JPH01165937A - 蛍光分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は蛍光分析方法に係り、特に蛍光直接測光方式を
採用した自動分析装置により蛍光分析を行なうに好適な
蛍光分析方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、免疫測定などを行なう自動分析装置は、測定液の
吸光度を測定する方式のものが主体であった。しかしな
がら近年、測定液中に含まれる微量成分を分析する要求
が高まっており、高感度分析が可能であるといわれてい
る蛍光測光が注目されている。

この蛍光測光方式を自動分析装置に採用する手段として
は、反応液を装置に固定されたフローセルに吸い上げて
測光するフローセル方式が最も簡便である。しかしなが
らこのフローセル方式によると、複数種類のサンプルを
順次フローセルに供給排出をくりかえして測光を行なう
ため、サンプル間のキャリオーバ率が高くなり、このキ
ャリオーバ率を低くするためには多量のサンプル、また
は洗浄用水で洗う必要がある。さらに、フローセルへの
反応液吸引機構が必要となり、コスト高になることが予
想される。しかもフローセルの外周は臨床分析に必要な
高精度の温度制御が困難であるため、分析結果のデータ
精度が低下するという問題があった。

これらの問題を解決する手段として蛍光直接測光方式が
ある。この方式はサンプルをそれぞれ異なるキュベツト
に充填して測光するものである。

また他の蛍光直接測光方式としては、蛍光偏光を測定す
るものや、サンプルの励起光入射液面と同じ液面から蛍
光をとり出す、いわゆるＩ−ツブ／１−ツブ測光方式な
どが知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記キュベラ１〜を用いて測光する方式
では、多数の検体を連続分析する場合にキュベツトを洗
浄して繰り返して使用することが多い。このため、使用
回数が増すに従ってキュベツトに傷が生じる。またキュ
ベツト供給段階でも全てのキュベツトを完全に無傷で供
給することは難しい。そして、これらのキュベツトに生
じた傷は、蛍光強度に大きく影響する。さらに多数のキ
ュベツトを用いて連続測定する場合には、測定時のセル
に対して光源は一定位置、一定角度で照射するように配
設されることが要求される。しかし、キュベツトまたは
、光源が移動する自動分析装置においては、キュベラ１
〜と光源を常に一定の位置関係に置くことは難しく、キ
ュベツトによっては光源に対して僅かにずれが生ずるこ
とが多い。この両者の位置ずれは蛍光強度に影響を与え
る。また、キュベツト成形時のキュベツト表面のゆがみ
や肉厚の僅かな違いも測定結果に影響する。

また前述した蛍光偏光を測定する方式の場合には、測定
結果としては蛍光強度の比で計算されることになるため
、上記のキュベツトに起因する問題は少ない。しかしな
がら、蛍光偏光方式を原理として分析することのできる
測定対象成分は、分子量的にみて低分子に限られており
、臨床分析において要求の大きい大分子成分の測定には
適さない。また、前述したトップ／トップ測光方式では
、データの精度を高めるためにキュベラ１−を動かしな
がら測定しているために、測定液面にゆらぎが生じる結
果となる。この液面のゆらぎによってデータの精度が実
際上低下する問題があり、さらに従来の自動分析機への
適用が困難であるという問題もあった。すなわち、光が
キュベツトを横切るタイプの測光方式で通常の蛍光分析
を行なう従来の蛍光直接測光方法では、前述したような
問題点があるため、自動分析装置への適用が困難であっ
た。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、自動分
析装置を用いて高い測定精度をもって蛍光直接測光方式
により蛍光分析を行なうことのできる蛍光分析方法を提
供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は上記目的を達成するために、測定対象物質を蛍
光直接測光式自動分析装置により分析を行なう蛍光分析
方法において、前記測定補助物質を同時に分析して、こ
の分析結果に基いて前記測定対象物質の分析結果を補正
するようにしたものである。

〔作用〕

上記の方法によると、測定対象物質とは異なる測定補助
物質の一定量を測定液中に含ませて分析し、この測定結
果をもとに測定対象物質の測定値を補正するようにした
ので、補正のための余分な測定時間やキュベツトの洗浄
が不要となる。このとき測定補助物質は、測定対象物質
の濃度の相違によって蛍光強度が影響を受けずに一定値
を示すように、測定補助物質及びその測定波長を選択す
る。

今、例えば測定対象物質をＡ、測定補助物質をＢとし、
傷などがない理想的なキュベラ１へに入れられた状態に
おけるＡの蛍光強度をＦｌ　、Ｂの蛍光強度をＦ２とす
る。また別の通常使用しているキュベツトで測定した前
記Ａ及びＢの蛍光強度をそれぞれＦ８及びＦ４とする。

このとき両方のキュベラ１〜には等濃度、等量のＢが存
在しているのであるから、Ｆ２：Ｆ４であるはずである
。このためＦ８はキュベラ１−による誤差を補正した後
には、Ｆ３ＸＦ２／Ｆ４　どなる。このように、１個の
キュベツトについてＡと同時にＢの蛍光強度を測定する
ことにより、キュベツト差を補正して精度の高い蛍光直
接測光が可能となる。

〔実施例〕

本発明に基づく望ましい実施例では、測定対象物質と共
に、測定液中に一定量含まれる測定対象物質とは異なる
物質を同時に測定して、後者の測定結果をもとにして前
者の測定結果を補正する。

測定対象物質と同時に測定される物質としては、あらか
じめ測定液中に含まれていたものでもよいし、分析のた
めに加えた試薬成分であってもよい。

実施例３で例示したように、補正のための成分が反応の
基質である場合には、反応生成物の蛍光強度を、反応成
分である基質の蛍光強度で補正できるので、効果が大き
い。

また、補正の目的で測定液中に加えた物質でもよい。い
ずれの場合でも、適当な励起波長により励起されて蛍光
を発するか、あるいは適当な波長に吸収されることが必
要である。

以下、本発明に係る蛍光分析方法の一実施例を説明する
。

まず、異なる２０個のキュベツトに、それぞれ２ｍＱず
つ１０−７ＭのＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）溶液を分注し、蛍光
強度を測定した。励起は４８０ｎｍ、蛍光は５３０ｎｍ
にて測定した。また傷やゆがみのないキュベツトを蛍光
光度計のキュベツトホルダに固定して、前記と同一のサ
ンプルをくり返して測定した。この測定結果を第１表と
第２表に示す。

第１表は傷やゆがみのないキュベラ１へでの測定値であ
り、 第　　　１　　　表 第２表は異なるキュベツトでの測定値である。

第　　　２　　　表 上記各測定には、励起光及び蛍光がそれぞれキュベツト
壁を通過し、励起光入射方向と蛍光出射方向とが垂直方
向の普及型の蛍光光度計を使用した。上記各表から明白
のように、キュベツトのちがいにより測定結果は大きく
ばらついており、蛍光直接測光のためにはキュベツト差
の補正が必要であることがわかる。

次に測定対象物質の薬物テオフィリンを含むサンプル５
０μＱと、これに対する抗体液５００μα、酵素液（β
−ガラクトシダーゼ）５００μＱと、基質誘導体（ガラ
クトース）で標識したウンベリフェロン・テオフィリン
結合体５０μα及びＢｉｅｉｎｅ緩衝液（ｐＨ８，５）
４００μＱとを３７℃で２０分間反応させた。このサン
プル中のテオフィリンと基質誘導体標識ウンベリフェロ
ン・テオフィリン結合体が競合して抗体と反応する。

そして抗体に結合できなかった基質誘導体標識ウンベリ
フェロン・テオフィリン結合体が、酵素（β−ガラクト
シターゼ」の触媒作用により加水分解した結果生成する
蛍光物質の蛍光強度を測定した。テオフィリン濃度は、
あらかじめ作成した標準曲線にあてはめて求めた。測定
には、励起波長４、　ＯＯｎ　ｍ、蛍光波長４５０ｎｍ
を用いた。このときの蛍光強度の測定再現性を下記第３
表に示す。

第　　　３　　　表 また、反応時に反応には直接関与しないが、テキサスレ
ッド（１ｍ　ｇ　／　５　ｍ　Ｑ溶液）を１０μρずつ
反応液に加え、前記と同様に３７℃で２０分間反応させ
た。測定にはテオフィリン濃度測定のために励起４００
ｎｍ、蛍光４５０ｎｍで第１の測光を行ない。つづいて
同じ反応液に対して励起５９０ｎｍ、蛍光６３０ｎｍで
第２の測光を行なった。このとき第２の結果の１つを基
にして第１の結果を補正して、測定の再現性を求めた。

その結果を下記第４表に示す。

第　　　４　　　表 以上の結果から、テ″キサスレッド測定値を利用してキ
ュベツト差を補正することにより、測定回現性が著しく
向上したことがわかる。

次に測定対象物質のα−フェトプロティン（ＡＦＰ）を
含むサンプ＃５０μｆｌと、抗ＡＦＰ抗体を結合させた
ガラスピーズと、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）
標識抗ＡＦＰ抗体液５０ｕＱと、１０　ｍ　Ｍ　トリス
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，４）１００μＱを加えて３７°
Ｃで２０分間反応させた。

この後ガラスピーズを十分に緩衝液で洗浄した。

このガラスピーズをキュベツトに移して、これに測定補
助物質であり、基質でもあるウンベリフェロンリン酸（
ＭＵＰ）１０ｍＭ５０ｔｔｆｌと、１．５Ｍジェタノー
ルアミン緩衝液（ｐＨ９，０）を加えて３７°Ｃで２０
分間反応させた。測定にはＭＵＰの酵素反応の結果生成
するウンベリフェロン（ＭＵＢ）のために、励起３７５
ｎｍ、蛍光４５０ｎｍを用いた。測定対象のＭＵＢ濃度
は、サンプル中に含まれるＡＦＰｐ度に応じて変化する
ため、ＭＵＢの蛍光強度をもとにしてサンプル中のＡＦ
Ｐの定量が可能である。これに対しＭＵＰは基質である
ため、全反応に対して常に一定量ずつ加えられ、しかも
基質大過剰域において酵素反応を進行させるうえに、生
成するＭＵＢは濃度としてみるとＭＵＰの３桁下の微量
である。このため酵素反応の進行度合の程度によらず、
反応液中のＭＵＰ量は一定であるとみなすことができる
。

Ｍ、ＵＰは蛍光性基質であり、生成物ＭＵＢとは異なる
蛍光スペクトルを示す。また励起及び蛍光の測光波長を
適当に選択することにより、反応液中のＭＵＢ濃度に左
右されずにＭＵＰ測定値が一定値を示す。このためこの
ＭＵＰ測定値を補正のために使用して、ＭＵＢ測光の再
現性測定を行なった。この測定補助物質としてのＭＵＰ
の測定のために、励起３５６ｎｍ、蛍光４１０ｎｍを用
いた。この結果を下記第５表に示す。

第　　　５　　　表 上記のように、ＭＵＰの測定値をもとにしてＭＵＢを補
正すると、著しく測定再現性が向」ニすることがわかる
。第１図にＭＵＢａ度が異なる場合のＭＵＰの蛍光スペ
クトルを示す。

〔発明の効果〕

上述したように本発明によれば、蛍光直接測光式自動分
析装置により測定対象物質の蛍光分析を行なうときに、
測定補助物質を同時に分析して、その分析結果に基づい
て、前記測定対象物の分析結果を補正するようにしたの
で、キュベラｊ・差を補正することができ、自動分析装
置を用いて高い精度をもって容易に蛍光分析を行なうこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭＵＰの蛍光スペクトルを示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、測定対象物質を蛍光直接測光式自動分析装置により
   分析を行なう蛍光分析方法において、前記測定対象物質
   とは異なる測定補助物質を同時に分析して、この分析結
   果に基づいて前記測定対象物質の分析結果を補正するこ
   とを特徴とする蛍光分析方法。 ２、前記測定対象物質と、前記測定補助物質とが測定液
   中にあらかじめ混在していることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の蛍光分析方法。 ３、前記測定補助物質は、前記測定対象物質の分析時に
   該測定対象物質を含む測定液中に加えられることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の蛍光分析方法。 ４、前記測定補助物質は、所定の励起波長により励起さ
   れて蛍光を発する物質であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項記載の蛍光分
   析方法。 ５、前記測定補助物質は、励起されて発した所定の波長
   の蛍光を吸収する物質であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項記載の蛍光分
   析方法。