JPS6129716B2 - - Google Patents

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JPS6129716B2
JPS6129716B2 JP53078019A JP7801978A JPS6129716B2 JP S6129716 B2 JPS6129716 B2 JP S6129716B2 JP 53078019 A JP53078019 A JP 53078019A JP 7801978 A JP7801978 A JP 7801978A JP S6129716 B2 JPS6129716 B2 JP S6129716B2
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JP
Japan
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antitumor
bifidobacterium
supernatant fraction
cells
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JP53078019A
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JPS557205A (en
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Yoshinori Atsui
Kazuhiro Imai
Zenzo Tamura
Yoshuki Hashimoto
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Individual
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Publication of JPS557205A publication Critical patent/JPS557205A/ja
Publication of JPS6129716B2 publication Critical patent/JPS6129716B2/ja
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明はビフイドバクテリウム属の細菌から得
られる抗腫瘍性を有する新規物質に関する。 ビフイドバクテリウム属の細菌及びその菌体成
分が強い抗腫瘍作用を有することはすでに知られ
ており、本発明者らはこの属の菌の生菌体ならび
に死菌体の破壊物に抗腫瘍作用を確認した(第35
回癌学会総会発表、昭和51年)。また特開昭52−
117494号明細書には、この属の菌の菌体成分のう
ち、水に不溶性の細胞壁画分が抗腫瘍性を示すこ
とが記載されている。 本発明者らはさらに検討を進めた結果、菌体内
に水に可溶性の成分、いわゆる菌体内上清画分
に、細肪壁画分より強い抗腫瘍作用を示す物質が
存在することを見出し、その単離に成功し、この
物質が新規物質であることを確認した。 本発明はこの知見に基づくもので、ビフイドバ
クテリウム属菌の菌体を破壊し、破壊物を遠心し
て水溶性である上清画分を分離し、これに蛋白凝
固剤を加えて生ずる沈殿を遠心により分離し、こ
れを水又は塩類溶液に対して透析したのち凍結乾
燥することを特徴とする、図面に示す特定の紫外
部吸収スペクトル及び赤外部吸収スペクトルを示
し、下記 C:41.94%、H:5.77%、N:10.44% の元素分析値を有する抗腫瘍性物質の製造法であ
る。 ビフイドバクテリウム属細菌は公知であり、こ
れらの菌株の微生物学的性状は「バージエイズ・
オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー」
8版、669〜677頁(1974年)に詳細に記載されて
いる。例えば下記の菌株が本発明に用いられる。 ビフイドバクテリウム・インフアンテイスS12
株(微工研菌寄託番号第3948号)、ビフイドバク
テリウム・アニマリスBifMO−Bif−1株(同第
3949号)、 ビフイドバクテリウム・アドレツセンテイス
aE194a株(同第3950号)、 ビフイドバクテリウム・ビフイドウムaE319株
(同第3951号)。 使用菌の培養は、嫌気条件下で、例えば炭酸ガ
ス、窒素ガス等で空気を置換して行われる。培地
は還元性物質を多く含むものが必要であり、例え
ば肝臓エキス、チオグリコール酸、L−システイ
ン、アスコルビン酸、硫化ナトリウムその他の化
合物を含む培地が用いられる。ビフイドバクテリ
ウム属細菌はその生育に特殊な栄養因子を要求
し、これは「ビフイズス因子」と呼ばれる。ビフ
イズス因子としては、例えばベンゾイル−D−グ
ルコサミン、4′−ホスホ−パンテテイン−S−ス
ルホン酸などがあげられる。 本発明方法は例えば次のように実施することが
できる。ビフイドバクテリウム属菌の菌体を破壊
するには、例えば超音波ないしは他の機械的な手
段、例えばブラウン・ホモジナイザーを用いる方
法、アルミナ粉末と混合して乳鉢内で磨砕する方
法などが用いられる。また適宜な溶菌酵素で溶菌
させてもよい。次いで菌体の破壊物を遠心し、未
破壊の菌体及び細胞壁からなる沈殿を除去し、水
溶性である上清画分を分取する。この上清画分を
水又は塩類溶液、例えば生理食塩水、リン酸緩衝
液などに対して透析したのち凍結乾燥すると、新
規物質が得られる。遠心分離により得られた上清
画分に、透析の前にまず蛋白凝固剤、例えば過塩
素酸、トリクロル酢酸などを加え、生ずる沈殿を
遠心により集め、これを水又は塩類溶液に対して
透析したのち凍結乾燥することにより精製するこ
とが好ましい。 さらに菌体破壊後の上清画分をそのまま、ある
いは蛋白凝固剤で沈殿させ、透析したのち、硫酸
アンモニウムによる分画ならびにカラムクロマト
グラフイー等により精製することもできる。 本発明の新規物質は、図面に示す特定の紫外部
吸収スペクトル(第1図)及び赤外部吸収スペク
トル(第2図)を示し、C:41.94%、H:5.77
%、N:10.44%の元素分析値を有し、優れた抗
腫瘍作用を有する。また発明は水に可溶で、熱に
比較的安定であり、100℃で30分間加熱後も活性
を失なわない。 本発明により得られる物質を抗腫瘍剤として用
いる場合には、通常は注射剤又は液剤の形で用い
ることが好ましい。この抗腫瘍剤は普通の助剤又
は添加物を用いて常法により製造することができ
る。新規物質の使用量は、一般に成人に対し1日
当たり約0.05〜1.0mgが好ましい。 実施例 1 下記組成の培地6にビフイドバクテリウム・
インフアンテイス(以下B.インフアンテイスと略
す)S12株の1夜培養種菌の1白金耳量を接種
し、炭酸ガス−窒素ガス(容量比1:9)で置換
した嫌気ジヤー中で、37℃において24時間培養す
る。 培地組成: トマトジユース浸出液 400 ml ネオペプトン(デイフコ) 15 g 肝臓抽出液 75 ml グルコース 20 g 可溶性殿粉 0.5g 塩化ナトリウム 5 g L−システイン・HCl・H2O 0.2g 蒸留水を加えて全量525mlとする。 PH:6.8〜7.0 トマトジユース浸出液は、トマトジユース液1
容量部に蒸留水1容量部を加え、100℃で1時間
加熱したのちPH7.0とし、過した液である。肝
臓抽出液は、肝臓末10gを蒸留水170mlと共に50
〜60℃に1時間加熱したのち過した液である。 培養終了後、無菌空気を導入しながら37℃で1
週間放置して死菌とし、これを3000gで15分間遠
心し、沈殿した菌体をリン酸緩衝生理食塩液
(PBS)を用いて2回遠心により洗浄する。得ら
れた洗浄菌体を300mlのPBSに懸濁する。 この菌懸濁液300ml(乾燥菌体量として12g)
をSONIC300Disemembrator(出力300W、周波
数20KHz)の装置で、65〜70%の出力で30〜50
分間0〜13℃に保ちながら超音波処理し、菌体を
破壊したのち、30000rpmで15分間遠心して未破
壊菌を除き、上清を10000gで60分間処理して得
られた菌体内上清画分を蒸留水に対して透析し、
凍結乾燥すると、抗腫瘍性物質7.95gが得られ
る。 この物質は分析の結果、糖(アンスロン硫酸法
により定量)が45〜50%、脂質(エーテル・エタ
ノール=1:1で抽出、重量測定)が検出限界以
下、RNA(オルシノール硫酸法にて定量)が
13.5%、DNA(ジフエノールアミン硫酸法にて
定量)が1.5%、蛋白(フエノール試薬法にて定
量)が25〜30%の組成を有する。 前記の方法で得られた抗腫瘍物質1gを
PBS100mlに溶解し、10%過塩素酸10mlを加え、
0℃で30分間撹拌したのち、30000gで10分間遠
心し、上清を除去し、沈殿を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥すると、抗腫瘍性物質400mgが得ら
れる。 この物質は、C:41.94%、H:5.77%、N:
10.44%の元素分析値を有し、紫外部吸収スペク
トル及び赤外部吸収スペクトルはそれぞれ第1図
及び第2図に示すとおりである。 実施例 2 実施例1と同様にして、6の培地にビフイド
バクテリウム・アドレツセンテイス(以下B.アド
レツセンテイスと略す)aE194a株を培養し、得
られた菌体をPBS250mlに懸濁し、同様に超温波
処理して菌体を破壊したのち遠心し、菌体内上清
画分を得る。これを蒸留水に対し透析し、凍結乾
燥すると、抗腫瘍性物質6.21gが得られる。以
下、実施例1と同様に処理する。 実験例 A B.インフアンテイスS12株を実施例1と同様に
して嫌気的に培養したのち遠心により集菌し、菌
体を超音波により破壊した。菌体の破壊物を
3000rpmで10分間遠心して未破壊の菌体を除去し
たのち、その上清をさらに10000gで60分間遠心
し、主として細胞壁画分から成る沈殿と上清画分
とに分離し、それぞれ蒸留水に対し透析し、凍結
乾燥した。こうして得られた菌体内上清画分及び
細胞壁画分、ならびにS12株死滅の凍結乾燥物
(陽性対照)を用いて、次のようにして抗腫瘍作
用を調べた。1群7匹のBALB/c系雄マウス
(体重20〜30g)の腹部皮下に、Math−A腫瘍を
細胞数が2.5×104/マウスとなるように移植し
た。第1群には上記の方法で製造したB.インフア
ンテイスS12株菌体の上清画分の生理食塩液溶液
(投与量:乾燥量として0.2mg/マウス/日)を腫
瘍移植の7日、8日、9日、10日、13日、15日、
17日及び20日後に腫瘍周辺部に注射した。 第2群には、上記の方法で製造したS12株菌体
の細胞壁画分の生理食塩液懸濁液(投与量:乾燥
量として0.2mg/マウス/日)を、第3群にはS12
株死菌の生理食塩液懸濁液(投与量:菌数として
109/マウス/日)、そして第4群に対照として生
理食塩水のみを、それぞれ同様に投与した。 腫瘍移植10日後から25日後まで触診により腫瘍
の平均直径の推移を観察した結果を第3図に示
す。またこの実験において腫瘍移植30日後の腫瘍
を摘出し、その重量を測定すると共に、腫瘍の増
殖の認められないマウス数を調べた。その結果は
第1表に示すとおりである。
【表】 第3図及び第1表の結果から明らかなように、
B.インフアンテイス菌体の上清画分及び細胞壁画
分は死菌体と同様に抗腫瘍作用を有していたが、
このうち上清画分が細胞壁画分より優れた効果を
示した。 実験例 B(実施例 3) 実施例Aと同様にしてB.インフアンテイスS12
株菌体の上清画分を得、これに10%過塩素酸を加
え、遠心して得られた沈殿及び上清をそれぞれ蒸
留水に対して透析し、凍結乾燥した。また実験例
Aと同様にしてB.アドレツセンテイスaE194a株
を培養し、菌体を破壊して得られた上清画分を蒸
留水に対して透析し、凍結乾燥した。 こうして得られた3種の画分及び実験例Aによ
り得られたB.インフアンテイスS12株菌体の上清
画分、ならびにS12株死菌及びB.アドレツセンテ
イスaE194a株死菌の凍結乾燥物(いずれも陽性
対照)を用いて、次のようにして抗腫瘍作用を調
べた。 1群5〜7匹のBALB/c系雄マウス(体重20
〜30g)の腹部皮下に、Meth−A腫瘍を細胞数
が2.5×104マウスとなるように移植した。腫瘍移
植の1日、2日、3日、5日、6日及び7日後に
腫瘍周辺部に各検体を生理食塩液中の溶液又は懸
濁液の形で次の量で注射した。B.インフアンテイ
スS12株の菌体内上清画分、S12株の菌体内上清
の過塩素酸処理沈殿画分及び過塩素酸処理上清画
分、ならびにB.アドレツセンテイスaE194a株の
菌体内上清画分は、それぞれ乾燥量として0.2
mg/マウス/日の量で、そしてB.インフアンテイ
スS12株死菌及びB.アドレツセンテイスaE194a株
死菌は、それぞれ菌数として109/マウス/日の
量で投与した。 腫瘍移植8日後から30日後まで触診により腫瘍
の平均直径の推移を観察した結果を第4図に示
す。この実験において、腫瘍移植30日後の腫瘍を
摘出し、その重量を測定し、また腫瘍の増殖が認
められないマウスの数を調べた結果を第2表に示
す。
【表】
【表】 第4図及び第2図の結果から明らかなように、
B.インフアンテイスS12株の菌体内の上清画分の
過塩素酸処理による沈殿には強い抗腫瘍作用を認
められたが、その上清の作用は弱かつた。またB.
ブレウエb株の菌体内上清画分にもB.インフアン
テイスと同様に抗腫瘍作用が認められた。
【図面の簡単な説明】
第1図及び第2図は、それぞれ本発明のにより
得られる物質の紫外部吸収スペクトル及び赤外部
吸収スペクトルを示すグラフであり、第3図及び
第4図は本発明により得られる物質の抗腫瘍効果
を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 ビフイドバクテリウム属菌の菌体を破壊し、
    破壊物を遠心して水溶性である上清画分を分離
    し、これに蛋白凝固剤を加えて生ずる沈殿を遠心
    により分離し、これを水又は塩類溶液に対して透
    析したのち凍結乾燥することを特徴とする、図面
    に示す特定の紫外部吸収スペクトル及び赤外部吸
    収スペクトルを示し、下記 C:41.94%、H:5.77%、N:10.44% の元素分析値を有する抗腫瘍性物質の製造法。
JP7801978A 1978-06-29 1978-06-29 New antiulcerative substance, its preparation and antiylcer containing thereof as effective component Granted JPS557205A (en)

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JP7801978A JPS557205A (en) 1978-06-29 1978-06-29 New antiulcerative substance, its preparation and antiylcer containing thereof as effective component

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JPS557205A JPS557205A (en) 1980-01-19
JPS6129716B2 true JPS6129716B2 (ja) 1986-07-08

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ID=13650078

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JP (1) JPS557205A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6392345A (ja) * 1986-10-07 1988-04-22 信越化学工業株式会社 医療用切開、圧入器具およびその製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6392345A (ja) * 1986-10-07 1988-04-22 信越化学工業株式会社 医療用切開、圧入器具およびその製造方法

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JPS557205A (en) 1980-01-19

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