JPS62103570A - 特異的ポリヌクレオチド類の均一系測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術的背景〕 （発明の分野） 緯酸のハイブリ・ソド］Ｆｇ成は、緯酸の同一性解明に
用いられて来た。ハイブリッド形成は、相補的塩基対形
成に　基づく。一本鎖核酸類を溶液中でインキュベート
すると、相補的塩基配列が対になって安定した２本鎖ハ
イブリッド分子が生成する。

一本鎖のデオキシ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮ
Ａ）がその相補的核酸配列と水素結合構造を生成する生
成能は、組換えＤＮＡ研究の分析手段として用いられる
。高い比活性を有する放射性ヌクレオチド三燐酸の入手
が可能となり、そしてこれらのヌクレオチドを核酸プロ
ーブへ挿入する合成方法が提供されたので、生物学的に
重要な多くの核酸配列を同定し、単離し、特質を確かめ
ることができるようになった。宿主の核酸構成を変える
ことによって生じる疾病状態の診断に、核酸ハイブリッ
ド形成は大きな威力を示す。これらの核酸構成の変化に
は、ＤＮＡの挿入、欠失、点突然変異等により、または
細菌、糸状菌１．真菌、ウィルス等の感染によって外来
性ＤＮＡを獲得することによるＤＮＡの遺伝的または環
境的変化か含まれる。核酸ハイブリッド形成は、今まで
学問上、もしくは産業上の分子生物学実験室で主として
用いられて来た。核酸ハイブリッド形成を臨床医学にお
ける診断手段して用いる応用は、簡単で感度の良い、自
動化された、同位充水を使用しない迅速すＤ　Ｎ　Ａハ
イブリッド形成分析が提供されなかったため、今まで行
なわれなかった。

現在、ＤＮＡプローブの検出方法は、一般に目標核酸を
ニトロセルロース紙、セルロース紙、ノアゾ化紙、また
はナイロン膜のような固体支持体に固定化することによ
って行なわれる。目標核酸を支持体に固定後、該支持体
を好適な標識プローブ核酸と約２〜４８時間接触させる
。面記時間が経過したら、固体支持体を上昇した温度で
数回洗浄し、結合しなかったプローブを除去する。つい
で支持体を乾燥し、このハイブリッド形成した材料をオ
ートラジオグラフィーまたは比色分析等の方法で検出す
る。

現在の方法は長時間を要し、また大変な手間がかかる。

そのような理由で、現在の方法を臨床検査に応用するこ
とは今まで行なわれなかった。そのような応用には、迅
速簡単にＤＮＡ配列を検出する同位元素を使用しない均
−系の方法が必要である。

（先行技術の説明） ランジャーらはビオチン標識ポリヌクレオチドの酵素的
合成方法と、これらの物質を新規ヌクレオチド親和性プ
ローブとして使用することを開示した〔プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシス・オブ・ジ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７８巻、６６３３〜
６６３７頁（１９８１年）〕。ビオチン標識ハイブリッ
ド形成プローブを使用して、培養細胞およびパラフィン
包埋組織切片中のウィルス・ゲノムを検出ｔろことかブ
リガティらによって論じられた〔ビＣ７０ノー（ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）、１２６巻、３２〜５０頁（１９８３年）
〕。一段階サンドイッチ・ハイブリッド形成試験によっ
て微生物核酸を検出する方法が米国特許第４４８６５３
９号に開示された。ＤＮＡ検出に基づいた感度の良い悪
性日＋ＲＫｉ”ｔ［全Ｍ平田ａ’；へ一笛ＡＪＱｎＡ７
９．ｐ＋、−＝；コ、ｔａ−すれた。米国特許第４４８
００４０号には、診断すべきウィロイドまたはウィルス
核酸と相補的な放射能標識ＤＮＡを使用する植物ウィロ
イド疾患らしくはウィルスの感度の良い迅速診断方法が
開示されている。ヨーロッパ特許出願公告第８３１０６
１１２．２号では、修飾標識したヌクレオチドおよびポ
リヌクレオチド類を提供し、それと同じものの調製方法
および利用方法、検出方法を教示している。細胞ＤＮＡ
の検出および測定方法と、それに使用する組成物が米国
特許第４４２３１５３号に開示された。

〔発明の要約〕

この発明は、アナライト（分析質、ａｎａｌｙｔｅ）を
含有していることか推測される試料中のポリヌクレオチ
ド・アナライトの存在を確かめる方法と、それに使用す
る試薬を提供する。この方法は、アナライトと相補的で
ある第１および第２ポリヌクレオチド試薬と試料とを測
定媒質中で結合させろことから成る。第１試薬および第
２試薬は、それぞれアナライトの異なった区域でハイブ
リヅド什する。第１試薬には、第１試薬の非共有結合的
な重合を可能とする手段を含んでいる。第２試薬には、
第２試薬の検出を可能とする手段を含んでいる。試料お
よび第１、第２ポリヌクレオチド試薬を、測定媒質中で
、第１試薬が重合を起こす条件下で結合させ、ここで第
２試薬は試料中にアナライトが存在している場合に限り
、重合した第１試薬と結合することができる。第１試薬
の非共有結合的な重合を可能どさせる好ましい手段は、
第１試薬と共有結合的に結合した反復配列のオリゴヌク
レオチドである。またこの方法は、第２試薬が重合した
第１試薬と結合するように成るかどうかを検出すること
を含んでいる。この発明方法は、とくにウィルス、細菌
、糸状菌、真菌等のＤＮＡ。

ＲＮＡ、ゲノム、およびそれらの断片等のようなポリヌ
クレオチド・アナライトの存在を測定することに応用で
きる。またこの発明は、上記方法による測定を実施し得
る試薬を組合わせた包装形態で含んでいるキットを包含
する。

〔実施態様〕

この測定方法は、一般にアナライトを含有していること
が推測されろ試料中のポリヌクレオチド・アナライトを
検出することに関するものであり、その方法には凝集反
応を含んでいる。この発明の改良点は、そのような測定
に凝集反応を起こす相補的なオリゴヌクレオチド配列を
使用することにある。

一般に、この方法はアナライトと相補的である第１およ
び第２ポリヌクレオチド試薬と試料とを測定媒質中で結
合させることから成る。第１試薬および第２試薬は、そ
れぞれアナライトの異なった区域でハイブリッド化する
。第１試薬には、第！試薬の非共有結合的な重合を可能
とする手段を含んでいる。第２試薬には、第２試薬の検
出を可能とする手段を含んでいる。これらの試薬と試料
とを、測定媒質中で、第１試薬が重合を起こす条件下で
結合させ、ここで第２試薬は試料中にアナライトが存在
している場合に限り、重合した第１試薬と結合すること
ができる。第１試薬が重合した後、第２試薬が、重合し
た第１試薬と結合したかどうかを検出する。もし重合し
た第１試薬内に第２試薬が検出されれば、目的のポリヌ
クレオチド・アナライトが存在していることが判明する
。

この発明の具体的態様を説明する曲に、まず幾つかの用
語を定義する。

ポリヌクレオチド・アナライト・・・・・・約２０〜Ｉ
ｏｏｏｏｏ個またはそれ以上のヌクレオチド、通常、約
１００〜２０００００個のヌクレオチド、多くは約５０
０〜１５０００個のヌクレオチドを（’ｒｔろボリマ−
ヌクレオチドから成る測定すべき化合物または組成物。

該ポリヌクレオチド・アナライトは、ｔ−ＲＮ、Ａ、Ｍ
−ＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、遺伝子、染色体、微
生物（例えば、細菌、ウィルス、糸状菌、真菌等）のよ
うな生物学的物質のゲノム、およびそれらの断片等を含
むＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。そのような生物学的
物質の例は米国特許第４３５１７６０号（とくにその第
９〜第＋Ｈｉｌｌ）に多数記載されている。

この発明の目的のため、ポリヌクレオチド・アナもしく
は一本鎖または変性すべく処理されている。

そのような処理は当該技術において周知されているもの
であり、例えば熱処理またはアルカリ処理等が挙げられ
る。例えば、２本鎖ＤＮＡは９０〜１００°Ｃに約１〜
ＩＯ分間加熱することによって変性した物質を得ること
ができる。

ポリマー生成オリゴヌクレオチド・・・・・・認識ポリ
ヌクレオチドと直接的または間接的に結合して重合プロ
ーブを生成するヌクレオチド残基のホモポリマーまたは
コポリマー。一般に、この発明の目的のため、ヌクレオ
チド残基は反復配列を有している。そのような反復配列
のオリゴヌクレオチドの例は、［ザ・ケミストリー・オ
ブ・ヌクレイツク・アソツヅ（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　ｏ「Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ）Ｊ、ジョーダ
ン〔バタワース・アンド・カンパニー・リミテッド（Ｂ
ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｉ
ｍ１ｔｅｄ））（１９６０年）のとくに１３章および１
４章に示されている。この発明に使用するオリゴヌクレ
オチドは天然産でも合成でもよく、通常は合成品がムｈ
　ｔｒｉ　　”ｒ　　４ｑ　　１　　　　立証、’；Ｗ
　　　　ｚｈ　ンコ／知　　す、　ｑ　　ｈ　　＋、−
ｉ−−ｆ−Ｋ’ＳＬＦＥが８個あるべきであり、好まし
くは少なくともヌクレオチド残基が２０個あるべきであ
る。ヌクレオチド残基数の上限は厳密なものではない。

普通一般にヌクレオチド残基数は１０００個を超えず、
通常、その数は２００個を超えない。この発明にとくに
好ましいものは、少なくとも８個以上のヌクレオチドを
有するホモポリマー性のオリゴヌクレオチド類、および
それぞれ少なくとも８個以上のヌクレオチド残基を有す
る互いに相補的でない２つのヌクレオチドからなるヘテ
ロポリマー性のヌクレオチド類である。例えば （Ａ）２ｎ１（Ｃ）ｔｎ、（ＡＣ）ｎ、（ＧＴ）ｎ、（
Ｔ）ｔｎ（ここで、Ａはアデノシン、Ｃはシチジン、Ｇ
はグアノシン、Ｔはチミジン、ｎは４〜１０００、好ま
しくは４〜１００である） が、この発明に使用できる。

重合プローブ・・・ポリヌクレオチド・・アナライトと
ハイブリッド形成することができ、非共有結合的に重合
し得る化合物。重合プローブはポリヌクレオチド・アナ
ライトの１区域と相補的なポリヌクレオチド配列を有し
ているので、そのようなポリヌクレオチド・アナライト
の区域と重合プローブが結合するように、アナライトと
ハイブリッド形成することができる。また、重合プロー
ブは非共有結合的な重合をすることかでき、即ち、重合
における結合が非共有結合的な重合体を生成する。

そのような結合は、主と（−で静電気的相互作用、疎水
相互作用、水素結合、双極子−双極子相互作用、ファン
デルワールス相互作用により生成される。一般に、重合
プローブは２つの部分から成る。

第１の部分は、ポリヌクレオチド・アナライトの１区域
と相補的な「認識オリゴヌクレオチド」配列である。一
般にこの認識オリゴヌクレオチドは、約８〜１００００
個のヌクレオチド、通常約２０〜２０００個のヌクレオ
チドを含んでいる。

重合プローブの第２部分は、プローブが非共有結合的に
重合する手段を提供する。この目的のため、重合プロー
ブは先に説明したポリマー生成オリゴヌクレオチドを都
合よく含むことができろ。

そのようなポリマー生成オリゴヌクレオチドは商業的に
入手可能であり、あるいは容易に合成することができる
。その他の、重合プローブを重合させる手段として、例
えばアビジンまたはビオヂン抗体を重合剤とする場合の
ビオチンのように、プローブと結合させた分子１１２５
〜１５００の有機残基が含まれ、また一般に、重合剤が
相補的レセプターまたはリガンドのとき１個またはそれ
以上のリガンドまたは受容体（特異的結合対構成員）を
プローブに結合させることができる。

認識オリゴヌクレオチドは生合成または化学合成によっ
て入手できる。短鎖プローブ（ヌクレオチド２０個まで
）の場合は、化学合成の方が生合成に比べて一層経済的
であることが多い。経済的であるだけではなく、化学合
成では、合成段階中に都合よく低分子量の化合物を挿入
する方法を提供することができる。また化学合成では、
ポリヌクレオチド・アナライトの鎖長および区域を非常
に自由に選択できる。認識オリゴヌクレオチド配列は、
商業的な自動核酸合成装置で用いている方法のような槽
鵡ＯＪ、１方洟により合線することがで成る。長鎖プロ
ーブの場合は、ＲＮＡ調製用の商業的キット〔例えば、
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　）に採用されている方法
、およびメッンングの記載のようにＭ１３プラスミドを
使用して１本鎖ＤＮＡを調製する方法〔メソッズ・オブ
・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、）、１０１巻、２０〜７８頁（１９８３年）〕のよう
に、分子生物学で用いられている標阜的な復製方法をｆ
ｌｌ用することができる。

重合プローブの認識オリゴヌクレオチド配列を選ぶ主な
基準は、 （１）　　該配列が確かなものであるということ、即ち
、合成される区域が正確に配列されｆ二ものでなければ
ならず、またポリヌクレオチド・アナライトに特異的で
あること。

（２）該配列が、安定でしから特異的な結合を提供し得
るに足る充分な鎖長を何才ろことである。

検出プローブが特殊な配列である場合はらっと短かい配
列を使用することらできろが、許容し得る最小の配列は
、通常、約１５個のヌクレオチドのものである。一般に
合成ポリヌクレオチド類は、約８〜３００個の鎖長のヌ
クレオチド、一層多くは１５〜５０個の鎖長のヌクレオ
チドである。生合成によるポリヌクレオチド類の場合は
、１本鎖であって、ポリヌクレオチド・アナライトと相
補的である核酸の場合に限って、未知配列のランダム断
片を使用し得る。重合手段を付与する方法には、リガン
ド標識をしたヌクし一′ｉ−チドを合成中にプローブへ
挿入する方法、ポリヌクレオチド尾部を、例えば核酸ポ
リメラーゼ等によって認識配列へと重合させる方法、曲
もって調製ｌまたポリマー生成オリゴヌクレオチドを、
例えばＤ　Ｎ　Ａリガーゼ等を用いて認識配列へ連結せ
しめる方法、または予め作成したプローブヘリガントを
付着せしめろ方法等が挙げられる。

検出プローブ・・・検出プローブは、重合プローブがハ
イブリッド形成している以外の区域でポリヌクレオチド
・アナライトとハイブリッド形成することかできる。ま
た、検出プローブは検出することができる。したがって
、検出プローブは一般に２つの部分から成る。検出プロ
ーブの一方の部分は、重合プローブが結合している区域
以外の区域でポリヌクレオチド・アナライトと検出プロ
ーブをハイブリッド化させることかできる。この目的の
ためには、重合プローブの認識オリゴヌクレオチドによ
って認識されないボリヌ、クレオチドの区域を認識する
配列を有する別の「認識オリゴヌクレオチドｊを都合よ
く使用できる。そのような認識オリゴヌクレオチドは、
前記の重合プローブの項の認識オリゴヌクレオチドの記
載を参照し、作成することができろ。

同時に検出プローブは、該プローブを検出させ得ろ部分
を含んでいる。一般に検出プローブは、単独またはシグ
ナル（信号）発成系の他の要素との相互作用によって検
出が可能となる信号を発生し得る標識を含んでいる。該
標識は、当初から認識オリゴヌクレオチドの１部をなし
、またはこれと結合して検出プローブを生成することが
でき、あるいは第１試薬の重合中または重合後に検出プ
ローブと結合し、もしくは重合プローブと結合すること
ができる。この点に関しては、特異的ポリヌクレオチド
配列、即ちハプテンのような特異的結合対の構成員（ｒ
ｓｂｐ構成員」）は、認識オリゴヌクレオチドと結合し
て検出プローブを生成することができ、この標識を、こ
れと相補的なｓｂｐ構成員と結合させろことができろ。

そのようなｓｂｐ構成員およびそれと相補的なｓｂｐ構
成員を例示すれば、抗原と抗体、ハプテンと抗体、ビオ
チンとアビジン、オリゴヌクレオチドとそれと相補的な
オリゴヌクレオチド、オペロンとそのレプレッサー、Ｄ
Ｎ、〜−ＲＮＡ／＼テロ２本鎖とその抗体等が挙げら口
、る。検出プローブのアナライトとのハイブリット形成
が標識の仔在によって妨げられる場合、または標識かハ
イブリッド形成条件下で不安定であるか、または不溶性
である場合に、前記したような検出プローブへの標識の
付着が遅延することは好都合なことである。

重合プローブおよび検出プローブの認識オリゴヌクレオ
チドと相補的であるポリヌクレオチド・アナライトの二
つの区域は、アナライトの実質上／？１’＋’）　ｕ丘
ｈ１浦を太七勤ト・−１の７は木育十六ご鼾木確かにす
るため、通常互いに適度に近接した位置にある。この発
明の目的のため、この二つの区域は、通常５０００キロ
ベース（Ｋｂ）、多くは２０００Ｋｂ、さらに多くは５
００Ｋｂ以内にあるが、ただし、とくに２個の核酸配列
の連結を証明する測定の場合には１ＯＱＱＱＫｂまたは
それ以上離れていることができる。

重合剤・・・重合プローブまたは第１試薬の非共有結合
的重合を実行することができる試薬。一般に重合剤は、
重合プローブの重合手段ととちに作用して、重合プロー
ブの非共有結合的重合を生じる。ここで、該手段にはポ
リマー生成オリゴヌクレオチド類およびその他のｓｂｐ
構成員類等が含まれる。ポリマー生成オリゴヌクレオヂ
トを使用する場合は、この重合剤は、通常ポリマー生成
オリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を有し、ポリ
マー生成オリゴヌクレオチドの少なくとも２個のコピー
を結合し得るオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレ
オチド間の結合またはハイブリッド形成から、重合プロ
ーブの非共有結合的重合がもたらされる。他のｓｂｐ構
成員が重合プローブに挿入されている場合は、重合剤は
少なくとも２個の結合部位を有するｓｂｐ構成員と相補
的である。

言うまでもなく、重合は、ポリヌクレオチド・アナライ
トと何れかの認識オリゴヌクレオチドとの間の結合を著
しく妨げるべきものではないし、また標識が検出プロー
ブへ結合することを妨げるものでもない。

特異的結合対の構成員（ｒｓｂｐ構成員」）・・・他方
の分子と特異的に結合し、それ故に該分子に固有の空間
的および極性的構成と相補的であると規定される表面上
の区域またはくぼみを有する異なった二つの分子のうち
一つ。特異的結合対の要素はリガンドと受容体（アンチ
リガンド）として表すことができる。これらは通常、抗
原−抗体のような免疫学的対の要素である。なお、ビオ
チン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸２本
鎖分子、ＩｇＧ−蛋白質Ａ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−
ＲＮＡ等のような他の特異的結合対の要素は免疫学的対
ではないけれども、これらもこの発明の範囲に含まれろ
。

リガンド・・・レセプターが天然にｑ在し、らしく１は
これを作成することができろ任行の有機化合物。

レセプター（「アンチリガントリ・・・ある分子に固有
の空間的および極性的構成、例えばエビトビツク部位ま
たは決定部位を認識し得ろ任意の化合物または組成物。

具体的なレセプターの例を挙げれば、例えばヂロキンン
結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂ断片、レクチン類
、核酸類、プロティンＡ、補体成分ＣＩｑ等の天然のレ
セプター等を挙げることができる。

支持体・・・水溶性でない多孔性または非多孔性の物質
。支持体は親水性であり、または親水性にすることがで
きるものであって、シリカ、硫酸マグネシウムおよびア
ルミナのような無機粉末類、天然の高分子材料、とくに
繊維含有紙のようなセルロース材料およびセルロースか
ら誘導された物質（例えば、１紙、クロマトグラフィー
紙等）、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化
ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アカ
ロース、ポリアクリル酸、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメ
タアクリル酸、ポリ（エチレンテレフタル酸）、ナイロ
ン、ポリ（酪酸ビニル）等のような合成ポリマーまたは
天然の高分子化合物を加工しｒこ重合体等を挙げること
ができ、これらをそのまま、または他の材料（例、ガラ
ス、セラミックス、金属等）と組合わせて使用すること
ができろ。支持体にｓｂｐ構成員を結合させるのは、ひ
ろく文献によって知られる公知の手技によって達成する
ことができる〔例えば、「インモビライズド・エンザイ
ムズ（Ｉ　ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚａｙｍｅｓ）
Ｊイチロウ・チバタ、ハルステッド・プレス、ニューヨ
ーク（１９７８）およびクアトレカサス、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２４５巻、３０５９頁（
１９７０年）、参照〕。

標識・・・検出プローブとコンジュゲートし、う一つの
標識と凝集し、またはそれと空間的に接近することによ
って検出され得る任弦の標識を使用することができる。

標識は同位元素であっても、または非同位元素てあって
もよいが、通常は非同位元素で、触媒、染料（例、スク
アレート染料等）、蛍光性分子、化学発光剤、補酵素、
酵素等を使用することができ、好ましくは、色素、触媒
ま１こはその他検出可能な基によりさらに標識でき、ま
たは標識することができないラテックスのような粒子ま
たは炭素粒子、金属ゾル、微結晶（クリスタライト）、
リポソーム、細胞等である。標識は信号発生系の１要素
であって、単独、もしくは該信号発生系の他の要素とと
もに検出し得る信号を発生することかできろ。標識は、
検出プローブの認識ポリヌクレオチドと直接結合するこ
とができ、または認識ポリヌクレオチドと結合し得るｓ
ｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員と結合することによ
り、認識ポリヌクレオチドお結合することができる。

シグナル発生系・・・シグナル発生系は１またはそれｌ
；１Ｆの槽戊恕素本有し、少なくともそのｌ要素は標識
である。シグナル発生系は、試料中のポリヌクレオチド
・アナライトの存在またはその量と比例した信号を発生
する。シグナル発生系は、測定し得る信号の発生に要す
るすべての試薬を含んでいる。標識が検出プローブとコ
ンジュゲートしない場合は、標識は、通常検出プローブ
の１部であるｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員と結
合する。

シグナル発生系の他の要素はシグナル発生液中に含まれ
、基質、エンハンザ−１活性化物質、化学発光体化合物
、補因子、阻害物質、スカベンジャー、金属イオン、お
よびングナル発生物質の結合に必要な特異的結合をする
物質等を含むことができる。また、シグナル発生系の他
の要素は、補酵素、および酵素生産物、他の酵素および
触媒等と反応することができる物質等である。シグナル
発生系は、外的手段、好ましくは粒子の凝集度の測定ま
たは電磁反射の使用のような手段により、好まりくけ視
覚的な計測によって検出し得る信号を提供する。多くの
場合、シグナル発生系には蛍光物質粒子またはその他の
吸光物質粒子、発色性の基質および酵素（発色性の基質
は酵素反応によって紫外部または可視部領域の光を吸収
する染料へと変換する）、りん、発蛍光剤または化学発
光剤のような粒子が含まれる。

シグナル発生系は、少なくとも１個の触媒（通常、酵素
）と少なくとも１個の基質とを含むことができるが、ま
た２個またはそれ以上の酵素と複数個の基質とを含むこ
とができ、さらにｌ酵素の基質が他の酵素の生産物であ
ることから成る酵素の組合わせを含むことかできる。シ
グナル発生系の作動により、試料中のポリオリゴヌクレ
オチド量と比例する検出可能な信号を提供する生産物を
生成することができる。

シグナル発生系に有用な多数の酵素および補酵素が米国
特許第４２７５１４９号（第１９〜２３欄）および米国
特許第４３１８９８０号（第１Ｏ〜Ｉ４欄）に示されて
いる。多数の酵素の組合わせが米国特許第４２７５１４
９号（第２３〜４８欄）に提供されており、該組合わせ
はこの発明に利用し得ることが判明した。

とくに興味深いのは、過酸化水素の産生、および色素前
駆物質を酸化して色素に変える過酸化水素の利用を行う
酵素類である。特殊・な組合わせとしては、過酸化水素
を利用して色素前駆物質を酸化する酵素、即ち、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、また
はミクロペルオキノダーゼのようなペルオキシダーゼ類
を組合わせに糖類酸化酵素（例えばブドー糖酸化酵素お
よびガラクトース酸化酵素等）またはウリカーゼやキザ
ンヂン酸化酵素のような複素環酸化酵素等を挙げろこと
ができる。その他の酵素の組合わせについては、前記し
た米国特許第４２７５１４９号に示されている。１個の
酵素を標識として使用したときは、その他の酵素を組合
わ仕て使用することができ、そのような酵素としては加
水分解酵素、転移酵素および酸化還元酵素が使用され、
好ましくはアルカリホスファターゼおよびβ−ガラクト
ンダーゼのような加水分解酵素が使用される。別法とし
て、蛍ルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼのよう
な発光酵素類を使用することができ使用可能な補酵素類
を例示すれば、ＮＡＤ　ＣＨ）、ＮＡＤＰ　（Ｈ）、ピ
リドキサール燐酸、ＰＡＤＣＨ）、ＦＮＭ〔トＩ〕等を
挙げることができる。

通常、代謝回転に含まれる補酵素であれば使用すること
ができる（とくに、米国特許第４３１８９８０号を参照
）。

酵素反応の生産物は、通常、染料または蛍光剤である。

多数の蛍光剤の例が米国特許第４２７５１４９号に提供
されている（第３０〜３１欄）。

シグナル発生系は、粒子直径が少なくとも約５０ｎｍで
５０ミクロンを越えない粒子で、通常、少なくとも約１
１００ｎで約２５ミクロンより小さくなく、好ましくは
約０．２〜５ミクロンである不溶性の粒子をｌまたはそ
れ以上含有することができる。この粒子は有機物でも無
機物でもよく、多孔性もしくは非多°孔性であって、好
ましくは水に近い密度を有しく一般に約０．７〜約０　
、５９／ｆｆ１ｆ２）、透明または半透明、または不透
明な物質から成る。

有機性粒子は、通常重合体から成り、測定媒質に容易に
分散し得るものであれば、付加重合体でも縮合重合体で
もよい。粒子の表面は、オリゴヌクレオチドまたはｓｂ
ｐ構成員と直接的または間接的に結合できるように、吸
着性または官能化できるものである。

粒子は天然物質、合成により修飾した天然物質および合
成物質から誘導することができる。有機重合体のなかで
とくに興味深いものは、多糖類、とくにアガロース（セ
ファロース）、デキストラン（セファデックスおよびセ
ファクリル）、セルロース、およびでんぷん等のような
架橋多糖類、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ア
クリル酸およびメタアクリル酸誘導体、とくに遊離のヒ
ドロキシル官能性基を有するそのエステル類およびアミ
ド類のホモポリマーおよびコポリマーのような付加重合
体等である。無機重合体にはシリコーン、ガラス類（バ
イオガラス）等がある。また、リポソーム、りん脂質、
細胞のような天然または合成の集合物を使用することが
できる。

これらの粒子が商業的に入手可能である場合、粒子サイ
ズの大きいものを、粉細、音波処理、撹拌等の機械的手
段により粉砕して小さい粒子にすることができる。

粒子は、通常多官能基であり、あるいは多官能性とする
ことができ、特異的または非特顆的な共有結合または非
共有結合の相互作用を介してオリゴヌクレオチドまたは
ｓｂｐ構成員をこれに結合させることができる。広範な
官能基を利用することが可能であり、または挿入するこ
とができる。官能基としては、カルボン酸、アルデヒド
、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、
メルカプト基等を挙げることができる。多くの化合物を
粒子に連結させる方法は周知のものであり、文献上で充
分説明されている［例えば、コートレカサス、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　）、２４５巻、３０５９頁（１
９７０年）、参照］。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ
構成員と連結する基の鎖長は、連結された化合物の性質
、連結された化合物と粒子との間の距離がプローブとポ
リヌクレオチド・アナライトとのハイブリッド形成にお
よぼす効果等によって大きく変化する。オリゴヌクレオ
チドまたはｓｂｐ構成員は実質上、粒子の外表に結合す
る。

粒子は、常法により、直接的、または粒子に結合させた
蛍光化合物または蛍光剤によって蛍光性とすることがで
きる。蛍光剤は、通常、粒子に溶解し、または共有結合
的または非共有結合的に粒子と結合し、粒子全体に実質
上均一に結合することが多い。米国特許第３８５３９８
７号には、フルオレスセイン化したラテックス粒子が教
示されており、このものはコバシフト・テクノロジー社
（Ｃｏｖａｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌ　ｎｃ
、　Ｘアン畢アーバー）からコバスフェレス（Ｃｏｖａ
ｓｐｈｅｒｅｓ）の商標名で商業的に人手することがで
きる。

興味ある蛍光剤は、一般に３５０ｎｍ以上の波長、通常
４００ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上の波長で光
を発するしのである。望ましくは、蛍光剤は高い里子効
率と大きいストークス・シフトを有し、コンジュゲート
および使用の条件下で化学的に安定なものである。蛍光
剤の語には、電磁放射または化学的活性化によって光を
発する物質を広く含めており、蛍光物質およびりん光物
質、シンチレークーおよび化学発光物質等が含まれる。

興味深い蛍光剤は、さまざまな範鋳に分類されるが、何
れも基本的な官能性を有している。これらの基本的な官
能性を挙げれば、１−および２−アミノナフタリン類、
’　ｐ、ｐ−ジアミノスチルベン類、ピレン類、第４級
フエナントリジン塩類、９−アミノアクリジン類、ｐ、
ｐ′　　−ジアミノスチルベンイミン類、アントラセン
類、オキサカルホキシアニン、メロシアニン、３−アミ
ノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベンズオキサゾール
、ビス−ｐ−オキサシリルベンゼン、１．２−ベンゾフ
ェナジン、レヂノール、ヒス−３−アミノビリンニウム
塩類、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェ
ノール、ヘンズイミダソリルフェニルアミン、２−オキ
ソ−３−クロメン、インドール、キサンチン、７−ヒド
ロキンクマリン、４．５−ベンズイミダゾール類、フェ
ノキサジン、サリチル酸類、ストロファンデシン、ポリ
フィリン類、トリアリルメタン類、フラビン、および希
土類金属キレート酸化物等である。代表的な蛍光剤は、
米国特許第４３１８７０７号（第７〜８ｍ）に列挙され
ている。

また、エネルギー吸収粒子および消光粒子も使用するこ
とができる。これらの粒子は、少なくとも直径約５０ｎ
ｍの不溶性固体粒子であって、プローブとポリヌクレオ
チド・アナライトとのハイブリッド形成、または特異的
結対要素間の特異的結合から生じる距離の範囲内で蛍光
粒子の蛍光を消光することができるものである。消光粒
子は、蛍光粒子と同一のものまたは異なったものでよい
が、通常界なったものである。普通、吸光粒子は、粒子
の表面間で測定した距離で約５０人より大きく、好まし
くは約５００人より大きく、一層好ましく約２０００人
より大きい距離で実質的に吸光を提供する。

発光状態を変えるため、多くの異なった型の粒子を使用
できる。とくに興味深いものは木炭、すす、グラファイ
ト、コロイド状炭素等のような炭素粒子である。炭素粒
子だけでなく金属ゾルら使用でき、とくに貴金属類（金
、銀、白金）か使用できる。その他、金属から誘導され
た粒子としては、硫化鉛、硫化銀または硫化銅のような
金属硫化物、および酸化鉄または酸化銅のような金属酸
化物等が挙げられる。

検出し得ろ信号として光を供給する別の供給源は化学発
光供給源である。化学発光供給源には、化学反応によっ
て電子的に励起されて、信号として検出し得ろ光を発す
るものと、エネルギーを蛍光受容体へ送るものがある。

多数の化合物の仲間が、種々の条件下で化学発光を提供
することが判っている。その中の１つは、２．３−ジヒ
ドロ−１，４−フタラジン−ジオンである。最もよく知
られているのはルミノールであって、これは上記の化合
物の５−アミノ類似体である。これに属する他の化合物
は、５−アミノ−６゜７．８−）リメトキシーおよびジ
メチルアミン−［Ｃａ］ベンズ類似体である。これらの
化合物は、アルカリ性過酸化水素または次亜鉛素酸カル
シウムと塩基とによって、蛍光を発することができる。

化合物群の別の仲間は、その親代合物ま一般名をロフィ
ンという２，４．５４リフエニルイミダゾール類である
。化学発光性の類似体にはｐ−ジメチルアミノ置換基お
よびｐ−メトキン置換基を含んでいろ。また、シ、〉う
酸化合物からも化学発光が得られ、通常、しゅう酸の活
性エステル（例えばｐ−ニトロフェニルエステル）と過
酸化物（例えば過酸化水素）とから、塩基性条件下で化
学発光が得られる。別法として、ルシフェリン類はルシ
フェラーゼと組合わせて、またはルノゲニンとして使用
することができる。

！＋ｔｉ助材料・・・・この発明による測定には、多く
の補助材料かよく使用されろ。例えば、バッファーは普
通に使用されるし、また測定媒質および測定成分の安定
剤ら普通に使用される。これらの添加剤のほかに、アル
ブミンのような蛋白質、界面活性剤、とくに非イオン界
面活性剤、結合促進剤（例えばポリアルキレングリコー
ル）等が挙げられ乙。

上記したように、この発明の方法によって、アナライト
の含有が推測される試料中のポリヌクレオチド・アナラ
イトの存在を確かめることができる。試料、およびアナ
ライトと相補的である第１および第２ポリヌクレオチド
試薬を測定媒質中で結合させろ。第１試薬および第２試
薬は、それぞれアナライトの異なった区域とハイブリッ
ト形成をする。第１試薬には、第１試薬を非共有結合的
に重合させることができる手段を含んでいる。そのよう
な第１試薬は、例えば、前記したような重合プローブで
あることができる。第２試薬には、第２試薬を検出させ
る手段を含んでいる。第２試薬は、前記したような検出
プローブであることができる。試料および第１、第２試
薬を、第１試薬が重合する条件下に測定媒質中で結合さ
せる。そのような条件としては、例えば重合剤を測定媒
質中に添加する方法”が挙げられ、そのような重合剤と
して、例えばポリマー生成オリゴヌクレオチドの配列と
相補的な配列とを有し、重合プローブの１部を成してい
るオリゴヌクレオチドを挙げることができる。第２試薬
は、アナライトが試料中に存在している場合に限って重
合した第１試薬と結合するように成る。第１試薬を重合
させ、第２試薬が重合した第１試薬と結合するように成
るかどうかについて、測定を行なう。これは、媒質また
はポリマーについて信号の有無を測定することによって
達成できる。例えば、測定媒質における凝集粒子の存在
を測定することにより、あるいは重合した第１試薬また
は測定媒質の電磁放射の存在を測定することによって、
重合した第１試薬に対する検出プローブの結合を検出す
ることができる。

この方法を実施するには水性媒質を使用する。

その他の極性溶媒も水とともに使用できる。そのような
溶媒は、通常、炭素原子数１〜６個、一層多くは炭素原
子数１〜４個の酸素原子を含んだ有機溶媒、即ち、アル
コールおよびエーテル等である。これらの溶媒の量は、
通常、約７０（重量）％より少なく、一般に約３０（重
量）％より少ない。

媒質のｐＨは、通常、約４〜１１の範囲にあり、さらに
約５〜ｌＯ１好ましくは６．４〜９．５の範囲にある。

ｐ　ｒ−ｒは、ポリヌクレオチド・アナライトと結合さ
せ、第１試薬を重合させるハイブリッド形成の有意水準
を維持し、一方では信号の発生がうまく最適となるよう
に選ぶ。場合によっては、これらの点を配慮して妥協す
ることもある。所望のｐＨを得て、測定の間中このｐ　
Ｉ−１を推持するために、さまざまのバッファーを使用
することができる。それらのバッファーを例示すれば、
はう酸塩、りん酸塩、炭酸塩、トリス、バルビツール等
のバッファーが挙げられる。この発明において使用する
バッファーを厳密に特定することはないが、個々の測定
においては、１つのバッファーが他よりすぐれて好まし
い場合がある。

この方法を実施するには、普通、適度な温度を用い、゛
測定の間中一定の温度を維持する。測定時の温度は一般
に約Ｏ〜６０℃であり、多くは約１５〜４５℃である。

先に述べたように、ポリヌクレオチド・アナライトが１
本鎖でない場合は、試料を処理して１本鎖物質を調製し
なければならない。このため、例えば重合試料および検
出試料を添加する前または後に、試料を、２〜１０分間
９０〜１００℃に加熱することによって都合よく処理す
ることができる。

測定可能なポリヌクレオチド・アナライトの濃度は、一
般に約−１０−１５〜Ｉ　Ｏ−”ｇ／ｍ１２の間であり
、多くは約１０−１３〜Ｉ　Ｏ−’ｇ／ｍＱの間である
。

測定が定性的であるか、または半定量的もしくは定量的
であるかにより、また個々の検出手技およびポリヌクレ
オチド・アナライトの濃度を考慮して、他の試薬濃度を
決定する。

種々の試薬の濃度は、対象となるポリヌクレオチド・ア
ナライトの濃度範囲によって決定するが、個々の試薬の
最終濃度は、普通、対象物の濃度範囲全般にわたって測
定感度が最適となるよう実験的に決定する。

測定媒質中の第１試薬および第２試薬の濃度は幅広く変
化させることができろ。これらの試薬は過刺遣存在して
いるのが好ましい。これらの試薬類は、通常、少なくと
も試料中に推測されるポリヌクレオチド・アナライトの
借す慣、Ｌ−箕ｊい吊木存在させ、１．０〜１０８倍ま
たは、それ以上過−剰に、好ましくは少なくとも１０２
倍過剰に存在さ仕ることができる。

また、測定媒質中の重合剤の濃度も幅広く変化させるこ
とができる。一般に、重合剤は重合プローブ濃度と等モ
ル濃度またはそれ以下の濃度で測定媒質中に存在し、好
ましくは、重合プローブ濃度の０．１〜０．８倍、一層
好ましくは、重合プローブ濃度の０．４〜０．６倍とす
る。

試薬類の添加順序はさまざまに変えることができる。第
２試薬は、第１試薬を測定媒質と接触させる而に、媒質
および試料と結合させることができる。ついで、この溶
液を重合剤と接触させる。

然し、試料および第１試薬、第２試薬、および重合剤を
同時に添加してもよく、その池の添加順序をとることも
できる。

一般に、試薬類の添加濃度およびその順序、および測定
条件を左右するのは、第１試薬または重合プローブの重
合を最大にさせようとする目的である。

前記したように、この発明の測定方法は、とくに均−系
の測定法を適用するものである。均一系測定法としては
、米国特許第３９９３３４５号に開示された方法のよう
な免疫蛍光法、米国特許第４２３３４０２号に開示され
たような酸素誘導法および、その他［エンザイム・イム
ノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
）ｊ、ニドワード−Ｔ−マジオ著、ＣＲＣ−プレス社［
ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、ポカ・ラドン（Ｂｏｃａ　
Ｒａｔｏｎ）、フロツク］、（１９８０年）および米国
特許第３８１７８３７号に論じられている酵素免疫測定
法が例示される。

前記ように、好適な標識およびシグナル発生系は、試料
中のアナライトの存在またはその量と関連して、検出プ
ローブが重合した重合プローブの１部となる度合いを測
定できるように選ぶ。以下に幾つかの具体例を示してこ
の方法を説明するが、これらはこの発明の範囲を制限す
るためのものではない。

一例をあげれば、重合プローブは認識オリゴヌクレオチ
ドと、ポリグアノシンのような８〜２０個のヌクレオチ
ドから成るホモポリマー・オリゴヌクレオチドから成っ
ている。検出プローブは認識オリゴヌクレオチドと、分
子量約１２５〜１５００のビオチンのような有機性残基
から成っている。この有機性残基の受容体は、アジピン
またはビオチンに対する抗体のような残基であって、信
号発生系の１部である粒子とコンジュゲートしている。

粒子を測定媒質に添加する。重合剤は、重合プローブに
含まれているホモポリマー・オリゴヌクレオチドと相補
的な、例えばポリグアノノンの場合、これに対するポリ
シチジル酸のようなホモポリマー・オリゴヌクレオチド
である。両方のプローブが、ともにポリヌクレオチド・
アナライトと結合する場合に限って、粒子はポリマーと
結合するように成る。粒子は例えば蛍光性のものであり
、発明方法を実施した後、蛍光に起こる任意の変化を分
光側光法または細胞計測法のような通常の手段によって
測定できる。

上記の測定には非流動細胞計測法的な手技を用いること
ができろ。細隙または好ましくはレーザーによって作ら
れた小直径の光線を用い光分散によってさの相対粒子サ
イズに基づいて粒子を分別する。またこの手技は、蛍光
パルス波高分析または蛍光波動（フラクチュエーション
）相関に使用できる［ブリッグズら、「ホモジニアス・
フルオレッセントψイムノ・アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎ
ｅｏｕｓ　Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　　Ｉ　ｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ）Ｊ、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、
２１２巻、１２６６〜１２６７頁（１９８１年）、およ
びニコリら、「フルオレッセンス・イムノアッセイ・ベ
イスト・オン・ロング・タイム・コレレイションズ・オ
ン、ナンバー・フラクチュエーションズ（Ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ　　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｂａ５ｅ
ｄ　ｏｎ　　Ｌｏｎｇ　Ｔｉｍｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉ
ｏｎｓ　ｏｒ　Ｎｕｍｂｅｒ　Ｆ　１ｕｃｔｕａｔｉｏ
ｎｓ）Ｊ、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オン・サイエンシズ・オン・ザ・ＵＳ　
Ａ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ
）、７７巻、４９０４〜４９０８頁（１９８０年）］。

この発明における蛍光変化を測定する好ましい方法には
、米国特許第４５６４５９８号に記載されたファイバー
・オプティック・サイトメーターを使用することができ
る。それを適用することによって、対象物質の存在また
は債を検出するのに、分散内に存在する粒子を測定する
方法および装置が提供されろ。光学ファイバーの使用に
より、比較的少量でら蛍光を感知し、計量することがで
きるので、その債を確定することができろ。予じめ測定
した波動から、その量は、唯１個だけ粒子が存在してい
ると考えられろ量と比例する。試料中に存在するアナラ
イトと関連して、蛍光波動に変化を生じ得ろさまざまな
手技を用いることによって、存在するアナライト量を決
定できる。波動は、静的な態様により、ある時間観察し
てもよく、または複数個のサンプル量を試料から採取し
て観察することもできる。観察結果を、アナライトの既
知量を含有する測定液で得た成績と比較することによっ
て、アナライト量を定量的に測定することができる。

この発明のらう１つの例を示せば、重合プローブは認識
オリゴヌクレオチドと、ポリグアノシンのような８〜２
０個の残基から成るホモボリマー・オリゴヌクレオチド
を含んでいる。２つの検出プローブを使用し、そのうち
の１つは蛍光化合物を標識として結合している認識オリ
ゴヌクレオチドを含んでおり、もう１つは粒子が結合し
ている認識オリゴヌクレオチドを含んでいる。重合剤は
、重合プローブに含まれているホモポリマー・オリゴヌ
クレオチドと相補的な、例えばポリグアノシンの場合、
これに対するポリシチジル酸のようなポモポリマー・オ
リゴヌクレオチドを含んでいる。

この発明の方法を実施し、その反応媒質の蛍光を測定す
る。粒子の蛍光をアナライトの既知量を含有する測定液
で得た蛍光と比較することによって、アナライト虫を定
量的に測定することができる。

上記の方法の変法として、検出オリゴヌクレオチドに結
合した分子量約１２５〜１５００のビオチンのような有
機性残基を検出プローブに含めることかできる。この有
機性残基の受容体は、ビオチンの場合、アビジンまたは
ビオチンに対する抗体のような残基であって、蛍光剤お
よび粒子と結合することができる。このような受容体試
薬をシグナル発生系の他の要素とともに添加することに
よって、上記と同様の結果を得ることができる。

この発明のもう１つの例を示せば、重合プローブは認識
オリゴヌクレオチドと、ポリグアノシンのような８〜２
０個の残基から成るホモポリマー・オリゴヌクレオチド
を含んでいる。検出プローブは西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼのような第１酵素を標識として含んでいる。重合
剤は、重合プローブに含まれているホモポリマー・オリ
ゴヌクレオチドと相補的な、例えばポリグアノシンの場
合、これに対するポリシチジル酸のようなホモポリマー
を含んでおり、これに、西洋ワサビのペルオキシダーゼ
の場合はブドー糖酸化酵素のような第２酵素を結合して
いる。酵素同志は、一方の生産物が他方の基質となる具
合に関連し合っている。

発明方法を実施するに当たっては、酵素信号発生系に必
要なすべての基質を反応媒質に添加して含有させる。媒
質を酵素活性について測定する。観察結果をアナライト
の既知量を含有する測定液で得た成績と比較することに
よって、アナライト最を定量的に測定することができる
。

上記の方法の変法として、検出オリゴヌクレオチドに結
合した分子量約１２５〜１５００のビオチンのような有
機性残基を検出プローブに含めることができる。この有
機性残基の受容体は、ビオチンの場合、アビジンまたは
ビオチンに対する抗体のような残基であって、この受容
体に第１酵素を結合させることができる。このような受
容体試薬をシグナル発生系の他の要素ととらに添加する
ことによって、上記と同様の結果を得ることができる。

また、以上の各態様において、試薬類のうちの１つを支
持体に付着させることができる。

便宜上、この発明に使用する試薬類を、各試薬の規定機
づつ組合わせて包装したキットを、試料中のポリヌクレ
オチド・アナライトの測定用として提供することができ
る。例えば、ポリヌクレオチドを含んでいると推測され
る試料中の該アナライトの測定に有用なキットは、 （ａ）（１）　　アナライトの、ある区域と相補的であ
るポリヌクレオチドを、（２）重合プローブと非共有結
合的に重合させる手段とコンジュゲートさせて含有して
いる重合プローブ、 （ｂ）（１）　　重合プローブによって認識された区域
以外のアナライトの区域と相補的であるポリヌクレオチ
ドを、（２）検出プローブを検出し得る手段とコンジュ
ゲートさせて含有している検出プローブ、 （ｃ）重合プローブの非共有結合的な重合を起こすこと
ができる重合剤、および （ｄ）必要とする補助材料 を組合わせて包装に含むことができる。

粒子を標識として使用した場合、このキットはさらに、
重合した重合プローブへ粒子を挿入するのに必要な任意
の試薬を含むことがてきる。例えば、そのような試薬と
して、検出プローブと結合する有機性残基に対する受容
体が挙げられ、この受容体がさらに粒子とコンジュゲー
トする。

酵素を標識として使用する場合は、試薬に、酵素を標識
したｓｂｐ要素、該酵素の基質またはその打部物質を含
むことができ、さらに別の任意の基質類、酵素類および
補酵素類、検出可能な発色団または発蛍光団を提供する
ものに必要な酵素生産物の任意の反応相手、信号発生系
の任意の他の要素等を含むことができる。

キットに含まれる各種試薬の相対量は、測定感度を実質
上最適化する試薬溶液濃度を提供するため大幅に変える
ことができる。また、キットに含まれる試薬類を、通常
、凍結乾燥により、賦形剤を加えた乾燥粉末の状態で提
供することができる。

これらの粉末試薬は、溶解することによって、測定を実
施し得る好適な濃度の試薬溶液を提供する。

［実施例］ この発明を説明するため、さらに下記の実施例を提供す
る。部および％はとくに明示しない限り重量単位による
。

実施例の説明のために、下記の略語を用いた。

ｄｕＴ　Ｐ　＝デオキシウリジン三燐酸ｄＧ−ＴＰ＝デ
オキシグアノシン三燐酸ＨＰ　Ｌ　Ｃ−一高速液体クロ
マトグラフィーα３２ＰＡＴＰ−α３２ｐ・アデノノン
三燐酸Ｈ９ＶＴＫ−ヘルペスウィルス・デミノンキナー
ゼ ＤＴＴ＝ジヂオスレイトール ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸 ＥＤＡＣ＝　１−エヂルー３−（３−ジメヂルアミノプ
ロピル）カルボジイミド ５ＤＳ−ドデンル硫酸ナトリウム ＴＥ＝１０ｍＭ−トリス・ＨＣ（１，ＩｍＭ−ＥＤＴＬ
−ブロス−ＬＢ（ルリア・バータニ）培地ｄｓ＝２本鎖 スクアレート染料＝１．１’　　−（４，４’　　−ビ
スジヘキサデシルアミノフェニル）カルポー！。

３−スフエイラン［スプリンガーら、アンゲバンテ・ヒ
エミー（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、　）８０巻、５４１
頁（１９６８年）の記載によって作成した］ ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン ビオチンｄｕＴＰ以外のヌクレオシド三燐酸はＰ。

Ｌ、バイオケミカルス［Ｐ、　Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ。

ビス力タウエイ（Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ　Ｊ　
Ｏ８８５４）］から購入した。ビオチンｄｕＴ　Ｐはエ
ンゾビウケム［Ｅｎｚｏｂｉｏｃｈｅｍ、ニューヨーク
］から購入した。放射性ヌクレオチド類はニュー・イン
グランド・ヌクレアー［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ
ｃｌｅａｒ、ボストン］からｌｌｉ’ａ人した。ポリヌ
クレオチド・キナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナ
ルトランスフェラーゼ［ミニマル・ヌクレアーゼ（Ｍｉ
ｎｉｍａｌ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ）］、制限エンドヌクレ
アーゼは、バイオケミカルスか、またはベセスダ・リザ
ーチ・ラボラトリーズ［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ガイザースバーグ
（Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍ　Ｏ２０８７７）
コから入手した。これらの酵素の使用法に関するプロト
コールの多くは提供会社の技術文献から得た。

実施例１ アビジン皮膜を施したラテックス・ビーズの作成 予成したスクアレート染料標識うテックスビー×１０目
ビーズ／ｍ（ＤにＥＤＡＣ（３７，５ｍｇ）を小量づつ
加えた後、４ｍｆ７の容量に希釈した。次に、アビジン
Ｄ「ベクター・ラボラトリーズ（ＶｅｃｔｏｒＬ　ａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンゲーム（Ｂ　ｕｒｌ　
ｉｎｇａｍｅ）、ＣＡ９４０１０］（２，ｏ）の０．Ｉ
Ｎ−ＮａＣ（！（２ｍ（２）溶液をこれに加えた。混合
物を超音波処理し、室温で１夜温合した。遠心し、ＣＢ
Ｓバッファー（０，１７Ｎ−グリノン、０．ＩＮ−Ｎａ
Ｃ（２，７６ｍＭ−ＮａＮ＊、ｐＨ９，２）、−１％Ｕ
ＳＡで洗滌した後、ビーズを６ｍ個のＣＢＳバッファー
・１％ＢＳＡに＠蜀して、６ＸＩ０１０ビ一ズ／ｍρの
予製液を得た。

実施例２ オリゴヌクレオチド・プローブ類の合成能のオリゴヌク
レオチドの合成に関して発表されているシリカゲル固体
支持体上に、積み本式にボスファイト・トリエステル化
学およびヌクレオシド・ホスファミダイトを積み上げる
合成法により、オリゴヌクレオチド５′　ＣＧＴＧＴＴ
ＴＧＣび５′　ＧＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＧＡＣ３′
　（プローブＢ）を合成した。その基礎化学および繰り
返し周期に関しては、ンンハらか「ヌクレオチドズ・ア
ンド・ヌクレオチドズ」に記載しているＥＳｉｎｈａら
、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ、　　３巻（２）、１５７〜１７１頁（１９８４
年）コ。このブロックを戻しくデブロック）　プローブ
を採取し、ＣＩＰスペリソルブ（ＣＩ　Ｐ　　５ｐｅｒ
ｉｓｏｒｂ）を用いたＩ（ＰＬＯによって精製した。オ
リゴヌクレオチド類はα３２Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌク
レオチド・キナーゼによって３２ｐ標識し、ＨＳＶ　　
ＴＫの遺伝子Ｄ　Ｎ　Ａドツト・プロットへのハイブリ
ッド形成により、その特質を明らかにした。

実施例３ プローブＢとビオチンとのコンジュゲート実施例２で作
成したオリゴヌクレオチド３００ｐＭ、　ビオチニル化
したｄｕＴ　Ｐ　３　ｎＭ、ターミナルトランスフェラ
ーゼ緩衝液（１４０ｍＭ−カコジレート、３０ｍＭ−ト
リス塩基、１ｍＭ−ＤＴＴ、１ｍＭ−ＣＯＣ１２２）の
混合液に、デオキヌクレオチジルトランスフェラーゼ２
００単位を添加した。この混合物を３７°Ｃでインキュ
ベートした。ついで混合液をＧ−５０セフアデツクス・
カラムに通すことによって、プローブＢのビオチニル化
生成物を得た。カラムは３２ｐ標識オリゴヌクレオチド
および３２ｐ　　ｈリホスフェートを通過させることに
よって較正した。

実施例４ ６尾部化したプローブＡの作成 実施例２で作成したオリゴヌクレオチド・プローブＡ１
００ｐＭおよびｄＧＴＰＩｏｎＭのターミナルトランス
フェラーゼ緩衝液（１４０ｍＭ−カコジレート、３０ｍ
Ｍ−トリス塩基、ＩｍＭ−ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＣｏＣＴ
ｏ）１００ｐＱの溶液にターミナルトランスフェラーゼ
２００単位を添加した。、混合液を３７℃で２時間イン
キュベートした後、７０°Ｃで２分間加熱して酵素を不
活性化した。尾部化したオリゴヌクレオチド・プローブ
ＡをＧ−５０セフアデツクスカラムに通して精製するこ
とにより、６尾部化したプローブＡ生成物を得た。

実施例５ ｐＨＳＶ　１０６ＤＮＡの作成 ｐＨ６Ｖ　１０６ＤＮＡは、単純ヘルペスウィルスｌ　
（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓ：ｍｐＩｅｘ　ｖｉｒｕｓ　　Ｔ　
）を含んでいるｐＢＲ３２２１導体であって、チミジン
キナーゼ遺伝子配列をＢａｍＩ−（［部位に挿入しであ
る。ｐＨ９Ｖ１０６ブラスミドを含んでいるエンエリキ
ア・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株を通常の分子クローニン
グ法によって作成した。ＤＮＡの作成方法はコールド・
スプリング・ハーバ−・モレキュラー・クローニング・
ラボラトリ−・マニュアル（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）に従っ
て行なった。

ｐＨ５ＶＩ０６エシエリキア・コリ株を１夜増殖さ仕た
培養５ｍＱをＬ−ブロス５００ｍＣに接種した。細菌を
１夜増殖させ、４°Ｃで１０分間、遠心してペレットを
得た。ｐＨ７，５の溶液（５０ｍＭ−グルコース、２５
ｍＭ−トリス・Ｔ−Ｉｃｃ、　　Ｉ　ＯｍＭ−ＥＤＴＡ
、リゾチーム５ｙｎｇ／ｍＱを含有）１０ｍ／Ｉ＋−八
１　　　　へ　九に烏七↓トわ　　由ｉ！ルー九　　Ｋ
　、ｈづン５Ｗ２７ボリアロマー試験管に移し、室温で
５分間静置した。０．２Ｎ−ＮａＯＩ−Ｉおよび２０％
５−ＤＳを含有している溶液２０ｍ（２をこの混合液に
加えた。パラフィンフィルムで内容物でおおい、試験管
を数回水中に静かに入れて、混合し、ついで１０分間、
水中に静置した。これに、水冷した５Ｍ−酢酸カリウム
水溶液（ｐＩ（４、５）ｌ　５ｍＣを加え内容物を水中
で１０分間静置した。ついてこの試験管をベックマン５
Ｗ２７０−ター（２００００ｒｐｍ、４°Ｃｌ２Ｏ分間
）で遠心した。細胞ＤＮＡおよび細菌残渣は試験管の底
部に固いペレットとなった。透明な上清を２本の２０ｍ
（！のコレノクス試験管に１多し、各試験管にそれぞれ
０．６容量づつのイソプロパツールを加えてよく混合し
た後、１５分間室温に保った。ツルホール遠心機（１２
０００ｇ３０分間）で遠心ずろことによって、目的のＤ
ＮＡを回収した。ペレットを７０％エタノールで洗滌し
、真空デンケータで乾燥した。ついでペレットを８ｍＣ
のＴＥ援衝液（ｐｌ−１８、０）溶解し、これにＣｓＣ
（２８ｇを加えた。臭化エチジウムを加え、密度勾配法
（４５０００ｒｐｍ、２４時間）によりＤＮＡを分離し
た。低い方のバンドを採取し、水を飽和したイソプロパ
ツールで抽出した。

臭化エチジウムを除去後、溶液をＴＥで充分に透析した
。

実施例６ ｐ１４ｓＶ　ｌ　０６ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
ＢａｍＨＩによる消化 実施例５で作成した精製ＤＮＡをＢａｍＨｌで消化する
ことにより、直線化した。消化は、ＤＮＡ１０μｇを緩
衝液［１０ｍＭ−）リス（ｐＨ７，５）、５０ｍＭ−Ｎ
ａＣＱ、Ｉ　ＯｍＭ−ＭｇＣＩ２．１ｍＭ−ジヂオスレ
イトール含有３１００ｍσに加え、これに２０単位の酵
素を加えて３７℃で１時間インキ５ベートした。試料を
６５℃で３分間加熱することによって反応を停止し、生
成物をそのまま使用しノと。

実施例７ 測定 実施例５で得たＤＮＡ３０ｆＭを含有しているｄｓＤＮ
Ａ２５０ｎｇ、およびＧ尾部化プローブＡ〜１ｐＭを含
む水溶液２０μρをキャップ付きエッペンドルフ試験管
に入れ、沸とう湯浴上で３分間加熱した。手早く試験管
を氷水浴に移し、ビオチニル化したプローブＢｌｐＭの
２μＱ溶液［ＩＭ−トリス・Ｉ−（Ｃｆ２　（ｐｉ−１
８、０’）および２．５Ｍ−ＮａＣＱ含有］を直ちに添
加した。ハイブリッド形成を起こすため、内容物を氷水
浴に１０分間放置し、ハイブリッドＤＮＡを回収した。

実施例１の記載によって調製したビーズ（共有結合して
いるアビジンおよびスクアレート色素含有）〜１０”を
１０μｍ２１衝液［５０ｍＭ−トリス（ｐＩ−１９，０
）、１５Ｍ−ＮａＣ＋２．５％卵白アルブミン、０．０
５％ツイーン、ＩＯｍＭ−ＥＤＴＡ含有コに懸濁し、超
音波処理した懸濁液に、前記のハイブリッドＤＮＡを含
有している溶液を加えた。

内容物を卓上振盪機で１０分間振盪した。振盪終了後、
ポリシチジル酸溶液（１０ｎｇ／ｍ（ｌ含有）（ポリＣ
）２μＱを追加し、内容物をさらに１０分間撹拌した。

この懸濁液（各２μｅ）を２５０倍に希釈し、各例毎に
ビーズの平均値径を測定することによって、粒子の平均
直径を求めた。ニコンブ（Ｎｉｃｏｍｐ）・レーザー分
光光度計を使用し、各実験毎に５ＱＱＯ（１回以上の測
定を行なった。第１表にその成績を示す。

し第１表］ （ｂ）この発明の方法ではない。比較のために実施上記
の結果から、この発明の方法によって迅速かつ正確で感
度の良いポリヌクレオチド・アナライトの測定を実施で
きることが判明した。この測定は容易に自動化できる。

第１表において、本発明による実験１では、実験２〜５
で観察された平均粒子直径より、有意に大きい平均粒子
直径が観察された。したがって、ポリヌクレオチド・ア
ナライトの測定において、相補的オリゴヌクレオチド配
列を使用して凝集を起こすことによる改良効果が証明さ
れた。凝集のためには、２つのプローブを使用し、２つ
ともポリヌクレオチド・アナライトにハイブリッド化さ
れることが必要である。

具体的な実施態様を例示して、この発明の詳細な説明し
たが、この方法より考えられる変更および修飾は、この
発明の精神および範囲に入ることは自明のことである。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）試料、およびアナライトと相補的である第
   １および第２ポリヌクレオチド試薬を測定媒質中で合わ
   せ、ここで第１試薬には第１試薬を非共有結合的に重合
   可能とする手段を含み、また第２試薬には第２試薬を検
   出可能とする手段を含み、該第１試薬および第２試薬を
   、それぞれアナライトの異なった区域にハイブリッド形
   成させ、しかもこの場合、第１試薬が重合する条件下で
   、該試料中にアナライトが存在している場合にのみ、第
   ２試薬が、重合した第１試薬と結合するに至るものとし
   、 （ｂ）第１試薬を重合させ、そして （ｃ）第２試薬が重合した第１試薬と結合するかどうか
   を測定することから成る アナライトを含んでいる疑のある試料中のポリヌクレオ
   チド・アナライトの存在を測定する方法。
2. （２）前記、ポリヌクレオチド・アナライトがウィルス
   、細菌、糸状菌、および真菌のＤＮＡ、ＲＮＡまたはゲ
   ノム、およびそれらの断片から選ばれる特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）第１試薬を非共有結合的に重合させ得る手段に、
   第１試薬とコンジュゲートした特異的結合対（ｓｂｐ）
   構成員を含んでおり、少なくとも２個の特異的結合部位
   を有する相補的なｓｂｐ構成員を測定媒質と合わせる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）第１試薬を非共有結合的に重合させ得る手段とし
   て、第１試薬と共有結合的に結合する反復オリゴヌクレ
   オチド配列を含んでいる特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
5. （５）反復オリゴヌクレオチド配列が、少なくとも８個
   のヌクレオチド残基を有するホモポリマーであるか、ま
   たは２個の非相補的なヌクレオチドから成る少なくとも
   ８個の鎖長のヌクレオチドを有するヘテロポリマーであ
   ることから成る特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）ｓｂｐ構成員およびそれと相補的であるｓｂｐ構
   成員が抗原−抗体、アビジン−ビオチン、ＩｇＧ−プロ
   テインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡからな
   る群から選ばれる特許請求の範囲第３項記載の方法。
7. （７）第２試薬を検出可能とする手段が、触媒、色素、
   蛍光剤、化学発光剤、粒子、金属ゾル、炭素粒子、ポリ
   マー粒子、リポソームおよび色素凝集体から成る群から
   選ばれた標識を含んでいる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
8. （８）第２標識を使用する特許請求の範囲第７項記載の
   方法。
9. （９）第２試薬を検出可能する手段が、第２試薬と結合
   した特異的結合対（ｓｂｐ）構成員およびその標識と結
   合した相補的なｓｂｐ構成員を含んでおり、ここで第２
   試薬および該標識の少なくとも１個と結合したｓｂｐ構
   成員の結合部位が一つに限られている特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。
10. （１０）ｓｂｐ構成員およびそれと相補的であるｓｂｐ
    構成員がそれぞれリガンドであり、それらのリガンドが
    ビオチンおよびリガンドの受容体、即ちアビジンであり
    、ここで唯１個のリガンドが第２試薬と結合しているこ
    とから成る特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）特許請求の範囲第１項の（ｃ）段階において、
    重合した第１試薬が、凝集粒子の存在を測定することに
    より、第２試薬の存在について検索される特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
12. （１２）第１試薬がアナライトとハイブリッド化するこ
    とができ、しかも非共有結合的に重合し得る重合プロー
    ブであり、第２試薬は、該重合プローブがハイブリッド
    形成する区域以外の区域でアナライトとハイブリッド化
    することができそれによって検出できる検出プローブで
    あることから成る特許請求の範囲第１項記載の方法。
13. （１３）重合プローブがアナライトと相補的なオリゴヌ
    クレオチドを含有し、それが重合プローブを非共有結合
    的に重合可能とする手段とコンジュゲートしたオリゴヌ
    クレオチドであることから成る特許請求の範囲第１２項
    記載の方法。
14. （１４）検出プローブが、その検出プローブを検出可能
    とする手段とコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを
    含有している特許請求の範囲第１２項記載の方法。
15. （１５）重合プローブが、その重合プローブを非共有結
    合的に重合させる手段とコンジュゲートしたアナライト
    のある区域とハイブリッド形成することができるポリヌ
    クレオチドを含んでおり、検出プローブは、その検出プ
    ローブを検出可能とする手段とコンジュゲートした重合
    プローブによって認識される区域以外の区域でアナライ
    トとハイブリッド化することができるポリヌクレオチド
    を含んでおり、また重合プローブの非共有結合的な重合
    を起こすことができる重合剤を含有している特許請求の
    範囲第１２項記載の方法。
16. （１６）凝集反応を含み、その凝集を起こすために相補
    的な反復オリゴヌクレオチド配列を使用することを改良
    点として含んでいる特許請求の範囲第１項記載の方法。
17. （１７）（ａ）（１）ポリヌクレオチド（これはアナラ
    イトのある区域と相補的であり、（２）とコンジュゲー
    トしている）と、（２）重合プローブを非共有結合的に
    重合可能とする手段を含有している、重合プローブ、 （ｂ）（１）ポリヌクレオチド（これは重合プローブに
    よって認識される区域以外のアナライトの区域と相補的
    であり、（２）とコンジュゲートしている）と、（２）
    検出プローブを検出可能とする手段とを含有している、
    検出プローブ、 （ｃ）重合プローブの非共有結合的な重合を起こすこと
    ができる重合剤、および （ｄ）必要な場合には補助材料 を組合わせて包装したキットであって、ポリヌクレオチ
    ド・アナライトを含んでいる疑のある試料中の該アナラ
    イトの存在を測定するのに有用なキット。