JPH0511256B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、化学発光物質又は生物発光物質と、
酸化剤及び触媒等の試薬との反応による発光現象
を利用する発光分析において、測定セル中の発光
物質に対し試薬を分注する分注方法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

化学発光物質又は生物発光物質は、酸化剤もし
くはこれと触媒（酸素）等との反応により発光現
象を生じ、この発光現象を利用して種々の未知物
質の分析が行われている。この化学発光物質とし
てはルミノール・ルシゲニン、ウラニン等が知ら
れている。特にルミノールは血液中のヘモグロビ
ンが触媒となることを利用して血痕の分析に用い
られていることで周知である。

ルミノールは、フエリシアン化カリウム等の触
媒の存在下で次式の反応が進行し、この発光現象
を利用して量子化されたhνを測定することによ
り、過酸化水素の定量を行うことができる（式中
のνは発光の振動数、ｈはプランクの定数を示
す） また、ペルオキシターゼのような酸素がルミノ
ールと過酸化水素系の触媒として有効に作用する
ため、EIA（Enzyme Immuno Assay）法のよう
に酵素を蛋白質あるいはホルモン等の種々の物質
に標識化することにより、未知物質の定量を可能
にすることができる。

さらに、このルミノール反応を利用してCo²⁺，
Cu²⁺，Ni²⁺，Cr³⁺，Fe²⁺の各種金属イオンの分
析を行うこともできる。

一般に、化学発光現象において時間の経過に対
する発光パターンは、第９図に示す如き傾向を示
す。すなわち、検体（定量対象物質）と試薬の混
合時点（t_p）から時間の経過に伴い発光量（cps，
１秒間当りのカウント数）は急激に増大し、最大
値（cps）maxに達したのち徐々に減少する。こ
こで検体の各濃度における発光量の比較即ち検体
の検量線を求める方法には、発光パターンの最
大値（cps）maxを比較する方法、ある時間幅
（t₂−t₁）における発光量の積分値Ｓを比較する
方法、の２つがある。これらのいずれの方法にお
いても、検体の定量を正確に行うためには検体と
試薬との混合による発光量からベースとなる試薬
のみの発光量を差し引いた値を比較することが望
ましく、さらに、この発光現象を利用して検体が
存在するかどうかを検出するには、検体と試薬と
の反応による発光量とベースの発光量との差が大
きい方が有利である。特に、検体の濃度が低いと
ベースの発光量との差が不明瞭になるので、でき
るだけベースとの差が低濃度において明瞭に計測
できるようにする必要があつた。

一方、アデノシン３リン酸（ATP）は、生体
内において加水分解の際に約8kcal／molの自由
エネルギーを放出し、生物はこの作用によりエネ
ルギーの貯蓄、供給、運搬を行つている。この
ATPはすべての生物中に存在し、生体内のさま
ざまな生化学反応に関与している極めて重要な物
質である。生物発光物質であるルシフエリンは、
前記ATPの存在下でルシフエラーゼと反応して
発光現象を生じることが知られており、この現象
を利用してATPの定量を行うことが可能である。
このルシフエリンとルシフエラーゼの反応は化学
発光現象以上に著しく反応が早いために、混合直
後の初期発光量を精度よく計測することが困難で
あつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところが、従来の発光量測定方法は、市販され
ているエツペンドルフピペツト、エクセルピペツ
トあるいはハミルトンシリンジ等の手動式ピペツ
トにより、試験管等の測定セルの中へ検体及び試
薬を分注し、光電子増倍管等のセンサーにより測
光する方法が一般的にとられている。そのため、
個人差ばかりでなくピペツトを押す力の加減によ
つても発光強度が異なり、測定値のバラツキの原
因になつていた。また、２液以上の試薬を分注す
る場合、同時分注が不可能なために、時間的な差
異による測定値のバラツキを解消することができ
なかつた。また、多種等の検体又は同種類の検体
を連続的に測定するためには、試薬をその都度ピ
ペツトにより分注しなければならないために多く
の時間と労力を要していた。さらに、ピペツト操
作による分注では試薬と検体との混合直後に最大
値に到達するような反応速度の非常に速い反応に
おいては、最大発光量（cps）maxを精度よく測
定することが不可能であつた。そしてこのこと
は、従来の測定に用いられていた器具は上述のピ
ペツト類だけで精度のよい分注装置が未だ開発さ
れておらず、皆無であつたことによるものと考え
られる。

〔問題を解決するための手段〕

本発明は、上記従来の分注方法における問題を
解決するためになされたものであつて、発光分析
可能な物質すなわち化学発光物質あるいは生物発
光物質の検体を収容した測定セルに、酸化剤及び
触媒等の試薬を注入するに際し、第１〜３図にそ
の構成の一例を示す分注器とその可動装置並びに
その制御装置とにより、ピペツト等の従来装置を
用いることなく、予め分注器内に収容しておいた
試薬を可動装置により分注器を操作させ、該分注
器に設けた分注針によつて測定セルへ注入するこ
とを特徴とする分注方法である。

また、上記方法において、分注器を２個以上設
けることにより数種の試験を測定セルへ同時分注
することをも特徴とする分析方法である。

第１〜２図は本発明の分注方法に用いられる分
注器の構成例を示し、第３図は該分注器を用いた
分注装置を示す。

第１〜２図の符号１は分注器２の可動装置であ
つて、分注器との関連は第３図に示してある。前
記分注器２はシリンダーとピストンからなつてい
て、その中に予め試薬が収容される。３は該分注
器２の先端部に接続して設けられた分注針であ
り、４は該分注針３と測定セル５との接続のため
の接続チユーブである。６はセルホルダーであ
り、７は試料保存容器である。分注器２の内径は
0.65mm程度の金属製の分注針を接続できるものが
好適である。

前記可動装置１は、空気圧を利用したエアシリ
ンダーあるいは電気的にモーターを駆動させる方
法が適用され、速度1.2〜3.0m／min程度の作動
が可能なものであれば、これ以外のものでもよ
い。

又、分注器２及びセルホルダー６はヒーター
（例えばシート状ヒーターで50〜100W）を利用し
て温度を一定にできる構造にする必要がある。試
料保存容器７は恒温槽内に浸漬し、同じく一定温
度にする（分注器内の液温を一定温度に保持でき
る時間がある場合は不要）。

なお、分注器２と分注針３、接続チユーブ４は
第２図のａに示す如く分注器２を水平方向に可動
させてもよく、ｂ，ｃに示す如く接続チユーブ４
を接続することなく、分注針３を直接測定セル５
へ挿入するような構造にしてもよい。

次に、第３図に示した分注装置について説明す
る。先ず、可動装置１の操作によつて分注器２内
へ送液チユーブを介して試薬を吸い込み、必要に
応じてこの試薬を測定セル５へ分注できるように
なつている。この測定セル５への試薬の分注は、
可動装置１により分注器２のピストンを押すこと
によつて行われるが、分注器２の数は分注する試
薬の種類数によつて１個に限らず複数個であつて
もよいことは言うまでもない。又、第３図に示す
電磁弁Ａは、測定開始時、同終了時あるいは試薬
交換時に、送液チユーブ内の洗浄のため試薬と洗
浄水の送液回路を切換えるスイツチとして取付け
てある。電磁弁Ｂは、測定開始時に送液チユーブ
内に充填されている洗浄水を廃液容器内へ送液す
るための切換スイツチとして取付けられている。
また、電磁弁Ｂは、測定終了時及び試薬交換時に
試薬及び洗浄水を廃液容器へ送液するための切換
スイツチとしての役目をもはたすものである。

前記可動装置は、予め設定した時間駆動するよ
うにマイコンで制御され、電磁弁Ａ，Ｂもまた予
め設定されたモードスイツチにより測定開始工
程、測定終了工程、試薬交換工程が選択され、そ
れぞれの工程において電磁弁が自動的に切換えら
れるように、マイコンで制御されている。

〔作用〕

本発明の分注方法によれば、例えばルミノール
及びH₂O₂の濃度は、10^-4mol／に限定されず
10^-4mol／から10^-2mol／のいずれの濃度に
おいても10^-16ｇ／ml程度の微量のペルオキジー
ゼの検出が可能であり、さらに、反応温度につい
ては35〜40℃の温度範囲で反応させることが最適
であり、ルミノール及びペルオキシダーゼの水素
イオン温度（pH）範囲はそれぞれ10〜12及び8.1
〜8.6の範囲が最適である。また、化学発光法で
は測定値のバラツキが大きいことが欠点とされて
いるが、本発明法では分注器２を一定の力で押す
こと、また分注針３あるいは分注針に接続するテ
フロン等からなる接続チユーブ４と測定セル５と
の距離を一定に保つこと、さらに分注針３あるい
は分注針３に接続した接続チユーブ４を測定セル
５の壁に接触させることなく測定セル５内へ溶液
を分注することにより、測定値のバラツキは７％
以下に抑えることが可能となつた。

さらに、本発明方法はH₂O₂とペルオキシダー
ゼの濃度を一定にしてルミノールの定量及び検出
も可能である。またさらに、ルミノールとペルオ
キシダーゼの濃度を一定にして、H₂O₂の定量及
び検出にも適用できる。

〔発明の実施例〕

以下本発明の分注方法の実施例を挙げる。

（） 実施例１： 第４図は、以上説明した本発明の分注方法と、
比較例（従来のエクセルピペツト）分注方法の発
光分析結果で、10^-2mol／ルミノールと10^-2
mol／H₂O₂による発光パターン及び発光量を
示している。この第４図から明らかなように、従
来の分注方法で行つた場合と本発明の分注方法で
行つた場合とでは発光量が約100倍の差がある。

（） 実施例２： 第５図、第６図は共にルミノールとH₂O₂を用
いてペルオキシダーゼの定量を行つた結果を示
し、第５図は従来の分注方法、第６図は本発明の
分注方法を夫々示す。

この第５図から明らかなように従来の分注は
10^-6Ｕ／ml（10^-11ｇ／ml）以下のペルオキシダ
ーゼの検出ができないことを示している。また、
従来の分注方法では、個人差ばかりでなくピペツ
トを押す力によつても発光量が異なるためバラツ
キの原因にもなつていた。さらに、このようなピ
ペツト操作による分注では、試薬と検体との混合
と同時に最大値に到達するような反応速度の非常
に速い反応においては、最大発光量（cpa）max
を検出することが不可能であつた。この攪拌方法
については、従来ボルデツクスミキサーのような
機械的な振動を利用した方法や超音波を利用した
方法が知られているが、これらの従来方法ではベ
ースとの差が明らかでなかつた。この点で本発明
の分注方法は以下説明するように分注器による攪
拌により検出感度向上が図られている。

第６図は、10^-4mol／ルミノールと10^-4
mol／H₂O₂及び10^-4〜10^-16ｇ／mlまで順次希
釈調整したペルオキシダーゼを夫々0.5ml分注器
に測り取り、これを同時に測定セル中に分注した
結果を示している。分注開始と同時に発生した光
子は１秒間単位で光電子増倍管により光電変換さ
れ、この時の電気出力計数値（cps）をレコーダ
ーにより記録する（第３図参照）。

第６図には記録された１秒間当りの発光量の最
大値（cps）maxが、ペルオキシダーゼの各濃度
（ｇ／ml）に対してプロツトされている。図中の
破線は10^-4mol／ルミノールと10^-4mol／H₂
O₂による発光量を示している。第６図から定量
範囲は10^-10ｇ／mlまで極めて良好な直線性を示
している。従来方法では10^-8ｇ／mlのペルオキシ
ダーゼの定量きの極めて困難であり、特にそれ以
下の濃度の検出は不可能であつた。しかし、第６
図から明らかなように本発明の分注方法によれ
ば、10^-16ｇ／mlの微量ペルオキシダーゼの検出
が可能である。

（） 実施例３： 第７図は、ルミノールとフエリシアン化カリウ
ムを用いて過酸化水素の定量を行つた本発明の分
注方法による結果を示す。４×10^-5mol／ルミ
ノールと６×10^-3mol／フエリシアン化カリウ
ムを各々250μずつ予めチユーブ内に充填し、
10^-3〜10^-9mol／まで順次希釈調整した過酸化
水素を夫々100μ測定セル内に測り取り、この
過酸化水素に予め分注器内に充填した前記のルミ
ノールとフエルシアン化カリウムを自動分注装置
により測定セル内に分注した。分注開始と同時
に、発生した光子は１秒間単位で光電子増倍管に
より光電交換され、この時の電気出力計数値を記
録計により記録した。第７図はこの記録された１
秒間当りの発光量の最大値（cps）maxが過酸化
水素の各濃度に対してプロツトされている。第７
図から明らかなように10^-7mol／まで極めて良
好な直線性を示している。

第８図は、本発明の分注方法の測定値のバラツ
キについて調べた結果を示す。蒸留水を100μ
測定セル内へ測り取り、予め分注器内に充填した
４×10^-5mol／ルミノールと６×10^-3mol／
フエリシアン化カリウムを各々250μずつ自動
分注装置により測定セル内へ分注した結果であ
る。従来の分注方法では、バラツキが大きいこと
が化学発光分析法の欠点とされていたが、本発明
の分注方法によれば30回の連続測定値（最大発光
量、○印）に対して変動係数（CV値）は3.1％で
あり、分注直後（０秒）から１分間の積分値（●
印）に対してCV値は4.0％と良好な結果が得られ
た。

〔発明の効果〕

本発明の分注方法は、試薬と検体を夫々別の分
注器に入れこの分注器を同時に作動させることに
より分注時の時間遅れを解消することもできるの
で、従来の分注方法では困難とされていた10^-18
mol／程度の検出が可能であり、超微量物質の
検出を可能にした。

例えば、免疫分析の検出系に本発明方法を利用
すれば、患者血清中のHCG（Human Chorionic
Goradotropin、人絨毛性性腺刺激ホルモン）の
ようなホルモンの定量特に10^-18mol／程度の
超微量ホルモンの検出を可能である。絨毛性性腺
刺激ホルモン（CG）は、繁殖等のヒト（人）及
び哺乳類の生殖腺の治療上有効であることが明ら
かにされている。一方生殖器その他の臓器の腫瘍
から生物学的及び免疫学的にHCGと同じ作用を
する物質が生産されることが知られており、腫瘍
形成の初期段階では患者の血液中あるいは尿中に
このような腫瘍から分泌されるホルモン量は非常
に低い濃度であると推定される。従つて、このよ
うな極微量物質の幅広い分野へ利用することが可
能である。

又、第８図から明らかなように本発明の分注方
法によれば従来バラツキが大きいとされていた化
学発光分析法を極めて小さいバラツキで行うこと
ができるようになつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の分注方法の一例を示す概略説
明図、第２図ａ，ｂ，ｃは夫々本発明に用いる分
注器の態様を示す概略説明図、第３図は本発明の
分注方法の自動制御装置の一例を示す配置図、第
４図は本発明の一実施例における発光量（cps）
と時間の関係を示すグラフ、第５図、第６図は共
に発光分析におけるペルオキシダーゼ量と発光量
（cps）の関係を示すグラフで、第５図は従来方
法、第６図は本発明方法の一実施例である。第７
図は本発明方法による過酸化水素定量と発光量
（cps）の関係を示すグラフ、第８図は本発明方法
の測定値のバラツキを示すグラフ、第９図は従来
方法による発光分析における時間と発光量（cps）
の関係を示すグラフである。 図中における符号１は分注器可動装置、２は分
注器、３は分注針、４は接続チユーブ、５は測定
セル、６はセルホルダー、７は試料保存容器。な
お、図中同一符号箇所は同一又は相当箇所を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 化学発光物質あるいは生物発光物質の検体を
   収容した測定セル内に酸化剤及び触媒の２以上の
   試薬を同時に注入することにより発光現象を利用
   する発光分析方法において、 試薬を各々分注針を有する分注器内に予め収容
   しておき、該分注器に付設した可動装置により分
   注器を可動させることによつて、同一測定セル内
   へ各々の試薬を同時注入することを特徴とする分
   注方法。