JPS6088042A - 不溶化タンパク質の安定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不溶化タンパク質の安定化法に関する。詳しく
は、不溶性支持体に固定された生物学的に活性なタンパ
ク質１例えば酵素や種々の病因疾患等に特有な抗原ある
いは抗体の失活を防止し、長期間に亘り安定な不溶化タ
ンパク質を提供する不溶化タンパク質の安定化に関する
。

不溶性支持体に固定されたタンパク質（不溶化タンパク
質）は、その酵素的活性、免疫反応的活性等を利用する
ために有用であり、近年特に血液、あるいは体液中に含
まれる生理活性物質を測定する臨床検査法のひとつであ
る免疫化学的測定法に広く用いられている（特公昭５８
−１６４７１号、特公昭５７−６２０２０号。

特公昭５７−８８５４６号、特開昭５４−１２８８９６
号、特開昭５７−１１５８５８号。

特開昭５７−１８６１６５号、特開昭５４−１２８８９
６号、特開昭５８−２９９２８号。

各公報参照）。

不溶化タンパク質の製造法は種々開発されているが、活
性なタンパク質を不溶性支持体に固定した場合における
タンパク質の変性及び失活等に関する安定性に問題があ
った。

この問題の解決法として、不溶化タンパク質を適当な緩
衝溶液中に保存する方法、血清アルブミン、血清グロブ
リン等の不活性タンパク。

チトクロームＣ又は乳糖、蔗糖等の糖類を含んだ溶液で
不溶化タンパク質を処理する方法等がある。緩衝溶液中
に保存する方法は取り扱い上不便であり、その他の方法
も必ずしも満足しうる効果が得られていない（特公昭５
８呵Ｇ＋１１：特開Ｂｆｉ５８− Ａ１２８８９６号、特開昭５０−８２２３０号。

各公報参照）。

そこで本発明者らは１種々研究の結果、簡単“な操作で
長期安定性を有し、また取り扱いの簡便な不溶化タンパ
ク質の安定化法を開発した。

本発明は、不溶性支持体に固定されたタンパク質（不溶
化タンパク質）を硫酸マグネシウムあるいは硫酸マグネ
シウムと不活性タンパク質を含む溶液で処理するという
簡単な方法でよい。

不溶性支持体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、
ポリアクリル酸エステル及びアクリルアミド等の合成樹
脂、セル口、、−ス及びデキストラン等の多糖類９紙、
ガラスｉまたは金属等その他にも前記特開昭５８−２９
・９２８号公報の第５頁に例示のあるものからなるチュ
ーブ状。

ピース状、シート状、棒状または繊紐状躊のものを目的
に応じて適宜選ぶことができる。

タンパク質としては、特開昭５７− ＄ １８６１６５号公報Ａ５頁及び特公昭５６−１５２８１
号公報第２頁に記載のあるα−フエトブ田ティン、ＯＥ
ｋ、フェリチン等の癌関連抗原、ＨＥ抗原、ＨＡ抗原等
の肝炎関連抗原及びインシュリン、Ｔ０ｎ、ＬＨ等のホ
ルモン関連抗原並びにこれらの抗体あるいはパパイン。

アミラーゼ、リパーゼ等の加水分解酵素類、グルコース
オキシダーゼ、カタラーゼ等のレド。

ケス酵素類及びグルタミン酸−ビルピン酸トランスアミ
ナーゼ等のトランスフェラーゼ酵素類が挙げられる。

不溶性支持体へのタンパク質の固定化法としては不溶性
支持体にタンパク質を物理的に吸着させる方法、グルタ
ルアルデヒド、アミノシラン等を架橋剤としてタンパク
質を固定する方法。

不活性タンパク質で処理した不溶性支持体に共局 グ結合によりタンパク質を結合させる方法等がある（特
開昭５１−６８９８１号、特開昭５８−２９９２８号、
特開昭５５−１１１７８８号。

各公報参照）。

尚、前記に示す不溶化タンパク質の製造法に関する不溶
性支持体及びタンパク質の種類並びに固定化法等は９本
発明の性質上特別な限定をするものでなく、それぞれの
目的に応じて適宜選択決定すればよい。

不溶化タンパク質の安定化に際しては、不溶性支持体に
固定されたタンパク質を硫酸マグネシウムあるいは硫酸
マグネシウムと不活性タンパク質１例えば牛血清アルブ
ミン、人血清アルブミン、牛ガンマ泳グロブリン等を含
む緩衝溶液に浸漬した後乾燥させればよい。

不活性タンパク質を含めなくとも本目的は達成できるが
含めることによって良い結果が得られることもある。

硫酸マグネシウム及び不活性タンパク質の適当な濃度は
、用いる不溶化タンパク質の種類。

号し 形状及び性質９例えば不溶ｋｐタンパク質製造するとき
の不溶性支持体の種類や形状、タンパク質の種類、精製
度合及び希釈程度並びに固定化法等による不溶性支持体
へのタンパク質の結合度合等により差はあるが、一般に
硫酸マグネシウムの濃度は０．００５〜１．０Ｍ、但し
、濃すぎると不溶化タンパク質を乾燥後、不溶化タンパ
ク質同士が付着する場合があるので好ましくは０．０５
〜０．５Ｍ、不活性タンパク質の濃度は０．０１〜１０
％（ｗ／ｖ）好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ　）　と
いうことができる。

浸漬及び乾燥は通常の室温で行うのがよく。

数時間浸漬させえ後−夜乾燥させればよい。また減圧乾
燥すれば乾燥は数時間に短縮できる。

次に本発明の方法、効果等を実施例によって示すが９本
発明はこれらの実施例によって限定されるものではない
。

実施例１ ヒトがん胎児性抗原（ＯＥＡ）をヤギに免疫して得た抗
ヒトがん胎児性抗原ヤギ血清のガンマグロブリン分画（
ＣＩＡ抗体）をｐＨ６，４の０．００１　Ｍリン酸緩゛
衝液で１：２５００に希釈した。この液に直径約０．７
ＣＩ１１のポリスチレン小球を加え、室温で一昼夜放置
した後、小球を精製水で洗浄した。次いで小球を０．　
Ｉ　Ｍ　Ｖ＆酸マグネシウムを含むＰＢＳ液（０，１Ｍ
リン酸緩衝液０．５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７，４）　に
室温下８時間浸した後、減圧乾燥して、安定化処理した
ＯＥＡ抗体を不溶化したポリスチレン小球（不溶化ＯＥ
Ａ抗体小球〕を得た。

実施例２ 実施例１と同様にして０．１Ｍ硫酸マグネシウムと０．
５％（ｗ／ｖ　）　牛血清アルブミンを含むＰＥＳ液を
用いて処理して安定化処理した不溶化０１Ａ抗体小球を
得た。

実施例８　ラジオイムノアッセイ法ＣＲＩＡ法） 試験管に標準溶液又は被検血清をそれぞれ５０μノずつ
を入れた後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）ＺＯＯ
μ！ずっと実施例１及び実施例２で得た不溶化ＯＤＡ抗
体小球１個ずつを入れる。そしてローチーターを用いて
室温で４時間インキュベージ、ンを行った後、試験管内
液を除去し、さらに生理食塩液ｌ＠ｔで洗浄する。

識し、ゲル濾過にて精製した後１％牛血清アルブミンを
含む０．０５Ｍ）リス緩衝液（ｐＨ８，６３Ｊ希釈した
溶液）２００μノ　ずつを加えた後。

八 ローチーターを用いて一晩インキュベーションを行う。

次いで試験管内液を除去し、さらに２度生理食塩液１．
０−で洗浄した後各試験管の放射能量を測定するいわゆ
るサンドイツチ法によるラジオイムノアッセイ法（ＲＩ
Ａ法）により標準曲線及び被検血清中のＣＢＡの値をめ
る。

その結果を図面と表１に示す。

なお１表１には、比較のため実施例１に準じて公知□技
術である不活性タンパク質（特開昭５０−８２２８０号
公報）又は糖類（特開昭５４−１１８８９６号公報）で
処理した不溶化ＯＥｋ抗体小球を用いた時の測定結果も
併せて示した。

不溶化タンパク質は上記の保存温度で８日間、但し本発
明の方法については４日間保存した。

以上の結果から本発明の方法によって処理した不溶化タ
ンパク質を用いた場合、４℃と４５℃での測定値の変化
は少なく安定化効果が認められた。

またラジオイムノアッセイに良好な標準曲線を得た。

実施例４ 実施例８と同じ条件で実施例２の硫酸マグネシウムの添
加量を変えて５日間保存し、その効果を検討した。その
結果を表２に示す。

この結果から、硫酸マグネシウム濃度が０．００５〜１
．０Ｍの範囲で安定化効果が認められるが、特に０．０
５Ｍ以上ではいずれの濃度においても優れた効果が認め
られる。

表２ （ＩＩＡ法） 得た。なおこの時のＰＥＳ液は０．０１Ｍリン酸緩衝液
０．５Ｍ塩化す）ＩＪウム（ｐＨ−８−，４）を用いた
。

試験管に標準溶液又は被検血清をそれぞれ２０μノ　ず
ツヲ入れた後ＰＥＳ液（０，０１Ｍリン酸緩衝液０．５
Ｍ塩化す）ＩＪウム　ｐＨ７，４Ｆ）と上記の不溶化Ａ
ＦＰ抗体小球１個ずつを入れダーゼ標識ＡＦＰ抗体溶液
（石川らの方法にてＡＦＰ抗体を西洋ワサビペルオキシ
ダーゼテ標識し、精製後ＰＥＳ液（ｐＨ７，４−）にて
希釈した溶液）８００μノ　を加えた後、室温で２時間
放置する。その後試験管内液を除去し、再び２回生理食
塩液１．５−で洗浄後、０−フェニレンジアミン−過酸
化水素混液８００μｌ　を加え室度を比色計にて計測す
るいわゆるエンザイムイムノアッセイ法（ＥＩＡ法）に
より被検血清中のＡＦＰの濃度を測定した。その結果を
表８に示す。

実施例６ ヒト肝７エリチンを用いて実施例と同様にし△ て不溶化７エリチン抗体小球を得た。なおこの時（７）
ＰＥＳ液は０．０１ＭＬン酸緩衝液、０．５Ｍ塩化ナト
リウム、ｐｎＪ、４を用いた。

この不溶化７！リチン抗体小城を用いて実施例８のｌ’
ＬＩＡ法に基づいて、被検血清中の７８リチンの濃度を
測定した。ただし、用いる標準溶液又は被検血清は２５
μ！　酢酸緩衝液５００ｐｌの代わりにＰＢｓ液（ｐＨ
ｙ、＊）ａｏｏＰｔ　。

ヨウ化ＯＦ！Ａ抗体（１２５Ｉ＞溶液ｐｔｏｏｐｔ　の
代わりにヨウ化７エリチン抗体（ＩｔＬｔ　＞溶液８０
０μｌ　を用い、またインキュベージ、ンをそれぞれ室
温で１時間及び２時間とした。その結果を表３に示す。

実施例７ 実施例６で得た不溶化フェリチン抗体小球を用いて実施
例５のＥＩＡ法に基づいて被検血清中の７エリチンの濃
度を測定した。但し、ペルオキシダーゼ標識ＡＦＰ抗体
溶液の代わりにペルオキシダーゼ標識フェリチン抗体溶
液を用いた。その結果を表８に示す。

表８ ？ 不溶化タンパク質は８日間保存した。

上記結果の示す如くいずれの場合も良好な安定化効果が
認められた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明によって処理した不溶化ＯＥＡ抗体を用い
て得たラジオイムノアッセイの標準曲線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 牲 不溶化支持体に固定されたタンパク質（不溶化タンパク
   質）を硫酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムと不
   活性タンパク質を含む溶液で処理することを特徴とする
   不溶化タンパク質の安定化法