DK169710B1 - Indirekte kolorimetrisk påvisning af en analyt i en prøve under anvendelse af forholdet mellem lyssignaler - Google Patents

Description

DK 169710 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde ved anvendelse af en enzymimmunoanalyse til måling af koncentrationen af en analyt i en prøve ved indirekte kolorimetrisk påvisning.

Analyser til den kolorimetriske påvisning af analytter er al-5 mindelige og velkendte. Især anvendes enzymimmunoanalyser (EIA) og enzymbundne immunosorbent analyser (ELISA) til den kolorimetriske påvisning af et antigen (analyt), der er til stede i en forsøgsprøve. I disse enzymimmunoanalysemetoder bindes antistoffer, der er specifikke over for forsøgsantigenet eller 10 forsøgsanalytten, til en fast fase, som sædvanligvis er et klart eller gennemsigtigt plastrør. I mange, men ikke i alle disse enzymimmunoanalyser, forekommer en sandwichdannelse mellem antistoffet i den faste fase, antigenet og det enzymmærkede antistof, således at mængden af enzymmærket antistof, der 15 er bundet til den faste fase, er direkte proportional med antigenkoncentrationen i prøven. Overskydende uomsatte reagenser vaskes normalt ud af røret, og substratet tilsættes for at bevirke enzymreaktionen.

Udover sandwichdannelse, som typisk forekommer med proteinan-20 tigener, er det muligt at udføre kompetitive analyser. En begrænsende mængde antistof sættes på den faste fase, og både prøve og et enzymmærket hapten inkuberes samtidigt. Når der ikke er nogen analyt til stede i prøven, binder det enzymmærkede hapten maksimalt til den faste fase. Med stigende mængde 25 analyt i prøven konkurrerer den med det enzymmærkede hapten om binding til den faste fase, således at mængden af bundet enzymmærket hapten er modsat proportional med analytkoncentra-tionen. Kompetitive analyser kan udføres for både haptenana-. lytter og proteinanalytter, men kun proteinanalytter kan un-30 derkastes en analyse af sandwichtypen.

Ved kolorimetriske påvisningsteknikker kan substratet omfatte et chromogent materiale, som reagerer på enzymet, således at det chromogene materiale aktiveres. Som et resultat frembringes tilstrækkelig farve i den flydende opløsning inden i rø- 2 DK 169710 B1 ret, hvilken farve kan påvises. Analyser af denne type fuldendes ofte ved måling af farveproduktionen inden i røret ved anvendelse af et spektrofotometer. I det tilfælde, at fluoro-chromer anvendes som stofferne, der skal påvises, kan fluores-5 censmikroskoper såvel som fluorometre anvendes til udøvelse af analysemetodeme. En enzymimmunoanalyse, hvor der anvendes et tetramethylbenzidin (TME) som chromogenet i den kolorimetriske påvisning af et antigen, er beskrevet i US patentskrift nr. 4.503.143.

10 Ved anvendelse af et spektrofotometer til den kolorimetriske påvisning af en analyt i en prøve, er der en række faktorer, som kan påvirke påvisningen af lys, der er forbundet med den chromogene reaktion. F.eks. er lyskilden, der giver en indfaldende lysstråle i røret indeholdende prøven, der skal undersø-15 ges, ofte en lampe, f.eks. en wolframlampe, såsom den der er beskrevet i US patentskrift nr. 4.516.856. Det er ikke ualmindeligt, at der er variationer i lampens ydelse, som kan påvirke lyset påvist i et spektrofotometer eller lys opsamlet i et fotomultiplikatorrør til påvisning af fluorescensemissioner.

20 Anbringelse af røret indeholdende prøven, der skal undersøges, kan være forskellig fra forsøg til forsøg og også have en virkning på forsøgsresultaterne. Andre faktorer, såsom lysve jslængde og optisk kvalitet af røret, kan give forskelle fra forsøg til forsøg, som kan påvirke analyseresultaterne. Det 25 antages, at en teknik, som af hjælper eller undgår de førnævnte variable ved kolorimetriske påvisningsmetoder, ville være meget ønskelig for at forbedre nøjagtigheden, reproducerbarheden og pålideligheden af disse forsøgsfremgangsmåder.

Forbedringer ved fluorometriske analyser har været beskrevet i 30 US patentskrift nr. 4.495.293. Formålet med det lige nævnte patent er imidlertid at tilvejebringe forbedringer i fluorescensintensiteten af det udsendte lys, som er i relation til ligandens koncentration. En anden teknik til makromolekylebe-stemmelser ved immunonephelometri er beskrevet af DeGrella et 35 al. i "A Nephelometry System for the Abbott TDx™", Clin.

3 DK 169710 B1

Chem. 31/9, 1474-1477 (1985). En nephelometrisk fremgangsmåde til undersøgelse af chromogene reaktioner er beskrevet i dette skrift, hvilken metode beror på spredt energidæmpning til måling af serumproteiner. Der er imidlertid ingen beskrivelser 5 eller antydninger i DeGrella et al. artiklen, som ville være anvendelige til at afhjælpe de variable, der er anført ovenfor, som påvirker analysemålingerae.

I overensstemmelse hermed søges der stadigvæk forbedringer i analyser, der beror på den kolorimetriske påvisning af analytic) ter, der har interesse. Den foreliggende opfindelse er rettet mod en sådan forbedring.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i de kendetegnende dele af krav 1 og 3 anførte.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til påvis-15 ning af en analyt i en prøve omfatter således i princippet, at man dirigerer en indfaldende lysstråle med flere bølgelængder ind i en flydende suspension eller opløsning, der indeholder en analyt, som har interesse. Denne væske er i stand til at dæmpe mængden af lys ved en første bølgelængde proportionalt 20 med den stigende koncentration af analytten, der er til stede i prøven. Fremgangsmåden omfatter endvidere påvisning af lyssignaler fra væsken med relation til den første bølgelængde og ved-en anden bølgelængde, ved hvilken i alt væsentligt ingen dæmpning af lys forekommer med den stigende koncentration af 25 analytten. Et forhold mellem de to respektive bølgelængder dannes. Dette forhold sammenlignes derefter med forhold for kendte mængder af analytten for at bestemme mængden af analytten i prøven.

En udførelsesform ifølge opfindelsen er en fremgangsmåde ved 30 anvendelse af en enzymimmunoanalyse til måling af koncentrationen af en analyt i en prøve ved indirekte kolorimetrisk påvisning, ved hvilken fremgangsmåde lysspredhingsdæmpning anvendes . Denne fremgangsmåde omfatter, at man forener et enzym- DK 169710 B1 -4 mærket ant is tof kon j ugat, en prøve, der skal undersøges for en analyt, og et antistof, som er bundet til en fast bærer, således at analytten binder til det bundne antistof og til konju-gatet til dannelse af et immunologisk kompleks i fast fase.

5 Endvidere omfatter denne fremgangsmåde blanding af en flydende opløsning, der indeholder et chromogent materiale, som reagerer på enzymet, med det immunologiske kompleks til fremkaldelse af en reaktion, som aktiverer det chromogene materiale. Partikler, der er i stand til at forårsage lys spredningsdæmp -10 ning ved eller i nærheden af det chromogene materiales absor-bansmaksimum, sættes til blandingen til dannelse af en stabil suspension. Fremgangsmåden omfatter endvidere, at man dirigerer indfaldende lys med flere bølgelængder ind i suspensionen.

En første bølgelængde hos det indfaldende lys er i alt væsent-15 ligt den samme som en bølgelængde, der maksimalt absorberes af det chromogene materiale. Det chromogene materiale er i stand til at absorbere stigende mængder lys ved maksimumsbølgelængden med stigende koncentration af det chromogene materiale. En anden bølgelængde hos den indfaldende lysstråle er spektralt 20 fjernet fra bølgelængden, der maksimalt absorberes af det chromogene materiale. Lys spredt af suspensionen ved den første og anden bølgelængde påvises, og et forhold mellem de to respektive bølgelængder dannes. Det næste trin i fremgangsmåden er at sammenligne størrelsen af forholdet med størrelsen 25 af forholdet, der er fremkommet ved lysspredningspåvisning, når-de tidligere trin er udført med prøver, der indeholder kendte koncentrationer af analytten, således at koncentrationen af analytten i prøven kan måles.

En anden udførelsesform ifølge opfindelsen er en fremgangsmå-30 de, ved hvilken der anvendes en enzymimmunoanalyse til måling af koncentrationen af en analyt i en prøve ved indirekte kolo-rimetrisk påvisning, ved hvilken fremgangsmåde fluorescensdæmpning anvendes. Ved denne .fremgangsmåde forenes et enzymmærket antistofkonjugat. med en prøve, der skal undersøges for 35 en analyt, og et antistof, der er bundet til en fast bærer, således at analytten binder til det bundne antistof og til 5 DK 169710 B1 konjugatet til dannelse af et immunologisk kompleks i fast fa-. se. Denne fremgangsmåde omfatter blanding af en flydende opløsning, der indeholder et chromogent materiale, som reagerer på enzymet, med et immunologisk kompleks til fremkaldelse af 5 en reaktion, som aktiverer det chromogene materiale. Til denne blanding sættes et første fluorophor til fremkaldelse af dæmpning af fluorescens ved eller i nærheden af absorbansmaksimaet hos det aktiverede chromogene materiale som en funktion af den stigende koncentration af tilstedeværende analyt i prøven. Til 10 denne blanding er sat et andet fluorophor, som i alt væsentligt ikke har dæmpning af dens fluorescens med stigende koncentration af analytten. Indfaldende lys dirigeres i flere bølgelængder gennem røret ind i opløsningen. Disse lysbølgelængder omfatter en bølgelængde ved eller i nærheden af absor-15 bansmaksimaet hos det aktiverede chromogene materiale og omfatter bølgelængder til forårsagelse af excitation af det første og det andet fluorophor. Fluorescens udsendt af fluoropho-reme i opløsningen påvises. Denne fremgangsmåde omfatter dannelse af et forhold mellem de to fluorescensbølgelængder.

20 Størrelsen af de dannede forhold sammenlignes med størrelsen af et forhold, der er fremkommet ved fluorescenspåvisning, hvor de tidligere trin er udført med prøver, der indeholder kendte koncentrationer af analytten, således at koncentrationen af analytten i prøven kan måles.

25 I overensstemmelse med principperne ifølge den foreliggende opfindelse opnås kolorimetrisk påvisning under anvendelse af indirekte teknikker, såsom opsamling af lyssprednings- eller fluorescenssignaler. Undersøgelse af lysforholdet giver et system, som indirekte måler mængden af farve, der er frembragt 30 ved en analyse, såsom en enzymimmunoanalyse. Anvendelse af et forhold mellem lyssignaler, idet et signal i forholdet er rapporteringssignalet, og det andet er et referencesignal, giver endvidere en korrektionsmekanisme til undgåelse af sådanne variable, som flukturering i lampens lys, variationer ved an-35 bringelse af rør og i rørets diameter eller'optiske'kvalitet. Endvidere overvindes ved anvendelse af det ovenfor beskrevne 6 DK 169710 B1 forhold også forskelle i koncentrationen af partikel formet stof, som sættes til blandingen for lyspåvisningsformål, når der anvendes ly s spredningsdæmpning. En anden fordel ved tilsætning af partikelformet stof til den førnævnte blanding er, 5 at partiklerne kan udvælges til dannelse af en stabil suspension, hvis lysspredning eller anden lyssignals evne er temperaturufølsom.

Derfor muliggør den foreliggende opfindelse indirekte kolori-metrisk bestemmelse af koncentrationen af analytten ved måling 10 af dæmpning af lysspredning eller fluorescens. Udover at eliminere de problematiske variable som nævnt ovenfor, muliggør den foretrukne fremgangsmåde ifølge opfindelsen en følsom påvisning af analytten, der har interesse, da lave koncentrationer af foretrukne chromogene stoffer, der anvendes ifølge 15 den foreliggende fremgangsmåde, påvirker graden af lys spredning eller fluorescens. Andre fordele og træk ved den foreliggende opfindelse vil fremgå nærmere ved læsning af den detaljerede beskrivelse nedenfor.

Fig. 1 er en grafisk gengivelse af målingen af lysspredning 20 ved tre bølgelængder som en funktion af koncentrationen af oxideret tetramethylbenzidin (TMB), fig. 2 er en grafisk repræsentation af to forhold ved forskellige bølgelængder for lysspredning, der er målt som en funktion af koncentrationen af oxideret tetramethylben-25 zidin (TMB) i overensstemmelse med principperne ifølge den foreliggende opfindelse, fig. 3 er en grafisk gengivelse af et forhold for lysspred-' ning, der er målt som en funktion af koncentrationen af human choriongonadotropin (hCG) , under anvendelse af 30 principperne ifølge den foreliggende opfindelse i en enzymimmunoanalyse, 7 DK 169710 B1 fig. 4 er en grafisk gengivelse af et forhold for lysspredning, der er målt som en funktion af koncentrationen af humant luteiniseringshormon (hLH), under anvendelse af principperne ifølge den foreliggende opfindelse i en 5 enzymimmunoanalyse, fig. 5 er en grafisk gengivelse af et forhold mellem fluorescenssignaler, der er målt som en funktion af koncentrationen af human choriongonadotropin (hCG), ved anvendelse af principperne ifølge den foreliggende opfindel-10 se i en enzymimmunoanalyse, fig. 6 er en grafisk gengivelse af et forhold mellem fluorescenssignaler, der målt som en funktion af koncentrationen af humant thyroid stimuleringshormon (hTSH), ved anvendelse af principperne ifølge den foreliggende op-15 findelsen i en enzymimmunoanalyse, og fig. 7 .er en grafisk repræsentation af et forhold mellem fluorescenssignaler, der er målt som en funktion af koncentrationen af thyroxin (T4), under anvendelse af principperne ifølge den foreliggende opfindelse i en-20 zymimmunoanalyse af den kompetitive type.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en -forbedring af fortrinsvis sådanne enzymimmunoanalyser, hvori der anvendes chromogene stoffer til den kolorimetriske påvisning af analytter omfattende antigener og antistoffer.

25 Forbedringerne, der opnås ifølge den foreliggende opfindelse, som anført ovenfor, er imidlertid i relation til en teknik, som indirekte bestemmer farven, der frembringes ved analysen til bestemmelse af koncentrationen af analytten i prøven.

Ved teknikken ifølge opfindelsen anvendes fluorescens- eller 30 lys spredningsmålinger ved bestemmelsen af mængden af analyt, der er til stede i prøven, snarere end at være baseret på den direkte måling af farveproduktion ved anvendelse af et spek- 8 DK 169710 B1 trofotometer eller lignende, idet det må forstås, at andre lyssignaler, såsom absorbans, også kan påvises ved hjælp af den indirekte kolorimetriske teknik ifølge den foreliggende opfindelse. Det blevet konstateret, at graden af lysspredning 5 eller fluorescens udsendt af den flydende prøve, der undersøges, kan dæmpes som en funktion af koncentrationen af det chromogene materiale, der anvendes i enzymimmunoanalysen. En sådan dæmpning forekommer, når bølgelængden af det indfaldende lys er den samme som eller i alt væsentligt den samme som el-10 ler i nærheden af bølgelængden maksimalt absorberet af det chromogene materiale. Med stigende koncentration af det chromogene materiale stiger lysabsorptionen af det indfaldende-lys derfor, mens graden af lysspredning eller fluorescens formindskes .

15 Der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse tetramethyl-benzidin (TMB) i hydrogenperoxid. Når TMB anvendes som substratet i en enzymimmunoanalyse, hvori enzymet er peroxidase, omdanner enzymet TMB til en oxideret form i nærværelse af et cosubstrat, hydrogenperoxid. Ved neutral pH-værdi har oxideret 20 TMB to hovedabsorptionsmaksima i den synlige del af spektrummet. Et absorptionsmaksima er centreret ved ca. 450 nm og det andet maksima i alt væsentligt ved ca. 655 nm. Efter syrning med en stærk, ikke-oxiderende syre forsvinder absorption ved 655 nm, mens båndet ved 450 nm bevares, men ved en højere 25 eks-tinktionscoefficient (se E.S. Bos et al., 3,3' ,5,5'-tetra-methylbenzidin as an Ames Test Negative Chromogen for Horse-Radish Peroxidase in Enzyme Immunoassay, Journal of Immunoassay 2, 187 (1981)).

I overensstemmelse med et aspekt ifølge den foreliggende op-30 findelse måles et lyssignal, såsom lysspredning, i stedet for at måle farven frembragt af et chromogent materiale, såsom TMB. Tilsætning af en lys spredningskilde, såsom røgbehandlede silicapartikler eller polystyrenmikroperler, til det oxiderede TMB resulterer i dæmpning af lys spredningen målt ved 450 nm, 35 som en funktion af mængden af oxideret TMB til stede, og såle- 9 DK 169710 B1 des indirekte måling af analytkoncentrationen i analyseprøven. Dæmpning af lysspredning målt ved 450 nm som en funktion af koncentrationen af oxideret TMB er illustreret i fig. l. Dæmpningen af lysspredningen ved 450 nm har relation til absorpti-5 onskarakteristika hos det chromogene materiale. Specifikt stiger mængder af lysabsorption og mængden af lysspredning formindskes med stigende koncentration af oxideret TMB, når bølgelængden af det indfaldende lys er den samme som bølgelængden ved maksimal absorption af det oxiderede TMB, i dette 10 tilfælde 450 nm. På den anden side kan det på fig. l ses, at lysspredning målt ved to andre bølgelængder spektralt fjernet fra den maksimale absorptionsbølgelængde af TMB ikke dæmpes over det koncentrationsinterval, der er anført. Da lysspredningspåvisning ved 560 nm og 650 nm forbliver i alt væsentligt 15 konstant over koncentrationsintervallet, kan lysspredning ved disse to frekvenser faktisk anvendes som indre referencebølgelængder, da deres størrelser er uafhængige af det lysabsorberende materiales koncentration. I overensstemmelse hermed kan et .forhold dannes med lys spredningen målt ved bølgelængden 20 ved det chromogene materiales maksimale absorption og ved en anden bølgelængde spektralt fjernet fra bølgelængden for maksimal absorption, og som er uafhængig af koncentrationen af det chromogene materiale. Disse lysspredningsforhold, der er bestemt som en funktion af koncentrationen af oxideret TMB er 25 illustreret i fig. 2.

Det kan i fig. 2 ses, at to forhold er blevet målt, et ved 450 nm/560 nm, og det andet ved 450 nm/660 nm. Begge disse forhold følger dæmpningskurven for det oxiderede TMB, der er illustreret i fig. 1. Fig. 2 viser imidlertid, at 450 nm/560 nm-for-30 holdets nøjagtighed er noget bedre end 450 nm/660 nm-forholdets. Det må forstås, at lysspredning kan måles ved andre frekvenser end 560 nm og 660 nm til tilvejebringelse af forhold, hvori en af bølgelængderne er uafhængig af det chromogene materiales koncentration. Ved at opstille lysspredningsforholdet 35 ved sådanne frekvenser, som illustreret i fig. 2, fås en indre korrektion for påvisningssystemet, som ophæver forskelle i 10 DK 169710 B1 ly svejs længden, optisk kvalitet af prøverøret, røranbringelse, variationer i lampens lys og endda forskelle i koncentrationen af lys spredningskilden, der sættes til prøven.

En anden indirekte kolometrisk teknik til påvisning af en ana-5 lyt i en prøve involverer anvendelsen af to fluorophorer. I stedet for at måle lysspredningskarakteristika af den flydende opløsning indeholdende det chromogene materiale, såsom TMB, måles fluorescens. En af fluorophoreme tjener som et rapporteringssignal, mens den anden fluorophor tjener som et refe-10 rencesignal.

De ved denne fremgangsmåde anvendte fluorophorer er valgt eller udvælges således, at deres respektive excitationsbølge-længder og emissionsbølgelængder er i alt væsentligt spektralt adskilt fra hinanden. Med baggrund i dette trask vælges fluoro-15 phoren, som tjener som rapporteringssignalet, således at exci-tationsbølgelængden og emissionsbølgelængden er ved eller i alt væsentligt i nærheden af det chromogene materiales absor-bansmaksima. F.eks. er det oxiderede TMB7s absorbansmaksima, som anført ovenfor, ved 450 nm. Det er blevet bestemt, at 20 mængden af fluorescens dæmpes som en funktion af koncentrationen af det chromogene materiale, såsom oxideret TMB, hvis bølgelængden af enten excitationen eller emissionen af fluorophoren er ved eller i alt væsentligt i nærheden af den bølgelængde,. som maksimalt absorberes af det oxiderede TMB. Med stigen-25 de koncentration af chromogent materiale stiger mængden af indfaldende lysabsorption, mens graden af fluorescens formindskes .

På den anden side vælges den anden fluorophor, således at den har en excitationsbølgelængde eller emissionsbølgelængde spek-30 trait fjernt fra bølgelængden, der repræsenterer det chromogene materiales absorptionsmaksima. Måling af udsendt fluorescens af den anden eller referencefluorophoren i en spektral region, som ikke overlapper det chromogene materiales absorptionsspektrum, er uafhængig af absorberende stoffers koncen- 11 DK 169710 B1 tration. Ved undersøgelse af forholdet mellem rapporterings-fluorophorens fluorescens ved eller i alt væsentligt i nærheden af det chromogene materiales maksimale absorbansbølgelæng-de og den af referencefluorophoren i en region, der er spek-5 tral fjernet fra det chromogene materiales absorptionsspektrum, giver en målingsteknik, som indirekte måler mængden af farve frembragt i en enzymimmunoanalyse.

Pålideligheden af fluorescenssignalforholdet, idet en fluorophor tjener til rapportering, og den anden fluorophor er refβίο rence, giver de samme fordelagtige træk, som ved det ovenfor beskrevne lysspredningsforhold for den indirekte kolometriske påvisning af analytten i en prøve.

Når fluorescensforholdteknikken anvendes, er det foretrukne chromogene materiale TMB, som, når oxideret, har et absorpti-15 onsmaksima i alt væsentligt ved 450 nm. En række fluorophorer er tilgængelige, som har en excitationsbølgelængde eller emissionsbølgelængde ved eller i nærheden af den samme som oxideret TMB's absorptionsmaksima. F.eks. er Coumarin 343, 9-amino-acridinhydrochlorid og 8-methoxypyren-l, 3,6-trisulfonsyre 20 (MPT) gode kandidater som rapporteringsfluorophoren, idet MPT foretrækkes. MPT exciteres ved ca. 395 nm og har en topemission ved ca. 430 nm. Disse bølgelængder er relativt tæt ved oxideret TMB7 s absorptionsmaksima ved 450 nm.

Forskellige fluorophorer kan også vælges som referencefluoro-25 phoren omfattende oxazin 170 perchlorat og fortrinsvis sulfor-hodamin 101 (SR 101) . SR 101 exciteres ved 589 nm og giver en topemission ved ca. 605 nm. Det kan således ses, at excitations- og emissionsbølgelængdeme for SR 101 er i alt væsentligt spektralt adskilt eller fjernet fra det oxiderede TMB7s bølge-30 længde for absorptionsmaksima, såvel som fra excitations- og emissionsbølgelængdeme for rapporteringsfluorophoren, såsom MPT. Denne spektrale adskillelse muliggør påvisningen af et fluorescenssignal, som er uafhængig af koncentrationen af de absorberende stoffer.

12 DK 169710 B1

Med hensyn til referencefluorophoren bør den endvidere vælges således, at der er ingen eller i alt væsentligt ingen dæmpning af signalet i forhold til de forskellige koncentrationer af det chromogene materiale, såsom TMB. Med henblik på dette tje-5 ner referencefluorophoren som en indre referencesystemkorrektion for en række faktorer omfattende røranbringelse, diameter eller optisk kvalitet. Ved udvælgelse af henholdsvis rapporteringsfluorophor og referencefluorophor bør rapporteringsfluorophoren derfor have dens grad af fluorescens dæmpet som en 10 funktion af koncentrationen af det chromogene materiale ved eller i nærheden af dets absorptionsmaksima, mens graden af fluorescens fra referencefluorophoren bør forblive relativt konstant som en funktion af det chromogene materiales koncentration. Det bør bemærkes, at nogle fluorophorer, såsom SR 15 101, kan tjene som referencefluorophoren så længe som fluores censgraden forbliver forholdsvis konstant, som en funktion 'af det chromogene materiale i korte tidsperioder efter tilsætningen af stopreagenset, såsom mindre end 2 minutter.

Enzymimmunoanalyser for en række analytter er de typer ana-20 lyser, der vælges til den indirekte kolorimetriske påvisningsmetode ifølge den foreliggende opfindelse. P.eks. undersøges analytter, såsom humant choriongonadotropin (hCG) ved undersøgelse af kvinders graviditet, luteiniseringshormoner (hLH) undersøges ved undersøgelse af kvinders frugtbarhed, thyroidsti-25 muleringshormon, thyroxin og analyser til undersøgelse af visse bakterier og mikroorganismer udføres under anvendelse af enzymimmunoanalyser og kolorimetriske påvisnings teknikker. Den foreliggende opfindelse er imidlertid ikke begrænset til påvisning af de førnævnte analytter, da sådanne analytter blot 30 er eksempler på de mange forskellige slags analytter, som kan måles under anvendelse af den indirekte lyspåvisningsteknik ifølge den foreliggende opfindelse.

Hvad angår partiklerne, som sættes til analyseprøven som en lys spredningskilde, er der en række alternativer tilgængelige.

35 Mikropartikler med en gennemsnitlig diameter i området fra DK 169710 Bl 13 mellem 0,010 og 0,014 μτα indbefattes fortrinsvis i den flydende opløsning, gennem hvilken lys rettes, således at når lys rammer disse partikler, opnås en spredningseffekt. Mikroper-ler, såsom sådanne, der er fremstillet af polystyren eller an-5 dre materialer med en densitet, der er ca. den samme som vands densitet, er egnede som en kilde til tilvejebringelses af lysspredningseffekten. Det foretrækkes, at sådanne mikroperler i alt væsentligt ikke har nogen sekundære emissionsegenskaber, som kan forvanske aflæsningerne. Mest foretrukket har det i-10 midlertid vist sig, at mikropartikler i det ovenfor nævnte størrelsesområde dannet ud fra røgbehandlet silica virker mest tilfredsstillende ifølge den foreliggende opfindelse. Det -har vist sig, at en fortynding af røgbehandlet silica i citronsyre frembringer en lysspredningsreaktion, som er lineær med kon-15 centrationen af røgbehandlet silica op til 0,3% (vægt/volu-men) . Mængden af røgbehandlet silica, der tilsættes til forskellige rør, kan. faktisk variere uden at påvirke lysspred-ningsaflæsningerne, fordi målingen af lysspredning som et forhold kompenserer for sådanne forskelle.

20 Velkendte enzymimmunoanalyseteknikker kan anvendes hermed.

F.eks. et forsøgsrør eller lignende typisk fremstillet ud fra klart eller gennemsigtigt plast omfattende et antistof for antigenet eller analytten, der er af interesse, bundet til de indre overflader deraf. I et eller flere trin forenes et en-25 zymmærket antistofkonjugat og en flydende prøve, der skal undersøges for analytten, i røret, således at analytten binder til det bundne antistof og til konjugatet til dannelse af et immunologisk kompleks i fast fase. Dette immunologiske kompleks er repræsentativt for en sandwichdannelse, der forekom-30 mer mellem det i fast fase bundne antistof, analytten og det enzymmærkede antistof, således at mængden af enzymmærket antistof, der er bundet til den faste fase, er direkte proportionalt med analytkoncentrationen i prøven. På sædvanlig måde bortvaskes uomsatte reagenser fra røret, og substratet sættes 35 derefter til for at påbegynde enzymreaktionen.

14 DK 169710 B1 I en foretrukken udførelsesfom herunder omfatter enzymreaktionen tilsætningen af både hydrogenperoxid og TMB til røret, hvorved TMB aktiveres (oxideres) resulterende i frembringelsen af farve inden i røret efter en given tidsperiode. Koncentra-5 t ionen af det oxiderede TMB inden i røret er direkte proportionalt med koncentrationen af analytten i prøven. En syreopløsning tilsættes derefter til røret for at standse enzymreaktionen. Analyser af denne type kan rapporteres ved hjælp af måling af lyssignalet ved anvendelse af et spektrofotometer 10 eller fluorometer. Disse farvepåvisningsinstrumenter er velkendte og omfatter typisk en lampe som en lyskilde, en holder eller indretning til fastholdelse af forsøgsrøret, et fotomul-tiplikatorrør og optik til påvisning af lyset. For så vidt som spredt lys kan påvises i en hvilken som helst retning kan an-15 bringeisen af lyspåvisningsudstyret inden i instrumentet variere. F.eks. kan, hvis et fluorometer anvendes, fluorescens påvises ved 90° i forhold til den indfaldende lysstråle. I overensstemmelse med et andet aspekt ifølge opfindelsen kan fluo-rometrets optik modificeres således, at lysspredning i stedet 20 for fluorescens påvises ved 90° i forhold til den indfaldende lysstråle. X spektrofotometre kan farve måles i den fremadrettede retning i forhold til den indfaldende lysstråle. Sådanne instrumenter kan modificeres til påvisning af spredning snarere end farve i den fremadrettede retning. Lys spredningen 25 kan også påvises i andre retninger.

Når der anvendes en lampe, såsom en wolframlampe, som lyskilden, tilvejebringes typisk en spektral righoldig stråle af lys med bølgelængder mellem 350 nm og 800 nm. Med sådant spektralt righoldigt lys kan det være nødvendigt at filtrere lysstrålen 30 på den indfaldende side af forsøgsrøret eller på spredningssiden eller begge. Ved anvendelse af passende filtre er det muligt at opnå det højest mulige signal, hvad enten der måles lysspredning eller fluorescens ved den maksimale absorptionsbølgelængde for det chromogene materiale. Udvælgelse og an-35 bringelse af de passende filtre afhænger af'det valgte chromogene materiale, da dæmpningbølgelængde og referencebølge- 15 DK 169710 B1 længden kan variere fra materiale til materiale. Filterudvælgelse og anbringelse kan let foretages af en med almindelig viden inden for optikområdet.

De følgende eksempler gives som eksempler på teknikken ifølge 5 den foreliggende opfindelse, men det må forstås, at opfindelsen ikke skal opfattes som begrænset dertil.

EKSEMPEL I

Et lysgennemtrængeligt polystyrenrør har dets indre overflader belagt med anti-hCG. Til dette rør sættes 100 mikroliter af en 10 1:50 fortynding af anti-hCG-peroxidasemærket konjugat og 100 mikroliter af en flydende prøve, der skal undersøges for og menes at indeholde hCG. Reaktionen fik lov til at foregå i 30 minutter ved 37°C, og inkubatet blev derefter opsuget. Efter vask af røret 3 gange, hver gang med 2 ml 0,05% "Tween" i 15 vand, blev 200 mikroliter substrat indeholdende både tetrame-thylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid tilsat, og blandingen fik lov til at blive inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Til røret blev derefter sat 1 ml 1 M citronsyre, der indeholdt 0,3% (vægt/volumen) røgbehandlede silicapartikler med 20 en gennemsnitlig diameter på ca. 0,014 μτη. Røret blev derefter anbragt i et optisk modificeret fluorometer, og lys blev rettet gennem rørets vægge ind i suspensionen. Lys spredt ved 90° i forhold til den indfaldende lysstråle blev påvist ved både 450 nm og 560 nm, og resultaterne blev udtrykt som et forhold 25 mellem de to bølgelængder. En standardkurve blev fremstillet ved anvendelse af de samme trin som anført ovenfor med prøver, der indeholdt kendte koncentrationer af hGC, og resultaterne, der fremkom derved, er vist i kurven i fig. 3. Ved at sammenligne forholdet for den ukendte prøve fremkommet ved instru-30 mentaflæsning med forholdet for standardkurven på fig. 3, blev hCG-koncentrationen i den ukendte prøve bestemt.

16 DK 169710 B1

EKSEMPEL II

En lysgennemtrængeligt polystyrenrør har dets indre overflader belagt med anti-hLH. Til røret blev sat 100 mikroliter af en 1:50 fortynding af anti-hLH-peroxidasemærket konjugat og 100 5 mikroliter af en prøve, der skal undersøges for og menes at indeholde hLH. Reaktionen fik lov til at foregå i 1 time ved 37°C, og ihkubatet blev derefter opsuget. Røret blev vasket 3 gange hver gang med 2 ml 0,05% "Tween" i vand. Til det vaskede rør blev sat 200 mikroliter substrat, der indeholdt både te-10 tramethylbenzidin (TMB) og hydrogenperoxid, og reaktionen fik lov til at foregå i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 1 ml 1 M citronsyre indeholdende 0,3% (vægt/volumen) partikler af røgbehandlet silica med en gennemsnitlig diameter på ca. 0,014 μτα. Røret blev anbragt 15 i et fluorometerinstrument, der var optisk modificeret til aflæsning af lysspredning opsamlet ved 90° i forhold til den indfaldende lysstråle. Lys spredningen blev påvist ved både 450 nm og 560 nm, og resultaterne blev udtryk som et forhold mellem lys spredningen ved de to bølgelængder. En standardkurve 20 blev fremstillet, hvori forholdene blev målt som en funktion af kendte koncentrationer af hLH. Denne standardkurve er vist i fig. 4. I prøven, der blev undersøgt, blev lys spredningsforholdet aflæst på instrumentet sammenlignet med standardkurven i fig. 4, således at koncentrationen af hLH i den ukendte 25 prøve blev konstateret.

EKSEMPEL III

Et lysgennemtrængeligt polystyrenrør har dets indre overflader belagt med anti-hCG. Til dette rør blev sat 100 mikroliter af en 1:200 fortynding af anti-hCG-peroxidasemærket konjugat og 30 100 mikroliter af en prøve, der skal undersøges for og menes at indeholde hCG. Reaktionen fik lov til. at foregå i 15 minutter ved 37°C og ihkubatet blev derefter opsuget. Efter vask af røret tre gange, hver gang med 2 ml 0,05% "Twéen” i vand, blev 200 mikroliter substrat indeholdende både TMB og hydrogenper- 17 DK 169710 B1 oxid sat til hvert rør. TMB indeholdt 1,7 mikro-M MPT og 8,6 mikro-M SR 101. Denne blanding fik lov til at blive inkuberet i 15 minutter ved 37°C. Røret blev derefter tilsat 0,8 ml 1 H citronsyre. Røret blev derefter anbragt i et fluorometer, som 5 omfattede et 395 nm filter på excitationssiden og et 430 nm filter på emissionssiden for MPT-fluorophoren. Fluorometeret omfattede et 589 nm filter på excitationssiden og et 605 nm filter på emis s ions s iden for SR 101-fluorophoren. Lys fra en lampe blev rettet gennem rørets vægge ind i opløsningen. Flu-10 orescens blev påvist ved 430 nm og 605 nm, og resultaterne blev udtrykt som et forhold mellem de to bølgelængder. En standardkurve fremstillet ved anvendelse af de samme trin, som nævnt ovenfor med prøver indeholdende kendte koncentrationer af hCG, og resultaterne, der fremkom derved, er vist i kurven 15 i fig. 5. Ved sammenligning af fluorescensforhold for den ukendte prøve fremkommet ved instrumentaflæsning med forholdet for standardkurven i fig. 5, blev hCG-koncentrationen i den ukendte prøve bestemt.

EKSEMPEL IV

20 I en fremgangsmåde, der ligner den, der er beskrevet i de foregående eksempler, blev et rør belagt med anti-hTSH. Til dette rør blev tilsat 100 mikroliter af en 1:200 fortynding af anti-hTSH-peroxidasemærket konjugat og 200 mikroliter af en prøve, der skal undersøges for og menes at indeholde hTSH.

25 Reaktionen fik lov til at forløbe i 30 minutter ved 37°C, og inkubatet blev derefter opsuget. Røret blev vasket tre gange hver gang med to ml 0,05% "Tween" i vand. Til det vaskede rør blev tilsat 300 mikroliter substrat indeholdende TMB og hydro-genperoxid, og de to ovennævnte fluorophorer, MPT og SR 101.

30 Reaktionen fik lov til at forløbe i 7 minutter ved 37°C, og reaktionen blev standset ved tilsætning af 0,8 ml 1 M citronsyre. Røret blev aflæst i fluorometeret som beskrevet i eksempel III, og resultaterne blev udtrykt som et forhold MPT/SR 101 til koncentrationen af hTSH, der oprindeligt var i prøven.

35 Typiske resultater er illustreret i fig. 6.

18 DK 169710 B1

EKSEMPEL V

Et lysgennemtrængeligt polystyrenrør havde dets indre overflader belagt med anti-T4. Til det belagte rør blev tilsat 300 mikroliter af en 1:15.000 fortynding af peroxidasemærket T4-5 konjugat og 25 mikroliter af en prøve, der skal undersøges for og menes at indeholde T4. Reaktionen fik lov til at forløbe i 15 minutter ved 37°C, og inkubatet blev derefter opsuget. Røret blev vasket 6 gange hver gang med 0,5 ml 0,5% "Tween"-20 i vand. Til det vaskede rør blev tilsat 300 mikroliter substrat 10 indeholdende TMB og hydrogenperoxid, og de to fluorophorer MPT og SR 101. Reaktionen fik lov til at forløbe i 15 minutter ved 37°C, og reaktionen blev standset ved tilsætningen af 0,8 ml 1 M citronsyre. Røret blev derefter aflæst i et fluorometer, som beskrevet i eksempel 3, og forholdet MPT/SR 101 blev optegnet 15 som en funktion af mængden af T4, der oprindeligt var tilsat røret. Typiske data er illustreret i fig. 7.

Således beror den foreliggende opfindelse på forholdene mellem lyssignaler til den indirekte kolometriske påvisning af en analyt, der har interesse. Anvendelsen af forholdsmetoden, som 20 beskrevet heri, giver en indre korrektionsmekanisme, som ophæver forskelle i lysvejslængde, rørets optiske kvalitet, røranbringelse, variationer i lampens lys og lignende faktorer, som påvirker systemets optik. I konventionel kolorimetri korrigeres . forskelle, såsom fluktuation i lampens lys og vejlængde 25 typisk ved anvendelse af et dobbeltstrålespektrometer og matchede cuvetter til alle målinger. Da der ved påvisningen ifølge den foreliggende opfindelse ikke anvendes en dobbeltstråle og forskellige cuvetter anvendes til hver måling, tjener forholdsmetoden beskrevet heri som en effektiv måde til elimine-30 ring af disse virkninger.

Claims (3)

19 DK 169710 B1

1. Fremgangsmåde ved anvendelse af en enzymimmunoanalyse til måling af koncentrationen af en analyt i en prøve ved indirek-5 te kolorimetrisk påvisning, kendetegnet ved, at man: a) forener et peroxidasemærket antistofkonjugat, en prøve, der skal undersøges for en analyt, og et antistof, der er bundet til de indre overflader i et gennemsigtigt plastrør, således 10 at analytten binder til det bundne antistof og konjugat til dannelse af et immunologisk kompleks i fast fase, b) tilblander i røret en flydende opløsning indeholdende et tetramethylbenzidin og hydrogenperoxid til fremkaldelse af en reaktion med det immunologiske kompleks og til aktivering af 15 tetramethylbenzidinet til en kolorimetrisk reaktion, c) sætter til blandingen en sur partikelholdig opløsning, der standser reaktionen og forårsager tilvejebringelse af en stabil partikelformig suspension, d) dirigerer indfaldende lys med flere bølgelængder igennem 20 røret ind i suspensionen, idet en første bølgelængde af nævnte indfaldende lys i alt væsentligt er ved 450 nm, ved hvilken aktiveret tetramethylbenzidin ved absorption dæmper mængden af lys spredt fra nævnte indfaldende lys som en funktion af den stigende koncentration af den tilstedeværende analyt, idet en 25 anden bølgelængde er spektralt fjernet fra. den første bølgelængde, og ved hvilken der i alt væsentligt ingen dæmpning af lysspredning forekommer med den stigende koncentration af analytten, e) påviser lys spredningen af suspensionen ved nævnte første og 30 nævnte anden bølgelængde og danner et forhold mellem de to respektive bølgelængder, og 20 DK 169710 B1 f) sammenligner det dannede forholds størrelse med størrelsen af et forhold, der er forbundet med påvisning af lysspredning, hvor trinnene (a) til (e) udføres med prøver, der indeholder kendte koncentrationer af analytten, hvorved koncentrationen 5 af analytten i prøven måles.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at analytten vælges blandt humant choriongonadotropin og lute-iniseringshormon.

3. Fremgangsmåde ved anvendelse af en enzymimmunoanalyse til 10 måling af koncentrationen af en analyt i en prøve ved indirekte kolorimetrisk påvisning, kendetegnet ved, at man: a) forener et peroxidasemærket antistofkonjugat, en prøve, der skal undersøges for en analyt, og.et antistof, der er bundet 15 til de indre overflader i et gennemsigtigt plastrør, således at analytten binder til det .bundne antistof og konjugatet til dannelse af et immunologisk kompleks i fast fase, b) tilblander i røret en flydende opløsning indeholdende et tetramethylbenzidin og hydrogenperoxid til fremkaldelse af en 20 reaktion med det immunologiske kompleks og til aktivering af tetramethylbenzidinet til en kolorimetrisk reaktion, c) sætter til blandingen en første fluorophor, der forårsager fluorescens ved eller i nærheden af det aktiverede tetrame-thylbenzidin' s absorbansmaksima som en funktion af den stigen- 25 de koncentration af den i prøven tilstedeværende analyt, d) sætter til blandingen en anden fluorophor, der i alt væsentligt ikke har nogen dæmpning af dens fluorescens som koncentrationen af analytten stiger og forårsager fluorescens ved en bølgelængde spektralt fjernet fra den af det aktiverede 30 tetramethylbenzidin, 21 DK 169710 B1 e) tilsætter en sur opløsning, f) dirigerer indfaldende lys med flere bølgelængder igennem røret ind i den sidstnævnte blanding, idet bølgelængderne omfatter en bølgelængde ved eller i nærheden af det aktiverede 5 tetramethylbenzidin's absorbansmaksima, og omfatter bølgelængder, der forårsager excitation af den første og den anden fluorophor, g) påviser fluorescens udsendt af fluorophorerne og danner et forhold mellem de to fluorescensbølgelængder, og 10 h) sammenligner det dannede forholds størrelse med størrelsen af et forhold, dér er forbundet med påvisning af fluorescens, hvor trinnene (a) til (g) udføres med prøver, der indeholder kendte koncentrationer af analytten, hvorved koncentrationen af analytten i prøven måles. 1