JPS6135793A - 微生物によるソホロ−ズの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物によるソホローズの製造法に関する。

〔従来の技術〕

微生物ＶＣよるセルラーゼ生産の生理促進物質、化粧品
原料として有用なソホローズは、塊の木（５ｏｐｈｏｒ
ａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｌ、　）の実のさや中のカンフ
ェロール配糖体の糖成分として最初に見い出されたが、
自然界では遊離状態の三糖として得られることは稀であ
って、わずかにロイヤルゼリー中に存在することが知ら
れているにすぎない０ また、微生物のソホローズ生産については、Ｋｈａｎ　
等が細菌アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）
属に属する微生物によるオリゴ糖生成研究において少量
のソホローズ生成を認めた以外に知られティなイ［Ａ、
Ｗ、　Ｋｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　１
８３゜６８２　（１９５９）、Ｔ、に、Ｗａｌｋｅｒ　
ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍ、　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、、　８３．１６１（１９’５９）　］。

〔発明が解決しようとする問題点〕

斯かる実状において、ソホローズ生産微生物の早急な探
索が望まれていた。

〔問題点全解決するための手段〕

本発明者は、ソホローズ生産能を有する微生物を広く検
索した結果、酵母トルログシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ
　）　　属に属する微生物中に斯様な能力ヲ有するもの
があることを見い出し、本発明を冗成した。

すなわち本発明は、酵母トルロプシス属に属するソホロ
ーズ生産菌全培養し、培地中にソホローズを生成蓄積せ
しめ、これ全採取すること全特徴とする微生物によるソ
ホローズの新規製造方法を提供するものである。

本発明で使用する微生物は、トルロプシス属に属しソホ
ローズ生産能を有するものであって、例エバトルロプシ
ス・ボンピコ−５（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ　ｓｂｏｍｂｉ
ｃｏｌａ　）　ＫＳＭ−３６、同ＡＴＣＣ−２２２１４
、同Ｐｌａ　１２３−６４、同ＮＲＲＬ・Ｙ−１４４５
Ｎ　等が挙げラレ、就中％にトルロプシス◆ボンビコー
ラＫＳＭ−３６が好ましい。

トルロプシス働ボンビコーラＫＳＭ−３６１１−１，、
本発明者が東京都武蔵野市のキャベツ畑のキャベツ葉よ
り分離し、微工研菌寄第７５８６号として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託したもので、以下の菌学的性
質を有する。

（ａｌ　　各培地における生育状態 麦芽汁培地、麦芽汁寒天培地、ポテト−デキストロース
寒天培地及びコーンミール寒天培地上での生育状態は、
いずれも、楕円乃至長楕円酵母で、（０，７５〜３．０
）Ｘ（１，５〜５．５）μの大きさを有し、多極出芽方
式で、真性菌糸、（ｂｌ　　子嚢胞子の形成 麦芽抽出液寒天培地を用いて子嚢胞子形成のイ１無を検
討した結果、予盛胞子の形成を認めなかてンた。

（Ｃ１射出胞子の形成 麦芽汁寒天培地で培養して射出胞子の有無を検討した結
果、射出胞子の形成全認めなかった０ （ｄ）　　各生理的性質 ■生育条件　ｐト１　　３〜８（最適５〜６）温度　　
７〜３８Ｃ（最適２５〜３４Ｃ）■硝酸塩の同化　　　
　　　　　− （勺脂肋の分解　　　　　　　　　十 ｅ）尿素の分解　　　　　　　　　− ■セラチンの液化　　　　　　　　− ■塩化ナナトリウム耐性　６〜８　％　（ｗ／ｖ　）の
刀ロチノイドの生成　　　　　− （８，）カスター培地における有機酸生成　　　　士Ｑ
）デンプン様物質の生成　　　　− ［相］ビタミンの要求性−＋ （ビオチン、チアミン要求性） ｔｅｌ　　同化性、発酵性の有無 同化性　発酵性 ■Ｄ−グルコース　　　　　　　＋　　　＋■トレハロ
ース　　　　　　　　−− ■Ｄ−ガラクトース　　　　　−　　　−■ラクトース
　　　　　　　　　−　　　−■シュクロース　　　　
　　　＋　　　十〇ラフィノース　　　　　　　−　　
　＋る■Ｄ−マンノーヌ　　　　　　　−− ■Ｄ−キシローヌ　　　　　　　− ■α−メチルーＤ−グルコシド　　　　−［株］メリビ
オース　　　　　　　　−躾Ｄ−アラビノーヌ　　　　
　− ■エスクリン　　　　　　　　− ■エタノール　　　　　　　　＋ ■イノゾ９ト　　　　　　　　　　− 暢マルトース　　　　　　　　　　−−［相］メレジト
ース　　　　　　　　一同化性　発酵性 ■　グ　リ　−ヒ　リ　ノ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＋［相］セロビオース　　　　　　　
　−０９）イヌリン　　　　　　　　　　−■）１）−
マンニット　　　　　　＋ ■ｐｌ蕗性デンプン　　　　　　− ＠ム）−ソルビット　　　　　　　＋ 以上の蘭学的性状から、本ＫＳＭ−３６株はトルログシ
ス桃に属すると判断される。更に該株は麦芽汁培地、Ｙ
Ｍ培地及びグルコース−酵母エキス−ペグトン培地のい
ずれにおいて培養しても皮膜の形成は認められない；Ｙ
Ｍ寒天培地での生育に良好で、コロニーの形状は周縁に
おいて金縁で随起して半レンズ状であり、表面は平滑で
、光沢は輝光、性状はバター質、色調はクリーム色であ
る；巨大コロニー培養でのコロニーの型は円型で、その
ほかコロニーの形態、形状はＹＭ寒天培地でのものと同
様である等の％徴を有する。

かかる菌学的性質を有する菌についてジエイ・ロダー（
Ｊ、　Ｌ、ｏｄｄｅｒ　）　（Ｄ　［ｆ　　イース）　
Ｊ（「Ｔｈｅ　Ｙｅａ、ｓｔｓ　Ｊ　Ｎｏｒｔｈ　−Ｈ
ｏｌ　１ａｎｄ　Ｐｕｂｌ　ｉｓｈｉｎｇＣｏ、　、　
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　−Ｌｏｎｄｏｎ　、　１９７１　
）、駒形和男編「微生物の化学分類実験法」　（学会セ
ンター、１９８２）、飯塚広、後藤昭二著１酵母の分類
同定法」（第２版、東京大学出版会、１９７７　）に基
いて検索した結果、本菌株と類似の菌株としてはトルロ
プシス・ボンビコーラＡＴＣＣ２２２１４（ＧＢＳ６０
０９Ｊが認められた。しがしながら、本発明のトルロプ
シス書ボンビコーラＫＳＭ　−３６は、ｎ−アルカンを
唯一の炭素源基質とする分離培地によってキャベツの桑
がら分離された菌株であるのに対し、公知のトルロプシ
ス・ボンビコーラ酵母株は高＃夏のグルコースを唯一の
炭素源基質とする分離培地によって、野花（例えばカナ
ダのアルバータ地方ののけし）の孔雀から分離された菌
株である。そして、公知のトルロプシス・ボンビコーラ
酵母株とは、これが尿素資化性、すなわちウレアーゼ活
性「＋」であるのに対し、本発明のトルク１シスｅボン
ビコーラＫＳＭ−３６はウレアーゼ活性１−」である点
で相違する。更に、最も顕著な相違として、トルロプシ
ス・ボンビコーラＫＳＭ−３６はンホロース生７）ｌ：
性が公知のトルロプシス畢ボンビコーラ酵刊抹に比べ遥
かに高いことが挙げられる。

そこで１本発明者に１ぐ５Ｍ−３６株全トルロブジノ属
に属する新酵母と判断し、トルロプシス・ボンビコーラ
（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｂｏｍｂｉｃｏｌａ　）　Ｋ
８Ｍ−３６と命名し、前記した如く工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託した。

このに、５Ｍ−３６株を分離源であるキャベツの莱から
分離するには、例えば後記参考例１に示す如く、ノルマ
ルパラフィン？唯一の炭素源と［２て含イ１°する培地
を用い常法に従って行えばよいＯ 本発明に係るソホローズ生産菌の培養に使用する培地の
組成は、使用するソホローズ生産菌が良好に生育し、ソ
ホローズを順調に生産するために必要な炭素源、窒素源
あるいは有機栄養源、無機塩などからなる。

炭素源としては、炭水化物（例えば、グルコース、フラ
クトース、シュクロース、ンルビトール等）、有機酸（
例えば、クエン酸、コハク酸等）、炭化水素（例えば、
ｎ−ドデカン、ｎ、−ヘキサデカン等）、油脂及びその
誘導体（例えば、動植物油脂、ジグリセライド、モノグ
リセライド、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコー
ル及びそのエステル等）、アルキル（又はアルケニル）
ハライドなど資化されるものならばいずれも使用できる
。また、窒素源あるいは有機栄養源としては、例えば硫
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機窒累源化合物類、グルタミン酸等のアミノ酸
類、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の有機窒素源物
質類が挙げられる。また、無機塩としては各種リン酸塩
、硫酸マグネシウムなどが使用できる。更に、微量の重
金属塩類が使用されるが、天然物を含む培地では必ずし
も添加を必要としない。ビタミンとしてチアミンとビオ
チン全要求するが、やはり天然物を含む培地では必ずし
も添加を必要としない。更にまた、栄養安求全必要とす
る変異株を用いる場合には、その栄養要求ヲ満たす物質
を培地に添加しなければならない。

培養は培地を加熱等により６ｈ後、賄を接種し、２０〜
３５Ｃで３〜５日振盪又は通気攪拌すればよい。ｐＨは
初発ｐＨを５〜６５に調整し、その後は培養にまかせれ
ば良い結果が得られる。

水に難溶性の炭素源等を使用する場合には、ポリオキン
エチレンソルビタノ等の各種界面活性剤ｋ　’７４地に
麟加することも可能である。

；ｌヌ上のり口くして得られた培養物は、そのまま１’
、Ｉ％母諒として用いることができるが、通常の固液分
離手段を用いて培養物から値体を分離（７、侍られる生
菌体又はその処理物（凍結乾燥菌体管ノヲ酵母源とする
こともできる。

９！に、培養物中からソホローズを単離するには、ｉ＆
　’ｇｔ実施例に示す如く、ソホローズの理化学的性質
を第１」用して、一般の有機化合物の採取および精製の
手段に準じて行うことができる。

すなわち、例えば培養物を遠心分離、濾過又は分相等に
吋して培養液を分取し、次いでこの培養液から抽出、イ
オン交換等の方法にＪ：り不純物を取除いたのち、更に
活性炭カラム等を用いたカラムクロマトグラフィー等の
方法に、ｌ：！ｌ１分別精製する。

〔作用〕

本発明に使用するトルロプシス属に属する菌株は、後記
実施例に示す如くソホローズ生産能を有する。

〔発明の効果〕

前述の如く、微生物のソホローズ生産能については、僅
かに１例知られているのみで、しかも少量のソホローズ
生成を認めたというに過ぎない。これに対し、本発明は
トルロプシス属に属する菌株が肩いソホローズ生産能を
有するという新知見に基くもので、微生物によるソホロ
ーズの製造を可能にするものである。

〔実施例〕

次に蚕考例及び実施例を挙けて本発明を説明する〇 参考例１ （１）東京都武蔵野市郊外のキャベツ畑のキャベツ葉１
ｏＦｔ”ｃ滅菌水３０ｍ１の入ったビーカーに入れ、１
０分間マグネチツクスターラーで１懸濁分散させた。静
置後、その上混液をｌｏｍｌ採取し、これ全下記組成の
分離用液体培地１００　ｍｌを含有１７た５００ｍ１容
坂ロフラスコに接種し、３１１Ｃ，１２０ストロ一ク／
分で７日間振盪培養した。この操作を繰り返し７行い、
４回集積培養を行った。

（分醒用ｉｌ１体培地の組成） ＋１−ヘギ゛リーデカ７　　　　１００　　／ｌ１１硝
散アンモニウム　　　　　２５　ｚ リンｒ俊二水素カリウム　　　　　１０ｒ（Ｍｔ［マグ
イ・カラム・７水塩　　　　　　５（）ｚ頃化カリウム
　　　　　　　　５０Ｊ 醇母エキス　　　　　　　　　１０ｚ 水追水　　　　　　　　　１’０ｆｌＯａｔｐＨ４，５ （１１）次いで、各段階の集積培地液から培養液０．５
縦採取し、これ葡下記方法で一調製された分離用寒天培
地の表面にコンラジー棒で均−ｉＣ塗布したのち、１１
−エキサブカンを含浸させた口紙で覆いセロテープで密
封し、３０Ｃで培養した。

（分離用寒天培地の調製） ｎ−へキサデカンを除いた上記分離用液体培地に寒天を
液体培地に対し外比で２．５重量係添加したのち蒸気滅
菌した。これを保温下で滅菌シャーレに一定量分注し平
板寒天培地とした。

（１１１）次いで、上記培養に、ｃ！ｌｌ生育したコロ
ニーの一白金耳を滅鉋水で１００倍希釈し、この希釈液
０．　ｉ　ｍＡ　ｆ前述の分離用寒天培地と同組成の寒
天培地に再度塗布し、同様に１１−ヘキサデカンを含浸
させた口紙で覆ってｎ−ヘキサデカンを供給しながら３
０Ｃで３日間培養した。生じた複数のコロニーが相互に
相異しないことを、肉眼的及び顕微鏡的に観察すること
により確認した。更に上記コロニーのうち１０個のコロ
ニーをそれぞれ分離用寒天培地と同組成の斜面寒天培地
に接種し、ｎ−ヘキサデカンを含浸させた口紙に、Ｊ：
りｎ−ヘキサデカン全供給しつつ３０Ｃで３日間培養し
た。１０本の斜面培地上の菌株が肉眼的及び顕微鏡的に
同一菌株であること’ｅ　ｆＱ　Ｕｕ：認し、また、こ
れらｌＯ菌株の各培地上の性状及び生理学的性質が同一
であることを確認した。上記菌株の各培地上の性状及び
生理学的性質は前述した通りである。

上記試験の結果、６１０本の培養菌はすべて自然界より
純粋に分離された単一菌株であることが判る。

（ｌｖ）次いで、上記で純粋培養された斜面培地上の菌
株エフ−白金耳を滅菌した１０係グリセリン水溶液（２
ｍｌりの入った凍結保存用）くイアルに懸濁し、−８０
Ｃにて凍結保存する。かくして３ケ月凍結保存後、迅速
に解法して得られる懸濁液の一白金耳全普通寒天培地に
蘇生後前記と同条件下に各培地上での性状及び生理学的
性質を調べた結果、凍結前とは変化が認められなかった
０ また、上記凍結及び解凍を１ケ月毎ｉｃＳ度繰り返した
菌株について同様に、各培地上での性状及び生理学的性
質を調べた結果変化は認められなかった。

実施例１ （ｉ）滅菌したグルコース５重量／容量％（以下、ｗ／
／ｖ％テ示す）−コーンヌティーフリッヵー２ｗ／ｖ％
含有スル種培地（ｐＨ６，２）５００ｒｎｌＪ、入れた
５詔容培養三角フラスコに、同組成の培地を入れ；７５
００ｍ１！容坂ロフラスコ中で３０ｃ、４８時間培養し
て得たトルロプシス・ボンビコ−ラＫＳＭ−３６培養液
２ｓｏｍｚ接種し、３０ｃで４８時間振盪培養した。次
いで、この培養液３００ｄｉ、パーム油１５ｗ／ｙ　％
−グルコースｌＯｗ／ｖチー酵母エキス０．５　ｗ／Ｖ
チを含有する本培地（ｐＨ５，６）　１５−ｇｋ入れ７
’（３０１容のジャーファーメンタ−に接種し、温［：
３０Ｃ。

通気：　０．５ＶＶＭ、　　内圧：　（Ｌ　７５　ｋｆ
／、２　、攪拌：３５　（ｌ　ｒｐｍの条件下で５日間
培養した。

（１１）培養液約１５４’ｊ（内径１　’５　ｃｒｎ、
長さ１００−の先端部が円錐状の保温ジャケラ）１４分
相管に入れ、下部より空気を噴出させて攪拌しながら約
７００で３０分加温したのち通気を止め、３０分間培養
液を放置沈降させた。このとき培養液は４相に分相する
。最下沈降相及びその上の菌体用を下部ノズルから静か
に抜きとった後、その上相（分相時の上から第２相）に
あたる水相を静かに採取した。

（＋ｉｉ　）　　次いで、採集水相部１！を採り、必要
に応じて分液ロート中でクロロホルム−メタノール混液
（２：ｔ）５ｏｏｄで抽出操作を行い、水相中のクロロ
ホルム−メタノール可溶性物質を除去する０そして、こ
の抽出処理水相部を５Ｃ１３５（間ｒｐｍで３０分間遠
心分離を行い上清液を得り。この上清液をロータリーエ
バポレーターで３５０温浴上にて混在するメタノール等
を留去するとともに減圧濃縮した。更に、得られた磯縮
液約ｓｏｙからイオン性物質を除去するために、これに
カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂を添加（，２時間
攪拌したのちイオン交換樹脂全洗浄除去した。

（ｌｖ）この脱イオン処理水相３２０ｍ１全量を活性炭
カラムに充填した。なお、活性炭カラムは内径２５ｍ、
長さ６０画のガラヌカラムに１８０ゴ容量の活性炭〔ク
ロマト用活性炭、和光紬薬（株〕装〕を充填したのち、
４規定−塩酸水溶液’ｉｌｏＯｏｍ／流し、次いで蒸留
水４０００　ｍｌ　ｆ流して調製したものを使用した。

この活性炭カラムによる分離操作は、最初溶離液として
蒸留水１０００　ｍｌ　ｆ流し、次に５チエタノール水
溶液’　　２５０ｏｍＪ、　１ｏ％エタノール水浴液１
０００　ｍＪ、２０％エタノール水溶液１ｏｏＯｄの順
序でステラフワイズ（階段的）溶出を行い、最後に５０
チエタノール水溶液１０００　ｍｌを流して終了した。

溶出液は大型フラクションコレクターで１０００重量分
画／フラクションで分取した。分離された谷分画部を薄
層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー及びガ
スクロ−マススペクトロメトリー（ＧＣ−ＭＳ）などで
分析することによ、！２嵐１１〜嵐４０の両分に分離分
画された物質がソホローズであることが確認された（第
１図）。上記発酵条件で得らｆｌ、たソホローズは発酵
液ｌｌあたり約３０１であった。

実施例２ シード培地（グルコース５　”／ｖ　％　−酵母エキス
０５Ｗ／Ｖ％）１０ｍｌｆ入れた試験管に、ＹＭスラン
トに生育した新鮮なトルロブ７スーボンビコーラ類（紀
１表）から各々−白金耳を採り、各々接種したのち、３
’ＯＣで４８時間培養した。

次いで、この培養液１　ｍｌ　ｆグルコースｉ　ｏ　ｗ
／ｖチーサフラワー油ｌＯｗ／／％−酵母エキス０５Ｘ
ｖ／／Ｖ％含有する本培地５０ｍ／ｉ入れた坂ロフラス
コにｊ妾押し、３０Ｕ、１２０ストロ一ク／分で１０日
間発酵した。この発酵液５厩を採取し、遠＋ｌ＞分離−
口過処理し、清澄な発酵液を得たのち、その全量ｆ　２
０　ｍｌ容のサンプルビンに入れ、凍結真空乾燥を行い
粉末とし、その重量全測定した。

次に、この粉末１ＯＩｎ９′ｆｔ正確に５ｍｌ容バイヤ
ル器に秤９採り、これにトリフルオロ酸０２３　ｍｙと
ホルムアミド０．５　ｍｌ　ｆ加え均一に溶解させたの
ち、最後に無水トリフルオロ酢酸金加え、密栓して１０
分間室温に放置した。この反応液の一定量全ガスクロマ
トグラフィー分析に供し、ソホローズを定量分析した。

ガスクロマトグラフィー分析に、３％５ｉｌｉｃｏｎｅ
　５ｇ−５２−Ｃｂｒｏｍ。

５ｏｒｂ　Ｗ　８０　／ｌＯＯメツシュ〔島津製作所（
株）製〕全２　＋ｌｌ１ｎρ×４フィートのガラスカラ
ムに充填したものを用いて行った。なお、カラム温度は
最初５分間ＨｉｏｏＣに維持し、次いでｘｏｔｌ：’／
分の昇温速度で昇温したのち、２３０Ｃで２分間維持し
た。キャリアガスはヘリウムを用い、流量は３　（１ｍ
Ａ　７分とした。検出には水素炎検出器を用いた。

谷トルロプシス争ボンビコーラ類のソホローズ生産曾は
第１表に示す通りである。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるカラムクロマトグラフィーの
結果を示す溶出曲線である。 以　　、ヒ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、トルロプシス属に属するソホローズ生産菌を培養し
   ソホローズを生成蓄積せしめ、これを採取することを特
   徴とするソホローズの製造法。