JPS6212837A

JPS6212837A - 電気泳動の結果を分析する方法及び装置

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Publication number: JPS6212837A
Application number: JP61124625A
Authority: JP
Inventors: クレイグ・ダグラス・マッケイ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-05-29
Filing date: 1986-05-28
Publication date: 1987-01-21
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: EP0214713B1; ATE61118T1; GB8612713D0; GB8513538D0; DE3677675D1; GB2175690B; EP0214713A1; US4874492A; JP2838117B2; GB2175690A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の分野この発明は、電気泳動に関するものであり、かつ電気泳
動の結果を分析する方法、混合物の成分を分離しかつ検
出する方法、および分離装置に関するものである。発明の前景電気泳動は、分子または他の単位が、たとえば分析また
は浄化のために、電界を印加することによって分離され
る分離技術である。このため、装置の差動的移動が生じ
、各単位の移動速度は、その変化および（その大きさお
よび形状と関連する）摩擦抵抗に依存している。この技
術は、たとえば蛋白質またはＤＮＡ　（デオキシリボ核
酸）片の混合物を分離するために用いられ、その混合物
は、典型的に澱粉またはポリアクリルアミドの適当な担
体材料、たとえば多孔性ゲル上に位置決めされる。電界
が印加されて差動的に移動する結果、１次元アレイの帯
または２次元アレイの点のいずれかが生じる。結果とし
て生じる帯または点は、次に挙げるものを含む多くの技
術によって検出される。１、　帯または点を不透明および可視性にする適当な染
料で染色することによって。２ｏ　適当な光源によって誘発されるとき光を放射する
螢光マーカまたはラベルを用いることによって。３、　　たとえばオートラジオグラフィーとして公知の
技術を用いて、放射性マーカまたはラベルを用いること
によって。これらの技術による電気泳動の結果の分析は、重大な限
界を有する。染色された染料を透過で検査すると、最も
ぼんやりした点または帯は、明るい背景に対して検出さ
れなければならず、−力量も暗い点または帯は、はとん
ど光を透過しないので、従来の検出器、たとえばテレビ
カメラまたは写真フィルムで正確に測定するのは不可能
であるかもしれない。電気泳動マーカ染料は、一般に、
最も低い点または帯レベルの検出を困難にする低レベル
の光のみ生じる。オートラジオグラフィーは、放射性材
料の取扱いに関連するすべての問題、さらに不完全な分
解能、および日ないし週のオーダの非常に長い可視化時
間を有する。発明この発明の１つの局面に従って、２次元電荷結合デバイ
ス（ＣＣＤ）を用いて、分離された成分から光のパター
ンを検出する、電気泳動の結果を分析する方法が提供さ
れる。他の局面では、電気泳動によって混合物を分離し、かつ
２次元電荷結合デノミイス（ＣＣＤ）を用いて、分離さ
れた成分から光のパターンを検出する、混合物の成分を
分離しかつ検出する方法を提供する。この発明はまた、他の局面では、電気泳動によって混合
物を分離する手段、および分離された成分から光のパタ
ーンを検出する２次元電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を備
える分離装置を提供する。この発明は、１次元および２次元電気泳動のいずれにも
応用可能であり、結果として生じる帯または点は、透過
された光で検査するために染色されるかまたは放射光線
を検査するために螢光マーカでラベルを付けられるかの
いずれかである。代わりに、以下でより詳細に説明する
が、ＣＣＤによって検出するために、放射性マーカから
光に変換するシンチレータが用いられてもよい。冷却ＣＣＤ検出器システムを用いるのが好ましい。とい
うのは冷却は、熱暗電流を抑制することによって感度お
よびダイナミックレンジを改良するからである。この発
明で用いるのに適する典型的なシステムは、アストロム
ド社（Ａｓｔｒｏｍｅｄ　　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）によって
生産されるＣＣＤ２０００イメージングシステムである
。この発明は、従来の態様で電気泳動によって分離を完了
し、かつそれから、たとえば染色後または螢光マーカを
加えた後、ＣＣＤを用いて、結果として生じる帯または
点のアレイを分析することによって実行されてもよい。代わりに、電気泳動による分離が停止され、分離してい
る成分から光のパターンが検出され、かつ電気泳動分離
が再び始められてもよい。さらに他の可能性として、電気泳動による分離中、移動
している成分から光を検出するために、フレーム転送Ｃ
ＣＤが用いられることができる。これは、以下でより詳細に説明するが、成分の運動と同
期して、ＣＣＤを横切って電荷分布を転送することによ
って達成される。この場合、成分は、分離プロセスを開
始する前に、螢光ラベルまたはシンチレータおよび放射
性ラベルを加えることによって、都合良く可視化される
。電荷結合デバイスは、一方の波長（たとえば可視光より
短い）の電磁放射線を吸収し、かつ他方の波長（たとえ
ば可視光のような）の電磁放射線を放射する１つ以上の
材料でコーティングされてもよく、それによって電荷結
合デバイスが敏感でない波長の電磁放射線は間接的に検
出されることができる。この発明のため、電気泳動の結果の分析は、従来の技術
と比べて著しくスピードアップされることができ、なら
びに得られる精度を高め、かつより小さいサンプル量を
用いることができる。この発明はまた、取扱われること
ができる１つのアレイ内に含まれる一体化された点また
は帯の強さの範囲を非常に増加させ、かつ各分離された
点または帯の蛋白質の量をはるかに正確に数量化するこ
とができる。この発明に従って、装置の１つの好ましい実施例を、添
付の図面、すなわち発明の分析方法で用いるための装置
の概略図である１つの図面に関連して、例として説明す
る。

【図面の簡単な説明】

図解された装置は、それに与えられるサンプル混合物の
電気泳動分離によって生じる１次元または２次元アレイ
の帯または点を持つゲル１０を備える。その点または帯
は、適当な源１４からゲルを介して透過される光１２に
よって検査するために染色されるか、または紫外線源１
８からより短い波長の光１６によって誘発されるとき光
を放射する螢光マーカでラベルを付けられるかのいずれ
かである。代わりに、放射能を放射性マーカから光に変
換するために、シンチレータが用いられてもよい。結果として生じる透過されたまたは放射された光線２０
は、アストロムド社によって生産されるＣＣＤ２０００
イメージングシステムを備える、冷却電気結合デバイス
検出器システムによって検出される。螢光マーカを用い
る実施例では、光は、まず、フィルタ２２を介して通過
し、より短い波長の投光照明に対して放射された光を選
択する。透過または放射された光は、それから、液体窒素または
スターリングサイクル、または他の機械または電気冷却
器で冷却されるコールドボックス２８内に含まれる冷却
固体電荷結合デバイス検出器２６（ＥＥＶ社によって作
られるＰ８６００シリーズＣ０Ｄ）上に、レンズ２４に
よって像を作られる。ＣＣＤ２　Ｂは、電気配線３０によって、ＣＣＤに、必
要な駆動波長およびバイアス電圧を提供し、かつまたシ
ステム全体の続出ノイズを最小にするためにＣＣＤによ
って出力される信号を処理するドライバエレクトロニク
ス装置３２に接続される。そのドライバエレクトロニクス装置は、ＶＤＵコンソー
ル３６を介してシステムをオペレータ制御することがで
きる上位コンピュータシステム３４によって駆動されか
つ制御され、データは３８で表わされるように、たとえ
ばディスク駆動機構および磁気テープ上で達成され、か
つゲルの像の表示は、像表示装置４０によって達成され
る。中央コンピュータ３４はまた、ゲル上の検出された
点または帯の分布を、その点および帯の詳細な特性、た
とえば位置、形状、大きさ、配向および強さとともに定
めることができるソフトウェアを含む。そのように得られたデータは、関連するプリンタ４２上
で出力されてもよく、または記憶するために、または他
のゲルについて得られる点または帯の分布と比較するこ
とができるように、ディスクまたは磁気テープ上で達成
されてもよい。上で説明したシステムは、次のような多くの利点および
特性を有する。１ｏ　冷却ＣＣＤシステムは、２次元イメージングシス
テムの、ｓｏ、０００：１を越える最も広いダイナミッ
クレンジを有する。転送モードでは、このシステムの高
いダイナミックレンジのため、たとえばテレビカメラの
ような低いダイナミックレンジの検出器（典型的に６４
；１から２５６：１までのダイナミックレンジ）で可能
であるよりはるかにぼんやりしている点および帯を検出
することができ、一方非常に明るい点および帯を、なお
かつ正確に測定することができる。２、　例外的に低い読出ノイズ（典型的に６電子ｒｍｓ
）ならびに高い量子効率（約４０％のピークより大きい
）のため、別な方法で検出可能であるよりはるかにぼん
やりしている点または帯の螢光モードで検出することが
できる。これは、低い動作温度（約１２５’Ｋまで下が
る）で暗い信号または読出ノイズを加えることなく、何
分または何時間もゲルから信号を積分することが可能で
あるからである。３、　得られるゲル上の分解能は、次のように高められ
てもよい。場面がフレーム転送ＣＣＤ検出器上に像を作
られるとき、それに当たる配向に正確に従う２次元電荷
分布が作られる。通常、蓄積された電荷分布は、デバイ
スを横切って２次元電荷分布を移動させ、かつそれを同
時に１行分読出すことによって、露光の終わりに読出さ
れる。しかしながら、露光全体を通じて、２−Ｄ電荷分布がデ
バイスを横切って転送され、かつＣＣＤに当たる光は既
に蓄積された電荷と同期してデバイスを横切って移動さ
れれば、運動の方向に任意の長さの像を得ることが可能
である。信号が列に沿って移動するとき、列の各画素は
、また信号に寄与し、そのため列の異なる画素の検出感
度は、出力の各画素の信号で平均される。したがって、
ＣＣＤの１つの列からの出力の画素は、検出器の観点か
ら完全に均一であり、かつそれゆえにデータをフィール
ディングする平面の必要を減じる出力の列を与える。他
の検出の付加的な分解能は、横向きにＣＣＤを段階状に
並べ、かつ１組の隣接ストリップ走査を与えるためにそ
の走査を繰返すことによって得られてもよい。モニタされている光源の運動と同期する、ＣＣＤを横切
る電荷分布の運動（電気泳動運動）は、制御コンピュー
タおよびドライバエレクトロニクスによって制御される
。４、　較正化学薬品（典型的に蛋白質またはＤＮＡセグ
メント）は、１−Ｄおよび２−Ｄｍ電気泳動ゲルしばし
ば加えられ、質量および電荷の較正標準として働く。信
号レベルは検出されるべきぼんやりした信号を無力化し
ないように螢光作用で、較正点または帯からの信号レベ
ルを一致させるのは困難である。ＣＣＤ検出器の広い分
光有効範囲（４００ｍｍ　−１１００ｍｍ）のため、較
正化学薬品は、それらの色が検出器の前にフィルタを置
くことによって区別されるように、主なサンプル化学薬
品のために用いられる染料の波長と十分異なる波長で螢
光を発する螢光染料で標識を付けられることができる。そのような手順によって、ＣＣＤ検出器の非常に優れた
幾何学的安定度のため、ゲルの電荷および質量軸の正確
な較正が達成されることができる。５、　　　ＣＣＤシステムの優れた幾何学的忠実度（上
の４で論じた）によって、通常の場合相対的に較正され
るよりむしろ絶対的に較正されるデータセットを作るこ
とができる。この手順によって、既に処理されたかつ分
析された他のゲルまたは何組かのゲルと異なるまたはそ
れらと共通の特徴を容易に捜されるゲル／検出器／コン
ピュータ分析システムの処理された出力の基準データバ
ンクを作ることができる。これらの手順のため、ゲルは
、たとえば（血清または器官蛋白質電気泳動では）減少
または膨張または薬を付加することによって、怪我また
は事故（血清蛋白質電気泳動では器官に固有の蛋白質の
検出）によって、（食品加工処理の一部として、食品サ
ンプルでは）汚染によって生じるサンプルの組成の変化
によるゲル点または帯のマツプの差を検出するように作
動されることができる。６、　ディデオキシ（ｄｉｄｅｏｘｙ）（酵素）方法に
よるＤＮＡの順序付けで、４つのタイプのＤＮＡのセグ
メントが生じる（Ａ、Ｃ，ＧおよびＴと呼ばれる）。こ
れらが、螢光染料、たとえばＦＩＴＣ（イソチオシアネ
ートの螢光）で標識が付けられ、かつ４つの成分が電気
泳動ゲルの４つの別個の並行１−Ｄトラックで作動すれ
ば、冷却ＣＣＤ検出器は、螢光モードで検出器の大きい
感度のため、低濃度のセグメントを検出することができ
る。４つのトラックは並行に同時に検出されるため、順
序付けは特に正確に行なわれることができる。ＤＮＡ順序付はゲルを作動する際の重大な問題は、ゲル
の分解能は、帯がサンプル起点から移動した距離ととも
に増加するということであり、そのためゲルの中央の帯
は、（ゲルが頂部から底部まで用いられると仮定すると
）ゲルの底部の帯と同様、半分だけ分解されてもよい。ただＣＣＤでは、移動している帯と同期してＣＣＤをク
ロックしている間２次元検出器は非常に感度がよいとい
う利点を得ることは可能であり、一方ゲルは、実際には
、上の３で説明したドリフト走査モードでと同様に作動
されている。ゲルの端縁の方へ通過するとき（電気的に
、クロックすることによって）帯をトラッキングするよ
うに、ゲルの底部またはより高い分解能端部近くに検出
器を置くため、すべての帯は、同じ高分解能で検出され
ることができる。このため、高い分解能によって、より
正確な順序付けが可能である。時間、努力および費用を
節約するには、１つのゲル（通常側々のゲルは、ゲルの
不完全に分解された頂部部分が正しく分解されることが
できるように用いられる）の流れを必要とする。冷却Ｃ
ＣＤシステムの幾何学的および測光精度のため、最小遅
延および最少の続いて起こるイメージング処理でシーケ
ンス結果を直接前ることが可能である。７、　成る応用では、４００Ａより小さい波長に対する
感度がほとんど全くないことは大きな利点である（たと
えば可視波長範囲に螢光を発生させるためにＵＶ光源を
用いるとき）。他の応用では、広がった青およびＵＶ応
答は、ここで説明する手順の一部として検出されるべき
光が、４０００Ａより小さい波長を持つとき役立つだろ
う。高められた青およびＵＶ感度は、固体マトリックス
のレーザ染料の混合物の薄い（厚さ数ミクロン）層でＣ
ＣＤをコーティングすることによって得られてもよい。染料層は、短い波長の放射線を吸収し、かつそれをスペ
クトルの可視領域で放射し、そこでこの再放射の部分は
ＣＣＤによって検出される。各レーザ染料は、光子を吸
収し、かつそれをほんの数百Ａ大きい波長で再放射し、
そのためレーザ染料のカクテルは、より大きい波長差だ
け入射光子をシフトするのに必要とされる。デバイスの
可視または赤検出用−子効率の５０％に近づく効率が実
際に達成される。用いるのが簡単でなければならない場
合には、高い周囲ライティング条件によって影響を及ぼ
されないレーザ染料を選択するよう気をつけなければな
らない。上で概説したレーザ染料の使用は、非常に広い
波長範囲にわたり高い量子効率を有する検出器を与える
。８、　電気泳動の多くの応用で、重要な蛋白質または重
要なりＮＡ４片は、放射性マーカでラベルを付けられる
。従来、得られるゲルは、それをアンバックし、乾燥し
、かつ写真乳剤と接触して置くことによって像を作られ
る。放射性崩壊は、像を生じるフィルムを黒くする。この発明を具体化する配置で、放射能を光に転換するた
めに、シンチレータが用いられてもよく、かつそれから
、光を検出するために、ＣＣＤが用いられてもよい。こ
れは、ａ）シンチレーション化合物を電気泳動前に担体
、たとえばゲルに混合することによって、またはｂ）ゲ
ルのプレートの１つとしてシンチレーションスクリーン
を用いることによってのいずれかでなされてもよい。ゲ
ルの放射性崩壊の結果、アンバックし、乾燥およびオー
トラジオグラフィーステップなしに、ゲルから可視放射
が生じるだろう。放射された光は、ＣＣＤによって前の
ように集められるだろう。ゲルは、アンバックされなけ
ればならないので、より薄い、より小さい、より速く流
れるゲルが用いられてもよい。そのような手順、特に第１の可能性（ゲルに組込まれる
シンチレータ）は、それほど活性でない放射性崩壊、た
とえばトリチウムの日常の使用を実行可能にし、これは
利点を有する。

【図面の簡単な説明】

図において、１０はゲル、１２．１６および２０は光、
１４は源、１８は紫外線源、２２はフィルタ、２４はレ
ンズ、２６は電荷結合デバイス、２８はコールドボック
ス、３０は電気配線、３２はドライバエレクトロニクス
装置、３４は上位コンピュータシステム、３６はＶＤＵ
コンソール、４０は像表示装置、４２はプリンタである
。手続補正棗（方式）昭和６１年８月１日昭和６１年特許願第１２４６２５号２、発明の名称電気泳動の結果を分析する方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人住　所　イギリス、シー・ビー・４　ドビー・ビイケン
ブリッジハミルトン・ロード、５３氏　名　フレイブ・ダグラス・マツケイ４、代理人住　所　大阪市東区平野町２丁目８番地の１　平野町八
千代ビル昭和６１年７月２６日６、補正の対象明ａｌｌ書の４、図面の簡単な説明の欄７、補正の内容明細書第２２頁第８行と第９行の間に以下の文を挿入す
る。記図面はこの発明の分析方法で用いるための装置の概略図
である。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）２次元電荷結合デバイス（ＣＣＤ）を用いて、分
離された成分から光のパターンを検出する、電気泳動の
結果を分析する方法。
（２）電気泳動によって混合物を分離し、かつ２次元電
荷結合デバイス（ＣＣＤ）を用いて、分離された成分か
ら光のパターンを検出する、混合物の成分を分離しかつ
検出する方法。
（３）電気結合デバイスは、フレーム転送ＣＣＤであり
、かつ光は、電気泳動運動中検出され、電荷パケットは
、電気泳動運動のため、ＣＣＤに当たる光の運動と同じ
方向に、かつそれと同期して、ＣＣＤを介してシフトさ
れる、特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
（４）ＣＣＤは、帯または点が電気泳動によって予め定
められた位置に持ってこられるとき、それらを検出する
ために用いられる、特許請求の範囲第３項記載の方法。
（５）電気泳動による分離が停止され、分離された成分
から光のパターンが検出され、かつそれから電気泳動分
離が開始される、特許請求の範囲第１項または第２項記
載の方法。
（６）電荷結合デバイスは、動作中、実質的に周囲温度
以下まで冷却される、特許請求の範囲第１項ないし第５
項のいずれかに記載の方法。
（７）電荷結合デバイスは、約１２５°Ｋまで冷却され
る、特許請求の範囲第６項記載の方法。
（８）電気泳動を受ける材料は、光のパターンを提供す
るために染色されかつ照明される、特許請求の範囲第１
項ないし第７項のいずれかに記載の方法。
（９）電気泳動を受ける材料は、光のパターンを提供す
るために、螢光材料で印を付けられ、かつ照明される、
特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の
方法。
（１０）電気泳動を受ける材料は、第１波長で電磁放射
線を放射する螢光材料で印を付けられ、かつ較正化学薬
品は、前記材料と混合され、前記較正化学薬品は、第２
波長で電磁放射線を放射する螢光材料で印を付けられ、
かつ電荷結合デバイスによって検出される波長は、前記
較正化学薬品が前記電気泳動を受ける材料から区別され
ることができるように変えられる、特許請求の範囲第９
項記載の方法。
（１１）電気泳動を受ける材料は、放射性材料で印を付
けられ、かつシンチレーション材料は、光のパターンを
提供するために用いられる、特許請求の範囲第１項ない
し第７項のいずれかに記載の方法。
（１２）電荷結合デバイスからの出力は、データバンク
に記憶される以前の電気泳動分離の結果と比較される、
特許請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかに記載
の方法。
（１３）電荷結合デバイスは、一方の波長で電磁放射線
を吸収し、かつ他方の波長で電磁放射線を放射する１つ
以上の材料でコーティングされる、特許請求の範囲第１
項ないし第１２項のいずれかに記載の方法。
（１４）電気泳動は、４つの平行１次元トラック上で行
なわれ、それぞれのＤＮＡセグメント（Ａ、Ｃ、Ｇまた
はＴ）は、各トラックで電気泳動を受ける、特許請求の
範囲第１項ないし第１３項のいずれかに記載の方法。
（１５）電気泳動によって混合物を分離する手段、およ
び分離された成分から光のパターンを検出する２次元電
荷結合デバイス（ＣＣＤ）を備える、分離装置。
（１６）２次元電気泳動が行なわれることができる、特
許請求の範囲第１５項記載の装置。
（１７）電荷結合デバイスはフレーム転送ＣＣＤである
、特許請求の範囲第１５項または第１６項に記載の装置
。
（１８）電荷結合デバイスのための、電気泳動運動のた
めにそれに当たる光の運動と同期して前記電荷結合デバ
イスを駆動するようにされる駆動回路を有する、特許請
求の範囲第１７項記載の装置。
（１９）電荷結合デバイスを実質的に周囲温度以下まで
冷却する手段を備える、特許請求の範囲第１５項ないし
第１８項のいずれかに記載の装置。
（２０）冷却手段は、温度を約１２５°Ｋまで下げるこ
とができる、特許請求の範囲第１９項記載の装置。
（２１）分離手段は、シンチレーション材料が電気泳動
を受ける混合物に、放射性マーカからの放射能に応答し
て光を放射するために与えられるプレートを備える、特
許請求の範囲第１５項ないし第２０項のいずれかに記載
の装置。
（２２）電荷結合デバイスによって検出される光の波長
を変えるための手段が設けられる、特許請求の範囲第１
５項ないし第２１項のいずれかに記載の装置。
（２３）前の電気泳動作動の結果のデータバンク、およ
び電荷結合デバイスの出力を前記データバンクの内容と
比較する電子手段を含む、特許請求の範囲第１５項ない
し第２２項のいずれかに記載の装置。
（２４）電荷結合デバイスは、一方の波長の電磁放射線
を吸収し、かつ他方の波長の電磁放射線を放射する１つ
以上の材料でコーティングされる、特許請求の範囲第１
５項ないし第２３項のいずれかに記載の装置。