JPH0811080B2 - オリゴヌクレオチド配列のフロースルーハイブリダイゼーションアッセイ - Google Patents

オリゴヌクレオチド配列のフロースルーハイブリダイゼーションアッセイ

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JPH0811080B2
JPH0811080B2 JP5324047A JP32404793A JPH0811080B2 JP H0811080 B2 JPH0811080 B2 JP H0811080B2 JP 5324047 A JP5324047 A JP 5324047A JP 32404793 A JP32404793 A JP 32404793A JP H0811080 B2 JPH0811080 B2 JP H0811080B2
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6834Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Description

【発明の詳細な説明】

【0001】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸を検出するための
膜フロースルーアッセイに関する。

【0002】

【従来の技術】核酸配列の相補性(complemen
tarity)は、特定の核酸および核酸配列を同定、
検出および単離するためのよく知られた手段である。こ
のような方法は、多くの現在の核酸アッセイ、特に、ハ
イブリダイゼーションアッセイの基礎を形成する。ハイ
ブリダイゼーションアッセイの原理は、2つまたはそれ
以上の一本鎖核酸を互いに暴露し、相補的配列をハイブ
リダイズさせ、そして形成された二本鎖核酸の量を測定
することである。別法としては、相補的核酸鎖の連続合
成を使用してその合成を指示する鋳型鎖の存在を示すこ
とができる。同定、検出または単離すべき核酸または配
列は、一般的には標的核酸または標的配列と呼ばれる。

【0003】標的を単離、同定または検出するために使
用される、標的核酸に相補的な一本鎖核酸または配列
は、一般的にプローブと呼ばれる。核酸ハイブリダイゼ
ーションのいくつかの方法において、ひとつ以上のプロ
ーブが異なる目的で使用される。プローブはしばしば、
プローブが標的核酸にハイブリダイズしたときに標的核
酸の同定を促進する、該プローブ中に取り込まれた検出
可能な標識を有する。標識は、目または機械により検出
できるシグナルを生産する。当業界において公知の核酸
アッセイの多くは、相補的一本鎖のハイブリダイゼーシ
ョンに依存する。溶液ハイブリダイゼーション法におい
ては、標的核酸およびプローブは溶液中に共に入れてハ
イブリダイズさせる。標的に対するプローブのハイブリ
ダイゼーションは二本鎖が形成される光学密度における
変化にしたがいうる。別法として、二本鎖核酸は、ハイ
ブリダイズした物質中に存在する標識手段により未反応
の一本鎖から単離され、そして検出される。例えば、ヒ
ドロキシアパタイトを使用することにより二本鎖核酸を
選択的に結合するか、またはS1ヌクレアーゼを使用す
ることにより未反応の一本鎖核酸を特異的に分解して、
当業界において公知のサイズ分離法によりハイブリダイ
ズした二本鎖核酸から単離することができる。

【0004】溶液ハイブリダイゼーションは、迅速であ
り、かつ、相補的核酸配列間の効果的な反応を許す。し
かしながら、続くハイブリダイズ生成物の分離および検
出は激しく浪費的であり、時間を消費し自動化が困難で
ある。これらいくつかの不利を克服するための幾つかの
試みとして、固相表面ハイブリダイゼーション法が開発
されてきたが、該方法は、ハイブリダイゼーション混合
物の一本鎖成分の一方を固相支持体に固定する。残りの
アッセイ成分を含む溶液中での固定化核酸と相補的一本
鎖配列とのハイブリダイゼーションは、塩基間の完全な
ハイブリダイズ複合体の固定化をもたらす。固相支持体
は次に溶液中から容易に取り出されて未ハイブリダイズ
成分からハイブリダイズ成分が分離される。ハイブリダ
イゼーションが生じたことは、ハイブリッド中に存在す
る標識の検出により固相表面上で直接測定されうる。

【0005】固相表面または固相核酸ハイブリダイゼー
ション法は、未ハイブリダイズの一本鎖核酸から、ハイ
ブリッドした核酸をアッセイ中で迅速かつ簡単に分離す
ることを提供する。しかしながら、それらは、幾つかの
不利を有する。すべての反応成分が拡散できない場合の
固相表面上のハイブリダイゼーションの動力学は、顕著
に遅い反応速度をもたらす。結果として、固相支持体を
含む場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程はよ
り長くなり、そしてアッセイの感度はしばしば低下す
る。さらに、固相支持体への核酸の結合は塩基対に利用
されない幾つかの塩基を生じ、さらには、ハイブリダイ
ゼーション効率を低下させる。

【0006】免疫アッセイにおいては、フロースルー固
相法が開発されて、慣用的固相に関連した容易な試薬分
離を犠牲にすることなしに、より迅速な結果を提供す
る。幾つかの公知の免疫フロースルーアッセイおよびそ
のようなアッセイに使用されるようにデザインされた装
置の幾つかは、米国特許第4.366,241号(トム
(Tom)ら)、米国特許第4,727,019号およ
び第4,632,901号(バーキルス(Valkir
s)ら)および米国特許第4,818,677号(ヘイ
−カウフマン(Hay−Kaufman)ら)に記載さ
れている。しかしながら、これらの免疫法は核酸ハイブ
リダイゼーションアッセイに対して完全には採用されて
おらず、公知のフロースルー核酸ハイブリダイゼーショ
ンアッセイは効果的なハイブリダイゼーションを生じさ
せるために反応表面を通してフローを開始するのに先立
ってインキュベーションの時間を必要とする。このイン
キュベーションの時間は、フローアッセイフォーマット
の主要な利点のひとつ、即ち、結果が得られるまでのス
ピードを価値のないものにする。

【0007】国際公開89/10979は、そのような
固相核酸ハイブリダイゼーションアッセイの一つを開示
する。一つの態様において、サンドイッチハイブリダイ
ゼーションは溶液中で実施されるが、免疫アッセイにお
いて共通に用いられているフロースルー法と同様なアッ
セイフォーマット中で、相補性取得(capture)
リガンドにより孔性膜上にハイブリッドが取得される。
しかしながら、効果的な結合を達成するためには、溶液
をフロースルーさせる前に溶液を10分間膜とインキュ
ベーションさせる。この方法は所望の標的核酸の検出の
ために2つのプローブ、即ち標識を有するプローブおよ
び取得のためのリガンドを有するプローブをも必要とす
る。

【0008】国際公開89/10979のとおり、いく
らかの時間の短縮が、制御されたかまたは制限されたフ
ロースルーサンドイッチ核酸アッセイを用いることによ
り達成されたが、核酸ハイブリダイゼーションのための
迅速で単純なフロースルー膜アッセイの完全な利点を提
供する方法は当業界において見つかっていない。即ち、
核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて満足のゆ
くレベルの感度を保った膜を用いた場合のインキュベー
ション時間の除去には成功していない。本発明は、装置
を通した液体の流れが制限されず、即ち、フロースルー
が阻害されてハイブリダイゼーションが許される間、膜
を用いているが、アッセイ成分のインキュベーション時
間が不要な点で、先行技術のフロースルー核酸ハイブリ
ダイゼーションアッセイとは区別される。

【0009】コルティ(Corti)ら(1990)、
J.Immunol.Mtds.134:81−86
は、DNAハプテン標識反応を評価する方法を記載して
いるが、該方法は抗ハプテン抗体/アルカリホスファタ
ーゼ配合体を使用してキャピラリー吸着フィルター上に
固定されたハプテン−DNAを検出する。ハプテン−D
NAは直接フィルター上に吸着する。

【0010】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相核酸ハ
イブリダイゼーションの分野における幾つかの問題を克
服する。膜を用いるが、サンプルのインキュベーション
時間を必要としないフロースルー膜ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイが提供される。したがってこのアッセイ
は、固相表面上でリガンド含有核酸を迅速かつ簡単に検
出し、そして核酸増幅反応産物のスクリーニングに関し
て、および特定の核酸配列の検出に基づくさまざまな治
療に有用である。

【0011】

【課題を解決するための手段】本発明は、リガンドを含
む核酸プローブを用いて所望の標的核酸配列を検出する
フロースルーアッセイ法を提供する。一つの態様におい
て、プローブは標的配列を鋳型として用いてリガンドを
取り込んで合成される。合成されたリガンド含有核酸プ
ローブの存在は、次に、フロースルーアッセイ装置の反
応表面に固定されたリガンドに関する抗リガンド抗体ま
たは特異的結合対メンバーに結合させることにより、標
的の存在を示して直接検出される。二番目の態様におい
て、標的配列は、反応表面に固定された相補的取得配列
に該リガンド含有プローブをハイブリダイズさせること
により検出される。いずれの態様においても、結合した
リガンド含有核酸は、リガンドに関する標識抗リガンド
抗体または標識特異的結合パートナーにリガンドを結合
させることにより検出される。別法として、標的配列
は、リガンド含有プローブおよび反応表面上に固定され
た取得配列にハイブリダイズすることにより、サンドイ
ッチアッセイにおいて検出されるが、その際プローブお
よび取得配列の両者は標的に対して相補的である。標的
配列に相補的な核酸に取り込むための好ましいリガンド
はビオチンである。

【0012】本発明によれば、所望の標的核酸配列に相
補的な核酸プローブは、合成のための鋳型として標的配
列を用いてリガンドを取り込んで合成される。リガンド
はフロースルーアッセイ装置の反応膜上のプローブを取
得する手段として、および/または反応膜上のプローブ
の存在を検出するための手段として作用する。

【0013】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッ
セイを実施するのに有用な好ましいフロースルー膜装置
は、フロースルー免疫アッセイの使用において当業界に
おいて本質的に公知である。本発明に採用されるのに適
しているフロースルー免疫アッセイ装置の例は、米国特
許第4,366,241号、米国特許第4,632,9
01号、米国特許第4,818,677号および米国特
許第4,920,046号に記載されている。これら装
置の操作の原理は、本発明の核酸アッセイ法に採用され
る場合同じであるが、試薬およびプロトコルのいくつか
の修飾は以下に記載されるとおり、特異性および感度を
達成するために必要である。

【0014】フロースルーアッセイ装置は孔性膜を含
み、結合またはハイブリダイゼーション反応がフロース
ルーの間に膜中で生じる。反応膜として使用されるのに
適したさまざまな物質が、特定のアッセイの使用におい
て公知である。ナイロンまたはニトロセルロース膜は、
核酸研究にしばしば用いられ、そして本発明のアッセイ
における使用のために適切である。ポールバイオサポー
トコーポレーション(Pall BioSupport
Corporation)(Glen Cove,
N.Y.)バイオダイン(BIODYNE)のようなナ
イロン膜が好ましいが、それは、紫外線による膜上への
核酸の固定法が実施しやすいからである。もっとも好ま
しいのは、ナイロン膜表面がカチオン第四アンモニウム
基で修飾されていることにより紫外線を用いずに迅速に
核酸を固定できるバイオダインB膜である。

【0015】標的核酸配列は検出されるオリゴヌクレオ
チド配列である。DNAオリゴヌクレオチドが好ましい
が、RNAも使用できる。標的配列は以下に記載される
相補的プローブの合成のための鋳型として使用するのに
適したあらゆる核酸配列であってよい。標的配列の例
は、プラスミドまたはその部分、ゲノミックDNA配
列、準細胞小器官由来のDNA配列、メッセンジャーR
NAおよびリボソームRNAを含み、これらすべては当
業界において公知の方法を用いて相補的プローブの合成
のために単離および調製される。

【0016】アッセイの実施に際し、標的配列に相補的
なリガンド含有プローブの合成のために、標的核酸を含
むかまたは含む疑いのあるサンプルを溶液中に調製する
のが通常である。リガンドは第2分子に特異的に結合す
る分子、即ち、特異的結合対のメンバーである分子であ
る。抗原、抗体、ビオチン、レクチンおよびハプテンは
それぞれ、抗原、アビジンまたはストレプトアビジン、
糖質(carbohydrate)および抗体に特異的
に結合するリガンドの例である。プローブの合成は、リ
ガンドに誘導されたオリゴヌクレオチド前駆体(デオキ
シヌクレオチド3リン酸またはdNTPs)を相補プロ
ーブに取り込む標的特異的cDNAまたはmRNA合成
法により達成され、例えば、規定されたプローブ配列を
もたらすポリメラーゼチェインリアクション反応または
他の核酸増幅法が挙げられる。ポリメラーゼチェインリ
アクション反応(PCR)はプローブの合成に最も好ま
しい手段である。好ましくは、ビオチン誘導ヌクレオチ
ドをプローブに取り込むが、さまざまなハプテンリガン
ド、例えばジゴキシゲニンを取り込んでもよい。

【0017】トレーサーを用いることにより、相補的プ
ローブが検出される。トレーサーは標識に結合したリガ
ンドに関して特異的な結合対メンバーからなる。特異的
な結合対メンバーは、リガンドを認識する抗体(例え
ば、抗ビオチン)またはリガンドに関する特異的な結合
パートナー(例えば、ビオチンリガンドに対するアビジ
ンまたはストレプトアビジン)でよい。トレーサーの標
識部分は、フロースルーアッセイ装置の反応膜に固定さ
れる場合、プローブの同定を促進する検出可能なモイエ
ティである。標識は直接検出可能なものか、またはさら
なる化学反応後に検出可能なものである。例えば、標識
は放射性標識、蛍光標識または可視発色染料であり、そ
れらすべては目または機械により直接検出できる。発色
生成物を生成する付加的化学成分と反応することができ
る酵素は間接的検出可能な標識の例であり、アルカリホ
スファターゼおよびホースラディッシュパーオキシダー
ゼを含む。可視発色染料を包含し、特定の結合分子に由
来するリポソームが好ましい標識である。これら標識お
よびアッセイにおけるその使用法は米国特許第4,69
5,554号、米国特許第4,717,676号および
米国特許第4,708,933号に記載されている。

【0018】標的配列に相補的なリガンド含有プローブ
はさまざまな方法で検出できる。ひとつの態様として、
抗リガンド抗体(好ましくは抗ビオチン)をフロースル
ーアッセイ装置の反応膜に拡散しないように固定する。
この態様はリガンド含有一本鎖または二本鎖核酸、例え
ばビオチン化デオキシヌクレオシド3リン酸を用いて合
成された、ポリメラーゼチェインリアクション反応産物
(一本鎖または鋳型核酸にハイブリダイズしたもの)の
取得に有用である。これら取り込まれなかったリガンド
誘導核酸前駆体がアッセイの結果に干渉しないこと、即
ち、膜上の抗ビオチンに結合するプローブと顕著に競合
しないことが、期待に反して見いだされた。この態様
は、特異的結合パートナーまたは抗リガンド抗体がプロ
ーブ取得のために膜上に固定されており、検出される特
異的標的配列に依存しない利点を有し、抗リガンドまた
は特異的結合パートナーの膜を使用して、抗体または特
異的結合パートナーにより結合する利点を含有するあら
ゆるプローブを取得することができる。

【0019】別の好ましい態様において、一本鎖標的配
列および/またはその相補鎖、またはその部分は、リガ
ンド含有プローブが取得配列にハイブリダイズすること
により膜を通って流れるように適用された、取得配列お
よびプローブ合成反応混合物として反応膜に固定され
る。取得配列はPCRにより合成、生成されるかまたは
標的配列を含む制限断片でありうる。好ましくは、取得
配列は標的配列の不在下で取得配列およびプローブへの
非特異的ハイブリダイゼーションを減じる相補的プロー
ブの合成に使用される標的配列のサブセットである。P
CRによりプローブを生成したら、取得配列も増幅に使
用されるプライマーに相補的な配列を含まない標的配列
の部分に由来することが好ましく、その結果、存在する
かもしれない伸長されなかったプライマーとのハイブリ
ダイズが生じない。反応膜も、蛋白質、ポリヌクレオチ
ド、ポリサッカライド等によりブロックされることによ
り膜への非特異的結合を減じる。

【0020】膜に固定された取得配列を変成し、そして
適当な物質および方法により膜に拡散しないように結合
させる。これらは、アミノ修飾ナイロン膜(例えば、B
IODYNE B)への固定またはニトロセルロースへ
の応用に関する加熱または紫外線照射を含む。取得配列
は加熱並びに化学的または酵素的手段により変成され
る。反応膜により残すことができる取得配列の最大量を
測定する研究が行われた。この目的のために、25ng
から3mgの標識250bp取得配列をBIODYNE
B膜にスポットし、ハイブリダイゼーションアッセイ
に共通に用いられるすべての溶液を添加した。結果が示
したことは、500ngから750ngの取得配列の間
で、膜からの取得配列の損失が25%を越えて増加し始
めたことである。このことから、膜は約500ngの2
50bp取得配列で飽和することが示唆された。

【0021】通常、希釈剤を用いたプローブ合成反応混
合物は膜上の固定取得配列に適用され、プローブが合成
されたならば、混合物が膜をフロースルーしたときに相
補的配列間のハイブリダイゼーションが生じる。好まし
くは、膜に適用された混合物は、粘度をわずかに増加さ
せて膜を通した液体の流れを遅くする成分を含む。例え
ば、硫酸デキストラン(約10%まで)およびデンハル
ト溶液(約1×、FicollおよびPVPを含む)が
この目的のために適切な増粘剤である。洗浄工程は、未
結合プローブ配列を除去して膜への非特異的結合を低下
させるためのハイブリダイゼーション後に含まれるのが
通常である。ハイブリダイズしたプローブは、次に前記
のトレーサーを用いて膜上で検出される。好ましくは、
プローブに含まれるリガンドはビオチンであり、そし
て、取得配列にプローブがハイブリダイズしたならば、
膜上に可視発色地域を生成する染料を含む抗ビオチン誘
導リポソームである。膜上へのプローブのハイブリダイ
ゼーションから、プローブ合成のために使用されたサン
プル中に標的配列が存在することが示される。

【0022】別の態様において、アッセイはフロースル
ーサンドイッチアッセイとして実施される。この態様に
おいて、反応膜上に固定された取得配列は標的配列の一
部分に相補的である。標的配列へのプローブのハイブリ
ダイゼーションが、標的配列に対する取得配列のハイブ
リダイゼーションを阻害しないように、プローブは標的
配列の第2部分に相補的なように合成される。サンドイ
ッチアッセイにおいては、取得配列およびプローブは標
的配列にハイブリダイズさせる。取得配列は、膜上にハ
イブリダイズした取得/標的/プローブに固定される。
プローブと標的配列は、膜への取得配列の適用前に溶液
中でハイブリダイズさせる。しかしながら、標的配列を
取得配列にハイブリダイズさせ、プローブを取得配列/
標的配列のハイブリッドにハイブリダイズさせる、即ち
段階ハイブリダイゼーションの方が好ましい。段階法が
速いのは、遅い溶液ハイブリダイゼーションが促進され
るからである。次に、固定されたプローブを前記のとお
りに検出する。

【0023】便宜上、このアッセイのための装置および
/または試薬はキットの形態でパッケージされる。この
ようなキットは、アッセイのための以下の成分の一部ま
たはすべてを含む:1)リガンド誘導核酸前駆体のバイ
アル、2)選択された方法に適切なオリゴヌクレオチド
プローブ合成のための試薬、3)反応膜に固定された適
切なリガンド結合パートナーまたは取得配列を有するフ
ロースルーアッセイ装置、4)洗浄試薬、5)トレーサ
ーおよび6)直接検出されない場合のトレーサーの標識
を検出するための試薬。別法として、取り込まれたリガ
ンドを用いて予め合成されたプローブは、特定のアッセ
イの応用、例えばナイセリア(Neisseria)の
検出に使用されるために提供される。

【0024】以下の実験例は本発明の特定の態様を例示
するために意図されたものであり、限定のために意図さ
れたものでない。本発明の修飾および変更は、特許請求
の範囲として規定される本発明の精神および範囲から離
れるものでないことは当業者には明らかであろう。

【0025】

【実施例】実施例1 標的およびプローブはPCRにより生産された。標的断
片は以下の条件を用いて増幅された;62.5mlの
水、10.0mlの10×AMPLITAQ緩衝液(P
erkin−Elmer Cetus,Norwal
k,CT)、16mlの1.25mM dNTP’s、
50mlの20mM前方(forward)プライマ
ー、5.0mlの20mlリバースプライマー、1−2
0ngの鋳型核酸(1.0ml総体積)および0.5m
lのAMPLITAQ DNAポリメラーゼ(5ユニッ
ト/ml、Perkin−Elmer Cetus)。
AMPLITAQの10×緩衝液は、100mMのTr
is−Cl pH8.3、500mMのKCl、15m
lのMgCl2および0.01%のゼラチンを含んだ。
プローブ断片は以下の条件を用いて増幅された:57.
7mlの水、10.0mlの10×AMPLITAQ緩
衝液、16mlのdNTP’s(1.25mMのA,
C,G;0.94mMのT)、5.0mlの1mM ビ
オチンー16−dUTP、5.0mlの20mM前方プ
ライマー、5.0mlの20mMリバースプライマー、
1−20ngの鋳型核酸(1.0ml総体積)および
0.5mlのAMPLITAQのDNAポリメラーゼ
(5ユニット/ml)。鋳型は、rubella E1
遺伝子(D.Clarkeら、Nucleic Aci
ds Res.,15(7):3041)の5’部分か
ら316bpのPstI/PvuII断片をPstI/
SmaI部位に含むBLUESCRIPTプラスミド
(Stratagene,La Jolla,CA)で
あった。

【0026】PCR増幅反応は典型的には約35サイク
ルで行い、95℃で2分間の変成、50℃で2分間のア
ニーリングおよび72℃で3分間の伸長合成を各サイク
ルで実施した。増幅後、250bpの取得配列およびプ
ローブ配列をHPLCによりPerkin−Elmer
PE TSK非孔性(nonporous)カラムに
より精製してプライマーおよび取り込まれなかったヌク
レオチドを説明書にしたがって除去した。この工程はD
NAを正確に定量させた。取得DNA(1mlの10m
MのTris−HCl pH7.5,1mM EDTA
(TE緩衝液))を膜にスポットした。さまざまな量の
取得配列を膜に適用して取得のための最適濃度を決定し
た(50ng,10ngおよび5ng)。

【0027】実施例2 2mlのDNAを3mmのBIODYNE B膜に適用
することにより調製された膜を、0.2M NaOHで
ぬらし、そしてStratagene社のSTRATA
LINKERを用いて1200mjoulesにセット
して紫外光を用いて架橋結合した。次に、膜を100m
Mのリン酸ナトリウム、pH8.0、10mM EDT
Aで洗浄することにより中和した。膜を45℃において
30分間ベイクし、そしてすぐに使用しないのであれば
乾燥剤と共に保存した。このアッセイは、図1に示され
る吸着紙に取得DNAを含む膜を重ねる(layin
g)ことにより実施された。該吸着紙は、ナイロン膜を
通した液体の流れを指示する。該吸着紙は、最も上のポ
リカーボネート層(1mmポアサイズ)、該ポアサイズ
層に接触したポリエステル層、および該ポリエステル層
に接触した吸着セルロース物質の層からなる。該吸着紙
の層は共に縫い合わされてもよい。

【0028】2から5マイクロリットルのビオチン化プ
ローブを、48%のホルムアミド、0.72Mのナトリ
ウム(4.8×SSC)、20mMのTris−HCl
(pH7.6)、1×デンハルト溶液、10%の硫酸デ
キストランおよび0.1%のSDSからなる40mlの
ハイブリダイゼーション緩衝液I(Hyb I)に加え
た。該プローブ溶液を70℃において5分間加熱した。
加熱したプローブをすぐにナイロン膜に滴下した。次に
加えられるすべての溶液も滴下により加えた。すべての
ハイブリダイゼーション溶液が膜を通って流れたなら
ば、2つの洗浄溶液を適用した。第1の溶液(150m
lの0.1%SDS含有2×SSC)を適用し、そして
完全にフロースルーさせ、次に、第2洗浄溶液(150
mlの0.2×SSC/0.1%SDS)を加えた。洗
浄後、150マイクロリットルのブロック溶液(3%の
BSA(画分V)、2%のblotto)を膜に加え
た。次に、ハイブリダイズしたプローブを、スルホロー
ダミンB染料を含む、抗ビオチン結合リポソームの懸濁
液150mlにより検出した。該膜に特異的に結合した
リポソームは取得DNAが適用された場所で赤い点を生
成した。この赤い点の回りの膜上にルーズに結合した
(associated)リポソームは、150mlの
1Mグアニジン(pH7.0)をもちいた最後の洗浄に
おいて明瞭にされたかすかにピンク色を生成した。

【0029】アッセイ結果は、以下の表に示される。こ
のアッセイにおいて、50ngの取得DNAが5ngの
プローブの検出に必要であることがわかった。少量の取
得DNAを用いた場合、アッセイ感度は低下した。

【0030】 ハイブリダイゼーション反応も特異的であることが示さ
れた。非相同性対照取得配列(Perkin/Elme
r Cetus GENEAMP対照断片)として使用
するため、ラムダDNAの500bp核酸断片を増幅
し、そしてビオチンで標識した。50ナノグラムを膜に
適用して250bpの標的配列に対して試験した。可視
反応はなかった。取得配列および標的配列として該増幅
されたラムダ断片を用いてフロースルーアッセイを実施
した場合に強固な陽性反応が見られ、このことから、該
断片がそれ自身にハイブリダイズしたことが確認され
た。

【0031】実施例3 この実験において、取得配列およびプローブ配列の両方
の大きさを変化させた。DNA調製物および他の方法は
実施例1に記載されたとおりである。50ナノグラムの
各取得配列(150bp,250bp,850bpおよ
び1650bp)をナイロン膜にスポットし、そして同
じサイズのプローブのパネルにハイブリダイズさせた。
このアッセイを実施するために、ビオチン化されたプロ
ーブ5ml(100ng)を40mlのHyb Iに加
え、そして70℃において5分間加熱した。該混合物を
膜に滴下し、そして実施例2のとおりにアッセイを実施
した。反応の強度はGretagモデルD183(Gr
etag社、Regensdorf、スイス)を用いて
定量した。結果を図2に示す。すべての例において、プ
ローブのハイブリダイゼーションおよび結果のシグナル
は反射メーターにより検出した。もっとも大きいプロー
ブ(1650bp)はすべてのサイズの取得DNAにお
いて最も強い強度のシグナルを与えた。対照的に、通
常、他のプローブはプローブ配列サイズの低下と共に低
下した強度のシグナルを与えた。異なるサイズの断片を
用いたアッセイの特異性は非特異的取得断片およびプロ
ーブ断片を用いて検出され、すべての場合に読み取り値
はバックグラウンドレベルと同様であった。

【0032】非特異的プローブは、もっとも大きな取得
断片(1650bp)を用いたときに極めて弱い陽性反
応を生じた。これは、少量の非特異的ハイブリダイゼー
ション、相対的に大きなサイズの取得断片または膜を通
したプローブの自由な流れを干渉する、膜内の部分的な
ポアの破壊によるのかもしれない。

【0033】同様の実験において、50bpおよび24
bpの取得配列が、850bp,450bp,250b
pおよび150bpのプローブを取得できることがわか
った。しかしながら、図3に示されるとおり、シグナル
の強度は大きな取得配列を用いたアッセイと比較して低
下した。この場合、100ngの24bpまたは50b
pの取得DNAは200ngのプローブを検出するのに
必要であった。DNAの量におけるこの増加でさえも、
少量の大きい断片を用いた場合(即ち、50ngの25
0bp取得断片)に比べて強度は低かった。

【0034】実施例4 ナイセリアゴノレア(Neisseria gonor
rhea)をモデルシステムとして用いて、細胞中の特
定の核酸断片を検出する本発明の方法の有用性を証明し
た。Woodsら[(1989)Molecular
Microbiology 3(1):43−48]に
より報告されたヌクレオチド番号53から320までの
約281bpのゴノコッカル(gonococcal)
H.8遺伝子を増幅するために、プライマーを選択して
合成した。この遺伝子は病原性ナイセリア種の間で高度
に保存されている。増幅されたプローブは、前記のとお
りにポリメラーゼチェインリアクションにより合成され
た。

【0035】フロースルーハイブリダイゼーションアッ
セイに関して、ナイセリアゴノレア株GC5766を液
体培地で生育させた。10倍の連続希釈を200mlの
2mM Tris−Cl(pH8.5)、2mM ED
TA、1%のTritonX−100中に作成してml
あたり106から102生物体を得た。各希釈物は95℃
において10分間加熱した。25マイクロリットルの各
希釈物をPCRにおける鋳型として用いた。H.8遺伝
子の281bp断片を増幅し、ビオチン−16UTPを
上記のとおりに取り込ませた。100mlのHyb I
に加えた、PCR産物の30マイクロリットルアリコー
トを、40サイクルおよび50サイクルの増幅後、フロ
ースルーアッセイにおいて試験した。膜上の相同性のあ
る非標識取得断片は、精製されたGC5766ゲノミッ
クDNAを鋳型として用いてPCRにより生成された。
ほんの250生物体が40サイクルにおいて検出でき
た。増幅反応のアリコートも反応産物の可視化のために
アガロースゲルにて電気泳動した。このゲルは、ハイブ
リダイゼーションアッセイより顕著に低い感度であっ
た。10サイクルのさらなる増幅(50サイクル)によ
り、ほんの2.5生物体がフロースルーハイブリダイゼ
ーションにおいて検出できたが、ゲル上にて可視化する
のは困難であった。

【0036】実施例5 フロースルーハイブリダイゼーションアッセイはサンド
イッチフォーマットにおいても実施された。Rubel
laE1遺伝子の小さい150bp断片を、1,650
bpの標的配列のための取得配列として用いた。該取得
配列とはハイブリダイズしないはずの、ビオチン−16
−UTPを上記のとおりに取り込んだ1,650bp標
的配列の400bp部分の増幅によりプローブを調製し
た。

【0037】150bpの取得配列をBIODYNE
B膜に2ml中50ngおよび10ngでスポットし
た。このアッセイは本質的に実施例2のとおりに実施し
た。TE中で精製および希釈された50マイクロリット
ルの標的配列を45mlのHyb Iと混合して70℃
において5分間加熱した。次に、調製された標的DNA
をナイロン膜に適用してフロースルーさせた。膜を45
mlの0.2×SSC、次に45mlの2×SSCおよ
び150mlの100mM PBS(pH8.0)で洗
浄した。プローブ(92ng)を45mlのハイブリダ
イゼーション緩衝液に加えて70℃において5分間加熱
して、膜にフロースルーさせた。前記150mlの各S
SC溶液により膜を洗浄して150mlのBlotto
/BSA溶液で前記のとおりにブロックした。スルホロ
ーダミンを含むウサギ抗ビオチンリポソーム(1%のB
LOTTO中の150mlの1:3希釈)を用いて膜上
のハイブリダイズしたプローブを検出し、2M尿素2滴
を加えた。

【0038】幾つかの濃度のプローブおよび取得DNA
に関して評価した。92ngのプローブおよび50ng
の取得DNA(150mer)を用いた場合、このシス
テムは4ngの1,650bp標的断片を検出できたこ
とがわかった。これらと同じプローブおよび取得断片お
よび非相同性標的(プラスミドpMSG,ファルマシア
社)を用いた場合、25ngのpMSG標的を用いた検
出可能な反応はなかったことから、この反応は特異的で
ることが証明された。

【図面の簡単な説明】

【図1】図1は、本発明のフロースルーアッセイ装置の
ひとつの態様を例示する。

【図2】図2は、さまざまなサイズの取得配列およびプ
ローブ配列に関して実施例3に記載された実験結果のグ
ラフによる記載を示す。50ナノグラムの各取得配列、
および100ナノグラムの各プローブを実験に用いた。

【図3】図3は、シグナル強度に対する取得配列サイズ
の効果を示す、実施例3に記載された実験結果のグラフ
による記載を示す。100ナノグラムの24bpおよび
50bp取得配列、および50ナノグラムの250bp
取得配列を実験に用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C12M 1/00 Z (72)発明者 リチャード・エル・マロニー アメリカ合衆国メリーランド州21228,カ ントンスヴィル,オーク・フォレスト・ア ベニュー 217

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の工程: (a)標的配列を鋳型として用いて、リガンドを含むプ
    ローブを合成し; (b)実質的に即座にプローブが反応膜を通って流れて
    取得配列にハイブリダイズするように、孔性反応膜上に
    固定された取得配列を有するフロースルーアッセイ装置
    にプローブを適用し; (c)トレーサーがリガンドに結合するように、検出可
    能な標識を結合したリガンドに特異的に結合する分子か
    らなるトレーサーに膜を接触させ;そして (d)標的配列の存在を示すものとして膜上のトレーサ
    ーを検出することからなる、標的核酸配列の検出法。
  2. 【請求項2】 ビオチン誘導ヌクレオチドを含むように
    プローブを合成し、抗ビオチン抗体からなるトレーサー
    にビオチンが結合する、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 染料を含む抗ビオチン抗体からなるトレ
    ーサーにビオチンが結合している、請求項2記載の方
    法。
  4. 【請求項4】 以下の工程: (a)鋳型として標的配列の第一部分を用いて、上記標
    的配列の第一部分に相補的な、リガンドを含むプローブ
    を合成し; (b)孔性反応膜上に固定された取得配列を有するフロ
    ースルーアッセイ装置に標的配列およびプローブを適用
    するが、その際、取得配列は標的配列の第二部分に相補
    的であり; (c)標的配列が取得配列にハイブリダイズし、そし
    て、プローブが標的配列にハイブリダイズするように、
    標的配列およびプローブを反応膜にフロースルーさせ; (d)トレーサーがリガンドに結合するように、検出可
    能な標識を結合したリガンドに特異的に結合する分子か
    らなるトレーサーに膜を接触させ;そして (e)標的配列の存在を示すものとして膜上のトレーサ
    ーを検出することからなる、標的核酸配列の検出法。
  5. 【請求項5】 ビオチン誘導ヌクレオチドを含むように
    プローブを合成し、抗ビオチン抗体からなるトレーサー
    にビオチンが結合する、請求項4記載の方法。
  6. 【請求項6】 反応膜に適用する前に、標的配列および
    プローブを膜にハイブリダイズさせる、請求項5記載の
    方法。
  7. 【請求項7】 プローブを膜に適用する前に標的配列を
    膜に適用する、請求項5記載の方法。
  8. 【請求項8】 染料を含む抗ビオチン抗体からなるトレ
    ーサーにビオチンが結合する、請求項5記載の方法。
  9. 【請求項9】 以下の工程: (a)鋳型として標的配列を用いて、リガンドを含む相
    補的なプローブを合成し; (b)プローブは実質的に即座に反応膜をフロースルー
    し、そして抗リガンド抗体に結合するように、孔性反応
    膜上に固定された抗リガンド抗体を有するフロースルー
    アッセイ装置にプローブを適用し; (c)トレーサーがリガンドに結合するように、検出可
    能な標識を結合したリガンドに特異的に結合する分子か
    らなるトレーサーに膜を接触させ;そして (d)標的配列の存在を示すものとして膜上のトレーサ
    ーを検出することからなる、標的核酸配列の検出法。
  10. 【請求項10】 ビオチン誘導ヌクレオチドを含むよう
    にプローブを合成し、反応膜上に固定された抗ビオチン
    抗体にプローブが結合しており、そして抗ビオチン抗体
    からなるトレーサーにビオチンが結合する、請求項9記
    載の方法。
JP5324047A 1993-01-04 1993-12-22 オリゴヌクレオチド配列のフロースルーハイブリダイゼーションアッセイ Expired - Lifetime JPH0811080B2 (ja)

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