JPS6199843A - 分注方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、化学発光物質又は生物発光物質と、酸化剤及
び触媒篩の試薬との反応による発光現象を利用する発光
分析において、測定セル中の発光物質に対し試薬を分注
する分注器法に関するものである。

〔従来の技術〕

化学発光物質又は生物発光物質は、酸化剤もしくはこれ
と触媒（酵素）等との反応により発光現象を生じ、この
発光現象を利用して種々の未知物質の分析が行われてい
る。この化学発光物質としてはルミノール、ルシゲニン
、ウラニン等が知られている。特にルミノールは血液中
のヘモグロビンが触媒となることを利用して血痕の分析
に用いられていることで周知である。

ルミノールは、フェリシアン化カリウム等の触媒の存在
下で次式の反応が進行し、この発光現象を利用して量子
化されたｈνを測定することにょシ、過酸化水素の定量
を行うことができる（式中のνは発光の振動数、ｈはブ
ランクの定数を示す）また、ベルオニシターゼのような
酵素がルミノールと過酸化水素系の触媒として有効に作
用するため、　ＥＩＡ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｎｎｏ
　Ａｓ５ａｙ　）法のように酵素を蛋白質あるいはホル
モン等の種々の物質に標準化することにより、未知物質
の定量を可能にすることができる。

さらに、とのルミノール反応を利用してＣｏ　　＋２＋ Ｃｕ　　＊　Ｎｉ　　ｒ　Ｃｒ　　＋　Ｆｅ　　等の各
種金属イオンの分析を行うこともできる。

一般に、化学発光現象において時間の経過に対する発光
パターンは、第９図に示す如き傾向を示す。すなわち、
検体（定量対象物質）と試薬の混合時点（ｔｏ）から時
間の経過に伴い発光量（Ｏｐｌ＋１秒間当シ秒間ウシト
数）は急激に増大し、最大値（ｅｐｌ　）　ｍ１Ｋに達
したのち徐々に減少する。ここで検体の各濃度における
発光量の比較即ち検体の検量線を求める方法には、０発
光パターンの最大値（ｃｐｓ　）　ｍａｘを比較する方
法、■ある時間幅（ｔｌｔｔ）における発光量の積分値
（Ｓ）を比較する方法、の２つがある。これらのいずれ
の方法においても、検体の定量を正確に行うためには検
体と試薬との混合による発光量からベースと々る試薬の
みの発光量を差し引いた値を比較することが望ま１２り
、さらに、との発光現象を利用して検体が存在するかど
うかを検出するには、検体と試薬との反応による発光量
とペースの発光１との差が大きい方が有利である。特に
、検体の濃度が低いとベースの発光量との差が不明瞭に
なるので、できるだけペースとの差が低濃度において明
瞭に計測できるようにする必要があった。

一方、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）ｔｊ：、生体内に
おいて加水分解の際に約８ｋ　ｃａｌ／ｍｏｌの自由エ
ネルギーを放出し、生物はこの作用によりエネルギーの
貯蓄、供給、運搬を行っている。このＡＴＰはすべての
生物中に存在し、生体内のさまざまな生化学反応に関与
している極めて重要な物質である。生物発光物質である
ルシフェリンは、前記ＡＴＰの存在下でルシフェラーゼ
と反応して発光現象を生じることが知られておシ、この
現象を利用してＡＴＰの定量を行うことが可能である。

このルシフェリンとルシフェラーゼの反応は化学発光現
象以上に著しく反応が早いために、混合直後の初期発光
量を精度よく計測することが困難であった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところが、従来の発光量測定方法は、市販されているエ
ツペンドルフピペット、エクセルピペットあるいはハミ
ルトンシリンジ等の手動式ピペットにより、試験管等の
測定セルの中へ検体及び試薬を分注し、光電子増倍管尋
のセンサーにより測光する方法が一般的にとられている
。そのため、個人差ばかシでなくピペット操作す力の加
減によっても発光強度が異なり、測定値のバラツキの原
因になっていた。また、２液以上の試薬を分注する場合
、同時分注が不可能なために、時間的な差異による測定
値のバラツキを解消することができなかった。また、多
極類の検体又は同種類の検体を連続的に測定するために
は、試薬をその都度ピペットにより分注しなければなら
ないために多くの時間と労力を要していた。さらに、ピ
ペット操作による分注では試薬と検体との混合直後に最
大値に到達するような反応速度の非常に速い反応におい
ては、最大発光量（ｅｐｌ　）　ｍｌＫを精度よく測定
することが不可能であった。そしてこのことは、従来の
測定に用いられていた器具は上述のピペット類だけで精
度のよい分注装置が未だ開発されておらず、皆無であっ
たことによるものと考えられる。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、上記従来の分注方法における問題を解決する
ためになされ友ものであって、発光分析可能な物質すな
わち化学発光物質あるいは生物発光物質の検体を収容し
た測定セルに、酸化剤及び触媒等の試薬を注入するに際
し、第１〜３図にその構成の一例を示す分注器とその可
動装置並びにその制御装置とにより、ピペット等の従来
装置を用いることなく、予め分注器内に収容しておいた
試薬を可動装置により分注器を操作させ、骸分注器に設
けた分注針によって測定セルへ注入することを同時注入
する分注方法である。

また、上記方法において、分注器を２個以上設けること
により数種の試薬を測定セルへ同時分注することをも同
時注入する分注方法である。

第１〜２図は本発明の分注方法に用いられる分注器の構
成例を示し、第３図は骸分注器を用いた分注装置を示す
。

第１〜２図の符号（１）は分注器（２）の可動装置であ
って、分注器との関連は第３図に示しである。前記分注
器（２）はシリンダーとピストンからなっていて、その
中に予め試薬が収容される。（３）は該分注器（２）の
先端部に接続して設けられた分注針であり、（４）は該
分注針（３）と測定セル（５）との接続のための接続チ
ューブである。（６）はセルホルダーであり、（７）は
試料保存容器である。分注器（２）の内径は０．６５−
程度の金属製の分注針を接続できるものが好適である。

前記可動装置（１）は、空気圧を利用したエアシリンダ
ーあるいは電気的にモーターを駆動させる方法が適用さ
れ、速度１．２〜３．０　ｍ／ｍｌｎ程度の作動が可能
なものであれば、これ以外のものでもよい。

又、分注器（２）及びセルホルダー（６）はヒーター（
例えばシート状ヒーターで５０〜１００Ｗ）を利用して
温度を一定にできる構造にする必要がある。試料保存容
器（７）は恒温槽内に浸漬し、同じく一定温度にする（
分注器内の液温を一定温度に保持できる時間がある場合
は不要）。

なお、分注器（２）と分注針（３）、接続チューブ（４
）は第２図の（ａ）に示す如く分注器（２）を水平方向
に可動させてもよ＜　、（ｂ）（ｃ）に示す如く接続チ
ューブ（４）を接続することなく、分注針（３）を直接
測定セル（５）へ挿入するような構造にしてもよい。

次に、第３図に示した分注装置について説明する。先ず
、可動装置（１）の操作によって分注器（２）内へ送液
チューブを介して試薬を吸い込み、必要に応じてこの試
薬を測定セル（５）へ分注できるようになっている。こ
の測定セル（５）への試薬の分注は、可動装置（１）に
よυ分注器（２）のピストンを押すこ′とによって行わ
れるが、分注器（２）の数は分注する試薬の麺類数によ
って１個に限らす桧数個であってもよいことは１うまで
もない。又、第３図に示す電磁弁Ａは、測定開始時、同
終了時あるいは試薬交換時に、送液チューブ内の洗浄の
ため試薬と洗浄水の送液回路を切換えるスイッチとして
取付けである。電磁弁Ｂは、測定開始時に送液チューブ
内に充填されている洗浄水を廃液容器内へ送液するため
の切換スイッチとして取付けられている。

また、電磁弁Ｂは、測定終了時及び試薬交換時に試薬及
び洗浄水を廃液容器へ送液するための切換スイッチとし
ての役目をもはたすものである。

前記可動装置祉、予め設定した時間駆動するようにマイ
コンで制御され、電磁弁Ａ、Ｂもまた予め設定されたモ
ードスイッチにより測定開始工程、測定終了工程、試薬
交換工程が選択され、それぞれの工程において電磁弁が
自動的に切換えられるように、マイコンで制御されてい
る。

〔作用〕

本発明の分注方法によれば、例えばルミノール及びＨ２
０ｍの濃度は、１０　　ｍｏｌ／ｌに限定されず１０　
　ｍｏｌ／ｌからｉＱ　　ｍａｔ／ｌのいずれの濃度に
おいて４ｂ　１０　　ｆ／ｍｏ１程度の微量のペルオキ
シダーゼの検出が可能であり、さらに、反応温度につい
ては３５〜４０℃の温度範囲で反応させることが最適で
あり、ルミノール及びペルオキシダーゼの水素イオン濃
度（ＰＭ（）範囲はそれぞれ１０〜１２及び８．１〜８
．６の範囲が最適である。また、化学発光法では測定値
のバラツキが大きいことが欠点とされているが、本発明
法では分注器（２）を一定の力で押すこと、また分注針
（３）あるいは分注針に接続するテフロン等からなる接
続チューブ（４）と測定セル（５）との距離を一定に保
つこと、さらに分注針（３）あるいは分注針（３）に接
続した接続チューブ（４）を測定セル（５）の壁に接触
させることなく測定セル（５）内へ溶液を分注すること
により、測定値のバラツキは７％以下に抑えることが可
能となった。

さらに、本発明方法は■３０！とペルオキシダーゼの濃
度を一定にしてルミノールの定量及び検出も可能である
。またさらに、ルミノールとペルオキシダーゼの濃度を
一定にして、Ｈ＊０ｍの定量及び検出にも適用できる。

〔発明の実施例〕

以下本発明の分注方法の実施例を挙げる。

（１）実施例１： 第４図は、以上説明した本発明の分注方法と、比較例（
従来のエクセルピペット）分注方法の発光分析結果で、
１０　　ｍｏｌ／ｌルミノールと１０−２ｍｏｌ／１Ｈ
２０Ｈによる発光パターン及び発光量を示している。こ
の第４図から明らかなように、従来の分注方法で行った
場合と本発明の分注方法で行った場合とでは発光ｆが約
１００倍の差がある。

（夏）実施例２： 第５図、第６図は共にルミノールとＨ２Ｏ２を用いてペ
ルオキシダーゼの定量を行った結果を示し、第５図は従
来の分注方法、第６図は本発明の分注方法を夫々示す。

この第５図から明らか彦ように従来の分注は１０　　Ｖ
／ｍｌ　（１０ｆ／ｍｌ　）以下のペルオキシダーゼの
検出ができないことを示している。また、従来の分注方
法では、個人差ばかシでなくピペットを押す力によって
も発光量が異々るためバラツキの原因にもなっていた。

さらに、このようなピペット操作による分注では、試薬
と検体との混合と同時に最大値に到達するような反応速
度の非常に速い反応においては、最大発光量（８ｐａ　
）　ｍ＆Ｘを検出することが不可能であった。この攪拌
方法については、従来ポルテックスミキサーのような機
械的な振動を利用１〜た方法や超音波を利用した方法が
知られているが、これらの従来方法ではペースとの差が
明らかでなかった。この点で本発明の分注方法はμ下説
明するように分注器による攪拌により検出感度向上が図
られている。

第６図は、１０　　ｍｏｌ／ｌ／ｌ／ミノールと１０　
　ｍｏＶｔＨ，Ｏ，及び１０−’　〜１０−１６ｆ／ｍ
ａｔまで順次希釈調整したペルオキシダーゼを夫々０．
５　ｍｔ分注器に測シ取り、これを同時に測定セル中に
分注した結果を示している。分注開始と同時に発生した
光子は１秒間単位で光電子増倍管により光電変換され、
この時の電気出力計数値（ａｐｅ　）をレコーダマによ
り記録する（第３図参照）。

第６図には記録された１秒間ｓｂの発光量の最大値（ｃ
ｐｓ　）　ｍａｘが、ペルオキシダーゼの各濃度（ｔ／
ｍＡ　）に対してプロットされている。図中の破線は１
０−４ｍｏｌ／Ａルミノールと１０−’　ｍｏ　ｔ／ｌ
Ｈ，ｏ。

による発光量を示し、ている。第６図から定量範囲は１
０　　　ｆ／ｍｔまで極めて良好な直線性を示している
。従来方法では１０　　ｆ／ｍｔのペルオキシダーゼの
定量は極めて困難であシ、特にそれ以下の濃度の検出は
不可能であった。しかし、第６図から明らかなように本
発明の分注方法によれば、１０−”ｆ／ｍｌの微量ペル
オキシダーゼの検出が可能である。

（１実施例６： 第７図は、ルミノールとフェリシアン化カリウムを用い
て過酸化水素の定量を行った本発明の分注方法による結
果を示す。４　Ｘ　１０　　ｍｏｌ／ｌルミノールトロ
ｘ　１０　　ｍｏｌ／ｌフェリシアン化カリウムを各々
２５０　ｍｔずつ予めチューブ内に充填し、１０−３〜
１０−’　ｍｏｌ／ｌまで順次希釈調整した過酸化水素
を夫々１００ｍｔ測定セル内に測シ取り、この過酸化水
素に予め分注器内に充填した前記のルミノールとフェリ
シアン化カリウムを自動分注装置により測定セル内に分
注した。分注開始と同時に、発生した光子は１秒間単位
で光電子増倍管により光電交換され、この時の電気出力
計数値を記録計により記録した。第７図はこの記録され
た１秒間当シの発光量の最大値（ａｐｅ　）　ｍａｘが
過酸化水素の各濃度に対してプロットされている。第７
図から明らかなように１０　　ｍｏｌ／２まで極めて良
好な直線性を示している。

第８図は、本発明の分注方法の測定値のバラツキについ
て調べた結果を示す。蒸留水を１００ｍｔ測定セル内へ
セル数り、予め分注器内に充填した４　’ｌ　１０−”
　ｍｏｌ／ｌルミノールと６　Ｘ　１０−’　ｍｏｌ／
ｌフェリシア／化カリウムを各々２５０　ｍｌずつ自動
分注装置により測定セル内へ分注した結果である。従来
の分注方法では、バラツキが大きいことが化学発光分析
法の欠点とされていたが、本発明の分注方法によれば３
０回の連続測定値（最大発光量、Ｏ印）に対して変動係
数（ＣＶ値）は５．１　％であり、分注直後（０秒）か
ら１分間の積分値（・印）に対してＣＶ値は４．ＯＳと
良好な結果が得られた。

〔発明の効果〕

本発明の分注方法は、試薬と検体を夫々別の分性器に入
れこの分注器を同時に作動させることにより分注時の時
間遅れを解消することもできるので、従来の分注方法で
は困離とされていた１０１１０ｌ８／を程度の検出が可
能であり、超微量物質の検出を可能にした。

例えば、免疫分析の検出系に本発明方法を利用すれば、
患者血清中のＨＣＧ　（Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｏｒｉｏｎｉ
ｃＧｏｒａｄｏｔｒｏｐｉｎ　＋人絨毛性性線刺激ホル
モン）のようなホルモンの定量特に１０　　　ｍｏｌ／
を程度の超微量ホルモンの検出を可能である。絨毛性性
腺刺激ホルモン（ＣＧ）は、繁殖等のヒト（人）及び哺
乳類の生殖腺の治療上有効であることが明らかにされて
いる。一方生殖器その他の臓器の腫瘍から生物学的及び
免疫学的にＨＣＧと同じ作用をする物質が生産されるこ
とが知られておシ、腫瘍形成の初期段階では患者の血液
中あるいは尿中にこのような腫瘍から分泌されるホルモ
ン量は非常に低い濃度であると推定される。従って、こ
のような極微量物質の幅広い分野へ利用することが可能
である。

又、第８図から明らかなように本発明の分注方法によれ
ば従来バラツキが大きいとされていた化学発光分析法を
極めて小さいバラツキで行うことができるようになった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の分注方法の一例を示す概略説明図、第
２図（ａ）（ｂ）　（ｃ）は夫々本発明に用いる分注器
の態様を示す概略説明図、第３図は本発明の分注方法の
自動制御装置の一例を示す配置図、第４図は本発明の一
実施例における発光量（ｃｐｓ　）と時間の関係を示す
グラフ、第５図、第６図は共に発光分析におけるペルオ
キシダーゼ量と発光量（ｃｐｓ　）の関係を示すグラフ
で、第５図は従来方法、第６図は本発明方法の一実施例
である。第７図は本発明方法による過酸化水素定量と発
光量（ｃｐｓ　）の関係を示すグラフ、第８図は本発明
１、方法の測定値のバラツキを示すグラフ、第９図は従
来方法による発光分析における時間と発光量（ｃｐＩＩ
）の関係を示すグラフである。 図中における符号（１）は分注器可動装置、（２）は分
注器、（３）は分注針、（４）は接続チューブ、（５）
は測定セル、（６）はセルホルダー、（７）は試料保存
容器。 なお、図中同一符号箇所は同−又は相当箇所を示す。 代理人　弁理士　　木　村　三　朗 （７７ｖ４４千し）γ（ン’−ｒミ１ＣＸＯｕＪ　　（
ｓｄり）Ｘ＜ｚ′−１＋−１１００寸　　　　ｎ　　　
　〜　　　− １、事件の表示 特願昭５９−２２０３−９８ ２、発明の名称 分注方法 名　称　（６１０）法式会社　明゛１舎（氏　名） ４、代理人 ６、補正の対象 （１）明細書（以下同じ）第６貞１行目に「ペルオ＝シ
ａ−ゼ」トするヲ「ベルオキシターゼ」ト補正する。 （２）第６頁６行目に［Ｉｍｍｎｎｏ−Ｊとあるをｒ　
Ｉｍｍｕｎｏ　Ｊと補正する。 （３）第６頁′５行目に「標準化」とあるを「標識化」
と補正する。 （４）　　第９貞１９行目に［ｇ／ｍｏｔ１とあるｋ［
ｇ／ｍｔ１と補正する。 （５）　　第１１頁１５行目にｌ’−Ｖ／ｍｔＪとを）
る金［ＩＪ／ｍｔＪと補正する。 （６）　　第１２頁１１行目にｒｇ／ｍｏＬＪとある？
「ｇ／ｍｔＪと補正する。 （７）　　第１３頁１４行目ｔｉｃ　［ｍＬＪとある全
ｒｌｔｔＪと補正する。 （８）　　第１５貞１６行目に「ｍｔ」とある全［μｔ
Ｊと補正する。 （９）　　第１４貞８行目に「ｍｔ」　　とある全「μ
ｔ」　と補正する。 叫　第１４Ａ１１行目に［ｒｒ＋４Ｊ　とあるを「μｔ
」と補正する。 ０］）第１５日８行目に「森」とある全「腺」と補正す
る。 αつ　図面第３〜８図１添付の補正第３〜８図に補正す
る。 ８、添付畜類の目録 （１）補正第６〜８図　　各１部 （身震１号）番禾督

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）化学発光物質あるいは生物発光物質の検体を収容
   した測定セルに酸化剤及び触媒等の試薬を注入すること
   による発光現象を利用する発光分析において、試薬を分
   注針を有する分注器内に予め収容しておき、該分注器に
   付設した可動装置により分注器を可動させることによつ
   て測定セル内へ試薬を注入することを特徴とする分注方
   法。
2. （２）２以上の分注器内に夫々予め試薬を収容しておき
   、可動装置により各分注器を可動させることにより同一
   測定セル内へ夫々の試薬を同時注入する特許請求の範囲
   第１項記載の分注方法。