JPS6185194A - ジニトリルを酵素的に変換する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、以下に指称する酵素モノニトリラーゼを用い
て、ジニトリル中の１個のシアノ基のみ又はその内の主
に１個のシアノ基ｆｔ選択的に対応するシアノカルボン
酸、シアノカルボン酸アミド、シアノカルビン酸エステ
ル又はシアノカルボン酸チオエステルに変換する方法に
関する。

〔発明の背景〕

ニトリル変換酵素の存在は十分く確立されている。それ
らの内、触媒作用によジニトリルを対応するカルメン酸
に変換するニトリル変換酵素は業界における研究者によ
！１％に十分く研究されている。このような酵素を用い
て行った研究によれば、ニトリル変換酵素によるニトリ
ルの変換は種々の機構により分子レベルで進行する。下
記の図式！は、ニトリルのカルビン酸への変換を説明す
るのに有効とされた仮説に基づく図式である。

図式Ｉ （１）　　　　　　　　（Ｉａ）　　　　　　　Ｃｍ）
上記図式中、Ｒは基、すなわちニトリルの１Ａシを示し
、更に「酵素」は、ニトリル変換酵素を示す。

図式Ｉに示すように１以下の内容が考えられる。

すなわち、酵素によりて攻撃される式Ｉのニトリルｕ、
式１＆の一時的スビーシーズ（すｅｅｌ・畠）Ｋ移行し
、これは、水の存在下で、式■のカルＩン酸又は対応す
る式■の力にメン酸アミドに分解する書式■のアミドは
引き続き式１ｍの一時的スビーシーズに変換され、最後
に式■の対応するカル２ン酸に変換される。式■の化合
物から式■の化合物に、式■の化合物から式頂の化合物
に更に式■の化合物から成層の化合物に触媒作用で変換
するニトリル変換酵素は、それぞれニトリルしドラター
ゼ、アミダーゼおよびニトリラーゼとして示される。か
くして、本明細書中で用いられる語句「ニトリル変換酵
素」は、所望にエリアミダーゼを含むニトリラーゼおよ
びニトリルヒドラターゼを含んでなる。

変換の触媒作用を示す酵素に対するニトリルの範囲は、
実際に非常に広い。ヤ２−ギアス（Ｊａｌｌａｇｅａｓ
　）等（アドバパイオケミエンジ二ア（Ａｄｖ、　ＢＩ
ｏｃｈ＊ｍ＊　Ｅｎｇｌｎ＊＊ｒ＊　）　１４　（１９
８０）、１頁以降）による、ニトリルの主変換Ｋｆ、ｌ
する最近のレビ為−において指摘されるように、いかな
るニトリルも酵素変換全党けるようでちる。また１この
レジ島−にはパシラス（Ｂａｅｌｌｌｕｓ　）、バクテ
リディウム（Ｂａｅｔ＠ｒｌｄｌｕｍ　）、ミクロコツ
カス（Ｍｌａｒｏｃｏｃｃｏｓ　）およびブレビパフチ
リウム（Ｂｒ５ｖｌｂａｅｔ＠ｒｌｕｍ　）の種を掲げ
て非常に広範囲の特異性を有するニトリル変換酵素の微
生物源が記載されている。著者は、これらの微生物ニト
リラーゼは非特異的であると信じている。また、微生物
ニトリラーゼがジニトリル中の双方のニトリル基を攻隼
するであろうと考えられている。

同様の記載は、ヤラギ纂アス研究グループによる米国特
許第３．９４０，３１６号明細書にも見られる。すなわ
ち、そのグロセスによればニトリルが、ニトリラーゼ作
用を示す細菌を用いて酸に加水分解される。加水分解は
完全に行なわれてｂる、すなわちジニトリルは完全に水
解されると述べられている。

更に同研究グループによる類似の記載は、米国特許第４
．００１，０８１号明細書にも見られ、これによれば、
二種の特定のジニトリルがニトリラーゼ作用を有する細
菌を用いて対応するジアミドに変換される、すなわち、
両方のシアノ基が変換される。該明細書中の例６および
１ｉを参照。

驚くべきことに、以下の内容が見出された。すなわち、
巾広い基質特異性を示す酵素のうち、モノニトリラーゼ
と指称される成る種のニトリル変換酵素が、ジニトリル
中の１個のシアノ基のみ又は主に１個のニトリルを選択
的に変換するために使用できることである。換言すれば
、全ての実際的目的に対し成る覆のニトリル変換酵素は
モノニトリラーゼでおることが見出され更にこの知見に
より本発明の実施は可能となる・ 〔本発明の詳細な説明〕 本発明は、モノニトリラーゼを用いてジニトリルを、対
応するシアンカルがン酸、シアノカルボン酸アミド、シ
アノカルゲン酸エステルまたはシアノカルボン酸チオエ
ステル１こ酵素的に変換し、しかる後所望により目的生
成物を回収する方法を含んでなる。

〔本発明の詳細な開示〕

モノニトリラーゼの多くの微生物源が、本発明方法によ
）用いられるモノニトリラーゼを提供する為使用出来る
。好ましくは、モノニトリラーゼは細菌、真菌又は他の
獣生物により産生される微生物源でちる。例えば、次の
微生物種がモノニトリラーゼの生成に用いられるニ ゲノイドモナス（Ｐｓ＠ｕｄｏｍｏｎａｓ）　　ｒグル
コノバクタ−（Ｇｌｕｅｏｎｏｂｍｅｔ＊ｒ　）　ｒア
グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｅｔ＠ｒｌｕｍ　）　
ｐアセトバクター（＾ａｅｔｏｂａａｔ＠ｒ　）　ｔア
クロモバクタ−（Ａｅｈｒｏｍｏｂａｅｔｅｒ　）　＃
アシネトバクター（Ａｅｌｎ＠ｔｏｂａｃｔａｒ　）　
ｐアルカリゲネス（Ａｌｃａｌ１ｇ＠ｎｓｓ　）　＋シ
トロバクター（Ｃ１ｔｒｏｂａｅｔａｒ）。

エンテロバクタ−（Ｅｎｔｓｒｏｂａａｔｅｒ　）　ｐ
エルウインア（Ｅｒｖｌｎｌａ　）　、エシェリキア（
Ｅ＠ｃｈ＊ｒｉｃｈｉａ　）　＊クレプシｘ　、ｙ　（
Ｋｌｅｂｓｌｓｌｌａ　）　ｚプ０ｆｆｐス（Ｐｒｏｔ
＠ｕｓ　）　、セレイシア（５ｓｒｒａｔｉａ　）　ｅ
ヤルシニア（Ｙ＊ｒａ１ｎｊａ　）　、クロモバクテリ
ウム（Ｃｈｒｏｒｎｏｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　）　＊アエ
ロモナス（Ａ＠ｒｏｍｏｎａｍ）。

ビブリオ（Ｎ’１ｂｒｌｏ　）　ｐフラＩバクテリウム
（Ｆ１ａｖｏｂａｃｔ＊ｒｌｕ＋ｎ　）　ｐミクロコツ
カス（Ｍｉａｒｏｃｏｃｅｕｓ　）　＊スタフィロコッ
カス（５ｔａｐｈｙｌｏａｏｅａｕｓ　）　ｔストレプ
トコッカス（８ｔｒ＠ｐｔｏｃｏｅｃｕｓ　）　＃バチ
ラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）＃クロストリジウム（Ｃ１
ｏｓｔｒｉ旧ａｍ）、ラクトパテラス（Ｌａａｔｏｂａ
ａｉｌｌｕｓ　）　ｒす＆　　：Ｉ７ストツク（Ｌ＠ｕ
ｅｏｎｏｍｔｏｃ　）　ｐブレビバクテリウム（Ｂｒ５
ｖｌｂａａｔ＠ｒｉｕｍ　）　Ｆセルロモナス（Ｃ＠１
１ｕｌｏｍｏｎａａ　）　ｒコリネバクテリウム（Ｃｏ
ｒｙｎ＠ｂａａｔｅｒｌｕｍ　）　、ミクロバクテリウ
ム（Ｍｉｃｒｏｂａａｔａｒｌｕｍ　）　ｗプロピオニ
バクテリウム（Ｐｒｏｐｌｏｎ１ｂａｅｔ＠ｒｌｕｍ　
）　、　ｗイコパクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔ＠ｒｌ
ｕｍ　）　＊ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｅｅｍ　）　ｙパクテリジウム（Ｂａｃｔ＠ｒｌｄｉｕ
ｍ）。

カエトメラ（Ｃｈａ＠ｔａｍ＊ｌｌａ　）　ｖセグトリ
ア（８＠ｐｔｏｒｉｍ　）　、ディプロプイア（Ｄｉｐ
ｌｏｄｉｍ　）。

アルトロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔ＊ｒ　）　、
ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｌａ　）　ｔステニフイリク
ム（Ｓｔ＠ｎｐｈｙｌ　１ｍ）＊トリログシス（Ｔｏｒ
ｙｌｏｐｍｌｍ　）　＊フ＜　−−ｒ（ｐｈｏｃｎａ）
。

コノチリウム（Ｃｏｎｏｔｈｙｒｌｕｍ　）　、　マイ
ロセリウム（Ｍｙｒｏｔｈ＠ｃｌｕｍ　）　ｐペスタロ
チア（ＰＩａｔａｌｏｔｌ＆）。

メランコニウム（Ｍ・ｒａｎｃｏｎｌｕｍ　）　、エビ
コツカム（Ｅｐｉｃｏｅｃｕｍ　）　、ペニシリウム（
Ｐ＠ｎｌｃｌｌｌｌｕｍ）ｙアスベルギリエウム（Ａｍ
ｐａｒｇｌｌｌｕｍ　）　ｐセベドニウム（Ｓ＊ｐｅｄ
ｏｎｌｕｍ　）　ｖ　７シジウム伊ｕｇｌｄｌｕｍ）＋
オイジオデンドｏ　ン（０１ｄｌｏｄ＠ｎｄｒｏｎ　）
　、　セフ　７０スポリウム（Ｃａｐｈａｌｏａｐｏｒ
ｌｕｍ　）　、　ス：＋２リオグシス（５ｃｏｐｕｌａ
ｒｌｏｐｓｌｓ　）　ｌ　／’エシロマイセス（Ｐａ＠
ｃｉｌｏｍｙｃｓｓ　）　＃ペルティシリクム（Ｖ＠ｒ
ｔｉｃｉｌｌｌｕｍ　）　ｅ　トリコセシウム（Ｔｒ１
ｃｏｔｈ＊ｃｉｍ）。

グル２リア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉｍ　）　、　モノトス
Ｉう（Ｍｏｎｏｔｏｓｐｏｒａ　）　、クラドスポリウ
ム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　）　ｅ　ヘルミントス
ポリウム（Ｈ＠１ｍ１ｎｔｈｏｓｐｏｒ１ｔ＋ｍ　）　
ｅクラドスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐａｒｌｕｍ　）
　、　ＣＩドトルラ＠ｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）。

り四エクレク（Ｋｌｏ＠ｅｋ＠ｒａ　）　、ジオトリチ
ウム（Ｇ＠ｏｔｒｌａｈｕｍ　）及びフサリウム（Ｆｕ
ｓｍｒｌｕｍ）の種、アグロパクテリウムラディオパク
ター（Ａｇｒｏｂａｅｔ＊ｒｉｕｍ　ｒａｄｌｏｂａｃ
ｔｅｒ　）　、グソイドモナスアエロギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄａｎｏｎｉｓ　ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ　）　、グツイ
ドモナスフルオレセンス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌ
ｕｏｒｓｓｃｅｎｓ　）　ｐグンイドモナスグチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　）　、コリネバ
クテリウムニトリロフィラス（Ｃｏｒｙｎｅｂａａｔｅ
ｒｌｕｍｎｌｔｒｌｌｏｐｈｌｌｕｓ　）　ｙ　：ｆｆ
リネパクテリウムグソイドノ７テリカム（Ｃｏｒｙｎｅ
ｂａｃｔｅｒｌｕｍｐｓｅｕｄｏｄｌｐｈｔｅｒｌｔｌ
ｅｕｍ　）　ｅノカルジ７０トコ２ス（Ｎｏｃａｒｄｌ
ａ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）　、エスシェリシイア
コリー（Ｅａｃｈｅｒｉｅｈｌａ　ｃａｌｌ　）　、　
二＆−ａスＩラクＩｆｆｙす（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　
ｃｒａｎｉａ　）　＋２テラスシルペストリス（Ｌａｔ
ｈｙｒｕｓ　ｓｙｌｖａｓｔｒｌｍ　）　。

ラテ２スオドラタス（Ｌａｔｈｙｒｕａ　ｏｄｏｒａＬ
ｕｓ　）　＊ピシアビロサ（Ｖｌｃｌａ　Ｖｉｌｌｏａ
ａ　）の菌株Ａ４（う〆ラトリイオツマイクロバイオロ
ジイ（以下ムリと称する）Ｋ寄託、オランダ国、第ＬＭ
Ｄ　７９　、２のもと、更に１９８５年４月１２日にナ
シ■ナルコレクシ冒ンオプインダストリイバクテリア（
以下ＮＣＩＢと称する）に第１２０７０号として寄託さ
れた）、菌株Ｎ−７７１，Ｎ−７４４及びＮ−７７５（
それぞれファーメンテイタ１ンリサーチインステイテ１
−ト（以下ＦＢＩと称する）、日本に第４４４５号、第
４４４６号及び第４４４７号として寄託された）及び菌
株１３３２（セントラ−ルビ島−ローフす−ルジーメル
カルチエレス（以下ＣＢＳと略す）、オランダ国に寄託
）、Ｒ３４０（ＣＢＳＡ４９５．７４）、Ｒ３４１（’
ＣＢ８４４９６．７４）、Ａ１１１（ＣＢＳ扁４９７．
７４）。

Ｂ　２２２　（ＣＢ８扁４９８．７４）、Ａ１１２゜Ａ
１３．Ａｌ４１．Ａｌ４２．Ｂ２１１．Ｂ２１２゜Ｂ２
２１　＊Ｃ２１１（ＣＢ８Ａ４９９．７４）＃Ｒ２１，
Ｒ２２，Ｒ３１１，Ｒ３１２（ＣＢＳＪｉ７１７．７３
）及び米国特許４，００１，０８１明細書に記載された
Ｒ３３１．１９８５年４Ａ１２日に、ＣＢ８４９６．７
４．４９４．７４．４９５．７４　。

７１７．７３，４９８．７４及び４９７．７４のもとで
寄託された菌株はそれぞれ、ＮＣＩＢ１２０６７から１
２０７３のもとて再寄託された。

本発明グロセスに使用する特定のニトリル変換酵素の適
合性線、高圧液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣと
略す）、ガス液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴（以
下ＮＭＲと略す）スペクトロスコピイー又は他の分析技
術、例えば反応中に放出されたアンモニアの検出によ）
、変換されるジニトリルの触媒作用によるひ素変換を監
視することにより試験出来る。特定のジニトリル中のシ
アノ基の一個のみを攻撃するニトリル変換酵素はモノニ
トリラーゼである。又、一定期間内に、特定のジニトリ
ル中のシアノ基の一個のみを攻撃するニトリル変換酵素
は、本発明の実施に適当である。

更に、特定のジニトリル中のシアノ基の一個を優先的に
加水分解し更に、一定期間内に、小程度に、例えば２５
チ以下、好ましくは５％以下に第一のシアノ基が変換さ
れる時間までに第二のシアノ基をも攻撃するニトリル変
換酵素も又、本発明の実施に使用出来る（この様な場合
において、目的化合物（式Ｖ）の１４製はよシ困難にな
るけれども）。

この様なニトリル変換酵素は、実際問題としてモノニト
リラーゼであシ、更に本発明中核酵素が本発明方法に必
要なモノニトリラーゼ特異性を有するとｂ５理由でモノ
ニトリラーゼとみなす。上記説明に従い、モノニトリラ
ーゼは所望によりアノダーゼに含むモノニトリルヒドラ
ターゼをも包含する。

本発明方法で用いられるモノニトリラーゼ製剤は、ジニ
トリル中に存在するシアノ基の一個のみ又は主に一個を
カルざン酸基、カルボン酸アミド基、カルメン酸エステ
ル基、又はカルボン酸チオエステル基に変換し得るいか
なる製剤をも含む。

モノニトリラーゼ製剤は高純鹿にｍｌ！！したモノニト
リラーゼ、微生物から単離した粗製酵素、該微生物の破
壊細胞又は無傷細胞である。公知方法により容易に調製
出来る固定化形態でモノニトリラーゼを用いることが有
利である。モノニトリラーゼは又、天然の＃素よシもよ
シ安定性及び活性を示すような化学的に変性された形態
で用いることが出来る。

ニトリル変換酵素は幅広い特異性を示す。又、モノニト
リラーゼは本発明によるジニトリルの所望の変換に広く
適用出来る。

更に詳しくは、次式■： ＮＣ−Ｘ’−Ｘ２−ＣＯＲ’　　（す 【式中、Ｒ１は−ＮＲ２Ｒ３，−０Ｒ２または−ＳＲ２
（ここで、Ｒ２およびｎｓは同一でも異っていてもよく
、それぞれ水素、低級アルキル、アリールまたはアリー
ル（低級アルキル）を表わす）を表わし、さらにＸｌお
よびＸ２は同一でもまたは異っていてもよく、それぞれ
１ｆｌｆｆｉ、２種またはそれ以上の次の基：ヒドロキ
シ、アミノ、カルボキシ、ニトロ、シアノ、アリール、
低級アルコキシ、低級アルキルチオまたは低級アルキレ
ンによりて置換されることのできる直鎖または分枝鎖の
アルキレンまたはアリーレンを表わす、但し更にＸ２は
原子価結合であってよい） で表わされるシアノカルボン酸、シアノカルボン酸アき
ド、シアノカルボン酸エステルおよびシアノカルピン酸
チオエステルは、次式■：ＮＣ−Ｘ’−Ｘ２−ＣＮ　　
　　　　　　ＱＶ）（式中　ｘｊおよびＸ２はそれぞれ
先に定義した意味を有する） で表わされる対応するジニトリル中のシアノ基の１方の
み又は主に一方をモノニトリアーゼにより変換できる。

式■及びＶの化合物中の幾つかの置換基又は置換基の一
部に関連して用いられる語句「低級」は、好ましくは六
個の炭素原子を含有するような基、好ましくは四個の炭
素原子を有する基を示す。従って、低級アルキルは、好
ましくはメチル、エチル及びグロビルである。アリール
は、好ましくはフェニル又はナフチルである。アリール
（低級アルキル）は、好ましくは、ベンジルである。低
級アルキレンは、好ましくは、メチレン、エチレン、グ
ロビレン及び１．４−ブチレンである。低級アルコキシ
は、好ましくはメトキシ及びエトキシである。低級アル
キルチオは、好ましくはメチルチオ又はエチルチオであ
る。アリーレンは、好ましくＨｌｏ−１ｍ−及びｐ−７
エニレンである。好ましくは　Ｘｉ又ＦｉＸ２で示され
るアルキレン残基は２２個以下の炭素原子、好ましくは
１８個以下の炭素原子を含有する。

式■のジニトリルの特異的でかつ好ましい例は、１．５
−ベンチレン又はエチレンでｆ換出来るマロン酸、コハ
ク酸、グルタル酸及びアジピン酸のジニトリルである。

本発明方法は、ジニトリル（式■）の溶液、例えば水溶
液管モノニトリラーゼで処理することにより行うことが
出来る０反応媒質（溶解した？２ニトリル（弐■）の濃
度は、必要に応じ希薄溶液から高濃度に変化し得る。有
機溶剤は反応混合物に添加することが出来るし、或いは
又酵素反応は例えば純粋な出発原料〔式■〕又は出発原
料（弐■）及び有機溶剤の混合物から成る、本質的に水
が存在しない雰囲気下で行うことが出来る。有機溶剤は
、とりわけジオキサン、ジメチルスルホキシド又はＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミドであ夛、これ等は例えば３０
／７０　（容−＃、／答りで水と混合出来る。一時的ス
ピーシーズ（式１ｍ及び（ｌａ　）は、水以外のヌクレ
オフィルズ、例えばアルコール、チオール及びアミンの
攻撃により、対応するカルピン酸中量体、例えばエステ
ル、チオエステル及びアミドを与える。アルコール、チ
オール又はアミンの存在下で本発明方法を行うことＫよ
シーカルボン酸アミド、カルメン酸エステル又はカルダ
ン酸チオエステルを合成出来る。

好都合には、酵素変換は例えば、ＨＰＬＣ，ガス液体ク
ロマトグラフィー、島迅スベクトロスコビイにより、又
はアミダーゼ又はニトリ２−ゼを用いる場合、アンモニ
アの測定により反応混合物のアリクｒ−）を分析して追
跡出来る。反応は例えば酵素を除去することによ）、反
応混合物を加熱することにより又は例えば塩酸を用いて
例えば約１の声値Ｋｉ！性化することにより所望時間で
停止される。かくして決定された反応時間は１時間未満
から数時間に亘り更に反応混合物のμ値を調節し更に反
応混合物を攪拌するのが好ましい。しかる後、目的化合
物（式Ｖ）を所望によりそれ自身公知の方法、例えば濾
過又は遠心分離によ〕モノニトリクーゼを除去した後、
それ自身公知の方法で単離される。

好都合な反応温度は約Ｏ〜５０℃、好ましくは約３０〜
４０℃の範囲内である。好都合ＫＦｉ、反応媒質のμ値
は約４．５〜１０．５、好ましくは約６〜９の範囲内で
ある。

得られる収率は、とシわけ用いる酵素及び基質の濃度、
反応媒質の温度及びμ値並びに反応時間に依存する。

本発明の好ましい利用は、イグシロンーカグロ２クタム
の調製に関連し、これはナイロン６の製造に用いられる
。本発明方法により、アジピン酸ジニトリルはアジピン
酸モノニトリルに変換出来る。後者の化合物は公知の方
法により６−アミノ−ｎ−カブロン酸に水素添加され、
これは引き続き公知の方法により脱水されてイグシｐン
ーカグロ２クタムとなる。択一的に１本発明方法により
、アジピン酸ジニトリルは、対応するシアノカルボン酸
アミド、エステル又はチオエステルに変換され、これは
水素添加され更に引き続き環化されイプシロンーカグロ
２クタムとなる。全く同様に、他のツクタムが対応する
ジニトリ、ルから得ることが出来る。

更に本発明の好ましい利用は、キラーレ（ｅｈｉｒａｌ
・）化合物のＩＩ！衷にある０式■のグロキツーレ（Ｐ
ｒｏａｈ１ｒａｌコ）物質は、本発明方法によ）、式Ｖ
のキ２−レ生成物に変換出来る。例えば、マロン酸ジニ
トリル又は関連した脂肪族ジニトリルのプロキラーレノ
アルキル化誘導体は、本発明方法により対応するキラー
レモノシ７ノ化合物に変換される。

本発明方法を更に次の実施例で説明するが、本発明はこ
れに限定されるものではない。実施例は本発明方法の好
ましい幾つかの態ｍを例示するものである０名称の後の
記号ＴＭはそれが商標であることを示す。

〔実施例〕

例１ コニカル形状振とうフラスコに装入したイブトン（６ｆ
／Ｊ　）、ペグティカーゼ（４Ｐ／Ｉ　）、牛肉エキス
（１，５ｆ／Ｊ）、酵母エキス（３Ｐ／ｌ　）及びグル
ツース（１０Ｆ／Ｊ）を含有する局地５００−に、菌株
Ｂ　２２２　（ＣＢＳ扁４９８．７４、米国特許明細ｉ
ｔ４．ｏ　ｏ　１．ｏ　ｓ　１に言及されている、この
菌はブレビバクテリウム（Ｂｒ・マｌｂａｃｔｅｒｌｕ
ｍ）と指体されているが、それはロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｅｏｅｅｕｍ　）としても分類されている）の２４
時間培養菌１０−を接種した。培養物を３７℃で２４時
間軌道を画く振とうによりインキエペートした。得られ
た菌体を遠心分離によ〕単離し、ｐＨ７，０の０．１Ｍ
ホスフェート緩衝液１００一部で三回洗浄し、最終的に
１０ｍ１の該緩衝液に懸濁させた、酵素的に活性な細胞
集団懸濁液を、−７の０、１　Ｍホスフェート緩衝液に
溶解した８００ｍＭアジぎン酸ジニトリル１５ＮｔＫ溶
解した。得られた反応混合物を２２℃で三時間攪拌し、
ジエチルエーテル三容積で抽出し、１Ｍ燐酸を添加して
酸性にし次いでジエチルエーテル三容状で抽出した。

−緒にしたエーテル相を食塩水で洗浄し、伝記ナトリウ
ムで乾燥し次いで真空中で乾燥し収率９０チでシアノカ
ルボン酸を得た。生成物はシリカゲルグレートを用いた
薄Ｉ５クロマトグラフィー法により均質なものとして判
定され更にシアノカルボン酸の標品のＩＲスイクトルと
同一のスイクトルを示した。

例２ ｐ）＋７の０．１　Ｍホスフェート緩衝液に溶解したゲ
ルタン酸ジニトリル３０　ｍＭ　溶液を、モノニトリラ
ーゼ細胞集団生成物を用いて例１に記載したと実質的に
同様な方法で処理した。反応混合物中のアンモニアの放
出を、監視し次いでモノシアノカルボン酸の変換が完結
したと判断した時、酵素反応を、１Ｍ塩酸を添加して反
応混合物の−１−１に低下せしめることＫよ）停止させ
九。不溶性物質を、遠心分離により反応混合物から除去
し、しかる後反応生成物をノエチルエーテルを用いて連
続的に抽出することによ）混合物から除去した。最後に
反応生成物のエーテル性ｍ液を硫酸ナトリウムで乾燥し
次いで真空中で乾燥し目的のモノシアノモノカルボン酸
を収率７５チで得た。

例３ ０、１Ｍホスフェート緩衝液（ＰＨニア）に溶解したマ
レイン酸ノニトリル３０ｒａＭ溶液を、例２に記載した
と同様にモノニトリラーゼを用いて処理した。酸性化し
次いで塩化す）　ＩＪウムで飽和しに後、反応混合物音
クロロホルムで連続的に抽出することＫよム反応生成物
を単離した。用いたクロロホルムを連続的に蒸発させ目
的のモノシアノモノカルメン改を収率６０チで得た。

例４ ２０チのジオキサンを含有する、−７の０．１　Ｍホス
フェート緩衝液に溶解したセパシン酸ノニトリル１０ｍ
Ｍ溶液を、例１に記載したと同様にモノニトリラーゼを
用いて熟埋した０例２で記載した如く単離した反応生成
物は、この化合物の標品と比較して目的モノシアノモノ
カルボン酸であることが判明した。７０チの収率が得ら
れた。

例５ ２０％のジオキサンを含有するホス７エー）１衝液（０
，ＩＭ、ＰＨ７）に溶解した１、４−ノシアノベンゼン
（１０ｍＭ　）を、例１に記載したと同様にモノニトリ
ラーゼを用いて処理した。触媒作用による酵素変換の過
程を、ＨＰＬＣを用い１５分毎に反応混合物を分析する
ととくより監視したｅ目的のモノシアノモノカルボン酸
への変換が最適であると判断され九時、反応を１Ｍ塩酸
を用いて酸性化することにより停止し、しかる後側１で
記載したと同様に処理し６５チの収率で目的生成物を得
た。

例６ ３．３−ジメチルグルタル酸ジニトリル１に１例ＩＫ記
載した手順と同様にモノニトリラーゼを用いて処理し、
８５俤の収率で３，３−ジメチル−４−シアノ酪酸を得
九。

例７ ３−メチル−３−ヒト筒キシグルタル酸ジニトリルを、
例２で記載したと同様にモノニトリラーゼを用いて処理
し、６５％の収率で目的の３−メチル−３−ヒドロキシ
−４−シアノ酪酸を得た。

以下令白 例８ ３−エテに−３−アミノグルタル酸ジニトリルを、例７
に記載したと同様の方法で変換し、３−ニブル−３−ア
ミノ−４−シアノ酪＃Ｒを収率５５饅で得た。

例９ ａ）　　１００　ＰＰｍのモノフルオロアセタミドを補
った、例１に記載の培地で菌株Ｂ２２２を培養しな。１
４日後、得られた菌株を例ＩＫ七記載たと実質的に同じ
条件で単離し、次いで引き続き−７，５の１０ｍＭの炭
酸水素アンモニウム緩衝液に溶解した０、４Ｍアジ？ニ
トリル溶液１，０００＋ｔに添加した。反応混合物のア
リクオートを５分間毎に集め次いで逆相ス７エルコ（Ｓ
ｕｐｈｅｌｅｏ）”Ｃ−１８カラム及び−７のｉｏ−緩
衝液から成る溶離剤を用いたＨＰＬＣＫよシ分析した。

２５分後、反応混合物は９９．５　％の収率に相当する
竹のアジポニトリルのモノアミド誘導体を含有すること
が見い出された。直ちにモノニトリラーゼを反応混合物
から濾過法により除去し、しかる後得られ７ｔｆｆｉ液
を凍結乾燥し目的の５−シアツインタン酸アミドを収率
９８−で得た。化合物はＨＰＬＣ及び薄層クロマドグ２
フイーにより判断して均質でろ９更にこれ等のテストに
おいて、目的化合物の標品と同一の性状を示した。

ｂ）　先に記載した如く（但し反応時間は２５分の代ル
に３時間である）して得られたブレビバクテリウム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ　）酵素を用いて７ノ？ニ
トリルと反応させ、５−シアツインタン酸アミドを得た
。

例１０ グルタル酸ジニトリルを例９で記載したと同様の方法で
処理し、対応するモノアミドモノシアノ化合物を収率９
５チで得た。

例１１ セパシン酸ジニトリルを、例９で記載したと同様の方法
で対応するモノアミドモノシアノ誘導体に変換した。７
５チの収率が達成された。

例１２ ３−メチル−３−ヒドロキシグルタル酸ジニトリルを例
９で記載したと同様にモノニトリラーゼで処理し、３−
メチル−３−ヒドロキシ−４−シアノグルタル酸を収率
８０チで得た。

例１３ 例９で記載した如く得られたモノニトリラーゼ７Ａ′：
Ａ品を、アルギン酸ナトリウム３チ水溶液に懸濁した。

得られた懸濁液を、０．１Ｍ塩化カルシウム水溶液に滴
下して移した。得られたペレットを一塩化カルシウム溶
液中で３時間攪拌し、引き絖き０．９％の塩化カルシウ
ムを含有する水で数回洗浄した・次いで固定化モノニト
リラーゼをカラムに充てんし次いでアジポニトリル（０
，４Ｍ）及び炭酸水素ア／モ−ラム（５ｍ１ｉｌ、　ｒ
）１７．５　）’に含有する水溶液を、得られた酵素反
応器内を通過させた。

反応器からの溶出液のサンプルを、例９で用いた方法に
よりＨＰＬＣで分析し次いで反応器内の流量を９５チの
目的モノアミドモノシアノ化合物の収率が確保出来るよ
うに調節した。

例１４ ニトリラーゼ調製品を例ＩＫ記載と同様ＫＮＣＩＢ１２
０６７から得た。得られた酵素的に活性な細胞を、室温
で有効に攪拌した１０ｍＭホスフェート緩衝液に溶解し
たアジポジニトリル３０　ｍＭ　溶液中に懸濁せしめた
。加水分解反応の過程を、ＨＰＬＣにより監視し、これ
はモノアミド化合物の収率が９７チ収率であることを示
し念。

例１５ 例１４で記載した如く得られた酵素調製品を、１０ｍＭ
ホスフェート緩衝液に懸濁させ、これに純粋なアジポジ
ニトリルをニトリル及び水相の二相系が得られるまで添
加した。次いで混合物を充分に攪拌し水性酵素含有相中
でジニトリルを乳化せしめた。反応混合物のアリフォー
トを例９に記載した如く分析した。通常の処理を行い、
目的のモノアミドを収率７６チで得た。

例１６ 例１４で記載した如く得られた酵素調製品を用いて、マ
ロン酸ジニトリルを例３で記載したと同様の方法で対応
するモノシアノモノカルｒン駿に変換せしめた。

例１７ 例１４で記載した酵素調製品及び例６で説明した手順を
用い、３．３−ジメチル−４−シアノ酪酸を７０チ収率
で得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ジニトリルを、対応するシアノカルボン酸、シアノ
   カルボン酸アミド、シアノカルボン酸エステルまたはシ
   アノカルボン酸チオエステルに変換する方法であって、
   ジニトリルをモノニトリラーゼで処理し、しかる後所望
   により目的生成物を回収する、前記方法。 ２、シアノカルボン酸、シアノカルボン酸アミド、シア
   ノカルボン酸エステルまたはシアノカルボン酸チオエス
   テルが次式Ｖ： ＮＣ−Ｘ＾１−Ｘ＾２−ＣＯＲ＾１Ｍ（Ｖ）｛式中、Ｒ
   ＾１は−ＮＲ＾２Ｒ＾３、−ＯＲ＾２または−ＳＲ＾２
   （ここで、Ｒ＾２およびＲ＾３は同一でも異っていても
   よく、それぞれ水素、低級アルキル、アリールまたはア
   リール（低級アルキル）を表わす）を表わし、さらにＸ
   ＾１およびＸ＾２は同一でもまたは異っていてもよく、
   それぞれ１種、２種またはそれ以上の次の基：ヒドロキ
   シ、アミノ、カルボキシ、ニトロ、シアノ、アリール、
   低級アルコキシ、低級アルキルチオまたは低級アルキレ
   ンによって置換されることのできる直鎖または分枝鎖の
   アルキレンまたはアリーレンを表わす、但し更にＸ＾２
   は原子価結合であってよい｝ を有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、目的生成物（式Ｖ）のシアノ基がモノニトリアーゼ
   により実質的程度に変換される前に、変換を中断する、
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、２５％以下、好ましくは５％以下の目的生成物（式
   Ｖ）が変換される、特許請求の範囲第１項から第３項ま
   でのいずれか１項に記載の方法。 ５、ジニトリル（ＮＣ−Ｘ＾１−Ｘ＾２−ＣＮ（式IV）
   ）がプロキラーレであり目的生成物（式Ｖ）がキラーレ
   である、特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれ
   か１項に記載の方法。 ６、モノニトリラーゼが微生物源、好ましくは細菌源で
   ある、特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか
   １項に記載の方法。 ７、モノニトリラーゼが固定化酵素である、特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、モノニトリラーゼが、ＮＣＩＢ１２０６７又はＮＣ
   ＩＢ１２０７２をもって寄託された菌株から産生される
   モノニトリラーゼの化学的および免疫学的性質と本質的
   に同一の性質を示す、特許請求の範囲第１項から第７項
   までのいずれか１項に記載の方法。 ９、次式Ｖａ： ＮＣ−（ＣＨ＿２）＿４−ＣＯＲ＾＾１（Ｖａ）（式中
   、Ｒ＾１は特許請求の範囲第２項で定義した意味を有す
   る） の化合物から得られる場合のナイロン６であって、該化
   合物が特許請求の範囲第１項から第８項までのいずれか
   １項に記載の方法によって得られている、前記ナイロン
   ６。 １０、特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれか
   １項に記載のシアノカルボン酸、シアノカルボン酸アミ
   ド、シアノカルボン酸エステルまたはシアノカルボン酸
   チオエステル。