JPS62195284A - 微生物の固定化物及びその製法 - Google Patents
微生物の固定化物及びその製法Info
- Publication number
- JPS62195284A JPS62195284A JP3502186A JP3502186A JPS62195284A JP S62195284 A JPS62195284 A JP S62195284A JP 3502186 A JP3502186 A JP 3502186A JP 3502186 A JP3502186 A JP 3502186A JP S62195284 A JPS62195284 A JP S62195284A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- suspension
- calcium
- microorganism
- microorganisms
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 23
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 14
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 claims abstract description 14
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 12
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 19
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 4
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 abstract description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- -1 calcium chloride Chemical class 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229940117913 acrylamide Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
本発明は微生物の固定化物及びその製法に関するもので
ある。
ある。
更に詳細には、本発明は、微生物を懸濁状態で固定化し
た物及びその製法に関するものである。
た物及びその製法に関するものである。
本発明の微生物の懸濁液をアルギン酸カルシウムの皮膜
で囲包してなる微生物の固定化物は、一般な微生物の代
謝生産物であるアルコール、アミノ酸等の物質生産、遺
伝子操作微生物の特殊代謝生産物の生産、各種物質の転
換反応等にきわめて有用である。
で囲包してなる微生物の固定化物は、一般な微生物の代
謝生産物であるアルコール、アミノ酸等の物質生産、遺
伝子操作微生物の特殊代謝生産物の生産、各種物質の転
換反応等にきわめて有用である。
従来、微生物の固定化はアクリルアミド、ゼラチン、ア
ルギン酸カルシウム、カラギーナン、エポキシ樹脂など
を用いてビーズ状にゲル化させ固定化していた。
ルギン酸カルシウム、カラギーナン、エポキシ樹脂など
を用いてビーズ状にゲル化させ固定化していた。
しかし、このようにして固定化された微生物は培養液中
でゲル中に培地成分を取り込んで、さらに生成物を排出
しなければならず、粒子が大きくなったりすると物質交
換が低効率となる欠点があった。
でゲル中に培地成分を取り込んで、さらに生成物を排出
しなければならず、粒子が大きくなったりすると物質交
換が低効率となる欠点があった。
本発明は、微生物を液中に懸濁状でアルギン酸カルシウ
ムの皮膜で囲包し固定化してなるものであって、微生物
が液中に懸濁されているために、培養栄養源、物質の流
入及び代謝産物の流出はきわめて容易であるなどのすぐ
れた効果を示すものである。
ムの皮膜で囲包し固定化してなるものであって、微生物
が液中に懸濁されているために、培養栄養源、物質の流
入及び代謝産物の流出はきわめて容易であるなどのすぐ
れた効果を示すものである。
本発明の微生物の固定化物の製法は、カルシウムイオン
を存在させた微生物懸濁液をアルギン酸ナトリウム溶液
に滴下し、液滴の表面にアルギン酸カルシウムの皮膜を
形成せしめることにある。
を存在させた微生物懸濁液をアルギン酸ナトリウム溶液
に滴下し、液滴の表面にアルギン酸カルシウムの皮膜を
形成せしめることにある。
本発明に使用する微生物は、酵母、細菌、かびなどいず
れの微生物でもよい。
れの微生物でもよい。
微生物は、水、培養液1代謝物質含有液、特殊物質含有
液などに懸濁させる。
液などに懸濁させる。
また、微生物の懸濁液は、微生物を培養して得た微生物
含有培養液をそのまま使用することもできる。
含有培養液をそのまま使用することもできる。
懸濁液中の微生物は、固定化後の増殖を考慮すれば各刈
高濃度とする必要はなく、約101ケ〜106ケ/ m
Q程度の懸濁濃度でよい。
高濃度とする必要はなく、約101ケ〜106ケ/ m
Q程度の懸濁濃度でよい。
次いで、この微生物懸濁液にカルシウムイオンを形成す
るカルシウム塩1例えば塩化カルシウムが添加される。
るカルシウム塩1例えば塩化カルシウムが添加される。
カルシウム塩は、懸濁液滴を囲包するアルギン酸カルシ
ウムの皮膜を形成する量であれば任意でよいが、懸濁液
に対して0.5〜1.0%程度の添加が好適である。
ウムの皮膜を形成する量であれば任意でよいが、懸濁液
に対して0.5〜1.0%程度の添加が好適である。
別に、アルギン酸ナトリウム溶液を調製しておくが、ア
ルギン酸ナトリウム0.5%〜5%程度の水溶液が好ま
しい。
ルギン酸ナトリウム0.5%〜5%程度の水溶液が好ま
しい。
次いで、カルシウムイオンを存在させた微生物の懸濁液
を液滴としてアルギン酸ナトリウム溶液に滴下し、微生
物の懸濁液の周囲にアルギン酸カルシウムの皮膜を形成
させるものである。
を液滴としてアルギン酸ナトリウム溶液に滴下し、微生
物の懸濁液の周囲にアルギン酸カルシウムの皮膜を形成
させるものである。
微生物の懸濁液の滴下はいかなる方法でもよいが、容器
から多数の内径1〜10aus程度のガラス管を下方に
固定した滴下容器を作り、これに微生物の懸濁液を入れ
蓋をして密閉し、容器内上方空間部と外界をゴム管でつ
なぎ、該ゴム管を通して空気を少量づつ間けつ的に容器
内に送れば、微生物の懸濁液は液滴となって落下する方
法などがよい。
から多数の内径1〜10aus程度のガラス管を下方に
固定した滴下容器を作り、これに微生物の懸濁液を入れ
蓋をして密閉し、容器内上方空間部と外界をゴム管でつ
なぎ、該ゴム管を通して空気を少量づつ間けつ的に容器
内に送れば、微生物の懸濁液は液滴となって落下する方
法などがよい。
アルギン酸ナトリウム液に落下した微生物の懸濁液は、
そこに含まれるカルシウムイオンがアルギン酸ナトリウ
ムと反応して、アルギン酸カルシウムとなり、アルギン
酸カルシウムは硬化するので、液滴を囲包し皮膜となる
のである。
そこに含まれるカルシウムイオンがアルギン酸ナトリウ
ムと反応して、アルギン酸カルシウムとなり、アルギン
酸カルシウムは硬化するので、液滴を囲包し皮膜となる
のである。
所望の厚さの皮膜が形成されたら、固定化物をアルギン
酸ナトリウム液から分離し、1〜4回程度水洗し、カル
シウムイオンを除去するのがよい。
酸ナトリウム液から分離し、1〜4回程度水洗し、カル
シウムイオンを除去するのがよい。
得られた微生物の固定化物は、培養タンクに投入し、例
えばアルコール発酵に何度でも使用でき、また、カラム
につめて、培養液を通液することによって例えばアルコ
ールを生産させることができるものである。
えばアルコール発酵に何度でも使用でき、また、カラム
につめて、培養液を通液することによって例えばアルコ
ールを生産させることができるものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1゜
グルコース1−0g7.100m1 Ko、po40
.3g/100mj1MgSO40,05g/ 100
mA (NH,)、50.0.5g/ 100mRC
aC1,0,05g/ 100m(l 酵母エキス0
.5g/ 100mnからなる培地IQを小型培養槽に
仕込み121℃15分間滅菌し、pH5,5に調整した
。 この培地にサツカロマイセス・セレビシェを接種し
、30℃で通気量3Q/win攪拌数30Orpmで2
4時間培養した。得られた培養液には別に滅菌した10
%塩化カルシウム液を最終濃度1.0%になる様に加え
、1.05 Qを得た。このカルシウム添加酵母培養液
を別に滅菌した1、0%アルギン酸ナトリウムの溶液に
内径5III11のガラス管より滴下し、3〜5秒で、
アルギン酸カルシウムの皮膜を形成した5〜6wmの球
体を得た。この球体を無菌の脱イオン水5Qに入れゆる
い攪拌を行い1時間放置しさらに2回水を交換し過剰の
カルシウムを除去し、うすいアルギン酸カルシウムの皮
膜でつつまれた酵母懸濁菌体1゜3kgを得た。
.3g/100mj1MgSO40,05g/ 100
mA (NH,)、50.0.5g/ 100mRC
aC1,0,05g/ 100m(l 酵母エキス0
.5g/ 100mnからなる培地IQを小型培養槽に
仕込み121℃15分間滅菌し、pH5,5に調整した
。 この培地にサツカロマイセス・セレビシェを接種し
、30℃で通気量3Q/win攪拌数30Orpmで2
4時間培養した。得られた培養液には別に滅菌した10
%塩化カルシウム液を最終濃度1.0%になる様に加え
、1.05 Qを得た。このカルシウム添加酵母培養液
を別に滅菌した1、0%アルギン酸ナトリウムの溶液に
内径5III11のガラス管より滴下し、3〜5秒で、
アルギン酸カルシウムの皮膜を形成した5〜6wmの球
体を得た。この球体を無菌の脱イオン水5Qに入れゆる
い攪拌を行い1時間放置しさらに2回水を交換し過剰の
カルシウムを除去し、うすいアルギン酸カルシウムの皮
膜でつつまれた酵母懸濁菌体1゜3kgを得た。
実施例2゜
グルコース1.0g/ 100mQ Ko、po40
−3g/ 100+ol1MgS040.05g/10
0履a (NH,)、SO40,5g/ 100s
+MCaC1,0,05g/ 100mQ 酵母エキ
ス0.5g/100−からなる培地2Qを小型培養槽に
仕込み121℃15分間滅菌を行い、 PH5,5に調
整した。この培地にサツカロマイセス・セレビシェを接
種し、30℃で通気量5M/akin攪拌数30Orp
m+で24時間培養した。培養液を遠心分離5000r
pm 10分して菌体を集め、この菌体に滅菌を行った
1%塩化カルシウム溶液IQを加え菌体懸濁液を調整し
た。この懸濁液を滅菌された0、7%アルギン酸ナトリ
ウム溶液(記文フードケミファHタイプ)に内径5mm
のガラス管より滴下し3〜5秒後にアルギン酸溶液より
取り出し5〜6mmの球体1.2kgを得た。この球体
を無菌の脱イオン水5Qに入れ攪拌しながら1時間放置
。
−3g/ 100+ol1MgS040.05g/10
0履a (NH,)、SO40,5g/ 100s
+MCaC1,0,05g/ 100mQ 酵母エキ
ス0.5g/100−からなる培地2Qを小型培養槽に
仕込み121℃15分間滅菌を行い、 PH5,5に調
整した。この培地にサツカロマイセス・セレビシェを接
種し、30℃で通気量5M/akin攪拌数30Orp
m+で24時間培養した。培養液を遠心分離5000r
pm 10分して菌体を集め、この菌体に滅菌を行った
1%塩化カルシウム溶液IQを加え菌体懸濁液を調整し
た。この懸濁液を滅菌された0、7%アルギン酸ナトリ
ウム溶液(記文フードケミファHタイプ)に内径5mm
のガラス管より滴下し3〜5秒後にアルギン酸溶液より
取り出し5〜6mmの球体1.2kgを得た。この球体
を無菌の脱イオン水5Qに入れ攪拌しながら1時間放置
。
水を取り換えて同様に放置し過剰のカルシウムを除去し
、うすいアルギン酸カルシウムの皮膜でつつまれだ懸濁
液状の酵母の固定化菌体を得た。
、うすいアルギン酸カルシウムの皮膜でつつまれだ懸濁
液状の酵母の固定化菌体を得た。
Claims (2)
- (1)微生物の懸濁液をアルギン酸カルシウムの皮膜で
囲包してなる微生物の固定化物。 - (2)カルシウムイオンを存在させた微生物懸濁液をア
ルギン酸ナトリウム溶液に滴下し、液滴の表面にアルギ
ン酸カルシウムの皮膜を形成せしめることを特徴とする
微生物の固定化法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3502186A JPS62195284A (ja) | 1986-02-21 | 1986-02-21 | 微生物の固定化物及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3502186A JPS62195284A (ja) | 1986-02-21 | 1986-02-21 | 微生物の固定化物及びその製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62195284A true JPS62195284A (ja) | 1987-08-28 |
Family
ID=12430406
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3502186A Pending JPS62195284A (ja) | 1986-02-21 | 1986-02-21 | 微生物の固定化物及びその製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62195284A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0922451A3 (en) * | 1997-11-28 | 2000-05-24 | Universita' Degli Studi Di Pavia | Microcapsules containing seminal material for artificial insemination in pigs |
JP2006122685A (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Cordis Neurovascular Inc | 安定化された部分を有する拡張可能なステント |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5813393A (ja) * | 1981-07-13 | 1983-01-25 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | 固定化微生物を用いるアルコ−ルの製造法 |
JPS60120986A (ja) * | 1983-11-03 | 1985-06-28 | ビー・ブラウン―エスエスシー・アクチエンゲゼルシャフト | 生体触媒ビーズの製造装置 |
JPS61152284A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-10 | Q P Corp | 固定化菌 |
-
1986
- 1986-02-21 JP JP3502186A patent/JPS62195284A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5813393A (ja) * | 1981-07-13 | 1983-01-25 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | 固定化微生物を用いるアルコ−ルの製造法 |
JPS60120986A (ja) * | 1983-11-03 | 1985-06-28 | ビー・ブラウン―エスエスシー・アクチエンゲゼルシャフト | 生体触媒ビーズの製造装置 |
JPS61152284A (ja) * | 1984-12-27 | 1986-07-10 | Q P Corp | 固定化菌 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0922451A3 (en) * | 1997-11-28 | 2000-05-24 | Universita' Degli Studi Di Pavia | Microcapsules containing seminal material for artificial insemination in pigs |
JP2006122685A (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Cordis Neurovascular Inc | 安定化された部分を有する拡張可能なステント |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4778749A (en) | Tissue culture and production in permeable gels | |
JPS60120987A (ja) | 固定化された微生物菌体もしくは酵素の製法 | |
US5895757A (en) | Encapsulation of living tissue cells in inorganic microspheres prepared from an organosilicon | |
WO1989010397A1 (en) | Process for culturing animal cells on a large scale and process for preparing supporting substrate for that process | |
JPS62195284A (ja) | 微生物の固定化物及びその製法 | |
JPS6214274B2 (ja) | ||
US5387522A (en) | Apparatus having a biphasic spray head for entrapping biological material in a hydrophilic gel | |
WO1985005630A1 (en) | Tissue culture and production in permeable gels | |
JPS6321475B2 (ja) | ||
CN110004135A (zh) | 一种球形固定化含d-泛解酸内酯水解酶细胞及其制备方法和水解d-泛解酸内酯的方法 | |
JPS6225974A (ja) | コラ−ゲンよりなるゲル状組成物 | |
JP2016528883A (ja) | ハイブリッドアルギン酸シリカビーズ及びそれらを得るための方法 | |
JPS60145095A (ja) | 固定化微生物によるキシリト−ルの製造法 | |
JPS5876097A (ja) | 固定化微生物によるグルコン酸の製造法 | |
JPH02150276A (ja) | 細胞培養法 | |
WO1987000197A1 (en) | Entrapment of anchorage-dependent cells | |
SU1742330A1 (ru) | Способ получени биокатализатора в полисахаридном носителе | |
GB2104914A (en) | Process for manufacturing alcohol by fermentation | |
RU2327738C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ β-ФРУКТОФУРАНОЗИДАЗЫ | |
JPS60221089A (ja) | 固定化された微生物菌体もしくは酵素の製造法 | |
JPS62134088A (ja) | 固定化酵素 | |
JPH02167066A (ja) | 細胞培養方法 | |
CA1271438A (en) | Tissue culture and production in permeable gels | |
RU2142505C1 (ru) | Состав для культивирования эшерихий | |
JPH0371880B2 (ja) |