FI88340C - Indirekt kolorimetrisk bestaemning av en analyt i ett prov med hjaelp av ljussignalers foerhaollande - Google Patents

Description

1 38340

Analyytin epäsuora kolorimetrinen määritys näytteestä valosignaalien suhteen avulla Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää 5 analyytin määrittämiseksi näytteestä ja tarkemmin ottaen se koskee entsyymi-immunomääritystä käyttävää menetelmää analyytin konsentraation mittaamiseksi näytteestä epäsuoralla kolorimetrialla.

Menetelmät analyyttien määrittämiseksi kolorimet-10 risesti ovat yleisiä ja tunnettuja. Antigeenin (analyytin) määrittämiseksi kolorimetrisesti testinäytteestä käytetään erityisesti entsyymi-immunomääritystä (EIA) ja entsyymiin sidotun immunosorbentin määritystä (ELISA). Näissä entsyymi-immunomääritysmenetelmissä vasta-aineet, 15 jotka ovat spesifisiä testattavalle antigeenille eli analyytille, sidotaan kiintofaasiin, jona on tavallisesti kirkas tai läpinäkyvä muoviputki. Monissa, joskaan ei kaikissa näissä entsyymi-immunomäärityksissä kiintofaa-sivasta-aineesta, antigeenistä ja entsyymillä leimatusta 20 vasta-aineesta syntyy sandwich-rakenne siten, että kiintof aasiin sitoutuneen, entsyymillä leimatun vasta-aineen määrä on suoraan verrannollinen antigeenin konsentratioon näytteessä. Reagoimatta jääneiden reagenssien ylimäärä poistetaan normaalisti putkesta pesemällä ja putkeen li-25 sätään substraatti reaktion toteuttamiseksi.

Sandwich-rakenteen muodostamisen lisäksi, joka syntyy tyypillisesti proteiiniantigeeneillä, on mahdollista suorittaa kilpailuun perustuvia määrityksiä. Rajoittava määrä vasta-ainetta siirretään kiintofaasille ja 30 sekä näyte että entsyymillä leimattu hapteeni inkuboidaan samanaikaisesti. Jos näyte ei sisällä analyyttiä, entsyymillä leimattu hapteeni sitoutuu maksimaalisesti kiinto-faasiin. Näytteen sisältämän analyytin määrän kasvaessa, analyytti kilpailee entsyymillä leimatun hapteenin kanssa ] j 35 sitoutumisesta kiintofaasiin siten, että entsyymillä lei- 2 88340 matun hapteenin kvantitatiivinen sitoutuminen on kääntäen verrannollinen analyytin konsentratioon. Kilpailuun perustuvia määrityksiä voidaan suorittaa sekä hapteeneil-la että proteiinianalyyteillä, mutta vain proteiiniana-5 lyytit sopivat sandwich-tyyppiseen määritykseen.

Kolorimetrisissä määritystekniikoissa substraattina voi olla kromogeeninen aine, joka reagoi entsyymiin siten, että kromogeeninen aine aktivoituu. Tämän tuloksena putkessa olevassa nestemäisessä liuoksessa syntyy mää-10 rittämiseen riittävä väri. Tämän tapaisiin määrityksiin liittyy tavallisesti putkessa muodostuneen värin spektro-fotometrinen mittaus. Jos määritettävät aineet ovat fluo-rikromeja, määrityksessä voidaan käyttää fluoresenssimik-roskooppia ja fluorimetriä. Entsyymi-immunomääritys, jos-15 sa antigeeni määritetään kolorimetrisesti ja kromogeeninä käytetään tetrametyylibentsidiiniä (TMB), kuvataan US-pa-tentissa nro 4 503 143.

Käytettäessä kolorimetriä analyytin määrittämiseksi kolorimetrisesti näytteestä, saattavat lukuisat teki-20 jät vaikuttaa kromogeeniseen reaktioon liittyvän valon määrittämiseen. Esim. valonlähteenä, joka lähettää valonsäteen testinäytettä sisältävään putkeen, on usein lamppu, esim. volframilamppu, jollainen kuvataan US-patentis-sa nro 4 516 856. Lampun tehon vaihtelut eivät ole harvi-25 naisia ja tällainen vaihtelu voi vaikuttaa spektrofoto-metrin määrittämään valoon tai valoon, joka suunnataan valomonistimeen fluoresenssisäteilyn mittaamiseksi. Testinäytettä sisältävän putken asento voi vaihdella määrityksestä toiseen ja tämäkin vaikuttaa testituloksiin.

30 Muut tekijät kuten valon kulkeman matkan pituus ja putken optinen laatu voivat aiheuttaa eroja testistä toiseen ja vaikuttaa tuloksiin. Uskotaan, että tekniikka, joka kolorimetrisissä määritysmenetelmissä korjaa tai estää yllä mainitut muuttujat, on erittäin toivottava parantamaan 35 näiden testimenettelyjen tarkkuutta, toistettavuutta ja 3 38340 luotettavuutta.

Fluorimetrisiin määrityksiin liittyviä parannuksia on kuvattu US-patentissa nro 4 495 293. Mainitun patentin kohteena ovat kuitenkin parannukset emittoituneen valon 5 fluoresenssivoimakkuudessa, joka on verrannollinen ligan- din konsentraatioon. Toinen tekniikka makromolekyylien määrittämiseksi immunonefelometrisesti on kuvattu DeGrel-lan ja työryhmän artikkelissa MA Nephelometry System for the Abbott TDx™", Clin. Chem. 31/9, 1474-1477 (1985).

10 Tässä julkaisussa kuvataan nefelometrinen menetelmä kro-mogeenisten reaktioiden seuraamiseksi. Tässä menetelmässä mitataan seerumiproteiineja attenuoimalla sirottunutta energiaa. Mutta DeGrellan ja työryhmän artikkelissa ei selitetä tai ehdoteta yllä kuvattujen, mittauksiin vai-15 kuttavien muuttujien käyttökelpoisia korjauksia.

Niinpä kaivataan jatkuvasti ko. analyysin kolori-metriseen määritykseen liittyviä parannuksia. Käsiteltävänä oleva keksintö koskee tällaista parannusta.

Keksinnön kohteena on menetelmä, joka on entsyymi-20 immunomääritysmenetelmä analyytin konsentraation mittaa miseksi näytteestä epäsuoran kolorimetrian avulla, joka perustuu valonsironnan attenuointiin. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Menetelmässä yhdistetään entsyymil-25 lä leimattu vasta-ainekonjugaatti, näyte, josta analyytti testataan, ja kiintoalustaan sidottu vasta-aine siten, että analyytti sitoutuu sitoutuneeseen vasta-aineeseen ja konjugaattiin immunologiseksi kompleksiksi kiintofaasi-muodossa. Lisäksi tässä menetelmässä sekoitetaan keske-30 nään nestemäinen liuos, joka sisältää entsyymin kanssa reagoivaa kromogeenista ainetta, ja immunologinen kompleksi, jolloin tapahtuu kromogeenisen aineen aktivoiva reaktio. Seokseen lisätään hiukkasia, jotka aiheuttavat valonsironnan attenuoitumisen kromogeenisen aineen absor-35 banssimaksimin kohdalla tai lähellä sitä, ja muodostuu 4 38 340 stabiili suspensio. Monesta aallonpituudesta muodostuva valo kohdistetaan suspensioon. Tulevan valon ensimmäinen aallonpituus on olennaisesti sama kuin kromogeenisen aineen absorboima maksimiaallonpituus. Kromogeeninen aine 5 pystyy absorboimaan kasvavia määriä valoa maksimiaallon-pituudella kromogeenisen aineen konsentraation kasvaessa. Tulevan valonsäteen toinen aallonpituus poistetaan spek-traalisti kromogeenisen aineen maksimaalisti absorboimasta aallonpituudesta. Määritetään suspension valonsironta 10 ensimmäisellä ja toisella aallonpituudella ja saadaan ko. aallonpituuksien mittausarvojen suhde. Menetelmän seuraa-vassa vaiheessa verrataan tämän suhteen arvoa valonsiron-tamäärityksellä saatuihin suhdearvoihin, jotka saatiin suorittamalla yllä kuvatut vaiheet näytteillä, jotka si-15 sälsivät konsentraatioltaan tunnettua analyyttiä, ja tällä tavoin voidaan mitata näytteen sisältämän analyytin konsentraatio.

Keksinnön eräänä toteuttamismuotona on menetelmä, joka on entsyymi-immunomääritysmenetelmä analyytin kon-20 sentraation mittaamiseksi näytteestä epäsuoran kolorimet-rian avulla, joka perustuu fluoresenssiattenuointiin. Tässä menetelmässä yhdistetään entsyymillä leimattu vas-ta-ainekonjugaatti, näyte, josta analyytti testataan, ja kiintoalustaan sidottu vasta-aine siten, että analyytti 25 sitoutuu sitoutuneeseen vasta-aineeseen ja konjugaattiin immunologiseksi kompleksiksi kiintofaasimuodossa. Lisäksi tässä menetelmässä sekoitetaan keskenään nestemäinen liuos, joka sisältää entsyymin kanssa reagoivaa kromogee-nistä ainetta, ja immunologinen kompleksi, jolloin tapah-30 tuu kromogeenisen aineen aktivoiva reaktio. Tähän seokseen lisätään ensimmäinen fluorifori, joka aiheuttaa fluoresenssin attenuoitumisen aktivoidun kromogeenisen aineen absorbanssimaksimin kohdalla tai lähellä sitä näytteen sisältämän analyytin konsentraation kasvun funk-35 tiona. Tähän seokseen on lisätty toinen fluorifori, jolla 5 38340 fluoresenssin attenuoituminen on lähes olematonta analyy-tin konsentraation kasvaessa. Monesta aallonpituudesta muodostuva tuleva valo kohdistetaan putken läpi liuokseen. Näiden aallonpituuksien joukossa on aallonpituus, 5 joka on aktivoidun kromogeenisen aineen absorbanssimak-simin kohdalla tai lähellä sitä, ja aallonpituuksia, jotka eksitoivat ensimmäisen ja toisen fluoriforin. Määritetään fluoresenssi, jonka fluoriforit emittoivat liuokseen. Tässä menetemässä saadaan myös kahden fluoresenssi-10 aallonpituuden mittausarvojen suhde. Muodostuneiden suh teiden arvoa verrataan fluoresenssimäärityksellä saatuihin suhdearvoihin, jotka saatiin suorittamalla yllä kuvatut vaiheet näytteillä, jotka sisälsivät konsentraatiol-taan tunnettua analyyttiä, ja tällä tavoin voidaan mitata 15 näytteen sisältämän analyytin konsentraatio.

Käsiteltävänä olevan keksinnön periaatteiden mukaisesti kolorimetria suoritetaan epäsuorilla tekniikoilla, esim. mittaamalla sironnan tai fluoresenssin synnyttämät valosignaalit. Määrittämällä valon aallonpituuksien 20 suhteita saadaan systeemi, joka mittaa epäsuorasti määrityksessä synnytetyn värin määrän, eli systeeminä on entsyymi-immunomääritysrnenetelmä. Käyttämällä valosignaalien suhdetta, joista toinen signaali on pääsignaali ja toinen on vertailusignaali, voidaan lisäksi estää 25 muuttujat kuten lampun tehonvaihtelut, vaihtelut putken asennossa, halkaisijassa tai optisessa laadussa. Käyttämällä yllä kuvattua suhdetta voidaan myös estää virheet, jotka valonsironta-attenuoinnissa johtuvat seokseen lisättävän hiukkasmuotoisen aineksen konsentraatioeroista. 30 Toisena etuna, joka liittyy hiukkasmuotoisen aineksen lisäämiseen yllä mainittuun seokseen, on se, että hiukkaset voidaan valita siten, että muodostuu stabiili suspensio, jonka valonsironta- tai muut valosignaaliominaisuudet eivät ole lämpötilaherkkiä.

35 Käsiteltävänä oleva keksintö mahdollistaa siis 6 88340 analyytin konsentraation kolorimetrisen määrittämisen siten, että mitataan valosignaalin, edullisesti valonsiron-nan tai fluoresenssin attenuaation voimakkuus. Sen lisäksi, että voidaan poistaa yllä kuvatut ongelmalliset muut-5 tujat, käsiteltävänä olevan keksinnön suositeltava menetelmä mahdollistaa mielenkiinnon kohteena olevan analyytin herkän määrittämisen, koska käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytettyjen suositeltavien kromogeenisten aineiden pienetkin pitoisuudet vaikuttavat valonsironnan 10 tai fluoresenssin voimakkuuteen. Käsiteltävänä olevan keksinnön muut edut ja tunnusmerkit ilmenevät alla olevasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Kuvio 1 esittää graafisesti valonsironnan mittaamista kolmella aallonpituudella hapettuneen tetrametyyli-15 bentsidiinin (TMB) konsentraation funktiona.

Kuvio 2 esittää graafisesti valonsirontamittauk-sessa käytettyjen erilaisten aallonpituuksien kahta suhdetta hapettuneen tetrametyylibentsidiinin (TMB) funktiona mitattuna käsiteltävänä olevan keksinnön periaatteiden 20 mukaisesti.

Kuvio 3 esittää graafisesti valonsirontamittauk-sessa saatua suhdetta ihmissikiön suonikalvosta saadun gonadotropiinin (hCG) konsentraation funktiona; tämä mittaus kuvaa käsiteltävänä olevan keksinnön periaatteiden 25 soveltamista entsyymi-immunomääritykseen.

Kuvio 4 esittää graafisesti valonsirontamittauk-sessa saatua suhdetta ihmisen luteinisoivan hormonin (hLB) konsentraation funktiona; tämä mittaus kuvaa käsiteltävänä olevan keksinnön periaatteiden soveltamista 30 entsyymi-immunomääritykseen.

Kuvio 5 esittää graafisesti fluoresenssisignaali-mittauksessa saatua suhdetta ihmissikiön suonikalvosta saadun gonadotropiinin (hCG) konsentraation funktiona; tämä mittaus kuvaa käsiteltävänä olevan keksinnön peri-35 aatteiden soveltamista entsyymi-immunomääritykseen.

7 88340

Kuvio 6 esittää graafisesti fluoresenssisignaali-mittauksessa saatua suhdetta ihmisen kilpirauhasta stimuloivan hormonin (hTSH) konsentraation funktiona; tämä mittaus kuvaa käsiteltävänä olevan keksinnön periaattei-5 den soveltamista entsyymi-immunomääritykseen ja

Kuvio 7 esittää graafisesti fluoresenssisignaali-mittauksessa saatua suhdetta tyroksiinin (T4) konsentraation funktiona; tämä mittaus kuvaa käsiteltävänä olevan keksinnön periaatteiden soveltamista kilpailutyyppiseen 10 entsyymi-immunomääritykseen.

Joskin monet erilaiset toteuttamismuodot kantavatkin tämän keksinnön, seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti keksinnön suositeltava, piirustuksista ilmenevä toteuttamismuoto siinä mielessä, että käsiteltävänä oleva 15 julkistus on vain esimerkki keksinnön periaatteista, jolla ei ole tarkoitus rajoittaa keksintöä toteuttamismuotoihinsa. Oheiset patenttivaatimukset ja niiden vastaavuudet määrittelevät keksinnön piirin.

Käsiteltävänä olevan keksinnön tehtävänä on tarjo-20 ta parannus edullisesti niihin entsyymi-immunomääritys- menetelmiin, joissa käytetään kromogeenisiä aineita ana-lyyttien, mukaan lukien antigeenien ja vasta-aineiden määrittämiseksi kolorimetrisesti. Mutta nämä käsiteltävänä olevan keksinnön yllä kuvatut parannukset liittyvät 25 tekniikkaan, jolla määritetään epäsuorasti määrityksessä synnytetty väri siten, että pystytään määrittämään analyysin konsentraatio näytteessä.

Sen sijaan, että määritettäisiin suoraan syntynyt väri spektrofotometrillä tai vastaavalla laitteella, kä-30 siteltävänä olevassa tekniikassa käytetään fluoresenssi- tai valonsirontamittauksia näytteessä olevan analyytin määrän määrittämiseksi ja on selvää, että käsiteltävänä olevan keksinnön epäsuorissa kolorimetrisissä tekniikoissa voidaan myös mitata muita valosignaaleja, esim. absor-35 banssia. On todettu, että nestemäisen näytteen emittoiman 8 88340 valonsironnan tai fluoresenssin voimakkuus voidaan atte-nuoida entsyymi-immunomäärityksessä käytetyn kromogeeni-sen aineen konsentraation funktiona. Tällaista attenuaa-tiota tapahtuu, kun tulevan valon aallonpituus on sama 5 tai olennaisesti sama tai lähes sama kuin kromogeenisen aineen absorboima maksimiaallonpituus. Niinpä, kun kromogeenisen aineen konsentraatio kasvaa, kasvaa tulevan valon absorption määrä ja valonsironnan tai fluoresenssin voimakkuus pienenee.

10 Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttökelpoisen kromogeenisen aineen yhtenä esimerkkinä on tetrametyyli-bentsidiini (TMB) vetyperoksidissa. Kun TMB:tä käytetään substraattina entsyymi-immunomäärityksessä, jossa entsyyminä on edullisesti peroksidaasi, entsyymi muuttaa TMB:n 15 hapettuneeseen muotoonsa kerasubstraatin eli vetyperoksidin läsnäollessa. Neutraali-pH:ssa hapettuneella TMBrllä on spektrin näkyvällä alueella kaksi pääabsorp-tiomaksimia. Toisen absorptiomaksimin keskikohta on suunnilleen 450 nm ja toinen maksimi on olennaisesti kohdassa 20 655 nm. Hapotettaessa vahvalla hapattamattomalla hapolla kohdan 655 nm absorptio häviää, mutta kohdassa 450 nm oleva kaista säilyy, joskin sen ekstinktiokerroin on kasvanut [ks. E.S. Bos et ai., 3,31,5,1-tetramethylben-zidine as an Ames Test Negative Chromogen for Horse-25 Radish Peroxidase in Enzyme Immunoassay, Journal of Immunoassay, 2, 187 (1981)].

Käsiteltävänä olevan keksinnön yhden aspektin mukaisesti ei mitata kromogeenisen aineen kuten TMB:n synnyttämää väriä, vaan määritetään valosignaali, esim. va-30 lonsironta. Valonsirontalähteen kuten kolloidisten sili-kahiukkasten tai polystyreenimikrohelmien lisääminen hapettuneeseen TMB:hen johtaa valonsironnan attenuoitumi-seen mitattuna aallonpituudella 450 nm läsnä olevan hapettuneen TMB:n funktiona ja siten testinäytteen sisältä-- 35 män analyytin konsentraation epäsuoraan mittaamiseen. Ku- 9 88340 vio 1 esittää aallonpituudella 450 nm mitatun valonsiron-nan attenuoinnin hapettuneen TMB:n konsentraation funktiona. Valonsironnan attenuointi aallonpituudella 450 nm liittyy kromogeenisen aineen absorptio-ominaisuuksiin.

5 Erityisesti, kun hapetetun TMB:n konsentraatio kasvaa, valon absorption voimakkuus kasvaa ja valonsironnan voimakkuus pienenee, kun tulevan valon aallonpituus on sama kuin hapetetun TMB:n maksimiabsorption aallonpituus eli tässä tapauksessa 450 nm. Kuviosta 1 käy myös ilmi, että 10 kahdella muulla aallonpituudella, jotka on spektraalisti poistettu TMB:n maksimiabsorption aallonpituudesta, mitattu valonsironta ei attenuoidu ko. konsentraatioalueel-la. Koska valonsironta-arvot aallonpituuksilla 560 nm ja 660 nm pysyvät olennaisesti vakioina koko konsentraatio-15 alueella, valonsirontaa näillä kahdella taajuudella voidaan itse asiassa käyttää sisäisinä vertailuaallonpituuk-sina, koska sironnan voimakkuus ei riipu valoa absorboivan aineen konsentraatiosta. Niinpä voidaan muodostaa suhde kromogeenisen aineen maksimiabsorption aallon-20 pituudella mitatun valonsironnan ja toisella aallonpituudella mitatun valonsironnan välillä, joka aallonpituus on spektrisesti poistettu maksimiabsorption aallonpituudesta ja joka on riippumaton kromogeenisen aineen konsentraatiosta. Kuvio 2 esittää näitä valonsirontasuh-25 teitä, jotka on määritetty hapetetun TMB:n konsentraation funktiona.

Kuviosta 2 havaitaan, että on mitattu kaksi suhdetta, toisena 450 nm/560 nm ja toisena 450 nm/660 nm. Molemmat nämä suhteet noudattavat kuviossa 1 nähtävän ha-30 petetun TMB:n attenuointikäyrää. Kuvio 2 osoittaa kuitenkin, että suhteen 450 nm/560 nm tarkkuus on hieman parempi kuin suhteen 450 nm/660 nm. On selvää, että valonsironta voidaan mitata muillakin taajuuksilla kuin 560 nm ja 660 nm suhteiden saamiseksi, joissa toinen aallon-‘ · 35 pituuksista on riippumaton kromogeenisen aineen kon- ΓΙΟ 88340 sentraatiosta. Mittaamalla valonsironnan suhde sellaisilla taajuuksilla kuin kuviossa 2, määrityssysteemissä aikaansaadaan sisäinen korjaus, joka eliminoi erot valon kulun pituudessa, näyteputken optisessa laadussa, putken 5 asennossa, vaihtelut lampun tehossa ja jopa erot näytteeseen lisätyn valonsirontalähteen konsentraatiossa.

Toisessa epäsuorassa kolorimetrisessä tekniikassa analyytin määrittämiseksi näytteestä käytetään kahta fluoriforia. Sen sijaan, että mitattaisiin kromogeenistä 10 ainetta, esim. TMB:tä sisältävän nestemäisen liuoksen va-lonsironta, mitataan fluoresenssi. Toinen fluoriforeista tuottaa pääsignaalin ja toinen vertailusignaalin.

Tässä tavassa käytettävät fluoriforit valitaan siten, että niiden vastaavat eksitaatio- ja emissioaallon-15 pituudet on spektrisesti erotettu olennaisesti toisistaan. Pitäen tämä mielessä fluorifori, jonka tehtävänä on tuottaa pääsignaali, valitaan siten, että sen eksitaatio-ja emissioaallonpituudet ovat kromogeenisen aineen mak-simiabsorbanssiarvojen kohdalla tai olennaisen lähellä 20 niitä. Kuten yllä mainittiin, esim. hapetetun TMB:n mak-simiabsorbanssi on kohdalla 450 nm. On osoitettu, että fluoresenssin voimakkuus attenuoituu kromogeenisen aineen kuten TMB:n funktiona, jos fluoriforin joko eksitaatio-tai emissioaallonpituus on hapetetun TMB:n maksimaalisti 25 absorboiman aallonpituuden kohdalla tai olennaisen lähellä sitä. Kun kromogeenisen aineen konsentraatio kasvaa, tulevan valon absorptio kasvaa ja fluoresenssin voimakkuus pienenee.

Toisaalta toinen fluorifori valitaan siten, että 30 sen eksitaatio- tai emissioaallonpituus on spektrisesti erillään kromogeenisen aineen maksimiabsorption aallonpituudesta. Toisen eli vertailufluoriforin emittoiman fluoresenssin mittausarvo spektrin alueella, joka ei mene päällekkäin kromogeenisen aineen absorptiospektrin kans-35 sa, on riippumaton absorboivan näytteen konsentraatiosta.

11 88340

Muodostamalla pääsignaalifluoriforin fluoresenssiarvon, joka on mitattu kromogeenisen aineen maksimiabsorbanssi-aallonpituuden kohdalla tai olennaisen lähellä sitä, ja vertailufluoriforin fluoresenssiarvon, joka on mitattu 5 kromogeenisen aineen absorptiospektristä erillään olevalla alueella, välinen suhde saadaan käyttöön mittaustekniikka entsyymi-immunomäärityksessä syntyneen värin määrän mittaamiseksi epäsuorasti.

Fluoresenssisignaalien suhteella, joista toisen 10 synnyttää pääsignaalifluorifori ja toisen vertailusignaa- lifluorifori, saavutetaan samat luoteenomaiset edut kuin yllä kuvatulla valonsirontasuhteella analyytin määrittämiseksi epäsuorasti näytteestä.

Käytettäessä fluoresenssisuhdetekniikkaa edullinen 15 kromogeeninen aine on TMB, jonka absorptiomaksimi hapettuneessa tilassa on olennaisesti 450 nm. Tarjolla on useita fluoriforeja, joiden eksitaatio- tai emissioaal-lonpituus on sama kuin hapetetun TMB:n absorptiomaksimi tai lähellä tätä. Esim. kumariini 343, 9-aminoakridiini-20 hydrokloridi ja 8-metoksipyreeni-l,3,6-trisulfonihappo (MPT) ovat hyviä pääsignaalin antavia fluoriforikandi-daatteja, joista MPT on suositeltava. MPT eksikoituu kohdassa n. 395 nm ja sen emissiomaksimi on kohdassa n. 430 nm. Nämä aallonpituudet ovat suhteellisen lähellä hapete-25 tun TMB:n absorptiomaksimia kohdassa 450 nm.

Myös vertailut luorifori voidaan valita erilaisista fluoriforeista, joita ovat oksatsiini 170-perkloraatti ja edullisesti sulforodamiini 101 (SR 101). SR 101 eksitoi-tuu kohdassa 589 nm ja sen emissiomaksimi on kohdassa n. 30 605 nm. Voidaan siis havaita, että SR 101:n eksitaatio- ja emissioaallonpituudet ovat spektrisesti olennaisesti erillään eli erotettu hapetetun TMB:n absorptiomaksimin V aallonpituudesta samoin kuin pääsignaalin antavan fluori- .·. ; forin kuten MPT:n eksitaatio- ja emissioaallonpituudet.

] J 35 Tämä spektrierottelu mahdollistaa fluoresenssisignaalin 12 3 8 340 määrittämisen, joka on riippumaton absorboivan näytteen konsentraatiosta.

Vertailutluorifori on lisäksi valittava siten, että sen signaali ei attenuoidu tai attenuoituu mitättömän 5 vähän kromogeenisen aineen kuten TMB:n konsentraation muuttuessa. Tällainen vertailutluorifori toimii sisäisenä vertailusysteeminä, joka pystyy poistamaan monista tekijöistä, mm. putken asennosta, halkaisijasta tai optisesta laadusta johtuvat erot. Niinpä on pääsignaalin ja vertaili) lusignaalin antavien fluoriforien valinnassa otettava huomioon, että pääsignaalin antavan fluoriforin fluoresenssin voimakkuus pitää attenuoitua kromogeenisen aineen konsentraation funktiona maksimiabsorptionsa kohdalla tai lähellä sitä ja vertailutluoriforin fluoresenssin voimak-15 kuuden on pysyttävä suhteellisen vakiona kromogeenisen aineen konsentraation funktiona. On huomattava, että jotkut fluoriforit kuten SR 101 voivat toimia vertailufluo-riforina, mikäli fluoresenssin voimakkuus kromogeenisen aineen konsentraation funktiona säilyy suhteellisen vaki-20 ona lyhyen ajan keskeytysreagenssin lisäämisen jälkeen, esim. alle kaksi minuuttia.

Käytettäessä käsiteltävänä olevan keksinnön epäsuoria kolorimetrisiä määritysmenetelmiä on entsyymi-immunomääritys monien analyyttien kohdalla paras valinta. 25 Analyytit kuten ihmissikiön suonikalvon gonadotropiini (hCG) naisten raskaustestissä, luteinisoivat hormonit (hLH) naisten hedelmällisyystestissä, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, tyroksiini ja määrätyt bakteerit ja mikro-organismit määritetään entsyymi-immuno- ja kolorimet-30 risillä määritystekniikoilla. Käsiteltävänä oleva keksin tö ei kuitenkaan rajoitu yllä mainittujen analyyttien määrittämiseen, vaan ne ovat pelkästään esimerkkejä monista erilaisista analyyteistä, jotka voidaan mitata käsiteltävänä olevan keksinnön epäsuorien valonmittaustek-: 35 nilkkojen avulla.

13 88340

On selvää, että kromogeenisenä aineena vetyperoksidissa käytettävän TMB:n lisäksi voidaan käsiteltävänä olevassa keksinnössä käyttää muitakin kroroogeenisiä aineita. Käsiteltävänä olevan keksinnön yllä kuvatut tek-5 niikat ovat sovellettavissa erilaisiin entsyymi- tai sub-straattisysteemeihin mittaamalla valonsironta tai fluoresenssi kromogeenisen aineen maksimiabsorbanssiaallon-pituuden kohdalla tai lähellä sitä ja käyttämällä vertai-luaallonpituutta, joka on erillään kromogeenisen aineen 10 absorptiospektristä ja riippumaton ko. analyytin kon- sentraatiosta. Muita edustavia kromogeenisiä aineita ovat siten TMB:n ohella bentsidiinit, o-fenyleenidiamiini, o-tolidiini ja ABTS. TMB, jota käytetään vetyperoksidissa kuten on kuvattu esim. US-patentissa nro 4 503 143, on 15 käsiteltävänä olevan keksinnön suositeltava kromogeeninen aine.

Yllä kuvatuissa EIA-menettelyissä käytetään entsyymiä analyytin, esim. vasta-aineen tai antigeenin leimaamiseksi ja kromogeenisen reaktion nopeuttamiseksi. So-20 pivia entsyymejä ovat oksidoreduktaasit ja erityisesti hemientsyymit katalaasi ja peroksidaasi mukaan lukien. Näillä entsyymeillä on selvästi erottuvat absorptio-spektrit niiden hemin sisältämien prosteettisten ryhmien vuoksi ja niiden spektreissä esiintyy ohimeneviä muutok-25 siä sekoitettaessa substraattinsa eli vetyperoksidin • kanssa. Erityisen sopiva entsyymi on TMB:n katalysoiva pipar juuriperoksidaasi.

Määritettävään näytteeseen valonsirontalähteenä lisättävinä hiukkasina on tarjolla useita vaihtoehtoja.

30 Nestemäiseen liuokseen, jonka läpi valo kohdistetaan, lisätään edullisesti mikrohiukkasia, joiden keskimääräinen läpimitta on 0,010 - 0,014 mikronia, jolloin syntyy si-rontailmiö valon osuessa näihin hiukkasiin. Mikrohelmet, esim. polystyreenistä tai muista materiaaleista, joiden : 35 tiheys on suunnilleen sama kuin veden, valmistetut mik- 14 88 340 rohelmet ovat sopiva valonsirontailmiön synnyttävä lähde. On suotavaa, että tällaisiin mikrohelmiin ei liity sekun-daariemissiota, joka saattaa vääristää lukeman. On kuitenkin havaittu, että yllä mainitulla kokoalueella ole-5 vat, kolloidisesta piidioksidista muodostuvat mikrohiukkaset toimivat tyydyttävimmin käsiteltävänä olevassa keksinnössä. On todettu, että kolloidisen piidioksidin laimennoksella sitruunahapossa saadaan valonsirontavaste, joka on lineaarinen kolloidisen piidoksidin pitoisuuteen 10 0,3 p/t-% saakka. Eri putkiin lisätyn kolloidisen piidi oksidin määrä voi itse asiassa vaihdella ilman vaikutusta valonsirontalukemiin, koska tällaiset erot kompensoituvat mitattaessa valonsironta suhteena.

Tässä yhteydessä voidaan käyttää tunnettuja ent-15 syymi-immunomäärityksiä. Esim. koeputkessa tai vastaavassa, joka on tyypillisesti valmistettu kirkkaasta tai läpinäkyvästä muovista, on ko. antigeenin tai analyytin vasta-ainetta sidottuna putken sisäpintoihin. Entsyymillä leimattu vasta-ainekonjugaatti ja nestemäinen näyte, jos-20 ta analyytti aiotaan määrittää, yhdistetään yhdessä tai useammassa vaiheessa putkessa siten, että analyytti sitoutuu sitoutuneeseen vasta-aineeseen ja konjugaattiin immunologiseksi kompleksiksi kiintofaasimuodossa. Tämä immunologinen kompleksi muodostaa sandwich-rakenteen, jo-: 25 ka muodostuu kiintofaasin muodossa olevasta vasta-aineesta, analyytistä ja entsyymillä leimatusta vasta-aineesta siten, että entsyymillä leimatun, kiintofaasiin sidotun vasta-aineen määrä on suoraan verrannollinen analyytin konsentraatioon näytteessä. Reagoimatta jääneet reagens-30 sit pestään tavalliseen tapaan putkesta ja sitten lisätään substraatti entsyymireaktion initioimiseksi.

Alempana kuvatussa edullisessa toteuttamismuodossa entsyymireaktio suoritetaan siten, että putkeen lisätään sekä vetyperoksidia että TMB:tä, jolloin TMB aktivoituu 35 (hapettuu) ja putkessa syntyy määrätyn ajan kuluttua vä- is 8 8 340 ri. Putkessa olevan hapettuneen TMB:n konsentraatio on suoraan verrannollinen näytteen sisältämän analyytin kon-sentraatioon. Sitten putkeen lisätään hapan liuos entsyy-mireaktion pysäyttämiseksi. Tämän tyyppiset määritykset 5 voidaan ilmaista mittaamalla valosignaali spektrofotomet-rillä tai fluorimetrillä. Nämä värin mittaamiseen perustuvat laitteet ovat tunnettuja ja ne muodostuvat tyypillisesti valonlähteenä toimivasta lampusta, testiputken pitimestä, valomonistinputkesta ja optiikasta valon mit-10 taamiseksi. Koska valonsironta on mitattavissa kaikissa suunnissa, valodetektorin sijainti laitteessa voi vaihdella. Käytettäessä esim. fluorimetriä, fluoresenssi mitataan 90 asteen kulmassa tulevan valonsäteen suhteen. Tämän keksinnön toisen aspektin mukaisesti fluorimetrin 15 optiikka voidaan modifioida siten, että fluoresenssin asemasta mitataan valonsironta 90 asteen kulmassa tulevan valonsäteen suhteen. Spektrofotometreissä voidaan mitata väri tulevan valonsäteen suunnassa; laitteet voidaan modifioida siten, että ne mittaavat tulevan valonsäteen 20 suunnassa valonsironnan värin asemasta. Valonsironta voidaan mitata muissakin suunnissa.

Käytettäessä valonlähteenä esim. volframilamppua syntyy lukuisista aallonpituuksista koostuva valo, joka emittoituu tyypillisesti alueella 350-800 nm. Käytettäes-25 sä tällaista moniaaltoista valoa voi olla tarpeen suodattaa valonsäde testiputken tulopuolella tai sirontapuolel-la tai molemmilla puolilla. Käyttämällä asianmukaisia suodattimia on mahdollista saavuttaa sekä valonsironta-että fluoresenssimittauksessa maksimisignaali kromogeeni-30 sen aineen maksimiabsorptioaallonpituuden kohdalla.

Asianmukaisten suodattimien valinta ja sijoittelu riippuvat ko. kromogeenisestä aineesta; attenuointiaallon-pituus ja vertailuaallonpituus voivat vaihdella aineesta toiseen. Ammattimies, joka omaa normaalitiedot optiikan 35 alalta, pystyy helposti suorittamaan suodattimien valin-

16 8 8 3 4 P

nan ja sijoittelun.

Seuraavat esimerkit selventävät käsiteltävänä olevan keksinnön tekniikkoja.

Esimerkki 1 5 Valoa läpäisevän polystyreeniputken sisäpinta päällystettiin anti-hCG:llä. Tähän putkeen lisättiin 100 mikrolitraa anti-hCG-peroksidaasilla leimatun konjugaatin 1:50-laimennosta ja 100 mikrolitraa nestenäytettä, jonka uskottiin sisältävn määritettävää hCG:tä. Reaktio sai 10 jatkua 30 minuuttia 37 °C:ssa ja sitten inkubaatti imettiin pois. Kun putki oli pesty kolmasti kahden millilit-ran annoksilla vettä, jossa oli 0,05 % Tveeniä, lisättiin 200 mikrolitraa substraattia, joka sisälsi sekä tetra-metyylibentsidiiniä (TMB) että vetyperoksidia, ja seosta 15 inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten putkeen lisättiin 1 millilitra 1 M sitruunahappoliuosta, jossa oli 0,3 p/t-% kolloidisia piidioksidihiukkasia, keskimääräinen läpimitta n. 0,014 mikronia. Sitten putki asetettiin optisesti modifioituun fluorimetriin ja sus-20 pensioon kohdistettiin putken seinien läpi valonsäde. Va-lonsironta määritettiin 90 asteen kulmassa tulevan valonsäteen suhteen aallonpituudella 450 nm ja 560 nm ja tulokset ilmaistiin näillä kahdella aallonpituudella saatujen arvojen suhteena. Laadittiin standardikäyrä toista-• 25 maila yllä kuvatut vaiheet ja käyttämällä konsentraatiol-taan tunnettuja hCG-näytteitä. Käytetyt arvot ilmenevät kuvion 3 käyrästä. Tuntemattoman näytteen sisältämän hCG:n konsentraatio saatiin siten, että lukema, jonka laite antoi tuntemattoman näytteen suhteelle, verrattiin 30 kuvion 3 standardikäyrään.

Esimerkki 2

Valoa läpäisevän polystyreeniputken sisäpinta päällystettiin anti-hLH:11a. Putkeen lisättiin 100 mikrolitraa anti-hLH-peroksidaasilla leimatun konjugaatin 35 l:50-laimennosta ja 100 mikrolitraa näytettä, jonka us- 17 8 8 340 kottiin sisältävän määritettävää hLH:ta. Reaktio sai jatkua tunnin 37 eC:ssa ja sitten inkubaatti imettiin pois. Kun putki oli pesty kolmasti kahden millilitran annoksilla vettä, jossa oli 0,05 % Tweeniä. Pestyyn putkeen li-5 sättiin 200 mikrolitraa substraattia, joka sisälsi sekä tetrametyylibentsidiiniä (TMB) että vetyperoksidia, ja reaktion annettiin jatkua 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktio keskeytettiin lisäämällä 1 millilitra 1 M sitruunahappoliuosta, jossa oli 0,3 p/t-% kolloidisia 10 piidioksidihiukkasia, keskimääräinen läpimitta n. 0,014 mikronia. Putki asetettiin fluorimetriin, joka oli modifioitu optisesti mittaamaan valonsironta 90 asteen kulmassa tulevan valonsäteen suhteen. Valonsironta määritettiin aallonpituudella 450 nm ja 560 nm ja tulokset il-15 maistiin näillä kahdella aallonpituudella saatujen arvojen suhteena. Laadittiin standardikäyrä, josta mitatut suhteet ilmenevät tunnettujen hLH-konsentraatioiden funktiona. Tämä standardikäyrä ilmenee kuviosta 4. Tuntemattoman näytteen sisältämän hLH:n konsentraatio saatiin si-20 ten, että lukemaa,jonka laite antoi testattavan näytteen valonsirontasuhteelle, verrattiin kuvion 4 standardi-käyrään.

Esimerkki 3

Valoa läpäisevän polystyreeniputken sisäpinta 25 päällystettiin anti-hCG:llä. Tähän putkeen lisättiin 100 mikrolitraa anti-hCG-peroksidaasilla leimatun konjugaatin l:200-laimennosta ja 100 mikrolitraa nestenäytettä, jonka uskottiin sisältävän määritettävää hCG:tä. Reaktio sai jatkua 15 minuuttia 37 °C:ssa ja inkubaatti imettiin 30 pois. Kun putki oli pesty kolmasti kahden millilitran annoksilla vettä, jossa oli 0,05 % Tweeniä, jokaiseen putkeen lisättiin 200 mikrolitraa substraattia, joka sisälsi sekä TMB:tä että vetyperoksidia. TMB sisälsi 1,7 mikromoolia MPT:tä ja 8,6 mikromoolia SR 10l:tä. Tämä 35 seos inkuboitiin 15 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten putkeen ie 38 340 lisättiin 0,8 millilitraa 1 M sitruunahappoa. Sitten putki asetettiin fluorimetriin, jonka eksitaatiopuolella oli 395 nm suodatin ja emissiopuolella 430 nm suodatin MPT-fluoriforia varten. SR 101-fluoriforia varten fluorimet-5 rissä oli eksitaatiopuolella 589 nm suodatin ja emissio-puolella 605 nm suodatin. Lampun valo kohdistettiin liuokseen putken seinien läpi. Fluoresenssi määritettiin aallonpituuksilla 430 nm ja 605 nm ja tulokset ilmaistiin näillä kahdella aallonpituudella saatujen arvojen suh-10 teenä. Laadittiin standardikäyrä toistamalla yllä kuvatut vaiheet ja käyttämällä konsentraatioltaan tunnettuja hCG-näytteitä. Käytetyt arvot ilmenevät kuvion 5 käyrästä. Tuntemattoman näytteen sisältämän hCG:n konsentraatio saatiin siten, että lukemaa, jonka laite antoi tuntemat-15 toman näytteen fluoresenssisuhteelle, verrattiin kuvion 5 standardikäyrään.

Esimerkki 4

Edellisiä esimerkkejä vastaavassa menetelmässä päällystettiin putki anti-hTSH:11a. Tähän putkeen lisät-20 tiin 100 mikrolitraa anti-hTSH-peroksidaasilla leimatun konjugaatin 1:200-laimennosta ja 200 mikrolitraa näytettä, jonka uskottiin sisältävän määritettävää hTSHzta. Reaktio sai jatkua 30 minuuttia 37 °C:ssa ja sitten inku-baatti imettiin pois. Putki pestiin kolmasti kahden mil-25 lilitran annoksilla vettä, jossa oli 0,05 % Tweeniä.

Pestyyn putkeen lisättiin 300 mikrolitraa substraattia, joka sisälsi TMB:tä ja vetyperoksidia ja kahta yllä mainittua fluoriforia MPT:tä ja SR 101:tä. Reaktio sai jatkua 7 minuuttia 37 eC:ssa ja reaktio keskeytettiin lisää-30 mällä 0,8 millilitraa 1 M sitruunahappoa. Putki luettiin fluorimetrissä esimerkissä 3 kuvatulla tavalla ja tulokset ilmaistiin suhteella MPT/SR 101 näytteen alkuaan sisältämän hTSH:n funktiona. Kuviossa 6 nähdään tyypillisiä tuloksia.

• 35 88340 19

Esimerkki 5

Valoa läpäisevän polystyreeniputken sisäpinta päällystettiin anti-T4:llä. Päällystettyyn putkeen lisättiin 300 mikrolitraa peroksidaasilla leimatun T4-konju-5 gaatin 1:15000-laimennosta ja 25 mikrolitraa näytettä, jonka uskottiin sisältävän määritettävää T4:ää. Reaktio sai jatkua 15 minuuttia 37 °C:ssa ja sitten inkubaatti imettiin pois. Putki pestiin kuudesti 0,5 millilitran annoksilla vettä, jossa oli 0,5 % Tween-20:ta. Pestyyn put-10 keen lisättiin 300 millilitraa substraattia, joka sisälsi TMB:tä ja vetyperoksidia ja kahta fluoriforia MPTitä ja SR l0l:tä. Reaktio sai jatkua 15 minuuttia 37 °C:ssa ja reaktio keskeytettiin lisäämällä 0,8 millilitraa 1 M sitruunahappoa. Sitten putki luettiin fluorimetrissä esi-15 merkissä 3 kuvatulla tavalla ja piirrettiin suhde MPT/SR 101 putkeen alkuaan lisätyn T4-määrän funktiona. Kuviossa 7 nähdään tyypillisiä tuloksia.

Käsiteltävänä olevan keksinnön perustana on siis valosignaalien suhde ko. analyytin määrittämiseksi epä-20 suoralla kolorimetriällä. Käyttämällä tässä kuvattua suh-detekniikkaa aikaansaadaan sisäinen korjausmekanismi, joka poistaa valonkulun pituudesta, putken optisesta laadusta tai putken asennosta johtuvat erot, lampun tehon vaihtelut ja vastaavat tekijät, jotka vaikuttavat sys-25 teemin optiikkaan. Tavanomaisessa kolorimetriassa esim.

" lampun tehon vaihtelut ja erot valonkulussa korjataan tyypillisesti käyttämällä kaksoissädespektrometriä ja vastakkain sovitettuja kyvettejä kaikissa mittauksissa. Koska käsiteltävänä olevan keksinnön detektori ei ole 30 kaksoissädedetektori ja koska jokaisessa mittauksessa käytetään eri kyvettiä, tässä kuvatut suhteeseen perustuvat tekniikat minimoivat tehokkaasti mainitunlaiset vaikutukset.

Claims (9)

20 88340

1. Menetelmä, jossa käytetään entsyymi-immunomää-ritystä analyytin konsentraation mittaamiseksi näytteestä 5 epäsuoralla kolorimetriällä, tunnettu siitä, että a) yhdistetään entsyymillä leimattu immunokonju-gaatti, näyte, josta analyytti testataan, ja kiintoalus-taan sidottu vasta-aine siten, että analyytti sitoutuu 10 sitoutuneeseen vasta-aineeseen ja konjugaattiin immunologiseksi kompleksiksi kiintofaasimuodossa, b) sekoitetaan keskenään nestemäinen liuos, joka sisältää entsyymin kanssa reagoivaa kromogeenista ainetta, ja immunologinen kompleksi, jolloin tapahtuu kromo- 15 geenisen aineen aktivoiva reaktio, ja kromogeeninen aine pystyy absorboimaan kasvavia määriä valoa ensimmäisellä aallonpituudella analyytin konsentraation kasvaessa, c) lisätään seokseen sellainen aine, että valosignaali attenuoituu ensimmäisen aallonpituuden kohdalla tai 20 lähellä sitä, d) kohdistetaan tuleva valonsäde, joka muodostuu monista aallonpituuksista, seokseen, joka sisältää mainittua ainetta, jolloin valoon sisältyy ensimmäinen aallonpituus ja valoon sisältyvä toinen aallonpituus pois- 25 tetaan spektrisesti ensimmäisestä aallonpituudesta, e) määritetään seoksen emittoima valo kahdella eri aallonpituudella ja muodostetaan kahdella aallonpituudella saatujen mittausarvojen suhde, ja f) verrataan muodostetun suhteen arvoa valonmit- 30 tauksessa saatuihin suhdearvoihin, jotka saatiin suorit tamalla vaiheet a) - e) näytteillä, jotka sisälsivät ana-lyyttiä tunnettuina konsentraatioina, ja tällä tavoin voidaan mitata näytteen sisältämän analyytin kon-sentraatio.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 21 88340 tunnettu siitä, että kromogeeninen aine on tetrametyylibentsidiini vetyperoksidissa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että attenuoitumisen aiheuttava 5 aine muodostuu hiukkasista, jotka ovat happoliuoksessa, joka lisätään seokseen keskeyttämään entsyymireaktio ja muodostamaan stabiili suspensio.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analyytti valitaan ryhmästä 10 ihmissikiön suonikalvon gonadotropiini ja luteinisoiva hormoni.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että attenuoitumisen aiheuttava aine on ensimmäinen fluorifori.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen fluoriforin eksitaatioaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat ensimmäisen aallonpituuden kohdalla tai olennaisen lähellä sitä.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seokseen lisätään myös vertailuaine, joka ei olennaisesti vaikuta valosignaalin tasoon ensimmäisen aallonpituuden kohdalla tai lähellä sitä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vertailuaine on toinen fluorifori.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisen fluoriforin eksi- 30 taatioaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat toisen aallonpituuden kohdalla tai olennaisen lähellä sitä. 22 88340