JPH07505471A - 分離プロセスのための方法および検出器 - Google Patents
分離プロセスのための方法および検出器Info
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- JPH07505471A JPH07505471A JP5517383A JP51738393A JPH07505471A JP H07505471 A JPH07505471 A JP H07505471A JP 5517383 A JP5517383 A JP 5517383A JP 51738393 A JP51738393 A JP 51738393A JP H07505471 A JPH07505471 A JP H07505471A
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- G01N30/6052—Construction of the column body
- G01N30/6082—Construction of the column body transparent to radiation
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
分離プロセスのための方法および検出器生物科学の分野において、生体分子の複
雑な混合物を分析することがかなり要求される。その例は臨床分析における代謝
物質、タンパク質、抗体および薬剤の分析である。他の例は遺伝子工学により特
定されたタンパク質の発酵におけるタンパク質組成の分析である。
バイオ分析を行なう通常の方法は試料をその成分に分離し、次にその成分を定量
することである。従来の分離法はクロマトグラフィーおよび電気泳動法である。
電気泳動法は分析法として有力である。
その理由はこの方法の分離能力が高いからであり、このことはとりわけ多(の成
分を一度に、また同一の試験で分析できることを意味する。分離された物質に適
した検出法と組合せた場合、本性もまた非常に感度をよ(することができる。他
方、本方法は一般に遅く、典型的な分離時間は1〜10時間である。
ここ数年の間、特定の形態の電気泳動法、すなわち毛管電気泳動法が相当注目を
集めている。電気泳動プロセスは石英の細い毛管(内径:約0.005〜0.1
++*)中で起こる。細い毛管は電気泳動プロセス中に生じるジュール熱を容易
に冷却する。したがって、電気泳動分離において非常に高い電界強度、例えば3
00V/cmを使用することができる。高い電界強度は非常に急速な泳動速度を
与えるため、毛管電気泳動法では分離時間が好都合に短くなる。通常の電気泳動
法において、温度勾配が分離層で容易に起こる。温度勾配は試料成分の分離を相
当減じる。この問題は、細い毛管が容易に冷却し、そのため問題の温度勾配をひ
き起こさない毛管電気泳動法により解決される。結果として、毛管電気泳動法に
おいては分離能力もまた非常によい。実刑となる論文がH,Carchonおよ
びE、Eggermontにより書かれている[International
Chromatography Laboratory、第6巻。
第17〜22頁(1991年)〕。
毛管電気泳動法により分離された混合物の検出および定量は通常、紫外/可視検
出器またはケイ光検出器を用いて行なわれる〔毛管電気泳動法における種々の検
出原理についての論文がLC−GC,第8巻。
No、 10.第788〜799頁(1990年)において0.1. Good
all、 DJ、 LloydおよびS、J、filliamsにより書かれて
いる〕。これらの検出器は常に毛管の一端に配置される。通常、光線は毛管を垂
直に通過し、そして検出器は通過した光の量または放出されたケイ光の量を測定
する。これにより、分離された物質はそれらが検出器を通過するにつれて順々に
検出される。このことは、すべての物質が検出器を通過するまで電気泳動を継続
しなければならないことを意味する。しばしば試料中の物質の数は不明であり、
そのため電気泳動試験は確実にすべての試料成分が検出器を通過するように、実
際に必要な時間よりかなり長〈実施しなければならない。このように毛管電気泳
動法の制限要因、すなわち、連続的な検出原理、換言すれば試料成分が順々に検
出されることが示される。代わりにもしも毛管全体が特定の検出器により瞬時に
検査される検出原理が得られるならば、すべての成分が同時に検出される同様の
検出原理が得られる。本発明はこのような原理および適当な装置の構成を開示す
る。
新規な検出原理は短い間隔で毛管全体を検査し、毛管中の試料成分の場所を記録
する検出器により毛管電気泳動を監視することにある。同時に、検出器は試料成
分のスペクトル特性を記録し、このことはそれらの同定を容易にする。得られる
データはコンピューターに記憶させる。
機能の特徴を説明するために、以下の短い装置についての記載は手引きとなるも
のと思われる(より詳細な記載がさらに与えられる):本発明の検出器は強力な
光源、例えばレーザーからなる。レーザーは好ましくは短い時間間隔で毛管全体
を照射する。各照射により、空間的に分離された試料物質はケイ光を発する。毛
管からのケイ光発光はレンズンステムを経てCCD(電荷結合素子)検出器上に
焦点が合わせられ、毛管の外観の電子像を形成する。コンピューターはこの像を
記憶する。各照射時間の間、試料成分は少し移動し、この移動はCCD検出器に
より記録される。コンピューターは連続的に記憶データを変換し、そしてリアル
タイムで分離の進行をディスプレーのスクリーン上に示すことができる。このこ
とは非常に大きな利点である。試料成分の分離が十分な精度でこれらを定量する
のに十分良好である場合、それはコンピューターのスクリーン上で直接見られる
。場合によっては、コンピューターは自分でこの判断を行なってもよい。このこ
とは分離が毛管の端部に位置する検出器の場合よりもかなり早く停止されつるた
め、時間の大きな節約を意味する。これは試料が非常にゆっくり泳動する成分を
含有する場合特にそうである。
本発明においては、十分に良好な分離が達成された時に電気泳動プロセスの極性
を逆にし、そして試料を後方に洗い流して次の試料のための毛管を準備すること
ができる。試料がゆっくり泳動する物質を含有する場合、本発明が効率(試料/
時間)を10倍程改善することは容易に理解される。
新規な検出器の別の利点はオペレーター/コンピューターが分離プロセスのすぐ
れた制御を有することである。連続的な検出を伴なうすべての分離プロセス、例
えば通常の毛管電気泳動法は分離が停止された時にすべての成分が実際に検出器
に到達していることを確認できないという問題がある。この問題は本発明に従っ
て分離毛管全体を監視することにより効果的に解決される。
新規な検出器を特に利用しつる分野かい(つか考えられる。それらのうちの1つ
は信頼できる測定法と組合わせた分析スピードが非常に重要である遺伝子の配列
分析である。複製抑制が制御された(controlled 1nterrup
ted replication) Sanger法により生成した試料は様々
な長さのオリゴヌクレオチドの混合物からなる。オリゴヌクレオチドはケイ光染
料、例えばアルゴンレーザー(514n鶴)による励起によく適応するローダミ
ン110、ローダミン6G、テトラメチルローダミンおよびX−ローダミンで標
識される。非常に迅速な分離サイクルがここでは可能である。十分な分離が達成
されるとすぐ、システムは電極を逆にすることにより再生されうる。そのため、
通常実用的に処理するものよりかなり長い配列を取り扱うことができる。
他の非常に興味深い分野はタンパク質−リガント相互作用の研究である。タンパ
ク質かりガントよりも高い泳動速度を有する場合、リガンドが最初幌毛管に加え
られる。しばらくして、タンパク質が加えられる。タンパク質はゆっくり泳動す
るリガンドセグメント中に泳動し、さらにしばら(してそれはりガントセグメン
トを完全に通過する。その通過に関連して、成分の泳動速度に反映する相互作用
が起こる。新規な検出器はこれらの相互作用を非常に正確に追跡することができ
る。その後、生じる前部およびそれらの組成を分析することにより、非常に興味
深い情報が平衡定数および動力学速度定数に関して抜粋されうる。
本発明の上記の記載は毛管電気泳動法に関する。同じ原理の利点は動電学的なり
ロマトグラフィー、すなわち実際の分離プロセスは電気泳動ではなくクロマトグ
ラフィーによるものである毛管電気泳動装置を使用する分離法にあてはまる。薄
いガラスまたはシリカカラムを使用する1(P!、C技術による分離もまた、新
規な検出法として利用することができる。
光源(レーザーまたは他の光源)を毛管に接続する種々の方法を含む、本発明の
別の態様が多数ある。1つの方法はファイバーをその縦方向に対して垂直に照射
することである。別の方法は励起光を毛管の端面に導入することである。この方
法は漂遊光の量が最小となるので特に均一で有効な照射を同時に行なうことが期
待される。
多(のタイプのレーザーを励起源として使用することができ、その選択はとりわ
け所望の励起波長により決定される。HeCdレーザー(例えば1.1conj
x社製)は442および325nmで適当な線を与える。小形のアルゴンイオン
レーザ−(例えば5pectra Physics社製)は青−縁線を与えるが
、紫外光もまた350nm付近で得られる。脈動窒素レーザー(例えばLa5e
r 5cience社製)は337n11で発光し、また任意の可視波長を発生
させる染料レーザーをポンプするのに使用されうる。
波長の区別なしにすべてのケイ光は、励起レーザー光が鋭い広域通過フィルター
、好適にはカラーフィルター(例えば5chott社製)により抑制された後、
直線状の検出器(ダイオード列)上に像が作られる。この目的に適したダイオー
ド列は例えばEG & G社またはRcticon社により販売さオ]ている。
ダイオード列は大抵25nmの長さで1024個のダイオードを有するが、より
長い設計のものもまた入手できる。レンズンステムはまっすぐな毛管が、各ダイ
オードが毛管に沿って特定の位置に対応するように正しい縮小でダイオード列上
に像を作るように選択される。空間的に分離された検出器の信号は制御ユニット
を経てコンピューターに読み取られる。脈動励起源(例えば窒素レーザー)が使
用される場合、同時にバックグラウンド光が抑制されるようにケイ光を有効に増
幅するためゲート付ミクロチャンネルプレートがダイオード列の前に使用されつ
る。
検出器システムは同時に空間的に分離された信号が記録されるように、ケイ光の
入ベクトルの色分布もまた達成されうる場合に特に有用である。これは毛管の像
を分光計の入口スリット上に作ることにより行なうことができる。このスリット
はスリット方向に対して垂直に光をスペクトル分解する格子溝と平行に配置され
る。焦点面において、光は一方の次元が毛管に沿って様々な位置に対応し、そし
て相当するスペクトルが他方の次元にある二次元CCD検出器上に落ちる。読み
取りユニットを経て様々な位置のスペクトルが読み取られる。このように配置さ
れる分光計(イメージング分光計)はサテライトに搭載された遠隔分析センサー
から知られている。コンピューターは厳密な分析においてスペクトルを評価し、
これらを記憶された参照スペクトルと比較する。別法として、所定の波長範囲の
強度が既知の発光を有するケイ光ラベルの発光バンドに対応して読み取られる。
限定スペクトル分析もまた、ケイ光が特定のミラーンステムにより最初に、例え
ばそれぞれイメージラインに焦点が合せられる4つの部分に分割される場合、直
線状の検出器(ダイオード列)を利用することにより達成されうる。ミラーの正
確な位置調整により、これらのイメージラインは直線状の検出器に沿って順々に
列に配置されうる。4つの別個のビームの中に、帯域通過フィルターが導入され
、それは例えばDNA配列分析に使用されるケイ光ラベルからケイ光を分離する
。このようにして、空間的に分離された像が同時に得られ、それから毛管に沿っ
て様々なラベルの位置がわかる。ここでスウニーデン特許第455.646号に
開示されている技術(ケイ光イメージングシステム)によりケイ光のビーム分割
および記録法が行なわれる。
上記したように、各成分の適当な分離が達成された時に、信号が読み取られ、分
析される。しかしながら、各成分はそれぞれ均一な速度で泳動するため、毛管の
情報は長い時間間隔の間に数回読み取られ、コンピューターで共に計算されて好
ましい信号強度および分解性の組合せを示す信号とされる。このように、スピー
ドおよび分解に関して最適な機能が本発明の原理に基づ(測定器において達成さ
れうる。
図1は検出器としてダイオード列を用いた実験構成を示す。光学素子と関連のあ
るレーザー光源(1)は毛管電気泳動用毛管(2)を照射する。その後、毛管中
に存在する物質(3)はケイ光を発する。ケイ光はレンズシステム(4)により
ダイオード列(5)上に焦点が合わせられる。ダイオード列からの信号は、その
ディスプレーのスクリーン上に分離された物質(3)の位置をリアルタイムで示
すことができるコンピューター(6)に送られる。
図2は検出器として冷却CCDカメラを用いた実験構成を示す。電カニニット(
1)はその中で試料成分の分離が行なわれる毛管(2)に電圧を印加する。レー
ザー光源(3)は変調レンズシステム(4)を経て毛管(2)を照射する。毛管
(2)中でケイ光を発する試料成分からのケイ光はレンズシステム(5)および
光増幅器(6)を通過して冷却検出器ユニットを用いたCCDカメラ(7)に入
る。CCDカメラからの信号は像処理プログラムを備えたコンピューター(8)
に送られる。コンピューターのディスプレースクリーンは毛管(2)中の分離プ
ロセスをリアルタイムで示す。
もちろん、本発明は上記した、また図面に示した態様に制限されないが、請求の
範囲で定義されたような本発明の一般的な概念から逸脱することなく多くの変更
および変形を行なうことができる。
F工GURE I
F工GORE 2
補正書の翻訳文提出書
(特許法第184条の8)
平成6年10月6日
Claims (10)
- 1.検出および定量が毛管の全長またはその長さの大部分について短い時間間隔 で同時に行なわれることを特徴とする、細い毛管中で分離される物質を検出およ び定量する方法。
- 2.検出が試料成分のケイ光に基づいている請求項1記載の方法。
- 3.検出が試料成分の光散乱に基づいている請求項1記載の方法。
- 4.使用される光源がレーザーである請求項1〜3記載の方法。
- 5.分離原理が毛管電気泳動法である請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 6.分離原理がカラムクロマトグラフィーである請求項1〜4のいずれか1項記 載の方法。
- 7.毛管全体または毛管の大部分を照射する光源および短い時間間隔で試料成分 から発光される光または試料成分により吸収される光を記録するイメージング検 出器を包含することを特徴とする、毛管電気泳動法、動電学的なクロマトグラフ ィーまたはカラムクロマトグラフィーにより分離される試料成分を検出するため の装置。
- 8.イメージング検出器が、入口スリット上に毛管の像が作られる分光計がその 前にあるCCD(電荷結合素子)であり、空間的に分離される試料成分は空間的 分離が検出器の一方向で、そしてスペクトル分離がその他方向で達成されるよう にスリットに対して垂直にスペクトル分離される請求項7記載の装置。
- 9.イメージング検出器が、試料から発光される光が少なくとも2つ、好ましく は4つの部分に分割され、それそれスペクトルフィルターを通り;様々な光がダ イオード列に順々に機械的調整により配置され;同時に空間的に分解されるケイ 光を所定数のスペクトルバンドで記録するビーム分割システムがその前にあるダ イオード列である、請求項7記載の装置。
- 10.記録データが、各試料成分がそのスペクトル特性に基づいて特性決定され 、そしてコンピューターに記憶されたスペクトル情報と比較することにより分類 が行なわれるように、コンピューターによって共に処理される請求項8または9 記載の装置。
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