FI83093C - Foerfarande foer producering av ligninolytiskt enzym med hjaelp av odling av mikro-organismer av stammen phanerochaete chrysosporium. - Google Patents

Description

1 83093

Menetelmä 1 igninolyyttisen entsyymin tuottamiseksi Ph22®£2-£!2a£££_£il£Z222P2£i2I!!-*tannan mikro-organismien viljelmän avulla - Förfarande för producering av 1igninolytiskt enzym med hjälp av odlinci av mikro-organismer av stammen P£a2££2££a2i:2 £^£Ζ££££2£ΪΗΠ!

Keksintö kohdistuu 1igninolyyttisen entsyymin tuottamiseen E!la2££2£ila£i;£__chrysosgorium-kannan uusien mikro-organismien avulla .

Ligniinin biologinen hajoaminen muodostaa olennaisen osan maa-5 pallon hiilen kierrossa.

Tämä yhdiste on selluloosan jälkeen runsain uusiutuva orgaaninen materiaali. Sillä on lisäksi kyky muodostaa kuorettumia ja estää aina hajoamiseensa saakka hajottavien bakteerien pääsy ligniiniä sisältävien kasvien kudosten selluloosaan ja hemisel-; 10 luloosaan.

Puun valko lahoa aiheuttavat Basidiomycetes-sienet kykenevät, ha-· jottamaan kaikki kasviseinämän aineosat, mukaanlukien lignii- nin. Tämän f e no 1 i polymeer i n hajoamista on tutkittu erityisesti .* : Phanerochaete_chrysosgori.um-sienen kohdalla.

15 Tämä sieni ja muut kyseistä valkolahoa aiheuttavat lajit ovat näin ollen käyttökelpoisia eri alojen sovellutuksissa, kuten puu- ja paperiteknologiassa ja kemiallisten yhdisteiden tuottamisessa 1ignose 11u1oosajätteistä.

. . Tällaisten mahdollisten sovellutusten valikoimaa voitaisiin 20 kuitenkin laajentaa, jos käytettävissä olisi menetelmiä tehok kaampien kantojen valitsemiseksi.

Et22££2£ll2£ ^ e_£h£ys2sg2£iH2~ s i e nen ligniinin hajotuksen ravin-teellisesta säätelystä tehdyissä eri tutkimuksissa on havaittu yleisesti selvä suhde vi1jelyvä1 iaineen typen niukkuuden ja 25 1igninolyy11is en aktiivisuuden esiintymisen välillä.

^ 83093

Esimerkiksi P_.__£hrysosporium ME-446 (ATCC 34541) ei hajota lig niiniä aktiivisen kasvuvaiheensa aikana, vaan s tationäärisessä vaiheessa, kun se on ravinteiden puutteessa.

Tämän sienen ligniinin hajotuksella on näin ollen sekundäärisen 5 metabolian piirteet, jolloin typellä on osuutensa tämän ligni-nolyyttisen aktiivisuuden syntymisessä ja pysymisessä.

Myös KEYSER et coll. ovat esittäneet julkaisussa J. of Bacteriology, sept. 1978, pp . 790-797, että P^_chrysosporiumin aikaansaamaa ligniinin hajoamista tapahtuu merkittävästi vain, 10 kun vi1je lyvä1iaineessa on typen vajaus.

Typen aiheuttaman 1igninolyyttisen systeemin repression voimakkuus vaihtelee valitun typpilähteen mukaan. Glutamiinihappo on voimakas 1igninolyysin repressori ja sillä näyttää olevan glu-tamiinin kanssa erityinen osuus 1igninolyyttisen aktiivisuuden 15 säätelyssä [FENN et coll., Arch. Microbiol. 130, pp. 59-65 (1981)^. Muilla mikro-organismeilla sekundäärinen metabolia aktivoituu eri ravintee11isten vajausten vaikutuksesta.

P^_chrysosporiumin tapauksessa 1 igninolyy ttistä systeemiä voi-: daan tehostaa samoin vi1jelyväliaineen hiilihydraatin ja rikin 2.0 vajauksen avulla, vaikkakin typen puutteen yksistään on katsot tu riittävän ligniinin merkittävän hajoamisen aikaansaamiseksi (JEFFRIES et coll., Applied and Environmental Microbiology, Aug. 1981, pp. 290-296).

MING TIEN ja T. KENT KIRK ovat selostaneet julkaisussa Science 25 221, pp. 661-663 (1983) Phanerochaete_chr^sos£orium Burdsall'in tuottaman ekstrase11u1aarisen entsyymin löytöä, joka entsyymi kykenee aiheuttamaan vetyperoksidin läsnäollessa ligniinin ala-rakenteen omaavien eri malliyhdisteiden hapettavan hajoamisen samoin kuin ligniinin, kuten kuusen tai koivun ligniinin hajoa-30 m i s en.

3 83093 Tämä Pj__£hr^soS£0ruumin BKM-1767 ( ATCC 24725) tai ΡΛ_chr^so- s^ori^umin ME-446 (ATCC 34541) tuottama entsyymi on kuvattu julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., voi. 81, pp. 2280-2284 (1984) suunnilleen 42000 daltonin glykoproteiiniksi , joka si-5 saitaa molekyyliä kohti yhden protohemi IX'n. Se katalysoi ei-stereospesifise 11ä tavalla useita hapetusreaktioita monomeeris-ten tai dimeeristen, ligniinin tyyppisten mo 1ekyy1imal1ien tai makromolekyläärisen ligniinin alkyy1isivuketjuissa : CQ -C^ -sidoksen katkeaminen yhdisteissä, jotka ovat tyyppiä aryyli- 10 C -H0H-C HR-C HO (R=aryyli tai 0-aryyli), bentsyy1ialkoholien o H γ 2 hapetus aldehydeiksi tai ketoneiksi, f enyy1i-glykoli-rakentei-den intradiolinen katkeaminen ja bentsyyliryhmien metyleenira-dikaalin hydroksylaatio. Kyseinen entsyymi katalysoi samoin fenolien oksidatiivis ta kytkentää, mikä ilmeisesti selittää jo 15 kauan tunnetun suhteen fenolin hapetuksen ja ligniinin hajoamisen väli1lä.

-- - Kaikki nämä reaktiot vaativat vetyperoksidin läsnäoloa toteu- ! tuakseen.

Tämä entsyymi on erikoinen oksygenaasi siinä mielessä, että sen ..' 20 aktiivisuus vaatii vetyperoksidin läsnäoloa.

yksinkertaisuuden vuoksi edellä kuvatusta entsyymistä käytetään seuraavassa nimitystä "1igninolyyttinen entsyymi".

Tämän entsyymin tuotanto-olosuhteet ovat kuitenkin vielä huonosti hallitut ja ligniinin biologisen hajoamisprosessin hitaus 25 muodostaa rajoittavan tekijän nykyään huomion kohteena oleville .. sovellutuksille: maa- tai metsätalouden sivutuotteiden entsy- maattinen tai mikrobien avulla tapahtuva delignifikaatio, tarkoituksena parantaa niiden sulavuutta märehtijöillä, selluloosan entsymaattista hydrolyysiä tai anaerobista käymistä.

’ 30 Näin ollen erinomaista 1igninolyyttista aktiivisuutta osoittavien Pj._chrysosgor i^um-kanto j en aikaansaaminen, jotka kannat kykenisivät muuttamaan 1igninolyy11is ta systeemiä, olisi perustavaa laatua oleva tekijä tulevia teollisia sovellutuksia ajatellen .

4 83093

Nyt on yllättäen havaittu, että Phanerochaete_ch£Z:|os|>or i um- kannan mikro-organismit kykenevät kehittämään huomattavasti korkeamman 1igninolyyttisen aktiivisuuden kuin ennestään tunnetut _chrysosgor i^um-kannat väliaineissa, joissa typpeä ei 5 ole rajoitettu ja näin ollen edu11isimmissa käyttöolosuhteissa kuin aikaisempi tekniikan taso on vaatinut.

Uudet keksinnön mukaisesti käytetyt mikro-organismit ligninolyyt-tisen entsyymin tuottamiseksi kuuluvat lajiin Phanerochaete chrvsosporium Burdsall. Keksinnön mukaiset mikro-organismit on 10 talletettu PASTEUR-instituuttiin Pariisiin talletuslaitokseen Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.) talletusnumeroilla 1-398 ja 1-399. Näiden Phanerochaete chrvsosporium Burdsall-kantojen morfologiset ominaisuudet ovat samat kuin Phanerochaete chrvsosporium-laiin ominaisuudet ja nämä on selostettu julkaisussa: Staplers, J.A.; 1948; "A Revision of the Genus Sporotricum"; STUD.MYCOL 24;1-104.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä viljelmän super-15 natantin aikaansaamiseksi, joka sisältää 1igninolyyttistä ent syymiä. Keksinnön uusia Phanerochaete_chrysospori^um-mikro-orga-nismeja viljellään menetelmän mukaisesti ravin tovä1iaineessa, jossa ei ole assimiloituvan typpilähteen vajausta ja joka sisältää assimiloituvan hiililähteen ja assimiloituvia mineraali-20 suoloja.

Keksintö kohdistuu myös menetelmään 1igninolyyttisen entsyymin tuottamiseksi. Keksinnön uusia Phanerochaete__£h£ZS°§por^um- mikro-organismeja viljellään menetelmän mukaisesti ravintoväli-aineessa, jossa ei ole assimiloituvan typpilähteen vajausta ja 25 joka sisältää assimiloituvan hiililähteen ja assimiloituvia mi ne raal isuoloj a , tarkoituksena saada aikaan 1igninolyyttistä entsyymiä sisältävä viljelmän supernatantti, joka entsyymi eristetään esim. sentrifugointi-, dialyysi- ja kromatografia-tekniikan avulla.

3D Kyseistä 1 i gn i no 1 yy 11. i s tä entsyymiä sisältävän supernatan t in tuottamiseksi erään toteutusmuodon mukaisesti valmistetaan ve-getatiivinen siirroste siirrostamalla pieneen määrään viljely-väliainetta konidiaalista mikro-organismin suspensiota.

I: 5 83093 Tätä mikro-organismia viljellään aerobisissa olosuhteissa tai edullisesti happiympäristössä 28-40°C:n lämpötilassa, edullisesti 37°C:ssa ja eri ravintovällaineissa, jotka sisältävät typpi1 äh teen , hiililähteen ja mineraalisuoloja.

5 Ennen siirrostamista mikro-organismilla on toivottavaa, että vi1jelyväliaineen pH säädetään arvoon 4,5-5. Tähän käytetään nitrium-2,2'-dimetyy1isukkinaattipuskuria, joka on säädetty aikai i me tai 1 ihydroks i d i 1 1 a , esim. kaiiumhydroksidi11a .

Ligninolyyttisen entsyymin merkittävä tuotto supernatanttiin 10 tapahtuu yleensä kolmannen ja kahdeksannen päivän välillä mak simin ollessa viidennellä tai kuudennella päivällä.

Assimiloituvana hii1i1 äh teenä käytetään esim. glukoosia, man-noosia, tärkkelystä, melibioosia, mannitolia, ksyloosia, mal-toosia, adonitolia, arabitolia, fruktoosia, sorbitolia, raf-15 finoosia, ksylitolia, D ( + )trehaloosia tai glyserolia.

Assimiloituva typpilähde voi olla esim. asparagiini, ammonium-nitraatti tai ammoniumtartraa11i .

! Mineraalisuoloina voidaan puolestaan käyttää rautasitraattia, ;·; KH2P04, ZnS04, MnS04, CaClg, CuS04> NaCl , FeS04, CoCl2 , ZnS04« 2Ö A1K(S04)2, H3B03, Na2Mo04, MgS04.

Glyseroli on edullinen keksinnön mukainen hiililähde. On h a -: : vaittu, että tällä ravinne1 ähtee 11ä väliaineessa, jossa ei ole typen vajausta, on mahdollista saada erittäin merkittäviä lig-ninaasin tai 1igninolyyttisen aktiivisuuden määriä, toisin kuin 25 kannoilla P^_ o s po r i um BKM-1767 (ATCC 24725) ja ME-446 (ATCC 34541), jotka eivät tuota 1igninolyyttistä entsyymiä näissä olosuhteissa.

Kuten aikaisemmin on selostettu, vi1jelyväliaineen hiilen ja / typen vajaus on välttämätön edellytys merkittävän ligninolyyt- S0 tisen aktiivisuuden ilmenemisessä kaikilla tähän asti tutki tuilla Pj__£h£^sos£or ium-kanno i 1 la .

6 83093 Täten keksinnön mukainen mikro-organismien viljely väliaineissa, joissa ei ole typen tai glyserolin vajausta, mahdollistaisi kyseisen 1igninolyyttisen aktiivisuuden saannin jatkuvalla prosessilla, mikä ei ole odotettavissa tunnetuilla P^_chr^so- 5 sgor i. um-kanno i 11 a , koska tässä tapauksessa on välttämätöntä säätää jatkuvasti vi1je lyvä1iainetta ravintee 11isten vajausten huomioonottamiseksi .

Keksinnön mikro-organismiviljelmien supernatanttien sisältämä 1igninolyyttinen entsyymi voidaan eristää etenkin sentrifugoin-10 nilla, dialyysillä ja kromatogra fia 11a, esim. kromatogra fia 11 a agaroosigeelipylväässä.

Täten saatua entsyymiä voidaan säilyttää kylmäkuivauksen jälkeen.

Uusien mikro-organismien viljelmät on valmistettu entsyymin tai 15 ligninaasin aktiivisuuden, 1igninolyyttisen aktiivisuuden sekä eri muuttujien tutkimiseksi, kuten hiili- ja typpi1ähteiden vaikutus myseelin kasvuun tai entsymaattiseen aktiivisuuteen.

I. MYSEELIN KASVATUS

; Tässä on yleisesti käytetty seuraavassa esimerkissä kuvattua 50 yleistä prosessia vaihdellen hiililähteen laatua ja/tai typpi pitoisuutta (asparagiini/NH^NO^) ravintoväliaineessa ja myseelin kuivapaino on määritetty eristyksen ja kuivauksen jälkeen 2,5 mm:n läpimittaisten lasikuitusuodattimien avulla.

P^_chrysos£orium C.N.C.M. -I-398:lla saadut tulokset on esitet-25 ty oheisissa piirustuksissa, joissa kuvassa 1 käyrä 1 esittää vi1jelyväliaineen typen (2,6 mM) vajauksen vaikutusta myseelin kasvuun glukoosin ollessa hi i1i1 ähteenä, 7 83093 kuvassa 2 käyrä 1 esittää viljelyväliaineen korkean typpipitoisuuden (26 mM) vaikutusta myseelin kasvuun glukoosin ollessa hii1ilähteenä, kuvassa 3 käyrä 1 esittää vi1jelyvä1iaineen korkean typpipitoi-5 suuden (26 mM) vaikutusta myseelin kasvuun tärkkelyk sen ollessa hii1i1 ähteenä ja kuvassa 4 käyrä 1 esittää vi1jelyvä1iaineen korkean typpipitoisuuden (26 mM) vaikutusta myseelin kasvuun glyserolin ollessa hii1i1 ähteenä.

10 Tuloksista on nähtävissä se, että glyseroli näyttää olevan epäedullinen hiililähde P^_c hrysosgo r i. um C.N.C.M. -I-398:n kasvul-1 e .

Väliaineen typen ollessa rajoitettu tai rajoittamaton myseelin kasvu on selvästi merkittävämpi glukoosin ollessa hiililähtee-15 nä.

Vertailun vuoksi on määritetty P_^__chry sosgor i um C.N.C.M.

-1-398: n kasvu ja tunnetun kannan _£hrysosj)or i^um BKM-1767 (ATCC 24725) kasvu viljelyvällaineessa, jossa typpipitoisuus on korkea (26 mM) glyserolin ollessa hii1i1ähteenä (väliaineen al-! 20 kuperäinen pH 4,5): [nkubaa- P. chrysosporium BKM-1767 P. chrysosporium C.N.C.M. -I -398 tioaika ------- .1..., — - - -.......... . - - — -

(päiviä) Myseelin kui- Myseelin kuivapaino (mg) pH vapaino (mg) pH

25 2 15,8 + 1,6 5,46 + 0,04 4,9 + 0,4 5,37 + 0,04 3 34,2 + 2,6 4,27 + 0,05 10,0 + 1,0 5,05 + 0,04 4 39,2 + 3,1 4,08 + 0,04 11,3 + 1,5 5,34 + 0,02 5 40,2 + 0,7 4,06 + 0,01 16,6 + 0,4 5,33 + 0,06 6 37,7 + 1,3 4,17 + 0,09 19,9 + 1,0 4,76 + 0,18 30 7 37,8 + 1,3 4,46 + 0,06 20,8 + 0,4 4,45 + 0,08 β 83093 Nämä tulokset osoittavat, että koeolosuhteissa tunnetun kannan kasvu on merkittävämpi kuin kannan ΡΛ_chrysosgorium C.N.C.M.

-1-398 kasvu.

Myöhemmissä kokeissa on voitu todeta, että hapetusolosuhteet 5 eivät vaikuta P^_chrysosporium C.N.C.M. -I-398:n kasvuun, kuten osoittavat seuraavat tulokset, jotka on saatu väliaineessa, joka sisältää glyserolia hii1i1ähteenä ja jolle on ominaista korkea typpipitoisuus:

Viljelmät asetettu 100% happi- Viljelmät asetettu ilma-[nkubaa- atmosfääriin siirrostuksen atmosfääriin siirrostuksen bioaika jälkeen jälkeen [päiviä) ------------------------------------------------------------------------

Myseelin kuiva- Myseelin kuiva-

paino (mg) pH paino (mg) pH

15 2 4,5 + 1,1 5,22 + 0,00 4,5 + 0,2 5,10 + 0,04 3 11,1 + 1,3 5,23 + 0,08 11,8 + 3,2 4,97 + 0,13 4 16,2 + 2,5 4,97 + 0,14 15,3 + 0,9 5,14 + 0,01 5 18,5 + 2,4 5,12 + 0,08 16,9 + 3,1 5,11 + 0,06 6 22,5 + 4,0 4,35 + 0,09 18,0 + 2,5 5,20 + 0,09 .'20 7 25,2+0,5 4,38+0,02 22,2+1,5 5,14+0,07 Näiden kokeiden kuluessa on myös havaittu, että kannassa P^ £Ϊ)£ϊ.®°^Ε°£ίΗΠ1 BKM-1767 (ATCC 24725) tapahtuu itiöiden muodostus viiden päivän jälkeen, voimistuen kuuden päivän jälkeen.

P^_c h rysospori^um C.N.C.M. -1-398: n tapauksessa on havaittu my-. 25 seelin hydrofobinen konsistenssi ja voimakas itiöiden muodostus * viiden päivän jälkeen. P j__£hrysospor ium I-399:llä ei ole kui tenkaan havaittu mitään itiöiden muodostusta.

9 83093

II. LIGNINAASIAKTIIVISUUS

A. Ligninolyyttisen entsyymin substraatti Jäljempänä kuvatun esimerkin mukaisesti aikaansaatujen viljelmien supernatanttien 1igninaasiaktiivisuus on määritetty mit-5 taamalla 35°C:ssa absorbanssin kasvu aaltopituudella 310 nm, mikä johtuu veratryy1ialkoholin (3,4-dimetoksibentsyy1ialkoho-li) hapettumisesta veratra1dehydik si, menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., Voi. 81, pp. 2280-2284 (1984).

10 Tätä tarkoitusta varten on käytetty samaa reaktioseosta kuin kyseisessä viitteessä sillä erolla, että käytetty vetyperoksidin pitoisuus on 0,27 mM.

Entsymaattinen aktiivisuus on määritelty yksikköinä, jolloin yksi yksikkö vastaa koeolosuhteissa minuutissa muodostunutta 15 yhtä nanomoolia veratraldehydiä.

P^_ch ry sospor j^urn C.N.C.M. -I-398:lla saadut tulokset on esitet-ty oheisissa piirustuksissa, joissa kuvassa 1 käyrä 2 esittää viljelyväliaineen typen (2,6 mM) vajauksen vaikutusta ligninaasiaktiivisuuteen glukoosin ·" 20 ollessa h i i 1 i 1 äh te enä , kuvassa 2 käyrä 2 esittää viljelyväliaineen korkean typpipitoisuuden (26 mM) vaikutusta ligninaasiaktiivisuuteen glukoosin ollessa hiililähteenä, kuvassa 3 käyrä 2 esittää viljelyväliaineen korkean typpipitoi-25 suuden (26 mM) vaikutusta ligninaasiaktiivisuuteen tärkkelyksen ollessa hii1ilähteenä ja kuvassa 4 käyrä 2 esittää viljelyväliaineen korkean typpipitoi-* suuden (26 mM) vaikutusta ligninaasiaktiivisuuteen glyserolin ollessa hiililähteenä.

10 83093

Kuvasta 1 on nähtävissä, että viljeltäessä P_.__chr jr sosjgor ium C.N.C.M. -I-398:a tekniikan tason mukaisissa olosuhteissa, toisin sanoen niukkatyppisessä väliaineessa, jossa glukoosi on hiililähteenä, ligninaasiaktiivisuus ilmenee viljelmien super-5 natanteissa kolmen päivän jälkeen.

Kuitenkin tämän aktiivisuuden maksimiarvo, joka suuruusluokaltaan on 50 yksikköä viiden päivän jälkeen, on havaittu olevan heikko ja verrattavissa tunnetun kannan PJ__£i2£Z§ospori.um ME-446 (ATCC 34541) vastaavissa viljelmissä havaittuihin aktiivisuuk-10 siin (10-20 yksikköä).

Kuvista 2 ja 3 on taas päinvastoin nähtävissä se, että ligninaasiaktiivisuus on selvästi havaittavissa viljelmissä, joissa on korkea typpipitoisuus (26 mM) ja joissa hiililähteenä on glukoosi tai liukoinen tärkkelys.

15 Viljelmissä, joissa on korkea typpipitoisuus ja joissa on joko glukoosi tai tärkkelys hiililähteenä, aktiivisuus on vielä merkittävä neljä päivää sen jälkeen, kun myseelin kasvu on saavuttanut maksimin.

Viljelmissä, joissa on korkea typpipitoisuus ja joissa glysero-'20 li on hiililähteenä, voidaan todeta huomattavasti kasvanut entsyymin tuotto. Aktiivisuus ilmenee kahden ja kolmen päivän jälkeen siirrostuksesta ja ylittää usein 350 yksikköä viiden päivän jälkeen.

Korkeat havaitut entsyymiaktiivisuusmäärät glyserolin ollessa 25 hiililähteenä ovat melko ilmeisesti suhteessa P^__chrjsos£orium C.N.C.M. -I-398:n heikkoon kasvuun glyserolilla verrattuna glukoosiin.

Vertailun vuoksi on kannan Pji_chrysospori.um C.N.C.M. -1-398 ja tunnetun kannan P. chrjsosgonun BKM-1767 (ATCC 24725) viljel-30 millä saadut 1igninaasiaktiivisuudet määritetty, kun viljelyvä-liaineessn on glyserolia ja korkea typpipitoisuus (26 mM).

h 11 83093

Saadut tulokset ovat seuraavat: --- ~~—*** ----“ —~ · —— — —

Inkubaa- P. chrysosporium P. chrysosporium tioaika- BKM-1767 C.N.C.M. -1-398 (päiviä) --------------------------------------------------------------- 5 ligninaasiaktiivisuus yksikköä/ml väliainetta 2 0 0 3 11+9 182 + 69 4 0 203 + 42 5 2+2 353+0 10 6 3+4 224+40 7 1 + 1 58+4

Tulokset osoittavat jälleen sen, että P_L_clirysos£orium C.N.C.M. -1-398 tuottaa 1igninaasiaktiivisuutta, kun vi1je lyvä1iaineen typpipitoisuus on korkea, toisin kuin tunnettu __£^ryso- 15 s£orium-kanta.

Samoissa olosuhteissa suoritetut täydentävät kokeet, toisin sanoen glyseroliväliaineessa, jossa typpeä ei ole rajoitettu, ovat antaneet 1igninasiaktiivisuuden suuruudeksi 490,7 + 4,5 ’·’ yksikköä ja 641,8 + 61,6 yksikköä viljelmien ollessa vastaavas- : : 20 ti ΡΛ__£il£ysos£orium C.N.C.M. -1-398 ja P^__£h£Z££§£££i££ • I- C.N.C.M. -1-399.

B. Ligniinin ma11iyhdisteet

Saatujen viljelmien supernatanttien entsyymiaktiivisuus on määritetty seuraavassa kuvatun esimerkin mukaisesti.

-.'25 Vetyperoksidista riippuvan 1-( 3,4,5-tr imetoks i f enyy 1 i )-2-( 2,6- : ’· d ime toks i-4-hydroks imetyyl ifenyy 1 i ) propaan i-1,3-d iol i n oksida- ;·. tiivisen hajoamisen aiheuttama 3,4,5-1 r i me tok s i be n t sa 1 dehy d i n muodostuminen on mitattu 35°C:ssa menetelmällä, joka on kuvattu £. julkaisussa Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., voi. 81, pp. 2280- • 30 2284 (1984) ja jota on käytetty ei-radioaktiivisi1le B-l-(di- '-· aryylipropaani )-dimeereille.

12 83093

Samoin on mitattu vetyperoksidista riippuvan 1-(3,4-dimetoksi-fenyyli)-2-(2-metoksifenoksi)-propaani-l,3-diolin oksidatiivi-sen hajoamisen aiheuttama veratraldehydin muodostuminen 35°C:ssa menetelmällä, joka on myös kuvattu julkaisussa Proc . 5 Natl. Acad. Sei. U.S.A., voi. 81, pp. 2280-2284 (1984) ja jota on käytetty β-Ο-4-eetteridimeerei11e (aryy1iglyseroli-aryy1i-eetteri).

Näiden kokeiden tulokset ovat paljastaneet merkittävän ligni- naasiaktiivisuuden määrän, jota edustaa käytettyjen malliyhdis- 10 teiden C -C -sidosten katkeaminen. a 0

Samoin on voitu todistaa hapen osapaineen tärkeä vaikutus ΡΛ C.N.C.M. I-398:n v i 1 j ely vä 1 i aine is i in , jotka sisältävät glukoosia hii1ilähteenä, tämän vaikutuksen ollessa vähemmän merkittävä alustoissa, jotka sisältävät glyserolia.

15 Tämän mikro-organismin viljelmät tarvitsevat glukoosiväliai-neessa, jossa ei ole typen vajausta, ehdottomasti puhtaan hap-piatmosfäärin 1igninaasiaktiivisuuden ilmenemiseen, kun taas saman mikro-organismin viljelmät glyserolivällaineessa, jossa ‘ : ei ole typen vajausta, kehittävät tämän aktiivisuuden ilma-at- ··· 20 mosfäärissä tai happ i a tmos f äär i ssä . Kuitenkin ilma-atmosfäärissä esiin tulleet entsymaattisen aktiivisuuden määrät ovat osoittautuneet neljä kertaa alhaisemmiksi kuin puhtaassa happi-atmosfäär i ssä.

III. LIGNINOLYYTTINEN AKTIIVISUUS

25 Seuraavat 1igninolyyttisen aktiivisuuden testit on toteutettu 14 käyttämällä synteettisenä ligniininä C-DHP:tä (DHP : polymeeri koniferyy1ialkoho1 in dehydrogenoinnis ta ) .

1) Jäljempänä kuvatun esimerkin mukaisesta P^_£]}£isosgor i um C.N.C.M. -1-398-vi1je 1mästä viiden päivän jälkeen saatuja su-;‘, 30 pernatantteja dekantoidaan. Ne yhdistetään ja 9 ml saatua s e o s -ta siirretään takaisin viljelmää sisältäviin pulloihin.

13 83093 Tämän jälkeen lisätään 0,5 ml 20% glukoosi1iuosta (w/v) ja 0,5 yksikköä glukoosioksidaasia (0,5 ml liuosta, joka on äskettäin valmistettu tislattuun veteen) reaktion kiihdyttämiseksi. Lisätään 0,1 ml 14C-DHP-suspensiota (5480 ppm) , tämän jälkeen pul- 14 5 loihin puhalletaan jatkuvasti happea ja muodostunut CO^ pidätetään 4 ml:aan fenetyyliamiini/metanoli/vesi-1iuosta (2:1:1). Tämän jälkeen lisätään 10 ml tuikenestettä ja radioaktiivisuus mitataan tuikelaskurilla. Näin on saatu seuraavat tulokset, jotka on ilmoitettu prosentteina kokonaan käytettävissä olevas-14 10 ta C : stä : --

Aika (h) % kerääntynyttä alkuperäistä C:tä reaktion alkamisesta (muuttunut CO^iksi) 2,5 54+4 5 65 + 7 15 24 66 + 7 ·’: Nämä tulokset osoittavat, että P_1_ch ry s osgor i^um -I-398:n vilje- lyväliaineet mahdollistavat synteettisen ligniinin merkittävän hajoamisasteen glukoosi-glukoosioksidaasi-systeem in luoman ve-typeroksidin läsnäollessa.

; : 14 14 . 20 Muissa vastaavissa kokeissa on saatu C:ta C 0 ^ : n muodossa aina 79%:iin asti kahden tunnin jälkeen.

2) Pj__£]2£Ζ®2®Ρ°ΓίΗΠ! C.N.C.M. -I-398:n viljelmät valmistetaan 37°C:ssa 250 ml pulloon, joka on varustettu siten, että siihen voidaan puhaltaa happea.

25 Näissä viljelmissä käytetään väliaineita, jotka ovat samoja kuin seuraavassa esimerkissä esitetty (glukoosi/2,6 mM typpeä ja glyseroli/26 mM typpeä). Näihin väliaineisiin lisätään ..: 14 0,1 ml C-DHP-suspensiota.

14 83093 5

Viljelmät siirroste taan suunnilleen 2,3.10 itiöllä, 100% hap- 14 pea puhalletaan ajoittain 2 minuutin ajan ja muodostunut CO^ pidätetään 4 ml:aan fenetyy1iamiini/metano 1i/vesi-seosta (2:1: 1). Tuikenestettä lisätään 10 ml ja radioaktiivisuus mi-5 tataan tuike 1askurissa.

On saatu seuraavat tulokset, jotka on ilmoitettu prosentteina 14 käytettävissä olevasta kokonais- C:stä: 14 14

Inkubaatioaika % kerääntynyttä alkuperäistä C:tä (muuttunut CO^ksi) (päiviä) ---------------------------------------------------------------- 10 glukoosi/2,6 mM typpeä glyseroli/26 mM typpeä 7 11 47 8 15 48 9 17 49 12 23 50 15 14 25 52 --- -- III. Ml_ .. ‘il - . — M M ,, 1-^ — τ--»..Π * — — - —I — _ ^ — rr „ — mx.

Nämä tulokset vahvistavat keksinnön mukaisten edullisten viljelyolosuhteiden paremmuuden (korkea glyseroli- ja typpipitoisuus) synteettisen ligniinin hajoamisen suhteen pitkäaikaisessa kokeessa .

20 Keksintöä kuvaa seuraava esimerkki, joka ei mitenkään rajoita keksintöä.

ESIMERKKI

LIGNINOLYYTTISEN ENTSYYMIN VALMISTUS

a) Ligninolyyt t i. 3 tä en tsyym i ä_s i^sä 1 j:ä v ä_v i l^e lmän_sugernatan t1 i 25 h ry sospor i^um C.N.C.M. -I-398:a säilytetään 2% mallasagari- levyillä 4°C:ssa.

15 83093

Lasivillalla suodatetuista konidiaa1is uspensiois ta koostuva siirroste valmistetaan käyttämällä sporulaatioväliainetta, joka on kuvattu julkaisussa Applied and Environmental Microbiology, voi. 35, No. 6, pp. 1223-1225 (1978).

5 Viljelmät (1% glyserolia ja 26 mM typpeä) valmistetaan tämän jälkeen 150 ml Erlenmeyer-pul1oih in, jotka sisältävät 10 ml vesipohjaista väliainetta, jolla on seuraava koostumus: mg

MiiAii§hde 10 Glyseroli 100 IZEEliMhde

Asparagi ini 10 NH.N0- 5 4 3 M^neraal^i^suol^at 15 KH2P04 2

MgS04, 7H20 0,5

CaC12, 2H20 0,132

MnS04> H20 0,05 -*· Rautas i tr aat t i 0,12 20 ZnS04> 7H20 0,066

CuSO . , 5H„0 0,01 4 2

CoC 12, 6H20 0,01

Vi^tam^^ni

Tiamiini 0,025 25 Hi ivauute 1 • Puskuri : · Natrium-2,2'-dimetyylisukkinaatti 14,6 pH säädetään 4,5-5:ksi ka 1iumhydroksidi11 a.

ie 83093 5

Viljelmät siirroste taan suunnilleen 2,3.10 itiöllä, happea puhalletaan 2 min. ajan siirrostuksen jälkeen ja pullot suljetaan ilmatiiviisti.

Viljelmiä pidetään tämän jälkeen 37°C:ssa ja 3-4 päivän jälkeen 5 siirrostuksesta saadaan supernatantti, joka sisältää lignino-lyyttistä entsyymiä, entsymaattisen maksimiaktiivisuuden ollessa 5-6 päivän kohdalla.

Kuuden päivän ikäiset viljelmät yhdistetään ja sentrifugointi 10 suoritetaan 4°C:ssa 15 min. ajan (10.000 g). Supernatanttiin lisätään p-metyy1isu1 fonyy1if1uoridia (0,2 mM) proteolyysin vähentämiseksi ja konsentr o int i suoritetaan suodattimena (huokoskoko : 10.000 daltonia) 250 mlrksi. Dialysointi suoritetaan 8-10 tunnin ajan 5 mM natriumtartraattipuskuria vastaan (pH = 4,5) ja liuos siirretään aikaisemmin samalla puskuriliuoksella tasapainotettuun agaroosigee 1iä sisältävään kromatografiapy1-vääseen.

Pylväs pestään 100 m1:11a puskuriliuosta ja siihen johdetaan - suolaliuosgradientti (0-0,1 M natriumkloridia 5 mM natrium- .-20 tartraatti1iuoksessa, pH 4,5 kokonaistilavuus 400 ml).

Kaikki puhdistusvaiheet suoritetaan 4°C:ssa. Tämän jälkeen entsyymi1iuos dialysoidaan deionisoitua tislattua vettä vastaan ja 1igninolyyttinen entsyymi säilytetään -20°C:ssa stabiilin kylmäkuivatun jauheen muodossa.

. 25 Ligninolyyttistä entsyymiä on saatu samoin edellisellä menetelmällä korvaamalla glyseroli glukoosilla tai tärkkelyksellä.

Kyseistä entsyymiä on voitu tuottaa myös korvaamalla P^_chryso-: spor jLum C.N.C.M. -1-398 P^_chrysospor i. um C.N.C.M. -1-399 :llä.

Claims (3)

1. Menetelmä 1igninolyyttisen entsyymin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että 28-40°C:n lämpötilassa ja ravintovä- liaineessa, jossa ei ole assimiloituvan typpilähteen vajausta ja jossa on assimiloituva hiililähde ja assimiloituvia mineraa- 5 lisuoloja, viljellään numeroilla 1-398 ja 1-399 laitokseen Collection Nationale de Cultures de Mieroorganismes (C.N.C.M.) talletetuista mikro-organismeista valittua Εί2§£££2£!}§®ί e £}2£ΧΕ2£Ε2£ΪΗΠ! Burdsa 11-kannan mikro-organismia mainittua ligni-nolyyttistä entsyymiä sisältävän vi1je 1mäsupernatantin saami-10 seksi ja että 1igninolyyttinen entsyymi mahdollisesti eristetään sentrifugoinni1la, dialyysillä ja kromatografiällä.

2. Förfarande enligt patentkrav lf kännetecknat 20 av att kolkällan är glycerol.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiililähde on glyseroli.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että typpilähde on asparagiini ja/tai ammoniumnitraatti. ia 83093 5 1. Förfarande för framställning av ligninolytiskt enzym, kännetecknat av att man vid en temperatur inom omrädet 28-40° och i näringsmedium som inte har brist pk assimilerbar kvävekälla och som innehäller en källa för assimilerbart koi och assimilerbara 10 mineralsalter odlar nägon av mikroorganismerna med numren 1-398 och 1-399 av stammen Phanerochaete chrvsosporium Burdsall deponerade hos institutionen Collection Nationale de Culture de Microorganismes (C.N.C.M.) för erhällande av en kultursupernatant 15 innehällande det ligninolytiska enzymet, och att det i ligninolytiska enzymet eventuellt isoleras genom centrifugering, dialys eller kromatografi.

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att kvävekällan är asparagin och/eller ammoniumnitrat.