JPS61234779A - 細胞毒性ｔリンパ球により溶解を受け得る標的細胞の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞毒性ＴｌＪンパ球により溶解を受け得る
標的細胞の製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

多くの感染、特にウィルス感染に対する人体の自然防禦
、及び恐らく多くの種類の腫瘍細胞に対する人体の自然
防禦は、細胞分解性看しくは細胞毒性１９７３球（ＣＴ
Ｌ）と呼ばれる一部の胸腺白米のリンパ球により主とし
て行なわれる。ＣＴＬはクローンとして人体に存在する
。各クローンは、標的細胞における特定の抗原構造に対
し特異性である。

この特異性により、特定クローンのＣＴＬは、その表面
に対応の抗原構造を有する細胞（すなわち標的細胞〕の
みを溶解することができる。主たる組織適合性錯体（Ｍ
ＨＣ）の遺伝子の生産物を特徴的に含むこれら抗原構造
は、（１）クラス１の自己−ＭＭＣ分子の意味において
のみ識別される異種抗原、又は（２）同質ＭＭＣのクラ
ス１分子のいずれかとして分類することができる。

Ｔ　リンパ球受容体は、Ｔリンパ球の表面上及び表面内
に位置する２種の亜単位から生成されるグリコ蛋白質で
ある。各亜単位は、特定抗原構造に対し特異性の可変領
域と、結合領域と、ヘルパーリンパ腫と細胞毒性１９２
３球との間の成る種の相違以外は全てのＴリンパ球受容
体に対し共通の不変領域と、経膜領域と、細胞質領域と
で構成される。

これら種類間のアミノ酸配列には若干の相違があるが、
ネズミ及びヒト由来の少なくともβ亜単位については相
当な類似性が示されている。

たとえばＴ３のような他の受容体関連分子はＴリンパ球
受容体分子に近接位置し、抗原構造を識別する際にＴ　
リンパ球受容体と共に作用することができる。Ｔリンパ
球受容体及び関連分子はステファン・シー命モイヤー、
オレステ・アクト、チェリーーヘルセンド・スチュワー
ト・エフ・シュロスマン及ヒエリス・エル−ラインヘル
ツに！り７ニユアル・レビュー・イミュノロジー、第２
巻、第２３〜５０頁（１９８４）に検討されている。

ウィルス感染又は癌細胞を有する殆んどの個人において
、免疫系はこれら全ての感染若しくは異常細胞を撲滅す
ることができない。免疫系の制約された能力の理由は現
在まだ知られていない。Ｔリンパ球受容体のヌクレオチ
ド及びアミノ酸構造の発見と共に、との能力を高める新
たな手段が可能になつ六と思われる。この手段の１つが
本発明であって、Ｔ　１７７３球が特異性を示す細胞に
つい′ての抗原構造の識別に関し、よシ多くの知識を与
えるべく設計した一連の実験において得られた全く予想
外の知見の成果でおる。本発明の要旨は、任意の選択さ
れた細胞を宿主自身の細胞毒性Ｔ　１７７３球による攻
撃及び溶解のための標的にする方法である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

したがって本発明の目的は、細胞毒性Ｔ　１７７３球に
より溶解を受け得る細胞の製造法を提供するととである
。

さらに本発明の目的は、細胞毒性でリンパ球により溶解
を受け得る細胞の製造法に使用するための試薬を提供す
ることである。

さらに本発明の他の目的は、細胞毒性ＴｌＪンパ球によ
る選択細胞のインビボ又はインビトロ溶解の方法を提供
することである◇ 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、細胞毒性Ｔ　１７７３球（ＣＴＩ、）により
溶解を受け得る選択若しくは標的細胞の製造法である。

この方法は、大抵の細胞毒性Ｔ　１７７３球又は受容体
関連分子により共有されるＴリンパ球受容体の領域に対
し向けられた抗体を、溶解すべき細胞の表面に結合させ
ることよりカっている。

抗受容体抗体と呼ばれる抗体は、たとえばグルタルアル
デヒドのような化学的架橋剤により直接に、或いは「リ
ンカ」分子により間接的にＣＴＬ受容体へ結合させるこ
とができる。「リンカ」は標的細胞表面上の抗原に対す
る他の抗体、標的細胞表面上の受容体に結合するホルモ
ン、又はたとえば肝臓細胞上の受容体に結合するガラク
トースのような炭水化物とすることができる。この方法
は、インビトロ及びインビボの両状態に適用することか
で亀る。この方法の可能な用途は、表面上における特異
性腫瘍抗原による腫瘍細胞の選択的溶解、或いは表面上
のウィルス特異性抗原によるウィルス感染細胞の選択的
溶解を包含する。

本発明は、細胞毒性１９２３球（ＣＴＬ）による溶解を
受け得る選択若しくは標的細胞の製造法である。

この方法において、ＣＴＬ表面上の受容体は、標的細胞
の表面に結合する他の分子により識別され、かつこの分
子と相互作用する。特に相互作用がインビボで生ずる場
合には宿主自身のＣＴＬを使用するのが好ましいが、特
殊の場合には他の源泉からのＣＴＬをも使用することが
できる。他の源泉は組織培養物、同種類の他の動物、又
は異種の動物を包含する。　　　　　゛ さらに、標的細胞との相互作用前に、「活性化」又は刺
戟されたＣＴＬの個数を増大させるのが好ましい。イン
ビボにおいて、個数及び活性化の増大は、宿主を便利か
つ適過な抗原又は抗原の組み合せ、たとえばヒト血液か
らの培養された正常ケシチン生成細胞若しくはバフィー
コート細胞、減退ウィルスワクチン（麻疹〕及び成る種
の非病原性ウィルスのような同種細胞に露出して生せし
めることができる。２種以上の抗ぷの組み合せが好まし
い。何故なら、これらは単一抗原よシも多くのＣＴＬク
ローンを活性化させる傾向が大きいからである。

標的細胞の溶解は、一般にＣＴＬ抗原特異性の受容体を
介し、標的細胞をＣＴＬに結合することを必要とする。

本発明は、この結合を達成する実際的かつ新規な手段の
発見、並びに選択された標的細胞をＭＨＣ遺伝子物質の
分子内で結合が生じない場合にも溶解しうるという予想
外の発見の両者に基づいている。通常の条件下において
、ＭＨＣ遺伝子物質の存在は、Ｔ　リンパ球による標的
細胞の識別に対し不可欠であると思われる。作用機能を
有する１９７３球（ヘルパー及び細胞毒性Ｔ　リンパ球
〕は、細胞が異種であるかどうかを決定する手段として
ＭＭＣ遺伝物質を使用することが理論化されている。事
実、ジー・ベルヶ、イー・マツクペイ、ヴイ・ヒュ及び
ダブリュー・アール・クラークによりジャーナル・オブ
・イミュノロジー、第１２７巻、第７８２〜７８７頁（
１９８１）に記載され７’ｃＣＴＬによる標的細胞のレ
クチン依存性溶解の最近の分析から引き出された結論は
、 との推定の抗原依存性過程においてさえ、クラスＩのＭ
ＨＣ物質の存在が標的細胞の溶解に対し依然として必要
とされることである。

本発明において、ＣＴＬは、ＣＴＬと標的細胞との両者
の表面に結合する分子により標的細胞と「結合」しうる
か或いは標的細胞に対し相互活性となしうる◇第１図に
示し７’（１実施例において、ＣＴＬ受容体に対する抗
体１２（すなわち抗受容体抗体）は、たとえばグルタル
アルデヒドのような架橋剤によって標的細胞１４に結合
される。次いで、抗受容体抗体１２はＣＴＬｌ　８上の
ＣＴＬ受容体１６に結合して標的細胞１４を溶解する。

好適な抗受容体抗体は、大抵のＣＴＬの対応受容体によ
り共有されるＣＴＬ抗原特異性受容体の領域に向けられ
たモノクローナル抗体である。この種の不変領域は、サ
イトウ等にょシネイチャー、第３０９巻、第７５７〜７
６２頁（１９８４）及びネイチャー（１９８４年１１月
１日〕に記載されている。本発明に有用な第２の抗受容
体抗体は、たとえばＴ３のような細胞毒性でリンパ球受
容体関連の分子に向けられたものである。関連分子はＣ
ＴＬ受容体に充分近接位置して、ＣＴＬと溶解すべき細
胞との間にブリッジを形成し、ＣＴＬ受容体を２つの結
合細胞間に位置せしめねばならない０ 所望の特異性を有するモノクロセル抗受容体抗体は、免
疫化ラットから単離されかつ骨髄腫細胞と融合させた肺
細胞から作成されるハイブリドーマから産生させること
ができ、この場合ラッテは（１）特定ＣＴＬ受容体の可
変領域に向けられる抗体を用いて単離されたＣＴＬ受容
体蛋白質、（２）ＣＴＬ受容体の不変領域の部分に対応
する１０〜１２個のアミノ酸配列を有する化学合成され
たペプチド、又は （３）　　組換ＤＮＡ技術により作成された受容体の殆
んど又は全ての亜単位に対応するポリペプチドのいずれ
かを用いて免疫化される。

第２図に示した第２の実施例において（インビボの状態
により適する〕、標的細胞１４の溶解は、標的細胞１４
上の表面分子２４に選択的に結合する他の分子２２に対
し抗受容体抗体１２を結合させて作成された「ハイブリ
ット」分子２０にょシＣＴＬを標的細胞１４に結合して
行なわれる。たとえば、ウィルス抗原若しくは腫瘍抗原
のような標的細胞表面抗原に向けられる第２の抗体を、
分子２２として使用することができる。たとえば標的細
胞上の受容体により選択的に結合されるメラニン細胞刺
戟ホルモン（ＭＳＨ）のようなホルモンも使用すること
ができる。後者は、特異性ＭＳＨ受容体を表面上に有す
ることが知られた黒色腫型癌の処置に有効である。たと
えば副腎ホルモン又は甲状腺ホルモンのような他のホル
モンも、これらの腺の除去が指示された場合に有用であ
る。大抵の場合、抗受容体抗体１２に結合すべき好適分
子２２は蛋白質である。しかしながら、たとえば炭水化
物のようが他の分子も使用することができる。との種の
炭水化物の例はガラクトースであって、哺乳類の肝細胞
における受容体に結合し、とれについてはイー−エフ・
ノイフエルド及びジー・アシュエル、「ザ・バイオケミ
ストリー・オブ・グリコプロティン・アンド・プロテオ
グリカン」（クイルアムージエー・レナルツ編）（プレ
ナム・プレス社、Ｎ、Ｙ、（１９８０）、第２４１〜２
６６頁の「受容体媒介のピノシトシスに対する炭水化物
識別系」に記載されている。

標的細胞特異性蛋白質は、当業者に知られた任意の二官
能性架橋剤を用いて抗受容体抗体に結合させることがで
きる。この種の架橋剤の例はグルタルアルデヒド及びた
とえば４３′−ジチオビス（スルホスクシンイミジルプ
ロピオネート〕のよウナ二官能性スルホーＮＨ８−エス
テル〔ジエー・ヴイ・スタロス、バイオケミストリー、
第２１巻、第３９５０〜３９５５頁に記載〕：ビス〔ス
ルホスクシンイミジル〕スベレート〔ティー・ピー・ギ
エドロツク等、ジャーナル・バイオロジカル・ケミスト
リー、第２５８巻、第１６〜１９頁（ｔ９ａｓ）］；及
び］Ｎ−スクシンイミジルー３−２−ピリジルジチオ）
プロピオネート〔ニー・アール・ノイラス及びエヌ・ス
トリック、ジャーナル・パイロロジカル・メゾラド、第
３巻、第１５５〜１６５頁（１ｔｐｓ１）、ｌであシ、
これはピアス・ケミカル・カンパニー社から得ることが
できる。架橋分子の活性若しくは結合部位は、それらが
標的細胞及びＣＴＬ表面における分子と相互作用しうる
ような露出末端に位置せねばならない０ 架橋分子゛を静脈内、腹腔内、皮下又は他の経路で注射
するインビボの状態において、抗体分子は古典的経路に
より補体を固定しないような種類若しくは同型の抗体か
ら選択するか、或いは補体を活性化するのに必要とされ
る抗体不変領域の部分を除去すべく処理せねばならない
。補体系は、錯体化した若しくは細胞結合した抗体上の
所定部位を識別し、順次に錯体又は細胞に結合し、かつ
最終的に細胞溶解及び炎症を引き起こしうるような一部
の蛋白質分子よシなっている。これは、非特異的又は未
制御で生ずる場合には望ましくない。

ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩ、Ｅは、古典的経路により補体
を固定しない。ＩｇＭ、Ｉ、Ｇｔ、１．Ｇ、及びＩ、Ｇ
ｓは補体を固定する。Ｉ、　Ｇ１、Ｉ、Ｇｔ、ＩｇＧｓ
及びＩ、Ｍ　　の補体固定部分を除去すると共に、活性
化された抗原結合部位を完全のまま残すには、酵素処理
を用いることができる。　　　゛ ＣＴＬ媒介の溶解全促進するこの方法のインビトロ用途
は、患者から取シ出された或いは組織培養で増殖された
細胞群の選択的処理である。１例は、ＣＴＬ受容体に対
する抗体と腫瘍細胞の表面に見られる抗原に対する抗体
とよりなる分子を使用して、照射線治療を受ける患者か
ら創出した骨髄からの腫瘍細胞を除去した後、この骨髄
を再導入することである。

ＣＴＬは人体（すなわち組織、リンパ系及び血＊）の全
体に見い出される。したがって、適当な架橋分子を動物
又はヒトに注射して人体のいずれの場所においても標的
細胞のＣＴＬ媒介の溶解を生ぜしめることができるり蛋
白質分子自身は比較的短い半減期を有する。六とえば、
ヒト　ＩｇＧは２３日間の半減期を有する０他のヒト免
疫グロブリンは６日間未溝の半減期を有する〔デービス
、ズルペツコ、アイゼン、ギンスベルグ、ウッド及びマ
ツカーティー、マイクロバイロロジー、第４８３頁（第
２版、１９７３年〕参照〕、結合されておらずかつ破壊
されていなければ、抗体はたとえば循環する大食細胞、
肝臓におけるクプ７アー細胞及び肺における肺胞大食細
胞のようなスカベンジャー細胞により分解しかつ除去さ
れるまで循環する。ＣＴＬ媒介の溶解によって生じた細
胞残骸は、第５図に示したと同様に処分することができ
る。インビボの状態において、薬剤を用いる場合と同様
に、架橋分子の投与に際し麻酔ショックを避けるには注
意を払わねばならない。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により説明するが、これのみに限
定されない。実施例における出発物質は全て、市販或い
は他の源泉から当業者に容易に入手することができる。

見 以下の詳細な例において、ＣＴＬクローン（すなわちク
ローン２Ｃ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を
作成した。このｍＡｂは、ＣＴＬクローンの細胞分解活
性を阻止しかつそのＣＴＬ受容体を免疫沈澱させるが、
同様な特異性の他のＣＴＬクローンの対応受容体の活性
を阻止せずまたは沈澱させないことが示された。この知
見を解釈すれば、ｍＡｂはこのＣＴＩ、クローンに対し
独特の受容体の可変領域部分に対し特異的に向けられる
ことを意味する。抗ＣＴＬ受容体ｍＡｂを精製し、かつ
（ｙ　Ｇ１−標識した細胞に共有結合させた。

次いで、これら標識細胞をＣＴＬクローン２Ｃ及び２．
１．１による溶解に対する感受性につき試験した。クロ
ーン２．１．１もＨ−２ｄハプロ型のＤ末端における遺
伝子の生成物に対し特異性であυ、またクローン２Ｃと
同様にそれ自身独特な細胞表面分子を有し、Ｔリン８球
受容体の特徴を備える。

ｍＡｂ　　を結合させた細胞はヒ）Ｔ細胞、リンパ腫細
胞系、ＨＰＢ−ＡＬＬ、並びにりＣ１−／２Ｃ用の天然
標的のＨ−２ハプロ型を欠如するネズミ細胞系、腫ｆａ
ｍ胞系ＥＬ４　（Ｈ−２ｂ）　、ＢＷ　５１４７　（Ｈ
−２ｋ）、Ｒ１，１（Ｈ−２）及びＲ１，Ｅ（クラス１
表面抗原に対し陰性である８１．１の変種りを包含する
。一般にクローン２Ｃ及びクローン２．１．１にょシ溶
解される腫瘍細胞系Ｐ８１５（Ｈ−２ｄ）　　を比較と
して使用した。

クローン２Ｃと２．１．１との両者は、未改変及び改変
の（ｍＡｂ結合した）Ｐ８１５比較細胞を同程度まで溶
解した。Ｈ−２ｄハプロ型を欠如する細胞（ネズミＥＬ
−４及びヒトＨＰＢ−ＡＬＬ細胞）は、これらのクロー
ンにより極く僅かしか溶解されない。しかしながら、ク
ローン２Ｃの受容体に向けられるｍＡｂを結合した後、
ネズミＥＬ−４及びヒトＨＰＢ−ＡＬＬはクローン２Ｃ
により溶解されたが、クローン２．１．１によっては溶
解されなかった。ＥＬ−４及びＢＷ５４１７（Ｈ−２ｋ
）細胞に対するたとえばＬＦＡ−１及び’ｒｈｙ　−１
のような他のＣＴＬ表面分子に向けられるｍＡｂの結合
は、これら細胞をクローン２Ｃによる溶解に対し感受性
にさせなかった。

ヒト細胞系だけでなく検出可能な細胞表面ＭＨＣクラス
１分子をもたない細胞も、ＣＴＬクローン受容体に対す
るｍＡｂを用いてネズミＣＴＬのクローンに対する標的
細胞に変換しうろことが示された。この例において、一
般にクローン２Ｃにより溶解されない２種の細胞系を使
用した。Ｒ１，１は培養されたＣ５８／Ｊリンパ腫（Ｈ
−２ｋ）であシ、その変種Ｒ１，Ｅはβ２−マイクロプ
ロプリンを産生ぜず、細胞表面クラス１分子を欠如して
いる。

ＣＴＬクローン２Ｃ受容体に対し特異性のｍＡｂを結合
した後、Ｒ１，１細胞とＲ１，Ｅ細胞との両者はクロー
ン２Ｃによる溶解に対し感受性となった。

改変及び未改変の８１．１若しくはＲ１，Ｅ細胞の両者
は、比較クローン２．１．１により溶解されなかった０ 上記の例には下記の材料及び方法を使用した。

千ズミ：　ＢＡＬＢ／ｅＡｎＮ（Ｈ−２）及びＢＡＬＢ
−Ｂ（Ｈ−２）ネズミは、マセチューセッツ工科大学の
癌中央研究所で生産した。

腫瘍細胞系：Ｐ８１５（Ｈ−２ｄ）、ＥＩ、　４　（Ｈ
−２ｂ）、ＢＷ５１４７（Ｈ−２ｋ）、Ｒ１，１（Ｈ−
２ｋ）、Ｒ１，Ｅ（クラス１の表面抗原に対し陰性であ
るＲ１．１の変種〕、ＨＰＢ−ＡＬＬ（ヒトＴ細胞リン
パ腫）及びＸ　６　五６５３　（ＢＡＬＢ／ｃ由来の骨
髄腫）は全て１０チの胎児牛血清、１０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ　。

２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位のペニシリン／−
の培養液、１００Ｐｆのストレプトマイシン／ｄ培養液
及び５　Ｘ　１０”−’Ｍの２−メルカプトエタールを
含有するＲＰＭＩ　　１６４０と共に培養物中に維持し
た。

クローン化ＣＴＬ　：アロ反応性のＣＴＬクローン゛２
Ｃ，Ｇ４及び２．１．１はエム・ライ・シトコツスキー
、エム・ニス・パステルナック及ヒエッチ拳エヌーアイ
ゼン、ジャーナル・イミューノロジー、第１２４巻、第
１３７２〜１３７６頁（１９Ｂ２）に記載されたように
ＢＡＬＢ　−Ｂネズミの牌細胞から作成した。これらク
ローンは、照射綜（４０００ランド）処理したＰ８１５
細胞と、コンカナバリンＡ（ベクター・ラバラドリース
社、バーリンガム、カリフォルニア州〕の存在下に４８
時間培養維持したラット牌細胞からの上澄液とによ１）
１週間刺戟して維持した。これら３極のクローンは全て
標的細胞を溶解して、Ｈ−２ｄハブロ型のＤ末端遺伝子
の生成物を発現した。

モノクローナル抗体：クローン２ＣのＴ細胞受容体を識
別するｍＡｂ（Ｉｎ２）は、ディー・エム・フランク、
ティー・エッチ・ジャーマン、エム・ライ−シトコツス
キー、エム・ニス・パステルチック及びエッチ・工遣拳
アイゼンによりプロシーテイング・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８１巻、第５７３〜５７
７頁（１９８４）に記載されたように作成した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　　Ａ　ｎ　Ｎ　ネズミは、り
ａ−ン２Ｃからの１Ｏ−２０Ｘ１０・個の細胞をそれぞ
れ２〜３週間間隔で６回腹腔内注射して免疫化した０最
後に注射してから４日後、ネズミから牌細胞を副出し、
かつ５０チポリエチレングリコールを用いてＸ６１６５
５骨髄腫細胞と融合させた。これら細胞を１０枚の２４
穴プレート（コスタ−・インコーポレーション社〕に分
配し、かつＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
チミン２９選択培地で増殖させた。２〜３週間後、培養
上澄液を、０１％１−放出分析で下記するように、クロ
ーン２ＣによるＰ８１５標的細胞の溶解を阻止する能力
につきスクリーニングし喪。

リンパ球機能関連抗原型１　（４−１６−１）及びクラ
ス１−Ｈ−２ｂ表面抗原（３−１８−８）に対するラッ
トｍ　Ａ　ｂは、前記と同様に〔フランク等、プロシー
ディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳ
Ａ、第８１巻、第５７３〜５７７頁（１９８４））作成
した。エム・サルミエント、ニー・エル・グラセブルツ
ク及びエフ・ダブリュー・ツイツチ、ジャーナル・イミ
ュノロジー、第１２５巻、第２６６５〜１６７２頁（１
９８０）により記載されたり、ｔ−２（！ｉ、１５５．
２　）に対するラットｍＡｂは、フランク・ツイツチ及
びマリアン・サルミエント（シカゴ大学〕からの寄贈物
である。

細胞毒性分析： ＣＴＬ媒介の標的細胞溶解は、ケー・グラブシュタイン
によりビー・ビーｅミツシェル及びニス・エム・シーギ
編のセレクテッド・メソッズ・イン書セルラー・イミュ
ノロジー、第１２４〜１３７頁（サンスランシスコ：フ
リーマン１９８０）に記載されたような標準ｃ、５１−
放出分析にょシ測定した。種々の数のＣＴＬ（培地１０
０　ｐ１中〕を２Ｘ１０４個＋７）Ｃ，＄１−標ｍされ
た標的細胞（１００μを中〕に加え、５７℃にて４時間
培養した。遠心分離によ′り細胞をペレット化させ、上
澄液を放射能につき分析し、そして特異性Ｃ，５１放出
チを１００　Ｘ−＄　（式中、ａはＣＴＬの存在下にお
けるＣＴ８１　　放出であシ、ｂはＣＴＬの不存在下（
１５チ未満つにおける標識標的細胞からのｃｒｓｌの自
然放出であシ、ｔは標的細胞の全Ｃ，５１含有量である
〕から算出した。幾つかの実験においては、ＣＴＬをｍ
Ａｂと共に３０分間予備培養し大径、Ｃ，５１標識標的
細胞を添加し喪。全ての分析は三反復で行なった。

個の生存ＩＢ２ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｅネズ
ミに腹腔内注射して誘導させた腹水液から精製した。リ
ポ蛋白質は、α２５チナトリウムデキストラン硫酸塩に
対する吸着、及び１．５４　ＣａＣ１１による沈澱によ
って除去した。５チ飽和硫酸アンモニウムで沈澱させて
得られたγグロブリンリッチなりラクションを５０ｍＭ
のリン酸カリウム（ｐａａｏ）に対し透析した□ｍＡｂ
ｌＢ２はｒ１重鎖を含有するので（間接的放射免疫結合
分析により測定）、抗体をさらにＤＥＡＥ−セルロース
上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した
。ＤＩＡＩ−セルロースから通過したものは抗体を含有
し、これをリン酸塩緩衝塩水（ｐＨ７、４）　（Ｐ　Ｂ
　Ｓ　）に対し透析したＯｍＡｂＩＢ２を標的細胞に結
合させる幾つかの方法を検査した。効果の最も緩和な方
法においては、ｍＡｂ　　をＱ、１％グルタルアルデヒ
ドにより細胞表面に架橋させた。この方法においては、
ＣＴ１１標識細胞をＲＰＭＩ−１６４０にて２回洗浄し
、α２チグルタルアルデヒドを含有するα２５ｓ７Ｉの
ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁させ、そして０．２５ｄの
ｍＡｂ　　ｌＢ２（ＰＢＳ　　１−当シ２η〕を加えた
０この混合物を氷上で２０分間培養し、かつフィコール
（登録商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルス社〕
上に勾配をつけて層化させた０遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ、１５ｍ１ｎ）の後、中間相（生存〕細胞を集め、１
０チ胎児牛血清（Ｆ’Ｃ８）を含有するＲＰＭＩ−１６
４０にて３回洗浄し、細胞毒性分析に使用した。

抗体は、免疫沈澱分析に使用するため充填ゲル１−当シ
約５岬の量でアフイーゲル１０（登録商標、ビオ−ラド
・ラバラドリース社〕に結合させた０ ＣＴＬ（２〜３Ｘ１０７）をＰＢＳで３回洗浄し、細胞
ペレットに次のものを加えた：　１００　ｐｔのラクト
ペルオキシダーゼ、１ｍＣ１のＮａ１１！ｇ　　にニュ
ー・インク２ンド・ヌクレア社〕及び５０μｔのα０３
チＨ２０，、標識された細胞をＰＢＳで３回洗浄し、か
つα１５ＭのＮａＣ１、α０２チのＮａ　Ｎ３．２５μ
Ｍｏ弗化フェニルメチルスルホニル、１０ｍＭのトリス
−ＨＣＩ（ｐＨ７，２）（抽出用緩衝液）における１−
のＣＬ５％ノニデッ）Ｐ４０で抽出した。

免疫沈澱及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ：α５チ牛血清アルブミ
ンを含有する１１２５−標識した細胞抽出物（約１０’
　ｃｐｍ　）を、５０　ｐＬのｌＢ２−アフイーゲル１
０（登録商標）と共に氷上で５時間培養した。次いで、
ゲルを上記の抽出緩衝液で３回洗浄し、かつ０．１Ｍの
２−メルカプトエタノールの存在下又は存在なしにＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥ試料緩衝液において１００℃で加熱した。

電気泳動を、ＳＤＳを含有する１０％ポリアクリルアミ
ドゲルにおいて、ニー・ケー・レムリネイチャー（ロン
ドン）、ニュー・バイオロー／　＋、第２２７巻、第６
８０〜６８５３ｉｊ（１９７５）の方法にしたがって行
なつ九。ゲルを固定し、乾燥させ、かつデュポン・クロ
ネツクス・ライティング・プラス（登録商標）の強化ス
クリーンを用いてコダックＸ−オマットＸＡＲフィルム
に露出させた。

特定実施例につき本発明を説明したが、多くの改変及び
変更をなしうろことが当業者には了解されよう。これら
の改変及び変更も本発明の範囲内に包含することを意図
する。

【図面の簡単な説明】

第１図は特異性表面受容体を有するＣＴＬとその表面に
結合されたＣＴＬ受容体に向けられた抗体を有する標的
細胞との間の相互作用を示す略図であシ、 第２図は特異性表面受容体を有するＣＴＬと、特異性表
面分子を有する標的細胞と、ＣＴＬ表面上の受容体に対
し特異性の抗体及び標的細胞上の表面分子に対し特異性
の分子よりなる二官能性分子との間の相互作用を示す略
図でｓｂ、第３図は細胞残骸を摂取するスカベンジャー
食細胞（たとえば大食細胞〕による第１図又は第２図の
いずれかに示した相互作用にしたがう標的細胞の溶解を
示す略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞毒性Ｔリンパ球受容体決定因子に特異性の抗体
   を標的細胞に結合して成る細胞毒性Ｔリンパ球により溶
   解を受け得る標的細胞の製造方法。 ２、前記受容体決定因子が細胞毒性Ｔリンパ球受容体の
   一定領域上にある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記決定因子を細胞毒性Ｔリンパ球受容体接合分子
   上に配置する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記受容体接合分子がＴ３である特許請求の範囲第
   ３項記載の方法。 ５、前記抗受容体抗体を該抗体の非抗原結合領域で前記
   標的細胞に結合させる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ６、前記抗受容体抗体を前記標的細胞に該標的細胞の表
   面に特異的に結合する第２の分子によつて結合させる特
   許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記第２分子が前記標的細胞の表面上の抗原に対し
   特異性の第２抗体である特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 ８、前記第２分子が前記標的細胞の表面上の受容体に特
   異的に結合するホルモンである特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 ９、前記第２分子が前記標的細胞の表面上の受容体に特
   異的に結合する炭水化物である特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 １０、更に、前記抗体の補体結合部分を除去することを
   含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、更に、前記抗体の補体結合部分を除去することを
   含む特許請求の範囲第７項記載の方法。 １２、前記抗体をＩ＿ｇＧ＿４、Ｉ＿ｇＡ及びＩ＿ｇＥ
   から成る非補体結合抗体から成る群より選ぶ特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １３、前記抗体をＩ＿ｇＧ＿４、Ｉ＿ｇＡ及びＩ＿ｇＥ
   から成る非補体結合抗体から成る群より選ぶ特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 １４、前記抗受容体抗体を、二官能価の橋かけ剤を用い
   て前記第２分子に結合させる特許請求の範囲第６項記載
   の方法。 １５、前記第２分子が腫瘍抗原、ウイルス性抗原、主組
   織適合抗原、特異性タンパク質受容体、ホルモン受容体
   及び炭水化物から成る群より選ぶ前記標的細胞上の第３
   分子に特異的に結合する特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 １６、溶解を受け得る標的細胞を、Ｔリンパ球受容体決
   定因子に対し特異性の抗体を含む細胞毒性Ｔリンパ球に
   よつて製造する際に使用する試薬。 １７、前記抗受容体抗体を細胞毒性のＴリンパ球受容体
   により共有されるＴリンパ球受容体の一部に向ける特許
   請求の範囲第１６項記載の試薬。 １８、前記抗受容体抗体を細胞毒性Ｔリンパ球受容体接
   合分子の一部に向ける特許請求の範囲第１６項記載の試
   薬。 １９、前記標的細胞の表面に特異的に結合する第２分子
   をさらに含む特許請求の範囲第１６項記載の試薬。 ２０、前記第２分子が前記抗受容体抗体に共有結合され
   ている特許請求の範囲第１９項記載の試薬。 ２１、前記第２分子が抗体、ホルモン及び炭水化物より
   なる群から選択される特許請求の範囲第１９項記載の試
   薬。 ２２、前記第２分子が、腫瘍抗原、ウイルス抗原、特異
   性蛋白質受容体、ホルモン受容体及び炭水化物受容体よ
   りなる群から選択される前記標的細胞の表面における第
   ３分子に特異的に結合する特許請求の範囲第１９項記載
   の試薬。 ２３、大抵の細胞毒性Ｔリンパ球により共有されるＴリ
   ンパ球受容体決定子に向けられる抗体を前記標的細胞に
   結合させ、かつ前記抗受容体抗体に結合した細胞を細胞
   毒性Ｔリンパ球に露出することを特徴とする標的細胞の
   溶解方法。 ２４、前記抗受容体抗体を、前記標的細胞の表面に特異
   的に結合する第２分子によつて前記標的細胞に結合させ
   る特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、前記第２分子を抗体、ホルモン及び炭水化物より
   なる群から選択する特許請求の範囲第２４項記載の方法
   。 ２６、前記受容体抗体をＴ３に向ける特許請求の範囲第
   ２３項記載の方法。 ２７、分子を細胞毒性Ｔリンパ球に結合させ、前記分子
   は大抵の細胞特性Ｔリンパ球により共有されるＴリンパ
   球受容体決定子に向けられた第１抗体と、標的細胞の表
   面（細胞毒性Ｔリンパ球）に対し特異的に結合する第２
   分子とからなり、前記抗体結合したリンパ球を標的細胞
   に露出する ことを特徴とする標的細胞の溶解方法。 ２８、前記第１抗体をＴ３に向ける特許請求の範囲第２
   ７項記載の方法。 ２９、前記第２分子を抗体、ホルモン及び炭水化物より
   なる群から選択する特許請求の範囲第２７項記載の方法
   。 ３０、前記ホルモンが成長因子である特許請求の範囲第
   ２５項記載の方法。 ３１、前記ホルモンが成長因子である特許請求の範囲第
   ２９項記載の方法。