予想に反して排除限界分子量がLDL、VLDLの
分子量より小さい100万程度のものでもある程度
の吸着能を示し、また細孔径の大きいもの程能力
が大きいわけではなく、むしろ能力が低下した
り、LDL、VLDL以外の蛋白が吸着されやすく
なつたりすること、すなわち最適な細孔径の範囲
が存在することが明らかになつている。すなわち
100万未満の排除限界分子量を持つ多孔質水不溶
性硬質ゲルを用いたばあいには、LDL、VLDL
の吸着量は小さく実用に耐えないが、排除限界分
子量が100万〜数百万とLDL、VLDLの分子量に
近い多孔質水不溶性硬質ゲルを用いてもある程度
実用に供しうる吸着体がえられることが明らかに
なつている。一方、排除限界分子量が大きくなる
につれてVLDL、LDLの吸着量は増加するがや
がて頭打ちになり、排除限界分子量が１億をこえ
ると、多孔質水不溶性硬質ゲルの構成成分である
少なくとも分子の一部に水酸基を有する高分子の
ゲル単位体積当りの含量が少なく、したがつて水
酸基の量が少なくなり、充分な硫酸基が導入され
ず、吸着量は目立つて低下する。従つて本発明に
用いる多孔質水不溶性硬質ゲルの排除限界分子量
は100万〜１億であり、好ましくは300万〜700万
である。 またその多孔質構造はLDL、VLDLの吸着容
量からみれば、表面のみが多孔質であるよりも全
体が多孔質であることが好ましい。 多孔質水不溶性硬質ゲルの形状としては、粒子
状、繊維状、膜状、中空糸状など任意の形状のも
のを選択することができる。粒子状の多孔質水不
溶性硬質ゲルを用いるばあい、その粒子径として
は、１〜5000μmであるのが望ましい。 多孔質水不溶性硬質ゲルに存在する水酸基の少
なくとも一部を硫酸エステル化する方法として
は、クロルスルホン酸、無水硫酸などをピリジ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの存在下
で水酸基を有する水不溶性硬質ゲルと反応させる
方法、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒
中で水酸基と硫酸とを直接反応させる方法など
種々の方法があげられ、いかなる方法を用いても
よいが、無水の条件あるいは無水に近い条件下で
行なうことが硫酸エステル化率が大きくなるとい
う点から好ましい。 本発明では前記のごとき方法により多孔質水不
溶性硬質ゲルが硫酸エステル化されるため、主と
して多孔質水不溶性硬質ゲルの表面に存在する水
酸基が直接硫酸エステル化される。 導入される硫酸残基の量は本発明に用いる多孔
質水不溶性硬質ゲル１mlあたり0.1μmol〜
10mmolが望ましく、10μmol〜1mmolがさらに
望ましい。該量が0.1μmol未満では、吸着能力が
充分でなくなる傾向が生じ、10mmolをこえると
非特異吸着、とくにフイブリノーゲンなどの吸着
が多すぎ、実用に供することが困難になる傾向が
生じたり、体液のPHを変化させる惧れが生じたり
する。 本発明の吸着体を治療に用いるには種々の方法
がある。 最も簡便な方法としては患者を体外に導き出し
て血液バツグなどに貯め、これに本発明の吸着体
を混合してLDL、VLDLを除去したのち、フイ
ルターを通して該吸着体を除去して血液を患者に
戻す方法がある。この方法は複雑な装置を必要と
しないが、１回の処理量が少なく治療に時間を要
し、操作が煩雑になるという欠点を有している。 他の方法としては吸着体をカラムに充填し、体
外循環回路に組み込みオンラインでで吸着除去を
行なう方法がある。処理方法には全血を直接環流
する方法と、血液から血漿を分離したのち血漿を
カラムに通す方法がある。本発明の吸着体は、い
ずれの方法にも用いることができ、前述のごとく
オンライン処理に最も適している。 本発明の吸着体を用いてLDL、VLDLを除去
する際、処理しようとする血液あるいは血漿に多
価金属イオンを添加することにより、除去効率、
選択性を向上させることができる。この目的に用
いる多価金属イオンとしては、カルシウム、マグ
ネシウム、バリウム、ストロンチウムなどのアル
カリ土類金属イオン、アルミニウムなどの族元
素イオン、マンガンなどの族元素イオン、コバ
ルトなどの族元素イオンなどがあげられる。 以下実施例により本発明の吸着体およびその製
法をさらに詳しく説明する。 参考例 両端に孔径15μmのフイルターを装着したガラ
ス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）に
アガロースゲル（Biorad社製のBiogel A5m、る
粒径50〜100メツシユ）、ポリマー硬質ゲル（東洋
曹達工業(株)製のトヨパールHW65、粒径50〜
100μm、およびチツソ(株)製のセルロフアインGC
−700、粒径45〜105μm）をそれぞれ均一に充填
し、ペリスタテイツクポンプにより水を流し、流
量と圧力損失Δpとの関係を求めた。結果を第１
図に示す。 第１図の結果からポリマー硬質ゲルが圧力の増
加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、アガ
ロースゲルは圧密化をひきおこし、圧力を増加さ
せても流量が増加しないことがわかる。 実施例 １ 全多孔性の硬質ゲルである架橋ポリアクリレー
トゲル（東洋曹達(株)製のトヨパールHW75、蛋白
質の排除限界分子量5000万、粒径50〜100μm）10
mlをとり、エタノール中で臨界点乾燥法により乾
燥させた。えられた乾燥ゲルをよく脱水したＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド10ml中に懸濁させて氷
冷し、これにクロルスルホン酸１mlを撹拌下に滴
下し、滴下終了後10分間撹拌を続けた。反応終了
後10％カセイソーダ水溶液で中和し、ゲルを濾別
して大過剰の水で洗浄し、表面に硫酸残基が
0.4mmol／ml導入された多孔質水不溶性硬質ゲル
をえた。 実施例 ２ 特開昭58−12656号公報の実施例に記載されて
いる方法、すなわち酢酸ビニル100ｇ、トリアリ
ルイソシアヌレート24.1ｇ、酢酸エチル124ｇ、
ヘプタン124ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）
3.1ｇおよび２，2′−アゾビスイソブチロニトリ
ル3.1ｇよりなる均一混合液と、ポリビニルアル
コール１重量％、リン酸２水素ナトリウム・２水
和物0.05重量％およびリン酸２ナトリウム・12水
和物1.5重量％を溶解した水400mlとをフラスコに
入れ充分撹拌したのち、56.5℃で18時間、さらに
75℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合をおこない、
粒子共重合体をえた。濾過、水洗、ついでアセト
ン抽出を行なつたのち、カセイソーダ46.5ｇおよ
びメタノール２よりなる溶媒中、40℃で18時
間、共重合体のエステル変換反応を行なつてえら
れたビニルアルコール単位を主構成成分とする多
孔質水不溶性硬質ゲル（排除限界分子量約180万、
平均粒径150μm）10mlをとり、アセトン中で臨界
点乾燥法により乾燥させた。えられた乾燥ゲルを
よく脱水したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド10ml
中に懸濁させ氷冷し、これにクロルスルホン酸１
mlを撹拌下に滴下し、滴下終了後10分間撹拌を続
けた。反応終了後10％カセイソーダ水溶液で中和
し、ゲルを濾別し、充分に水で洗浄して表面に硫
酸残基が0.8mmol／ml導入された多孔質水不溶性
硬質ゲルをえた。 実施例３〜４および比較例１ 実施例１および２でえられた各ゲル１mlを試験
管にとり、これに家族性高脂血症患者の血漿６ml
を加えて撹拌しながら37℃で２時間インキユベー
トした（それぞれ実施例３および４に相当）。そ
れぞれ上澄液中のLDL、VLDL、HDLコレステ
ロール、フイブリノーゲンの量を測定した。結果
を第１表に示す。 なお、ゲル化を加えないものについてもLDL、
VLDL、HDLコレステロール、フイブリノーゲ
ンの量を測定した（比較例１）。結果を第１表に
示す。

【表】 第１表の結果から、本発明の吸着体を用いると
LDLおよびVLDLは吸着されるが、HDLコレス
テロール、フイブリノーゲンはほとんど吸着され
ていないことがわかる。 ［発明の効果］ 本発明の吸着体を用いると患者の体液から有害
なLDL、VLDLを選択的かつ効率よく除去する
ことが可能となる。また本発明の吸着体は本発明
の方法により、比較的高価なリガンドを用いたア
フイニテイークロマトグラフの原理を応用した吸
着体よりも安価に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種ゲルを用いて流速と圧力損失との
関係を調べた結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式：【式】で表わされる単位を 有する高分子よりなる排除限界分子量が100万〜
   １億の多孔質水不溶性硬質ゲルであつて、該ゲル
   の形成後に該ゲル表面水酸基の少なくとも一部が
   直接硫酸エステル化されてなる体外循環治療用リ
   ポ蛋白吸着体。 ２ 多糖類よりなる排除限界分子量が100万〜１
   億の多孔質水不溶性硬質ゲルであつて、該ゲルの
   形成後に該ゲル表面水酸基の少なくとも一部が直
   接硫酸エステル化されてなる体外循環治療用リポ
   蛋白吸着体。 ３ 式：【式】で表わされる単位を 有する高分子よりなる排除限界分子量が100万〜
   １億の多孔質水不溶性硬質ゲルを形成したのち、
   該ゲルの表面に存在する水酸基を直接硫酸エステ
   ル化する体外循環治療用リポ蛋白吸着体の製法。 ４ 多糖類よりなる排除限界分子量が100万〜１
   億の多孔質水不溶性硬質ゲルを形成したのち、該
   ゲルの表面に存在する水酸基を直接硫酸エステル
   化する体外循環治療用リポ蛋白吸着体の製法。