JP2838117B2 - 電気泳動の結果を分析する方法及び装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、電気泳動に関するものであり、かつ電気
泳動の結果を分析する方法、混合物の成分を分離しかつ
検出する方法、および分離装置に関するものである。 発明の背景 電気泳動は、たとえば分析または浄化のために、分子
または他の単位が電界を印加することによって分離され
る分離技術である。このため、分子単位等の単位の差動
的移動が生じる。各単位の移動速度は、その変化および
（その大きさおよび形状と関連する）摩擦抵抗に依存し
ている。この技術は、たとえばタンパク質またはDNA
（デオキシリボ核酸）片の混合物を分離するために用い
られる。その混合物は、典型的には、澱粉またはポリア
クリルアミドの適当な担体材料、たとえば多孔性ゲル上
に位置決められる。電界が印加されて差動的に移動する
結果、１次元アレイの帯または２次元アレイの点のいず
れかが生じる。生じる帯または点は、次に掲げるものを
含む多くの技術によって検出される。 1.帯または点を不透明および可視性にする適当な染料で
染色することによって。 2.適当な光源によって誘発されるときに光を放射する蛍
光マーカまたはラベルを用いることによって。 3.たとえばオートラジオグラフィーとして公知の技術を
用いて、放射性マーカまたはラベルを用いることによっ
て。 これらの技術による電気泳動の結果の分析には、重大
な限界がある。染色された染料を透過により検査する
と、最もぼんやりした点または帯は、明るい背景に対し
て検出されなければならなず、一方、最も暗い点または
帯は、ほとんど光を透過しないので、従来の検出器、た
とえばテレビカメラまたは写真フィルムで正確に測定す
るのが不可能であるかもしれない。電気泳動マーカ染料
は、一般に、最も低い点または帯レベルの検出を困難に
する光レベルの光しか生じない。オートラジオグラフィ
ーは、放射性材料の取扱いに関するすべての問題、さら
に不完全な分解能、および可視化のため日および週のオ
ーダの非常に長い時間を必要とする。 本願発明 この発明の１つの局面に従って、２次元電荷結合デバ
イス（CCD）を用いて、分離された成分から光のパター
ンを検出する、電気泳動の結果を分析する方法が提供さ
れる。 他の局面では、電気泳動によって混合物を分離し、か
つ２次元電荷結合デバイス（CCD）を用いて、分離され
た成分から光のパターンを検出する、混合物の成分を分
離しかつ検出する方法を提供する。 この発明はまた他の局面では、電気泳動によって混合
物を分離する手段、および分離された成分から光のパタ
ーンを検出する２次元電荷結合デバイス（CCD）を備え
る分離装置を提供する。 この発明は、１次元および２次元電気泳動のいずれに
も応用可能である。生じる帯または点は、透過された光
で検査するために染色されるか、または、放射光線を検
査するために蛍光マーカがラベルをつけられるかのいず
れかである。代わりに、以下により詳細に説明するが、
CCDによって検出するために、放射性マーカから光に変
換するシンチレータが用いられてもよい。 冷却CCD検出器システムを用いるのが好ましい。とい
うのは、冷却は熱暗電流を抑制することによって感度お
よびダイナミックレンジを改良するからである。この発
明で用いるのに適した典型的なシステムは、アストロム
ド社（Astromed Limited）によって生産されるCCD2000
イメージングシステムである。 この発明では、電気泳動による分離が停止され、分離
している成分から光のパターンが検出され、かつ電気泳
動分離が再び始められる。 さらに他の可能性として、電気泳動による分離中、移
動している成分から光を検出するために、フレーム転送
CCDが用いられることができる。これは、以下により詳
細に説明するが、成分の運動と同期して、CCDを横切っ
て電荷分布を転送することによって達成される。この場
合、成分は、分離プロセスを開始する前に、すなわちゲ
ルを作動する前に、蛍光ラベルまたはシンチレータおよ
び放射性ラベルを加えることによって可視代される。 電荷結合デバイスは、一方の波長（たとえば可視光よ
り短い）の電磁放射線を吸収し、かつ他方の波長（たと
えば可視光のような）の電磁放射線を放射する１つ以上
の材料でコーティングされてもよく、それによって電荷
結合デバイスが敏感でない波長の電磁放射線は間接的に
検出されることができる。 この発明によれば、電気泳動の結果の分析は、従来の
技術と比べて著しくスピードアップされることができ、
得られる精度を高め、かつ用いるサンプル量はより小さ
くてよい。この発明はまた、取扱われることができる１
つのアレイ内に含まれる一体化された点または帯の強さ
の範囲を非常に増大させ、かつ各分離された点または帯
のタンパク質の量を遥に正確に数量化することができ
る。 この発明に従って、装置の１つの好ましい実施例を、
添付の図面、すなわち発明の分析方法で用いるための装
置の概略図である１つの図面に関連して、例として説明
する。 図面の詳細な説明 図解された装置は、ゲル10を備える。このゲル10に
は、サンプル混合物が与えられる。ゲル10はこの混合物
の電気泳動分離によって生じる１次元または２次元アレ
イの帯または点を持つ。その点または帯は、適当な源14
からゲルを介して透過される光12によって検査するため
に染色されているか、または紫外線源18からより短い波
長の光16によって誘発されるときに光を放射する蛍光マ
ーカでラベルをつけられているかのいずれかである。代
わりに、放射能を放射性マーカから光に変換するために
シンチレータが用いられてもよい。 結果として生じる透過されたまたは放射された光線20
は、アストロムド社によって生産されるCCD2000イメー
ジングシステムを備える、冷却電荷結合デバイス検出器
システムによって検出される。蛍光マーカを用いる実施
例では、光は、まず、フィルタ22を介して通過し、より
短い波長の投光照明に対して放射された光を選択する。
透過または放射された光は、それから、液体窒素または
スターリングサイクル、または他の機械または電気冷却
器で冷却されるコールドボックス28内に含まれる冷却固
体電荷結合デバイス検出器26（EEV社によって作られるP
8600シリーズCCD）上に、レンズ24によって像を作られ
る。 CCD26は、電気配線30によってドライバエレクトロニ
クス装置32に接続される。ドライバエレクトロニクス装
置32は、必要な駆動波長およびバイアス電圧をCCDに提
供し、かつまたシステム全体の読出ノイズを最小にする
ためにCCDによって出力される信号を処理する。このド
ライバエレクトロニクス装置32は、VDUコンソール36を
介してシステムをオペレータ制御することができる上位
コンピュータシステム35によって駆動されかつ制御さ
れ、データは38で表わされるように、たとえばディスク
駆動機構および磁気テープ上で達成され、かつゲルの像
の表示は、像表示装置40によって達成される。中央コン
ピュータ34はまた、ゲル上の検出された点または帯の分
布を、その点または帯の詳細な特性、たとえば位置、形
状、大きさ、配向および強さとともに定めることができ
るソフトウェアを含む。このように得られたデータは、
関連するプリンタ42上で出力されてもよく、また記憶す
るために、または他のゲルについて得られる点または帯
の分布と比較することができるように、ディスクまたは
磁気テープ上で達成されてもよい。 上で説明したシステムは、次のような多くの利点およ
び特性を有する。 1.冷却CCDシステムは、２次元イメージングシステムの5
0,000:1を超える最も広いダイナミックレンジを有す
る。転送モードでは、このシステムのダイナミックレン
ジが高いため、たとえばテレビカメラのようなダイナミ
ックレンジの低い検出器（典型的には64:1から250:1ま
でのダイナミックレンジ）で可能であるよりも遥にぼん
やりしている点および帯をも検出することができ、一
方、非常に明るい点および帯を、なおも正確に測定する
ことができる。 2.読出ノイズが非常に低く（典型的には６電子rms）か
つ量子効率が高い（40％のピークより大きい）ため、他
の方法で検出可能であるよりも遥にぼんやりしている点
または帯を蛍光モードで検出することができる。これ
は、低い動作温度（125゜Kまで下がる）で暗い信号また
は読出ノイズを加えることなく、何分も何時間もゲルか
ら信号を積分することが可能であるからである。 3.得られるゲル上の分解能は、次のように高められても
よい。場面がフレーム転送CCD検出器上に像を作られる
とき、それにあたる配向に正確に従う２次元電荷分布が
作られる。通常、蓄積された電荷分布は、デバイスを横
切って２次元電荷分布を移動させ、かつそれを同時に１
行分読出すことによって、露光の終わりに読出される。
しかしながら、露光全体を通じて、２−Ｄ電荷分布がデ
バイスを横切って転送され、かつCCDにあたる光は既に
蓄積された電荷と同期してデバイスを横切って移動され
れば、運動の方向に任意の長さの像を得ることが可能で
ある。信号が列に沿って移動するとき、列の各画素は、
また信号に寄与し、そのため列の異なる画素の検出感度
は出力の各画素の信号で平均される。したがって、CCD
の１つの列からの出力の画素は、検出器の観点から完全
に均一であり、かつそれゆえにデータをフィールディン
グする平面の必要を減じる出力の列を与える。他の検出
の付加的な分解能は、横向きにCCDを段階状に並べ、か
つ１組の隣接ストリップ走査を与えるためにその走査を
繰返すことによって得られてもよい。 モニタされている光源の運動と同期する、CCDを横切
る電荷分布の温度（電気泳動運動）は、前記コンピュー
タおよびドライバとエレクトロニクスによって制御され
る。 4.較正化学薬品（典型的にはタンパク質またはDNAセグ
メント）は、１−Ｄおよび２−Ｄ電気泳動ゲルにしばし
ば加えられ、質量および電荷の較正標準として働く。信
号レベルは検出されるべきぼんやりした信号を無力化し
ないように蛍光作用で、較正点または帯からの信号レベ
ルを一致させるのは困難である。CCD検出器の広い分光
有効範囲（400mm−1100mm）のため、較正化学薬品は、
それらの色が検出器の前にフィルタを置くことによって
区別されるように、主なサンプル化学薬品のために用い
られる染料の波長と十分異なる波長で蛍光を発する蛍光
染料で標識をつけられることができる。そのような手順
によって、CCD検出器の非常に優れた幾何学的安定度の
ため、ゲルの電荷および質量軸の正確な較正が達成され
ることができる。 5.CCDシステムの優れた幾何学的忠実度（上の４で論じ
た）によって、通常の場合相対的に較正されるよりむし
ろ絶対的に較正されるデータセットを作ることができ
る。この手順によって、既に処理されたかつ分析された
他のゲルまたは何組かのゲルと異なるまたはそれらと共
通の特徴を容易に捜されるゲル／検出器／コンピュータ
分析システムの処理された出力の基準データバンクを作
ることができる。これらの手順のため、たとえば減少ま
たは膨張または薬を付加することによって（血清または
器官タンパク質電気泳動では）、怪我または事故によっ
て（血清タンパク質電気泳動では器官に固有のタンパク
質の検出）、（食品加工処理の一部として、食品サンプ
ルでは）汚染などによって生じるサンプルの組成の変化
によるゲル点または帯のマップの差を検出するようにゲ
ルが作動されることができる。 6.ディデオキシ（dideoxy）（酵素）方法によるDNAの順
序付で、４つのタイプのDNAセグメントが生じる（A,C,G
およびＴと呼ばれる）。これらが、蛍光染料、たとえば
FITC（イソチオシアネートの蛍光）で標識がつけられ、
かつ４つの成分が電気泳動ゲルの４つの別個の並行１−
Ｄトラックで作動すれば、冷却CCD検出器は、蛍光モー
ドで検出器の大きい感度のため、低濃度のセグメントを
検出することができる。４つのトラックは並行に同時に
検出されるため、順序付または特に正確に行なわれるこ
とができる。 DNA順次付ゲルを作動する際の重大な問題は、ゲルの
分解能は、帯がサンプル起点から移動した距離とともに
増加するということであり、そのためゲルの中央の帯
は、（ゲルが頂部から底部まで用いられると仮定する
と）ゲルの底部の帯と同様、半分だけ分解される。ただ
CCDでは、移動している帯と同期してCCDをクロックして
いる間２次元検出器は非常に感度がよいという利点を得
ることが可能であり、一方、ゲルは実際には、上の３で
説明したドリフト走査モードの場合と同様に作動されて
いる。ゲルの端縁の方へ通過するとき（電気的に、クロ
ックすることによって）帯をトラッキングするように、
ゲルの底部またはより高い分解能端部近くに検出器を置
くため、すべての帯は、同じ高分解能で検出されること
ができる。このため、高い分解能によって、より正確な
順序付が可能である。時間、努力および費用を節約する
には、１つのゲル（通常個々のゲルは、ゲルの不完全に
分解された頂部部分が正しく分解されることができるよ
うに用いられる）の流れを必要とする。冷却CCDシステ
ムは幾何学的および測光精度のため、最小遅延および続
いて起こる最小のイメージング処理でシーケンス結果を
直接得ることが可能である。 7.ある応用では、400Åより小さい波長に対する感度が
ほとんど全くないことは大きな利点である（可視波長範
囲に蛍光を発生させるためにUV光源を用いるとき）。他
の応用では、広がった青およびUV応答は、ここで説明す
る手順の一部として検出されるべき光が、4000Åより小
さい波長を持つとき役立つだろう。高められた青および
UV感度は、個体マトリックスのレーザ染料の混合物の薄
い（厚さ数ミクロン）層でCCDをコーティングすること
によって得られてもよい。染料層は、短い波長の放射線
を吸収し、かつそれをスペクトルの可視領域で放射し、
そこでこの再放射の部分はCCDによって検出される。各
レーザ染料は、光子を吸収し、かつそれをほんの数百Å
大きい波長で再放射し、そのためレーザ染料のカクテル
は、より大きい波長差だけ入射光子をシフトするのに必
要とされる。デバイスの可視または赤検出用量子効率の
50％に近づく効率が実際に達成される。用いるのが簡単
でなければならない場合には、高い周囲ライティング条
件によって影響を及ぼされないレーザ染料を選択するよ
う気をつけなければならない。上で説明したレーザ染料
の使用は、非常に広い波長範囲にわたり高い量子効率を
有する検出器を与える。 8.電気泳動の多くの応用で、重要なタンパク質または重
要なDNA片は、放射性マーカでラベルをつけられる。従
来、得られるゲルは、それをアンパックし、乾燥し、か
つ写真乳剤と接触しておくことによって像を作られる。
放射性崩壊により、像を生じるフィルムが黒くなる。 この発明を具体化する配置で、放射能に光を転換する
ために、シンチレータが用いられてもよく、かつそれか
ら、介を検出するために、CCDが用いられてもよい。こ
れは、ａ）シンチレーション化合物を電気泳動前に担
体、たとえばゲルに混合することによって、またはｂ）
ゲルのプレートの１つとしてシンチレーションスクリー
ンを用いることによってのいずれかでなされてもよい。
ゲルの放射性崩壊の結果、アンパックステップなしに、
かつ乾燥およびオートラジオグラフィーステップなし
に、ゲルから可視放射が生じるであろう。放射された光
は、CCDによって前のように集められるであろう。ゲル
は、アンパックされる必要はないので、より薄い、より
小さい、より速く流れるゲルが用いられる。 そのような手順、特に第１の可能性（ゲルに組込まれ
るシンチレータ）は、それほど活性でない放射性崩壊、
たとえばトリチウムの日常の使用を実行可能にしこれは
利点となる。

【図面の簡単な説明】 図面は、本願発明の一実施例の構成を示すブロック図で
ある。 図において、10はゲル、12,16および20は光、14は光
源、18は紫外線源、22はフィルタ、24はレンズ、26は電
荷結合デバイス、28はコールドボックス、30は電気配
線、32はドライバエレクトロニクス装置、34は上位コン
ピュータシステム、36はVDUコンソール、40は同表示装
置、42はプリンタである。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−80739（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−105051（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−23852（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−61633（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−58974（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−73612（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−122945（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−228757（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−211384（ＪＰ，Ａ) 実公 昭54−7820（ＪＰ，Ｙ１) 実公 昭59−22497（ＪＰ，Ｙ１)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．蛍光的にマークされた試料を電気泳動を用いて分析
   する方法であって、 前記試料が付加された電気泳動ゲルを作動して電気泳動
   を行ない、蛍光的にマークされた異なる成分の差動的移
   動を生じさせ、 前記ゲルを光源で照射してマークされた成分を可視的に
   し、 前記ゲルを作動している間、または前記ゲルを作動した
   後のいずれかにおいて、感光性電荷結合デバイス（CC
   D）によってマークされた成分から出る光のパターンを
   検出するステップを含み、前記電荷結合デバイスは２次
   元検出器アレイを有しかつ検出の間冷却されている、試
   料分析方法。 ２．電荷結合デバイスはフレーム転送CCDである、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３．CCDは、帯または点が電気泳動によって予め定めら
   れた位置に持って来られるとき光パターンに含まれるそ
   れらの帯または点を検出するために用いられる、特許請
   求の範囲第２項に記載の方法。 ４．ゲルを作動して電気泳動による分離を行なうのが停
   止され、分離された成分から光のパターンが検出され、
   かつゲルの作動が再開される、特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ５．電荷結合デバイスは動作中周囲の温度よりも実質的
   に低い温度に冷却される、特許請求の範囲第１項ないし
   第４項のいずれかに記載の方法。 ６．電荷結合デバイスは約125゜Kまで冷却される、特許
   請求の範囲第５項記載の方法。 ７．試料は、第１の波長で電磁放射線を放射する蛍光材
   料でマークされ、かつ較正化学薬品が前記材料と混合さ
   れ、前記較正化学薬品は、第２の波長で電磁放射線を放
   射する蛍光材料でマークされ、かつ電荷結合デバイスに
   より検出される波長は、前記電気泳動を受ける材料から
   区別されることができるように変えられる、特許請求の
   範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の方法。 ８．電荷結合デバイスからの出力は、データバンクに記
   憶される以前の電気泳動分離の結果と比較される、特許
   請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の方
   法。 ９．前記電荷結合デバイスは、一方の波長で電磁放射線
   を吸収しかつ他方の波長で電磁放射線を放射する１つ以
   上の材料でコーティングされる、特許請求の範囲第１項
   ないし第８項のいずれかに記載の方法。 １０．電気泳動は４つの平行な１次元トラック上で行な
   われ、それぞれのDNAセグメント（A,C,GまたはＴ）は、
   各トラックで電気泳動を受ける、特許請求の範囲第１項
   ないし第９項のいずれかに記載の方法。 １１．蛍光マークが付された試料を電気泳動により分析
   するための装置であって、 蛍光マークが付された試料が付加される電気泳動ゲルを
   照射する照射源と、 前記電気泳動ゲルを作動して電気泳動を行ない、照射源
   によるゲルの照射による光パターンを生じる、試料の異
   なる成分の差動的な移動を生じさせるのを制御する手段
   と、 前記ゲルを作動している間、または前記ゲルを作動した
   後のいずれかにおいて光のパターンを検出するための手
   段とを備え、前記検出手段は２次元検出器アレイを有す
   る感光性電荷結合デバイス（CCD）と、検出の間CCDを冷
   却するための手段とを含む、分析装置。 １２．２次元電気泳動が行なわれることができる、特許
   請求の範囲第11項に記載の装置。 １３．電気結合デバイスはフレーム転送CCDである、特
   許請求の範囲第11項または第12項に記載の装置。 １４．冷却手段は温度を約125゜Kまで下げることができ
   る、特許請求の範囲第11項ないし第13項のいずれかに記
   載の装置。 １５．電気結合デバイスによって検出される光の波長を
   変えるための手段が設けられる、特許請求の範囲第12項
   ないし第14項のいずれかに記載の装置。 １６．前の電気泳動作動の結果のデータバンク、および
   電荷結合デバイスの出力をデータバンクの内容と比較す
   るための電子手段とを含む、特許請求の範囲第11項ない
   し第15項のいずれかに記載の装置。 １７．前記電荷結合デバイスは、一方の波長の電磁放射
   線を吸収し、かつ他方の波長の電磁放射線を放射する１
   つ以上の材料でコーティングされる、特許請求の範囲第
   11項ないし第16項のいずれかに記載の装置。