JPS61199782A - フアネロカエテ・クリソスポリウム株およびその用途 - Google Patents
フアネロカエテ・クリソスポリウム株およびその用途Info
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- JPS61199782A JPS61199782A JP60278868A JP27886885A JPS61199782A JP S61199782 A JPS61199782 A JP S61199782A JP 60278868 A JP60278868 A JP 60278868A JP 27886885 A JP27886885 A JP 27886885A JP S61199782 A JPS61199782 A JP S61199782A
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規な微生物であるファネロカエテ・クリソス
ポリウム ブルドサル （Ｐｈａｎｅｒｏｅｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｌｕａ＋ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株およびリグニン分解酵
素の生産のためのその用途に関する。
ポリウム ブルドサル （Ｐｈａｎｅｒｏｅｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｌｕａ＋ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株およびリグニン分解酵
素の生産のためのその用途に関する。
リグニンの生物分解（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）
は、地球の炭素循環（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ｃａｒ
ｂｏｎ ｃｙｃｌｅ）において本質的な役割を演じてい
る。
は、地球の炭素循環（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ｃａｒ
ｂｏｎ ｃｙｃｌｅ）において本質的な役割を演じてい
る。
リグニンはセルロースについで、再生することができ（
ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ’ ｒｅｎｅｗｉｎｇ １ｔｓ
ｅｌｆ）最も多量に存在する有機材料を代表する。この
化合物はまた外殻を形成する（ｂｅｃｏｍｅ １ｎｃｒ
ｕｓｔｅｄ）ことができ、それが分解するまで、分解細
菌が木質植物の組織のセルロースおよびヘミセルロース
に近づくのを防ぐことができる。
ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ’ ｒｅｎｅｗｉｎｇ １ｔｓ
ｅｌｆ）最も多量に存在する有機材料を代表する。この
化合物はまた外殻を形成する（ｂｅｃｏｍｅ １ｎｃｒ
ｕｓｔｅｄ）ことができ、それが分解するまで、分解細
菌が木質植物の組織のセルロースおよびヘミセルロース
に近づくのを防ぐことができる。
木材の白腐れをひきおこす担子菌類は、リグニンを含む
、植物細胞壁のすべての成分を分解することができる。
、植物細胞壁のすべての成分を分解することができる。
このフェノール性ポリマーの分解は、ファネロカエテ・
クリソスポリウム菌類について特に詳しく研究されてい
る。
クリソスポリウム菌類について特に詳しく研究されてい
る。
問題の木材の白腐れをひきおこす叙上の菌類および他の
種は、したがって木材および紙の技術およびリグノセル
ロース廃棄物からの化学物質の生産のような種々の分野
に応用することがせできる。
種は、したがって木材および紙の技術およびリグノセル
ロース廃棄物からの化学物質の生産のような種々の分野
に応用することがせできる。
それにもかかわらず、もし一層大きな分解能を有する菌
株を選択する方法が利用できれば、叙上の応用の可能性
の範囲は広げることができるであろう。
株を選択する方法が利用できれば、叙上の応用の可能性
の範囲は広げることができるであろう。
本発明は叙上の問題点を解決するためになされたもので
ある。ファネロカエテ・クリソスポリウム菌類によるリ
グニンの分解における栄養調節についての挿々の研究に
よって、培地中のチッ素の不足とリグニン分解活性の出
現とのあいだに明らかな関係の存在することが見出され
た。
ある。ファネロカエテ・クリソスポリウム菌類によるリ
グニンの分解における栄養調節についての挿々の研究に
よって、培地中のチッ素の不足とリグニン分解活性の出
現とのあいだに明らかな関係の存在することが見出され
た。
たとえばファネロ力エテφクリソスポリウムＭＥ−４４
６（ＡＴＣＣ３４５４１）は、チッ素が栄養的に不足し
ているときには活性な成長期のあいだにではなく静止期
のあいだにリグニンを分解する。したがって、この菌類
によるリグニンの分解は二次代謝の特徴をあられしてお
り、チッ素はこのリグニン分解活性を確立し維持するこ
とに影響する。
６（ＡＴＣＣ３４５４１）は、チッ素が栄養的に不足し
ているときには活性な成長期のあいだにではなく静止期
のあいだにリグニンを分解する。したがって、この菌類
によるリグニンの分解は二次代謝の特徴をあられしてお
り、チッ素はこのリグニン分解活性を確立し維持するこ
とに影響する。
また「ジャーナル オブ バクテリオロジ−（Ｊ、ｏｆ
’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ．９７８年９月、
７９０〜７９７頁」において、ケイサー（Ｋｅｙｓｅｔ
）らは培地のチッ素が不足しているときにのみファネロ
カエテ・クリソスポリウムによるリグニンの分解が顕著
な程度までおころを示している。
’ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ） ．９７８年９月、
７９０〜７９７頁」において、ケイサー（Ｋｅｙｓｅｔ
）らは培地のチッ素が不足しているときにのみファネロ
カエテ・クリソスポリウムによるリグニンの分解が顕著
な程度までおころを示している。
チッ素によるリグニン分解系の抑制の強度は、選んだチ
ッ素源にしたがって変化する。グルタミン酸はリグニン
分解に対して強力な抑制作用を示し、グルタミンといっ
しょになってリグニン分解活性の調節において優先的な
役割を果たしているように思われる（フェン（Ｐｅｎｎ
）らの「アーチーブス オブ ミクロバイオロジー（Ａ
ｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、）、 １３０巻、５９
〜８５頁（１９８１年）」参照）。
ッ素源にしたがって変化する。グルタミン酸はリグニン
分解に対して強力な抑制作用を示し、グルタミンといっ
しょになってリグニン分解活性の調節において優先的な
役割を果たしているように思われる（フェン（Ｐｅｎｎ
）らの「アーチーブス オブ ミクロバイオロジー（Ａ
ｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、）、 １３０巻、５９
〜８５頁（１９８１年）」参照）。
他の微生物では、種々の栄養素の不足の影響のもとて二
次代謝が活性化される。ファネロ力エテ・クリソスポリ
ウムのばあいは、リグニン分解系は炭水化物の影響およ
び培地中のイオウの不足のもとで刺激されうるが、チッ
素の不足のみが実質的なリグニン分解をうるために必要
であると考えられている（シェフリーズ（Ｊｅｆｒｌｅ
ｓ）らの「アプライド アンド エンバイアロンメンタ
ル ミクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ
）、１９８１年８月、２９０〜２９６頁」参照）。
次代謝が活性化される。ファネロ力エテ・クリソスポリ
ウムのばあいは、リグニン分解系は炭水化物の影響およ
び培地中のイオウの不足のもとで刺激されうるが、チッ
素の不足のみが実質的なリグニン分解をうるために必要
であると考えられている（シェフリーズ（Ｊｅｆｒｌｅ
ｓ）らの「アプライド アンド エンバイアロンメンタ
ル ミクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ
）、１９８１年８月、２９０〜２９６頁」参照）。
「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２Ｌ ６８１〜
６６３頁、（１９８３年）」において、メンタ・ティー
ン（Ｍｌｎｇ Ｔｉｅｎ）およびティー・ケント・カー
ク（Ｔ、Ｋｅｎｔ Ｋｉｒｋ）はフ７ネロヵエテ・クリ
ソスポリウムによって産生された細胞外酵素の発見を報
告しており、この酵素は過酸化水素の存在下で、モミま
たはカンパがらのリグニンの分解のみならず、リグニン
のサブ構造（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する異な
るモデル化合物の酸化的分解をもひきおこしうる。
６６３頁、（１９８３年）」において、メンタ・ティー
ン（Ｍｌｎｇ Ｔｉｅｎ）およびティー・ケント・カー
ク（Ｔ、Ｋｅｎｔ Ｋｉｒｋ）はフ７ネロヵエテ・クリ
ソスポリウムによって産生された細胞外酵素の発見を報
告しており、この酵素は過酸化水素の存在下で、モミま
たはカンパがらのリグニンの分解のみならず、リグニン
のサブ構造（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する異な
るモデル化合物の酸化的分解をもひきおこしうる。
ファネロカエテ・クリソスポリウムＢＫＭ−１７６７（
ＡＴＣＣ２４７２５）もしくはファネロカエテ・クリソ
スポＩＪ ラムＭＥ−４４８（ＡＴＣＣ３４５４１）１
．１ｍよッテ産生された叙上の酵素は、質量が約４２０
００ドルトンで１分子あたり１個のプロトヘム■を含有
する糖タンパクとして「プロシーディンゲス オブザ
ナヨナル アカデミ−オブ サイエンスイズ オブ ザ
ユナイテッド スティツ ォブ アメリカ（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ｔｌ、Ｓ、Ａ、）、８
１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９８４年）Ｊに記載
されている。立体非特異的な仕方で、該酵素はリグニン
型の分子モデル（モノマーまたはダイマー）または高分
子リグニンのアルキル側鎖の種々の酸化、すなわちアリ
ール−〇 −１１０１１−ＣβＩＩＲ−α Ｃｒ ８２０ （式中、Ｒはアリール基または０−アリ
ール基をあられす）の型の化合物におけるＣα −Ｃβ
開裂、ベンジルアルコールのアルデヒドもしくはケトン
への酸化、フェニルグリコール構造のジオール・内開裂
、およびベンジル基のメチレン基のヒドロキシル化を触
媒する。該酵素はまたフェノールの酸化的カップリング
をも触媒し、このことはおそらく、フェノール酸化とリ
グニン分解とのあいだの古くから知られている関係を説
明している。
ＡＴＣＣ２４７２５）もしくはファネロカエテ・クリソ
スポＩＪ ラムＭＥ−４４８（ＡＴＣＣ３４５４１）１
．１ｍよッテ産生された叙上の酵素は、質量が約４２０
００ドルトンで１分子あたり１個のプロトヘム■を含有
する糖タンパクとして「プロシーディンゲス オブザ
ナヨナル アカデミ−オブ サイエンスイズ オブ ザ
ユナイテッド スティツ ォブ アメリカ（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ｔｌ、Ｓ、Ａ、）、８
１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９８４年）Ｊに記載
されている。立体非特異的な仕方で、該酵素はリグニン
型の分子モデル（モノマーまたはダイマー）または高分
子リグニンのアルキル側鎖の種々の酸化、すなわちアリ
ール−〇 −１１０１１−ＣβＩＩＲ−α Ｃｒ ８２０ （式中、Ｒはアリール基または０−アリ
ール基をあられす）の型の化合物におけるＣα −Ｃβ
開裂、ベンジルアルコールのアルデヒドもしくはケトン
への酸化、フェニルグリコール構造のジオール・内開裂
、およびベンジル基のメチレン基のヒドロキシル化を触
媒する。該酵素はまたフェノールの酸化的カップリング
をも触媒し、このことはおそらく、フェノール酸化とリ
グニン分解とのあいだの古くから知られている関係を説
明している。
これらのすべての反応は、進行させるために過酸化水素
の存在することが必要である。
の存在することが必要である。
この酵素は、その活性が過酸化水素なしでは発揮されな
いという事実によって独特の酸素添加酵素を構成してい
る。
いという事実によって独特の酸素添加酵素を構成してい
る。
便利のために、このように記載された酵素を以下「リグ
ニン分解酵素」と呼ぶことにする。
ニン分解酵素」と呼ぶことにする。
該酵素の産生条件の調節はいまだ充分ではなく、リグニ
ンの生物分解プロセスの遅さが、最近になって試みられ
ている応用、すなわち反すう動物に対して農業もしくは
林業副産物の消化性を改善するための該副産物の酵素的
もしくは微生物による脱リグニン化、セルロースの酵素
的加水分解、または嫌気的発酵のような応用において制
限的な因子となっている。
ンの生物分解プロセスの遅さが、最近になって試みられ
ている応用、すなわち反すう動物に対して農業もしくは
林業副産物の消化性を改善するための該副産物の酵素的
もしくは微生物による脱リグニン化、セルロースの酵素
的加水分解、または嫌気的発酵のような応用において制
限的な因子となっている。
したがって、リグニン分解系を防害しうるファネロカエ
テ命クリソスポリウムの高活性なリグニン分解株をうろ
ことは将来の産業的応用にとって著しい財産となるであ
ろう。
テ命クリソスポリウムの高活性なリグニン分解株をうろ
ことは将来の産業的応用にとって著しい財産となるであ
ろう。
今や驚くべきことに、制限されないチッ素含量の培地中
において本発明のファネロカエテ・クリソスポリウム株
が、知られたファネロヵエテ・クリソスポリウム株より
もはるかにすぐれたリグニン分解活性を発現しうろこと
が見出され、それゆえ操作条件が従来技術によって要求
されるものよりも有利になる。
において本発明のファネロカエテ・クリソスポリウム株
が、知られたファネロヵエテ・クリソスポリウム株より
もはるかにすぐれたリグニン分解活性を発現しうろこと
が見出され、それゆえ操作条件が従来技術によって要求
されるものよりも有利になる。
本発明はまず、ファネロカエテ・クリソスポリウム ブ
ルドサル種の新規な２種の微生物に関する。
ルドサル種の新規な２種の微生物に関する。
本発明はまた、リグニン分解酵素を生産するための本発
明による新規なファネロカエテ・クリソスポリウム微生
物の用途に関する。
明による新規なファネロカエテ・クリソスポリウム微生
物の用途に関する。
本発明による微生物は、コレクシオン ナシオナル ド
クルトウール ド ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ ｄｅ旧ｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｅｓ）（Ｃ，Ｎ、
Ｃ，Ｍ、）内のパスツール研究所（ｌｎｓｔｊｔｕｔ
Ｐａ５ｔｅｕｒ） （パリ）にそれぞれ、 ｌ−３９８
およびｌ−３９９の寄託番号で寄託されている。
クルトウール ド ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ ｄｅ旧ｃｒｏｏｒｇａｎｌｓｍｅｓ）（Ｃ，Ｎ、
Ｃ，Ｍ、）内のパスツール研究所（ｌｎｓｔｊｔｕｔ
Ｐａ５ｔｅｕｒ） （パリ）にそれぞれ、 ｌ−３９８
およびｌ−３９９の寄託番号で寄託されている。
本発明はさらに、リグニン分解酵素を含有する培養上澄
み液（ｃｕｌｔｕｒｅ ５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の製
造方法に関し、該方法は、資化しうるチッ素源が不足し
ておらず資化しうる炭素源および資化しうる無機塩を含
有する栄養培地中で本発明の新規なファネロカエテ・ク
リソスポリウム微生物を培養することからなる。
み液（ｃｕｌｔｕｒｅ ５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の製
造方法に関し、該方法は、資化しうるチッ素源が不足し
ておらず資化しうる炭素源および資化しうる無機塩を含
有する栄養培地中で本発明の新規なファネロカエテ・ク
リソスポリウム微生物を培養することからなる。
本発明はまたリグニン分解酵素の製造方法に関し、該方
法は、資化しうるチッ素源が不足しておらず資化しつる
炭素源および資化しうる無機塩を含有する栄養培地中で
本発明の新規なファネロカエテ・クリソスポリウム微生
物を培養してリグニン分解酵素を含をする培養上澄み液
をえ、つぎにたとえば遠心分離、透析またはクロマトグ
ラフィー技術によって該酵素を単離することからなる。
法は、資化しうるチッ素源が不足しておらず資化しつる
炭素源および資化しうる無機塩を含有する栄養培地中で
本発明の新規なファネロカエテ・クリソスポリウム微生
物を培養してリグニン分解酵素を含をする培養上澄み液
をえ、つぎにたとえば遠心分離、透析またはクロマトグ
ラフィー技術によって該酵素を単離することからなる。
該リグニン分解酵素を含有する上澄み液の製造方法の実
施態様によれば、該微生物の分生子の懸濁液とともに少
量の培地を接種することによって植物接種材料が調製さ
れる。
施態様によれば、該微生物の分生子の懸濁液とともに少
量の培地を接種することによって植物接種材料が調製さ
れる。
微生物はつぎに好気的生活の条件下もしくは好ましくは
酸素存在下、２８℃〜４０℃、好ましくは３７℃におい
てチッ素源、炭素源および無機塩を含有する種々の栄養
培地上で培養される。
酸素存在下、２８℃〜４０℃、好ましくは３７℃におい
てチッ素源、炭素源および無機塩を含有する種々の栄養
培地上で培養される。
微生物を接種する前に培地のｐｌｉを４．５〜５に調節
するのが望ましい。この調節は、アルカリ金属水酸化物
たとえば水酸化カリウムで調節された２、２−ジメチル
コハク酸ナトリウムを用いることによって行なわれる。
するのが望ましい。この調節は、アルカリ金属水酸化物
たとえば水酸化カリウムで調節された２、２−ジメチル
コハク酸ナトリウムを用いることによって行なわれる。
一般に、培養開始３日目〜８日目（５日目または６日目
が最高）に上澄み液中にリグニン分解酵素の著しい産生
がみられる。
が最高）に上澄み液中にリグニン分解酵素の著しい産生
がみられる。
資化しうる炭素源の例としては、グルコース、マンノー
ス、デンプン、メリビオース、マンニトール、キシロー
ス、マルトース、アドニトール、アラビトール、フルク
トース、ソルビトール、ラフィノース、キシリトール、
Ｄ（＋）−トレハロースおよびグリセロールがあげられ
る。
ス、デンプン、メリビオース、マンニトール、キシロー
ス、マルトース、アドニトール、アラビトール、フルク
トース、ソルビトール、ラフィノース、キシリトール、
Ｄ（＋）−トレハロースおよびグリセロールがあげられ
る。
資化しつるチッ素源の例としては、アスパラギン、硝酸
アンモニウムおよび酒石酸アンモニウムがあげられる。
アンモニウムおよび酒石酸アンモニウムがあげられる。
無機塩の例としては、クエン酸鉄、ＫＨ２ＰＯ４、Ｚｎ
ＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＮａＣ
ｊ。
ＳＯ４、ＭｎＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＮａＣ
ｊ。
Ｐｅ５ｏ４、Ｃ０ＣＯ４、ＺｎＳＯ４、ＡｊｌＫ（ＳＯ
ａ＞２．８３ＢＯ３、Ｎａｚ ＭｏＯ４およびＭｇ５Ｏ
ｉがあげられる。
ａ＞２．８３ＢＯ３、Ｎａｚ ＭｏＯ４およびＭｇ５Ｏ
ｉがあげられる。
グリセロールは、本発明による好ましい炭素源である。
事実、チッ素の不足していない培地中でのこの栄萎源は
非常に高濃度のリグニナーゼ（ｌｉｇｎｉｎａｓｅ）ま
たは同等のリグニン分解活性をうろことを可能にする。
非常に高濃度のリグニナーゼ（ｌｉｇｎｉｎａｓｅ）ま
たは同等のリグニン分解活性をうろことを可能にする。
ファネロカエテ・クリソスポリウムＢＫＭ−１７８７（
ＡＴＣＣ２４７２５）およびＭＥ−４４６（ＡＴＣＣ３
４５４１）株では叙上の条件のもとではリグニン分解酵
素を産生じない。
ＡＴＣＣ２４７２５）およびＭＥ−４４６（ＡＴＣＣ３
４５４１）株では叙上の条件のもとではリグニン分解酵
素を産生じない。
すでに記載したように、チッ素源が不足し培地中に炭素
が存在することが、これまで調べられたフ７ネロカエテ
・クリソスポリウムのすべての株において顕著なリグニ
ン分解活性を現出するために必要な条件である。
が存在することが、これまで調べられたフ７ネロカエテ
・クリソスポリウムのすべての株において顕著なリグニ
ン分解活性を現出するために必要な条件である。
それゆえ、チッ素またはグリセロールの不足していない
培地中での本発明による微生物の培養は、該リグニン分
解活性を連続的な方法でうろことを可能にする。そのよ
うな連続的な方法は、ファネロカエテ・クリソスポリウ
ムの知られた株では思い描くことができない。というの
もそれらの株ではチッ素が不足するように培地をたえず
調節する必要があるからである。
培地中での本発明による微生物の培養は、該リグニン分
解活性を連続的な方法でうろことを可能にする。そのよ
うな連続的な方法は、ファネロカエテ・クリソスポリウ
ムの知られた株では思い描くことができない。というの
もそれらの株ではチッ素が不足するように培地をたえず
調節する必要があるからである。
本発明の微生物の培地の上澄み液中に含まれるリグニン
分解酵素は、とりわけ遠心分離、透析、またはクロマト
グラフィー、たとえばアガロースゲルカラム上のクロマ
トグラフィーによって単離することができる。
分解酵素は、とりわけ遠心分離、透析、またはクロマト
グラフィー、たとえばアガロースゲルカラム上のクロマ
トグラフィーによって単離することができる。
このようにしてえられた酵素は、つぎに凍結乾燥したの
ち貯蔵される。
ち貯蔵される。
酵素すなわちリグニナーゼの活性、リグニン分解活性、
および菌糸の増殖もしくは酵素活性への炭素およびチッ
素源のような種々のパラメーターを調べるために、本発
明の新規な微生物の培地を調製した。
および菌糸の増殖もしくは酵素活性への炭素およびチッ
素源のような種々のパラメーターを調べるために、本発
明の新規な微生物の培地を調製した。
（１）菌糸の増殖試験
本明細書で後述する実施例に記載の一般的な手順を用い
、栄養培地中の炭素源の性質およびチッ素含量（アスパ
ラギン／ Ｎ１１４ ＮＯ３）を変化させた。直径２
、５ ｍ＋ａのガラス繊維フィルターで単離し乾燥した
のち菌糸の乾燥重量を測定した。
、栄養培地中の炭素源の性質およびチッ素含量（アスパ
ラギン／ Ｎ１１４ ＮＯ３）を変化させた。直径２
、５ ｍ＋ａのガラス繊維フィルターで単離し乾燥した
のち菌糸の乾燥重量を測定した。
ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。
−１−３９８でえられた結果を第１図、第２図、第３図
および第４図に示した。
および第４図に示した。
第１図は、炭素源としてのグルコースの存在下、培地中
のチッ素の不足（チッ素含量＝２．６ｍＭ）が菌糸の増
殖におよぼす影響を示す。
のチッ素の不足（チッ素含量＝２．６ｍＭ）が菌糸の増
殖におよぼす影響を示す。
第２図は、炭素源としてのグルコースの存在下、培地中
の高チッ素含ｆｎ（２６ｍＭ）が菌糸の増殖におよぼす
影響を示す。
の高チッ素含ｆｎ（２６ｍＭ）が菌糸の増殖におよぼす
影響を示す。
第３図は、炭素源としてのデンプンの存在下、培地中の
高チッ素含ｆｆｉ（２６ｍＭ）が菌糸の増殖におよぼす
影響を示す。
高チッ素含ｆｆｉ（２６ｍＭ）が菌糸の増殖におよぼす
影響を示す。
第４図は、炭素源としてのグリセロールの存在下、培地
中の高チッ素含ｆｆｉ（２０ｍＭ）が菌糸の増殖におよ
ぼす影響を示す。
中の高チッ素含ｆｆｉ（２０ｍＭ）が菌糸の増殖におよ
ぼす影響を示す。
結果からとくに、グリセロールがファネロカエテ・クリ
ソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖にと
って比較的好ましくない炭素源であるように思われる。
ソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖にと
って比較的好ましくない炭素源であるように思われる。
炭素源としてグルコースを用いたときは、培地のチッ素
含量が限られていようがいまいが、菌糸の増殖は目立っ
てよくなる。
含量が限られていようがいまいが、菌糸の増殖は目立っ
てよくなる。
比較のために、炭素源としてグリセロールを有し高チッ
素含量（２８ｎＭ）の培地（培地の初期ｐｌは４．５）
中でファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、−１−３９８と知られた株すなわちファネロカエテ・
クリソスポリウムＢＫＭ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２
５）の増殖を調べた。結果を第１表に示す。
素含量（２８ｎＭ）の培地（培地の初期ｐｌは４．５）
中でファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、−１−３９８と知られた株すなわちファネロカエテ・
クリソスポリウムＢＫＭ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２
５）の増殖を調べた。結果を第１表に示す。
これらの結果は、実験的条件において、知られらた菌株
の増殖の方が本発明のファネロカエテ・クリソスポリウ
ムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖よりもはるかに
大きいことを示している。
の増殖の方が本発明のファネロカエテ・クリソスポリウ
ムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖よりもはるかに
大きいことを示している。
つぎの実験から酸素化の条件はファネロカエテ・クリソ
スポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖に影響
をおよぼさないことが見出された。炭素源としてグリセ
ロールを含有し高チッ素含量で特徴づけられる培地から
えられた結果を第２表に示す。
スポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の増殖に影響
をおよぼさないことが見出された。炭素源としてグリセ
ロールを含有し高チッ素含量で特徴づけられる培地から
えられた結果を第２表に示す。
これらの実験において、ファネロヵエテ・クリソスポリ
ウムＢＫＭ−１７８７（ＡＴＣＣ２４７２５）株は、培
養開始５日以後に胞子形成を示すこともまた認められた
。この胞子形成は６日以後に激しく ｊなった。
ウムＢＫＭ−１７８７（ＡＴＣＣ２４７２５）株は、培
養開始５日以後に胞子形成を示すこともまた認められた
。この胞子形成は６日以後に激しく ｊなった。
ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。
−Ｉ−３９８のばあいには、菌糸の疎水濃度（ｈｙｄｒ
ｏｐｈｏｂｉａ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および激し
い胞子形成が観察された。
ｏｐｈｏｂｉａ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）および激し
い胞子形成が観察された。
しかしながら、フ７ネロヵエテ・クリソスポリウムＣ，
Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９９のばあいには胞子形成は認め
られなかった。
Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９９のばあいには胞子形成は認め
られなかった。
（２リグニナーゼ活性試験
：Ａ、リグニン分解酵素の基質 後述する実施例に記載のようにしてえられた培養上澄み
液のりグニナーゼ活性を、「ブロワ １−ディンゲ
ス オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエン
スイズ オブ ザ ユナイテッド ステイッ オブ ア
メリカ、８１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９８４年
）」に記載された方法；こしたがい、８５℃でのベラト
リルアルコール（３，４−ジメトキシベンジルアルコー
ル）のベラトルムアルデヒドへの酸化による ３１０ｎ
ｍでの吸又の増加を測定することによって決定した。こ
乃ことは、過酸化水素を０．２７１Ｍの濃度で用いセほ
かは叙上の文献中のものと同じ反応混合物を用いて行な
った。
：Ａ、リグニン分解酵素の基質 後述する実施例に記載のようにしてえられた培養上澄み
液のりグニナーゼ活性を、「ブロワ １−ディンゲ
ス オブ ザ ナショナル アカデミ−オブ サイエン
スイズ オブ ザ ユナイテッド ステイッ オブ ア
メリカ、８１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９８４年
）」に記載された方法；こしたがい、８５℃でのベラト
リルアルコール（３，４−ジメトキシベンジルアルコー
ル）のベラトルムアルデヒドへの酸化による ３１０ｎ
ｍでの吸又の増加を測定することによって決定した。こ
乃ことは、過酸化水素を０．２７１Ｍの濃度で用いセほ
かは叙上の文献中のものと同じ反応混合物を用いて行な
った。
酵素の活性は単位で定義づけ．単位は実験的条件下での
１ ｎＩＩｏｌ／分のベラトルムアルデヒドの生成に対
応した。
１ ｎＩＩｏｌ／分のベラトルムアルデヒドの生成に対
応した。
ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ。
−１−３９８でえられた結果を第５図、第６図、第７図
および第８図に示す。
および第８図に示す。
第５図は、炭素源としてのグリコースの存在下、培地中
のチッ素の不足（チッ素含ｍ：２．６ａＭ）がリグニナ
ーゼ活性におよぼす影響を示す。
のチッ素の不足（チッ素含ｍ：２．６ａＭ）がリグニナ
ーゼ活性におよぼす影響を示す。
第６図は、炭素源としてのグリコースの存在下、培地中
の高チッ素含：Ｉ （２６ｍＭ）がリグニナーゼ活性に
およぼす影響を示す。
の高チッ素含：Ｉ （２６ｍＭ）がリグニナーゼ活性に
およぼす影響を示す。
第７図は、炭素源としてのデンプンの存在下、培地中の
高チッ素含ｍ （２８ｍＭ）がリグニナーゼ活性におよ
ぼす影響を示す。
高チッ素含ｍ （２８ｍＭ）がリグニナーゼ活性におよ
ぼす影響を示す。
第８図は、炭素源としてのグリセロールの存在下、培地
中の高チッ素含ｆｆｉ（２６ｍＭ）がリグニナーゼ活性
におよぼす影響を示す。
中の高チッ素含ｆｆｉ（２６ｍＭ）がリグニナーゼ活性
におよぼす影響を示す。
第５図は、ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、
Ｃ，Ｍ、−１−３９８を技術の状態の条件、すなわちチ
ッ素が不足しており炭素源としてグルコースを含有する
培地中で培養すると、培養開始３日以後にリグニナーゼ
活性が培養上澄み液中にあられれることを示している。
Ｃ，Ｍ、−１−３９８を技術の状態の条件、すなわちチ
ッ素が不足しており炭素源としてグルコースを含有する
培地中で培養すると、培養開始３日以後にリグニナーゼ
活性が培養上澄み液中にあられれることを示している。
しかしながら、この活性の最大値は培養開始５日後に５
０単位のオーダーであって低く、知られた株、すなわち
ファネロカエテ・クリソスポリウムＭＥ−４４８（ＡＴ
ＣＣ３４５４１）の比較培養で検出されるｌＯ〜２０単
位という酵素活性に匹敵するものである。
０単位のオーダーであって低く、知られた株、すなわち
ファネロカエテ・クリソスポリウムＭＥ−４４８（ＡＴ
ＣＣ３４５４１）の比較培養で検出されるｌＯ〜２０単
位という酵素活性に匹敵するものである。
一方、第６図および第７図は、高チッ素含量（２８ａ＋
Ｍ）で炭素源として可溶性デンプンを有する培地からリ
グニナーゼ活性が容易に検出しうることを示している。
Ｍ）で炭素源として可溶性デンプンを有する培地からリ
グニナーゼ活性が容易に検出しうることを示している。
高チッ素含量で炭素源としてグリコースまたはデンプン
を含有する培地においては、菌糸の増殖のピークが過ぎ
た培養開始４日以後もなお該活性が顕著である。
を含有する培地においては、菌糸の増殖のピークが過ぎ
た培養開始４日以後もなお該活性が顕著である。
高チッ素含量で炭素源としてグリセロールを含有する培
地においては、酵素の産生は非常に大きく増加している
ことがわかる。該活性は接種２日後および３日後のあい
だにあられれ、５日以後にはしばしば３５０単位をこえ
ている。
地においては、酵素の産生は非常に大きく増加している
ことがわかる。該活性は接種２日後および３日後のあい
だにあられれ、５日以後にはしばしば３５０単位をこえ
ている。
グリセロールが炭素源であるときに観察される高い酵素
活性は、グルコースに比べてグリセロール上ではファネ
ロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３
９８の増殖速度が小さいことと関係があるように思われ
る。
活性は、グルコースに比べてグリセロール上ではファネ
ロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３
９８の増殖速度が小さいことと関係があるように思われ
る。
比較のために、高チッ素含ｆｉｔ （２ＢＩＩＩＭ）を
有しグリセロールを含有する培地でのファネロ力エテΦ
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８および
知られた株であるファネロカエテ・クリソスポリウムＢ
ＫＭ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）のそれぞれの培
養からえられＬリグニナーゼ活性を決定した。結果を第
３表に示す。
有しグリセロールを含有する培地でのファネロ力エテΦ
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８および
知られた株であるファネロカエテ・クリソスポリウムＢ
ＫＭ−１７６７（ＡＴＣＣ２４７２５）のそれぞれの培
養からえられＬリグニナーゼ活性を決定した。結果を第
３表に示す。
［以下余白］
これらの結果もまた、知られた株のファネロカエテ・ク
リソスポリウムと対比して培地のチッ素含量が大きいば
あいにはファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ
，Ｍ、−１−３９８によってリグニナーゼ活性が産生さ
れることを証明している。
リソスポリウムと対比して培地のチッ素含量が大きいば
あいにはファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ
，Ｍ、−１−３９８によってリグニナーゼ活性が産生さ
れることを証明している。
同じ条件、すなわちチッ素の不足していないグリセロー
ル培地中で行なわれた補助実験では、ファネロ・カエテ
・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８およ
びフ７ネロカエテー・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、−１−３９９の培養によって、４９０．７± ４．５
単位および８４１．８±６１．６単位のりグニナーゼ活
性がそれぞれ示された。
ル培地中で行なわれた補助実験では、ファネロ・カエテ
・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８およ
びフ７ネロカエテー・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ
、−１−３９９の培養によって、４９０．７± ４．５
単位および８４１．８±６１．６単位のりグニナーゼ活
性がそれぞれ示された。
Ｂ、リグニンのモデル化合物
後述する実施例に記載のようにしてえられた培養上澄み
液の酸素活性を決定した。
液の酸素活性を決定した。
このことは、非放射性β−■（ジアリールプロパン）ダ
イマーのために「ブロシーデインダスオブ ザ ナショ
ナル アカデミ−オブ サイエンスイズ オブ ザ ユ
ナイテッド ステイツ オブ アメリカ、８１巻、２２
８０〜２２８４頁、（１９８４年）」に記載された方法
にしたがい、過酸化水素に依存してＬ−（３，４，５−
トリメトキシフェニル）−２−（２，８−ジメトキシ−
４−ヒドロキシメチルフェニル）プロパン−１，３−ジ
オールの酸化的分解による３、４．５−トリメトキシベ
ンズアルデヒドの生成を３５℃においてＪｌｌｊ定する
ことによって行なった。
イマーのために「ブロシーデインダスオブ ザ ナショ
ナル アカデミ−オブ サイエンスイズ オブ ザ ユ
ナイテッド ステイツ オブ アメリカ、８１巻、２２
８０〜２２８４頁、（１９８４年）」に記載された方法
にしたがい、過酸化水素に依存してＬ−（３，４，５−
トリメトキシフェニル）−２−（２，８−ジメトキシ−
４−ヒドロキシメチルフェニル）プロパン−１，３−ジ
オールの酸化的分解による３、４．５−トリメトキシベ
ンズアルデヒドの生成を３５℃においてＪｌｌｊ定する
ことによって行なった。
同じようにして、β−０−４エーテルダイマー（アリー
ルグリセロール−アリールエーテル）のために「プロシ
ーディンゲス オブ ザ ナショナルアカデミ−オブ
サイエンスイズオブ ザ ユナイテッド ステイッ オ
ブ アメリカ、８１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９
８４年）」に記載された方法にしたがい、過酸化水素に
依存して１−（３，４−ジメトキシフェニ少）−２−（
２−メトキシフェノキシ）−プロパン−１，３−ジオー
ルの酸化的分解によるベラトルムアルデヒドの生成を３
５℃において測定した。
ルグリセロール−アリールエーテル）のために「プロシ
ーディンゲス オブ ザ ナショナルアカデミ−オブ
サイエンスイズオブ ザ ユナイテッド ステイッ オ
ブ アメリカ、８１巻、２２８０〜２２８４頁、（１９
８４年）」に記載された方法にしたがい、過酸化水素に
依存して１−（３，４−ジメトキシフェニ少）−２−（
２−メトキシフェノキシ）−プロパン−１，３−ジオー
ルの酸化的分解によるベラトルムアルデヒドの生成を３
５℃において測定した。
これらの実験の結果によって、用いられたモデル化合物
におけるＣα−Ｃβ結合の開裂によって示される高レベ
ルのりグニナーゼ活性が明らかになった。
におけるＣα−Ｃβ結合の開裂によって示される高レベ
ルのりグニナーゼ活性が明らかになった。
炭素源としてグリコースを含有するファネロカエテ・ク
リソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地に
対して酸素分圧が重要な影響をおよぼすことを示すこと
も可能であっが、グリセロールを含有する培地に対して
は該影響は一層小さかった。
リソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地に
対して酸素分圧が重要な影響をおよぼすことを示すこと
も可能であっが、グリセロールを含有する培地に対して
は該影響は一層小さかった。
チッ素の不足していないグルコース培地中での該微生物
の培養においては、もしリグニナーゼ活性をあられそう
とすれば純粋な酸素雰囲気が絶対的に必要である。一方
、チッ素に不足していないグリセロール培地中での同じ
微生物の培養では、大気または酸素雰囲気で該活性が発
現される。しかしながら、大気雰囲気中で記録された酵
素活性のレベルは、純粋な酸素雰囲気中でのものに比べ
て４倍低いことが示された。
の培養においては、もしリグニナーゼ活性をあられそう
とすれば純粋な酸素雰囲気が絶対的に必要である。一方
、チッ素に不足していないグリセロール培地中での同じ
微生物の培養では、大気または酸素雰囲気で該活性が発
現される。しかしながら、大気雰囲気中で記録された酵
素活性のレベルは、純粋な酸素雰囲気中でのものに比べ
て４倍低いことが示された。
（３）リグニン分解活性
リグニン分解活性を調べるだめの以下の試験は、合成リ
グニンとして１４Ｃ−ＤＩＩＰ （ＤＩＩＰはコニフエ
リルアルコールを脱水素してえられるポリマーをあられ
す）を用いて行なった。
グニンとして１４Ｃ−ＤＩＩＰ （ＤＩＩＰはコニフエ
リルアルコールを脱水素してえられるポリマーをあられ
す）を用いて行なった。
後述する実施例に記載するようにしてファネロカエテ・
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ−１−３９８の培養５
日後にえられた上澄み液をデカントした。
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ−１−３９８の培養５
日後にえられた上澄み液をデカントした。
それらの液を集め、えられた混合物９ ｍｌを培地を含
有するフラスコ中に再び入れた。
有するフラスコ中に再び入れた。
つぎに２０％グルコース溶液（Ｗ／Ｖ） （１，５ｍｌ
を加え、反応を刺激するためにグルコースオキシダーゼ
０．５単位（蒸留水で新たに調製した溶液０．５ｍ１）
をさらに加えた。 Ｃ−ＤＩＩＰ（５４８０ｄｐｍ）の
懸濁液０ ． ｍｌを入れ、つぎにフラスコにたえず酸
素を流し、生成した” ＣＯ２をフェネチルアミン／メ
タノール／水の混合物（２：ｌ：ｌ） ４ｍｌ中にとら
えた。つぎにシンチレーション液１０ｍ１を加え、放射
能をシンチレーションカウンターで測定した。結果を第
４表に示す。
を加え、反応を刺激するためにグルコースオキシダーゼ
０．５単位（蒸留水で新たに調製した溶液０．５ｍ１）
をさらに加えた。 Ｃ−ＤＩＩＰ（５４８０ｄｐｍ）の
懸濁液０ ． ｍｌを入れ、つぎにフラスコにたえず酸
素を流し、生成した” ＣＯ２をフェネチルアミン／メ
タノール／水の混合物（２：ｌ：ｌ） ４ｍｌ中にとら
えた。つぎにシンチレーション液１０ｍ１を加え、放射
能をシンチレーションカウンターで測定した。結果を第
４表に示す。
第 ４ 表
これらの結果は、ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ
，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地が、グルコース／グ
ルコースオキシダーゼ系によって生じた過酸化水素の存
在中において合成リグニンの高レベルの分解をひきおこ
しうろことを示している。
，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地が、グルコース／グ
ルコースオキシダーゼ系によって生じた過酸化水素の存
在中において合成リグニンの高レベルの分解をひきおこ
しうろことを示している。
他の同様な実験において、７９％までの１４ＣＯ２のか
たちの１４ｃが２時間後にえられた。
たちの１４ｃが２時間後にえられた。
酸素を流しうるように装備された２ ５０ ｍｌフラス
コ中に３７℃でファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，
Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地を調製した〇これらの
培地を後述の実施例に記載するものと同じ培地（グルコ
ース／チッ素２．８＋ｎＭおよびグリセロール／チッ素
２［ｉｍＭ）を用いて調製し、これに１４Ｃ−ＤＨＰの
懸濁液０ ． ｍｌを加えた。
コ中に３７℃でファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，
Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８の培地を調製した〇これらの
培地を後述の実施例に記載するものと同じ培地（グルコ
ース／チッ素２．８＋ｎＭおよびグリセロール／チッ素
２［ｉｍＭ）を用いて調製し、これに１４Ｃ−ＤＨＰの
懸濁液０ ． ｍｌを加えた。
これらの培地におよそ２．３Ｘ １０５の胞子を接種し
、フラスコに周期的に １００％酸素を２分間流し、生
成し１Ｉｎ１４ＣＯ２をフェネチルアミン／メタノール
／水の混合物（２：ｌ：ｌ） ４ｍｌ中にとらえた。シ
ンチレーション液１０ｍ１を加え、シンチレーションカ
ウンターで放射能を４１１１定した。結果を第５表に示
す。
、フラスコに周期的に １００％酸素を２分間流し、生
成し１Ｉｎ１４ＣＯ２をフェネチルアミン／メタノール
／水の混合物（２：ｌ：ｌ） ４ｍｌ中にとらえた。シ
ンチレーション液１０ｍ１を加え、シンチレーションカ
ウンターで放射能を４１１１定した。結果を第５表に示
す。
［以下余白］
第 ５ 表
これらの結果によって、長期の実験における合成リグニ
ンの分解に関して、本発明による一層好ましい培養条件
、すなわち高グリセロールおよびチッ素含量の優位さが
確証される。
ンの分解に関して、本発明による一層好ましい培養条件
、すなわち高グリセロールおよびチッ素含量の優位さが
確証される。
［実施例］
つぎに本発明を実施例にもとづいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない
。
るが、本発明はもとよりこれらに限られるものではない
。
実施例
リグニン分解酵素の製造
（ωリグニン分解酵素を含有する培養上澄み液２％マル
トースを含有するアガープレート上でファネロカエテ・
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ−１−３９８を４℃に
たもった。
トースを含有するアガープレート上でファネロカエテ・
クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ−１−３９８を４℃に
たもった。
ガラスウール上で濾過した分生子の懸濁液からなる接種
材料を、「アプライド アンド エンバイアロンメンタ
ル ミクロバイオロジー、３５巻、ｎｏ ８．１２２３
〜１２２５頁、（１９７８年）」に記載された胞子培地
を用いて調製した。
材料を、「アプライド アンド エンバイアロンメンタ
ル ミクロバイオロジー、３５巻、ｎｏ ８．１２２３
〜１２２５頁、（１９７８年）」に記載された胞子培地
を用いて調製した。
つぎに、以下の組成を有し水酸化カリウムで９１１を４
．５〜５に調節した水性培地１０ｍ１を含有する １５
０ｍ１円錐フラスコ中で、培地（グリセロール１％、チ
ッ素２６ｍＭ）を調製した。
．５〜５に調節した水性培地１０ｍ１を含有する １５
０ｍ１円錐フラスコ中で、培地（グリセロール１％、チ
ッ素２６ｍＭ）を調製した。
（組 成） （ｍｇ）（１）炭素源
グリセロール １００
（２）チッ素源
アスパラギン １０
ＮＨａ ＮＯｓ ５（３）無
機塩 に！Ｉ２ＰＯ４２ ＭｇＳＯ４・７［！２０ ０．５ＣａＣ
ｆｌ ２ ” ２１１２０ Ｑ．４２
Ｍｎ５Ｏａ φＨ２００，０５ク エン酸鉄 ０．１２ＺｎＳＯ４・７
１１２０ ０．０６ＢＣｕＳＯ４・５
１１２０ ０．０１ＣｏＣＩ ２
・（ｉＨ２００，０１（４）ビタミン チアミン ０．０２５酵母エキス
１ （５）バッファー ２．２′−ジメチルコハク酸 ナトリウム １４．６培地におよそ２
．３Ｘ １０５の胞子を接種し、接種後フラスコに酸素
を２分間流し、密閉して栓をした。
機塩 に！Ｉ２ＰＯ４２ ＭｇＳＯ４・７［！２０ ０．５ＣａＣ
ｆｌ ２ ” ２１１２０ Ｑ．４２
Ｍｎ５Ｏａ φＨ２００，０５ク エン酸鉄 ０．１２ＺｎＳＯ４・７
１１２０ ０．０６ＢＣｕＳＯ４・５
１１２０ ０．０１ＣｏＣＩ ２
・（ｉＨ２００，０１（４）ビタミン チアミン ０．０２５酵母エキス
１ （５）バッファー ２．２′−ジメチルコハク酸 ナトリウム １４．６培地におよそ２
．３Ｘ １０５の胞子を接種し、接種後フラスコに酸素
を２分間流し、密閉して栓をした。
培地をつぎに３７℃にたもち、接種３〜４日後にリグニ
ン分解酵素を含有する上澄み液をえた。
ン分解酵素を含有する上澄み液をえた。
接１１５〜６日後において酵素の活性が最大であった。
山）リグニン分解酵素の分離
接種６日後の培地を集め、４℃において１５分間遠心分
離した（ １００ＯＯＧ）。タンパク質加水分解を少な
くするために上澄み液にｐ−メチルスルホニルフルオラ
イド０．２ａ＋Ｍを加え、生成物をフィルター（細孔の
大きさ二ｔｏｏｏｏドルトン）上で２５０ ｍｌに濃縮
した。酒石酸ナトリウム５ｗＭの緩衝溶液（ｐＨ４，５
）に対して透析を８〜１０時間行ない、前もって同じ緩
衝溶液で平衝化しアガロースゲルを含有するクロマトグ
ラフィーカラム中に導入した。
離した（ １００ＯＯＧ）。タンパク質加水分解を少な
くするために上澄み液にｐ−メチルスルホニルフルオラ
イド０．２ａ＋Ｍを加え、生成物をフィルター（細孔の
大きさ二ｔｏｏｏｏドルトン）上で２５０ ｍｌに濃縮
した。酒石酸ナトリウム５ｗＭの緩衝溶液（ｐＨ４，５
）に対して透析を８〜１０時間行ない、前もって同じ緩
衝溶液で平衝化しアガロースゲルを含有するクロマトグ
ラフィーカラム中に導入した。
カラムを緩衝溶液１００ ｍｌで洗浄し、塩勾配（ｓａ
ｌｌｎｅ ｇｒａｄｌｅｎｔ） （５ｓＭ酒石酸ナト
リウム溶液中のθ〜０゜ＩＮの塩化ナトリウム、ｐＨ４
，５、全容量４００ｍ１）を導入した。
ｌｌｎｅ ｇｒａｄｌｅｎｔ） （５ｓＭ酒石酸ナト
リウム溶液中のθ〜０゜ＩＮの塩化ナトリウム、ｐＨ４
，５、全容量４００ｍ１）を導入した。
精製のすべての工程は、４℃において行なった。酵素溶
液をつぎに脱イオン化した蒸留水に対して透析し、リグ
ニン分解酵素を一２０℃において凍結乾燥した安定な粉
末のかたちでたもった。
液をつぎに脱イオン化した蒸留水に対して透析し、リグ
ニン分解酵素を一２０℃において凍結乾燥した安定な粉
末のかたちでたもった。
リグニン分解酵素はまた、グリセロールをグルコースま
たはデンプンとおきかえて叙上の方法を用いることによ
ってもうろことができた。
たはデンプンとおきかえて叙上の方法を用いることによ
ってもうろことができた。
同じように該酵素は、ファネロカエテ・クリソスポリウ
ムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８のかわりにファネロカ
エテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，にニーｔ−ａ９ｑ
を用いることによっても製造することができた。
ムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８のかわりにファネロカ
エテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，にニーｔ−ａ９ｑ
を用いることによっても製造することができた。
第１図、第２図、第３図および第４図は、フ７ネロカエ
テ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８を
炭素源がグルコースでチッ素含量が２．６ｍＭの培地、
炭素源がグルコースでチッ素含量が２６ａ＋Ｈの培地、
炭素源がデンプンでチッ素含量が２６ｍＭの培地および
炭素源がグリセロールでチッ素含量が２８ｍＭの培地で
それぞれ増殖させたときの培養時間と菌糸重量との関係
をあられすグラフである。第５図、第６図、第７図およ
び第８図は、ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ
。 Ｃ，Ｍ、−１−３９８を炭素源がグルコースでチッ素含
量が２ 、 ｆ３ｍＭの培地、炭素源がグルコースでチ
ッ素含量が２６ａＭの培地、炭素源がデンプンでチッ素
含量が２６＋ａＭの培地、炭素源がグリセロールでチッ
素含量が２６ａＭの培地でそれぞれ増殖させたときの培
養時間とりグニナーゼ活性との関係をあられすグラフで
ある。 特許出願人 アンスチチュー・ナチオナール嗜ド畢うΦ
ルシェルシュ・アグ 培養時間（日） 培養時間（日） 培養時間（日） 培養時間（目） 才５図 オ６図 培養時間（日） オ８図 培養時間（日〕
テ・クリソスポリウムＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、−１−３９８を
炭素源がグルコースでチッ素含量が２．６ｍＭの培地、
炭素源がグルコースでチッ素含量が２６ａ＋Ｈの培地、
炭素源がデンプンでチッ素含量が２６ｍＭの培地および
炭素源がグリセロールでチッ素含量が２８ｍＭの培地で
それぞれ増殖させたときの培養時間と菌糸重量との関係
をあられすグラフである。第５図、第６図、第７図およ
び第８図は、ファネロカエテ・クリソスポリウムＣ，Ｎ
。 Ｃ，Ｍ、−１−３９８を炭素源がグルコースでチッ素含
量が２ 、 ｆ３ｍＭの培地、炭素源がグルコースでチ
ッ素含量が２６ａＭの培地、炭素源がデンプンでチッ素
含量が２６＋ａＭの培地、炭素源がグリセロールでチッ
素含量が２６ａＭの培地でそれぞれ増殖させたときの培
養時間とりグニナーゼ活性との関係をあられすグラフで
ある。 特許出願人 アンスチチュー・ナチオナール嗜ド畢うΦ
ルシェルシュ・アグ 培養時間（日） 培養時間（日） 培養時間（日） 培養時間（目） 才５図 オ６図 培養時間（日） オ８図 培養時間（日〕
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 寄託番号Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．−Ｉ−３９８で寄託され
ており、チッ素の不足していない培地中においても高い
リグニン分解活性を示すファネロカエテ・クリソスポリ
ウム ブルドサル（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈ
ｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株。 ２ リグニン分解酵素を含有する培養上澄み液の製造に
用いられる特許請求の範囲第１項記載のファネロカエテ
・クリソスポリウム ブルドサル株。 ３ リグニン分解酵素製造のための特許請求の範囲第１
項記載のファネロカエテ・クリソスポリウム ブルドサ
ル株。 ４ 寄託番号Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．−Ｉ−３９９で寄託され
ており、チッ素の不足していない培地中においても高い
リグニン分解活性を示すファネロカエテ・クリソスポリ
ウム ブルドサル（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈ
ｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株。 ５ リグニン分解酵素を含有する培養上澄み液の製造に
用いられる特許請求の範囲第４項記載のファネロカエテ
・クリソスポリウム ブルドサル株。 ６ リグニン分解酵素製造のための特許請求の範囲第４
項記載のファネロカエテ・クリソスポリウム ブルドサ
ル株。 ７ 資化しうるチッ素源が不足しておらず資化しうる炭
素源および資化しうる無機塩を含有する栄養培地中にお
いて、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．−Ｉ−３９８の寄託番号で寄託
されたファネロカエテ・クリソスポリウム ブルドサル
（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒ
ｉｕｍ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株もしくはＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ
．−Ｉ−３９９の寄託番号で寄託されたファネロカエテ
・クリソスポリウム ブルドサル株を２８〜４０℃の温
度で培養することからなる、リグニン分解酵素を含有す
る培養上澄み液の製造方法。 ８ 前記栄養培地中の資化しうる炭素源がグリセロール
である特許請求の範囲第７項記載の製造方法。 ９ 前記栄養培地中の資化しうるチッ素源がアスパラギ
ンおよび／または硝酸アンモニウムである特許請求の範
囲第７項記載の製造方法。 １０ 資化しうるチッ素源が不足しておらず資化しうる
炭素源および資化しうる無機塩を含有する栄養培地中に
おいて、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．−Ｉ−３９８の寄託番号で寄
託されたファネロカエテ・クリソスポリウム ブルドサ
ル（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ Ｂｕｒｄｓａｌｌ）株もしくはＣ．Ｎ．Ｃ．
Ｍ．−Ｉ−３９９の寄託番号で寄託されたファネロカエ
テ・クリソスポリウム ブルドサル株を２８〜４０℃の
温度で培養してリグニン分解酵素を含有する培養上澄み
液をえ、該酵素を遠心分離、透析またはクロマトグラフ
ィーで単離することからなるリグニン分解酵素の製造方
法。 １１ 前記栄養培地中の資化しうる炭素源がグリセロー
ルである特許請求の範囲第１０項記載の製造方法。 １２ 前記栄養培地中の資化しうるチッ素源がアスパラ
ギンおよび／または硝酸アンモニウムである特許請求の
範囲第１０項記載の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8419028A FR2574427B1 (fr) | 1984-12-12 | 1984-12-12 | Micro-organismes de souche phanerochaete chrysosporium et leur utilisation |
| FR8419028 | 1984-12-12 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
1984
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-
1985
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