JPS60500384A - 生物学的特異親和反応のための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的特異親和反応のための方法及び装置本発明は、不均質系における生物学 的特異反応に基づく分析的測定法実施の改良及び簡素化法、並びにそれに使用す るためのマトリックスに関する。

多数の生化学的測定法は、レセプター及びリガンド間の生物学的特異親和反応（ ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）に基づく。

かかる反応の例としては、例えば抗原抗体反応のような免疫化学反応、例えば酵 素基質又は酵素−補酵素、レクチン−糠のような酵素測定法等が挙げられる。通 常リガンドは測定される成分であり、液体中に溶解されておシ、一方レセプター は液体と接触する担体上に固定さｎる。測定可能な基で標識された既知量のりガ ント、又はいわゆるマーカーを、非標識のりガントと競合させることにより、又 はその替りに非標識のりガントとの反応後に担体に過剰量の標識リガンドを加え ることにより、非標識のりガントの量を測定することができる。

例えば、放射線免疫測定法、すなわちいわゆるＲＩＡ法においては、放射性同位 元素がマーカーとして使用される。この技術においては、例えば、試料中の抗原 分子は、担体に結合した抗体上の有効位置に対して、添加さｎた同位元素標識抗 原分子と競合する。反応後に、非結合物質に洗浄により除去され、担体上の残留 放射線活性量は、試料中の抗原の濃度を示す。あるいは前記に従い、抗原試料は 、同位元素標識抗原の添加の前に、抗原試料を担体上に添加してもよい。

担体として、ゲル又はセルロースの粒子、紙製小ディスク、又は単に試験管の内 壁が使用されてきた。しかしながら、当該生物学的特異反応は実際には比較的速 やかに進行し、従って前記のタイプの担体で得られる不均質反応系においては、 溶液中の輸送現象は、総反応速度及びそれにより測定可能な程度まで反応が進行 するのに要する時間を測定するものである。

自由液体中では、輸送、すなわち対流による濃度差の均一化があり、一方界面で は、吸収液体層が常に存在し、これを通して、輸送が拡散のみにより成される。

この反応速度を決定する拡散層の厚さは、攪拌によって減らすことができ、そ九 故反応系の攪拌又は振動は拡散依存を軽減するのに使用される。総反応速度を増 加するのに使用されるもう一つの方法は、担体の表面積を拡大することである。

これにょジ、例えば、微小ゲル粒子として担体を形成することにょジ攪拌なしで 実質的な拡散に対する非依存性が成しとげら九た。

しかしながら拡散依存を軽減するこｎらの方法は不利な点にも関連する。そ九と いうのも、攪拌を行なうことは特別な装置を必要とし、かつ一定の攪拌状態を保 つことが困難であるために、その再現性は必ずしも満足できるものではない。ま た他方では、例えば前記の微小ビル粒子により担体の表面拡大を行い、物質輸送 速度を増大させるならば、分離及び洗浄工程はむしろより複雑になる。更に、担 体から液相を分離するために遠心分離が必要である。

本発明は、不均質系における生物学的特異親和反応の反応速度を最適化するため の新規方法に関し、同時にこの方法により、攪拌及び遠心分離を行うことを必要 としないより簡単でより確実な分析方法を提供するものである。本発明は、表面 積拡大及び拡散層厚の減少の組合せに基づいており、すなわち、開孔性の液体吸 収マ）　ＩＪツクス体の中で全反応が完全に行われ、その細孔中にはレセプター が固定さｎておりかつそのレセプターは、固相表面間の距離が自腹の反応体の反 応速度が、少くともマトリックス結合レセプターと反応すべき溶解成分又はリガ ンドの拡散速度に対して実質的に非依存になる程度に拡散層を制限するように、 選択さｎた限定空隙容量をマトリックスは有するという概念に基づいて因る。

マトリックス体は”自己含有空間″全形成し、その有孔性のために大きな表面積 能力を有する。従って、比較的小さな太きさでよく、−子ましくは適する支持体 上（＝支持されていてもよく、庇って特別な反応容器は必要ない。分析における 種々の液体はかあるいは吸引器、ピペット又は任意のその他の適当な方法で吸引 さｎる。

本発明による有孔性マトリックス体内で反応を行うことは、従来法よりも良好な 再現性及びより迅速な分析方法を提供し、かつマーカーの測定のための特定の場 合以外はいかなる特別な装置も必要としな−。従って本発明方法はその若干の変 法において、後記のような、例えば当業者に慣用の極めて簡単な手段で遂行さｎ る。

本発明に従って、有孔性マトリックスにおける生物学的特異親和反応を遂行する ことは、それ自体従来技術において公知である。例えば、英国特許第１．４２０ ．９１６号明細書は、放射線免疫測定反応のような、生物学的特異反応において 使用するための反応セルを開示しており、この反応セルは、孔を備えた支持体上 に支持さｎた有孔吸収性物質のマドＩＪックスノ々ツドを包含する。１反応酸分 をマトリックス内に、例えば凍結乾燥形で供給し、他の反応成分を実際の試験中 に加えると、形成ざｎる微粒子反応生成物はマトリックス中に保持される。しか しながら、英国特許明細書による有孔性マトリックス中で反応を行なう目的は、 第一に慣用法において液体水面上での反応容器への撥ね及び湿潤によって起る試 料ロスを避けることである。従って、前記の特許明細書においては、本発明によ るような、溶解成分の拡散速度に依存しな込マトリックスを形成してそのマトリ ックス中で分析反応の反応速度を促進及び最適化する可能性は追求さ九でおらず 、実現もしなかった。このことはその他の多数の発表、例えばＥＰ−Ａ−１３１ ５６，５Ｅ−Ｂ−４０７１１４、ＵＳ−Ａ−３９５１７４８及びＥＰ−Ａ−５１ １８３の方法及び装置にもあてはまる。かかる非拡散依存性は確かに孔の寸法及 びマトリックスの幾何学について特別な要件がめられるが、以前の方法で定義す る理由もなかったし、特別な問題やまして本発明によるその解明はあシ得なかっ た。

次に、本発明の方法の問題となる本質についての簡単な理論的説明を続ける。そ れについての理論的方法に依ると、不均質ト 系においては一定の厚さの層、いわゆるネルンン截散層（Ｎｅｒｎｓｔｄｉｆｆ ｕｓｉｏｎ　Ｌａｙｅｒ　）が形成さｎ、その中で輸送が拡散のみによって行な われるが、そｎに反してこの層の外側の溶液は対流によって完全に混合さｎる。

前記の如く、層の厚さは攪拌により小さくし得るが、拡げしく攪拌した場合も、 １０−１００μｍの範囲の厚さの拡散層が残る。

厚さＬを有する平坦な拡散層について、安定状態の層中でかつ拡散層の平坦な限 定表面間に拡散物質の供給又は除去がない場合に、次の関係が拡散種の濃度に適 用可能であることが知ら〔式中Ｘは限定表面に対する縦座標軸であり、ｃｏはｘ 　＝　０である時の濃度であり（すなわち、層の１表面部分）、がっｃＬはｘ　 ＝　Ｌである時の濃度である〕。

従って傾き を持っ濃度勾配直線が形成され、従って、拡散層を通る金泥は次の式によシ表わ さｎる。

〔式中Ｑは自由液体容積Ｖ中の溶解成分の量であり、旦は拡散層の厚さであり、 Ｄは拡散定数であり、かっＡは固体相の面積である〕。（前記の式１−３はフィ ックの第１及び第２法則から容易に誘導される。） Ｑを除く全てのノ？ラメ−ターは定数であり、Ｑは時間と共に指数的に変化する 。系は拡散限定であってはならないので、拡散工程の半減期は化学的反応の半減 期よりも短くなけｎばならない（これは溶解成分が関係する限り−次運動力学に 従うと思われる）。従って拡散工程の半減期は、Ａを大きくおよび／又は生を小 さくすることにより減らすことができる。

しかしながら、毛細管（本発明のマトリックスの細孔の最も簡単な場合である） におりて、拡散は平らな表面の代シに２つの同心性の円筒面の間で起ると考えね ばならず、この場合式＋１１は次式に置き換えられる。

〔式中、ｒ□は外側の円筒表面の半径であり、ｒＬは内側の円筒表面の半径であ り、かつＫは定数である〕。平坦な拡散層の場合と違い、直線的濃度勾配は得ら れず、この場合は次の式が得られる。

しかしながら、内側円筒表面の半径が外側の半径の１　／　ｅ（〜０．３７）で ある特別な場合について、式（５）ニ次の式に簡明化される。

固体相が半径ｒ。を有する毛細管の壁よシなる系について、溶解相の濃度に、ｒ （０，３７・ｒ□については半径に依存性はなく、かつｒ＝ｒｏについてはゼロ と考えられ、かつ定常勾配はその間に保たれ、式（３）に類似の次の関係が示さ れる：ここで毛細管の半径は拡散層迭に相当する。前記式（３）と同様の方法で 、拡散工程の半減期は、Ａを増加させることおよび／又はヰを減少させることに よって短かくすることができる。前記の如く、ヰは従来法の攪拌により、又は本 発明に依り系の物理的大きさを制限することにより小さくすることができる。従 って、毛細管の拡散層は、毛細管直径の半分よシも決して大きくあり得ない。

この毛細管モデルは本発明の有孔性マ）　ＩＪノックス適用することができ、こ の時毛細管半径は細孔半径に相当する。当該の反応系及び濃度範囲について、化 学反応の半減期は１−１０分間、拡散定数はＩ　Ｑ−７−１０−’　ｃｘ２／　 ｓ　の範囲であると考えられる。これらの値を式（７）にあてはめると、有効固 体相面積２０ｃ！ＩＬ２／液体容積１００　μｌに対して、達成されるべき非拡 散依存性のための、迭（又はｒ。）として最高値約１００μｍが得られる。

固相表面の有効寸法はｄに依存する。ヰよシも小さい大きさの表面積増大要素が 存在する範囲では、これらは有効表面Ａに貢献しない。それは拡散層と自由液体 との間の界面の増加が起らないからである。

前記の円筒状毛細管孔の特別な場合の直径約１００μｍの値は、示された条件下 で達成されるべき非拡散依存性のための円筒状細孔を有する本発明のマトリック スの最大孔直径の近似値としてみなされ得る。勿論、マトリックスの細孔形状は 、本発明範囲内において灯、説明した円筒状形から実質的に変化してよく、従っ て細孔の寸法／形状に関する要件は、マトリックス細孔中で起る拡散工程が、特 定の直径／面積／容積寸法を有する円筒状毛細管孔中で得られるそれに実質的に 等しくなるようなものとして述べることができる。

細孔の理想的最高寸法からの特定の偏差は、結果に対して本質的で実際的ないか なる影響も与えないが、マトリックス物質は比較的に均質であるべきである。従 って、液体で満されておりかつ液体中に溶解した成分とマトリックス骨格に固定 した成分との間の比較的に厚い拡散層をひきおこすものより大きな中空又は空隙 は決しであるべきではない。更に、マトリックス骨格は、（少なくとも広い範囲 ではなく）透過可能でもなく、有孔性を呈してもならず、それによって限定不可 能な拡散層を生成する。当然、固定成分でマ）　ＩＪラックス製造するために細 孔寸法の避けられない下限がある。しかしながら、これは当業者により容易に実 現され、従ってここで更に議論する必要はない。

一定のマトリックス物質の適当な細孔寸法及び必要な均質性は、例えば異なる細 孔寸法のマトリックス物質中の反応速度を従来法の不均質系中の反応速度（この 際拡散依存性は攪拌又は振動により実質的に除かれる）と、あるいは相応する表 面積拡大系、例えば前記の微小ゲル粒子と比較することにより、当業者には比較 的簡単に経験に基づいて測定し得る。

前記の有孔性の要件が満足すれば、マトリックスは、液体試料、洗浄溶液等がマ ）　ＩＪツクス体により直ちに吸収及び保持され得る程の毛細管現象を得る。当 該の生物学的特異親和反応における液体媒体は通常水なので、マ）　ＩＪラック ス質の細孔表面は、マ）　ＩＪノックスより吸収及び保持される液体のために親 水性であるべきである。それとは別の疎水性物質の親水性吸収表面は、界面活性 剤での処理、又は後に説明するような公知技術での耐久表面処理により得られる 。おそらく、固定成分又はレセプターをマトリックス中に適用する場合には、疎 水性細孔表面は十分に親水性である。

マトリックス物Ｎは硬質又は軟質いずれでもよい。軟質マトリックスは、更に後 記するような具体例について好ましいものである。本発明の目的のために必要な 有孔性は、例えば焼結したもの、繊維又はスポンジ物質において達成され得る。

マ）　ＩＪラックス質は種々の物質から選択され得、例としては、ガラス、金属 、種々のプラスチックス、例えばポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエ チレン、ナイロン、及び特定の天然海綿、繊維物質等が挙げられる。しかしなが ら、有利にはマトリックス物質は、可溶性又は不溶性の多糖類、それ等の誘導体 又は多糖類を被覆した合成物質から選択される。使用できる多糖類の例は、セル ロース、デキストラン、アガロース、澱粉等であり、これらは例えばその付着性 を増すためあるいはその溶解性を減らすために架橋結合のような誘導化を受けて も良い。特に適する物質は、その乾燥重量の７−２０倍の水吸収能力を有するセ ルロース泡状物又は相応するその他の同様の特性を有する多糖類泡状物である。

セルロース泡状物の中で、特にウニテックス（Ｗｅｔｔｅｘ、登録商標）及びス ジ（Ｓｕｇｉ、登録商標）の商品名で市販されているものが挙げられる。ウニテ ックスは、七ロブラストＡＢ社（Ｃｅ１ｌｏｐｌａｓｔ　ＡＢ、　Ｎｏｒｒｋｏ ｊｓｉｎｇ、　ｓｗｅｄｅｎ）により市販されたセルロース泡状生成物のための 登録商標であり、これは乾燥状態でその乾燥重量の約１０−１５倍の水吸収能力 を有する。スジは、ケッチンバッハ　デンタル社（、、Ｋ　ｅｔｔｅｎｂａｃｈ Ｄｅｎｔａｌ、　Ｅｓｃｈｅｎｂｕｒｇ、　Ｗｅｓｔ−Ｇｅｒｍａｎｙ　）によ り市販された同様の生成物のための登録商標である。

固定成分又μレセプターは共有結合により又は吸着にょクマトリックスに結合さ れ得る。この結合においては、例えば米国特許第３，６４５，８５２号明細書中 に開示された（この開示はこの参照により具体化される）いわゆるＣＮＢｒ−法 が、極めて有利であることが判った。中空又は空隙の表面は、使用するりガント に対するその特性を改善する為に、例えば液相中の成分がマトリックス骨格に非 特異的に結合するのを阻げるために、任意に変更されてよい。前記の物質を包含 する固型体又は基質の表面を、例えばゲル又はポリマー層で被覆するための種々 の技術は当業者に公知である。新規の有利な表面被覆方法は、欧州特許出願筒８ ３８５０２７４．８号明細書（この告知はこの参照にょ勺具体化される）に記載 され、これはポリマー層で被覆した表面に関係し、その架橋結合度は、例えば架 橋結合度が基質から外へ向って減少するように、深さで調節される。これは例え ば合成有孔ポリマー基体中のＣＮＢｒを吸収し、続いてこれを、適当なｐＨを有 する多糖類溶液（例えばアガロース）中に浸すことによシ達成される。このよう に基体の孔は異方性ＣＮＢｒ〜架橋結合アガロース１により被覆され、これに成 分が固定され得る。

前記に依シ拡散限定運動力学を避けるための条件は満足されたとｂう事実にもか かわらず、固相がゲル又はポリマー層よりなるかまたはそれによって備えられ、 それに１反応酸分が固定された場合に、固定化成分の低下した見かけの濃度を引 きおこす反応中の溶解成分の”内部”濃度勾配が形成される。十分に高い見かけ の濃度（真の濃度よりも８０％大きい）は、周知のテイーレ単位（’ｌ’ｈｉｅ ｌｅ’ｓ　ｒｎｏｄｕｌｅ　）　ｏｒ　が系について、２よジも小さい場合に得 られる。これは次式に示される。

〔式中２はゲル層の厚さであり、ｒヶはデル層中の反応の半減期であジ、かつ百 はゲル層中に溶解した成分の拡散定数である〕。

■がＤに等しく、かつＴ６が全系の前もって仮定した半減期の１００分の１であ る場合に、ｚ　（１５μｍ々らばω〈２という要求は満足される。従って、約１ ５μｍよシも低い厚さを有するゲル又はポリマー層は、総反応速度に対して重要 性を持たないものとみなされる。

本発明で使用するためのマドＩＪツクス体は任意の適する形態、例えば立方体、 塊、球、粒子等で形成される。本発明の目的のために、マドＩＪツクス体は、例 えばプレートに接着させたり、プレートのフレームあるいはウェルに固定するこ とにより、支持体に適当に備えつけられる。

レセプター成分は、切断されるか個々の小さなマ）　ＩＪツクス体に形成される 前に、マドＩＪツクス体に適当に固定される。勿論、レセプター成分の適用は、 前もって形成されたマトリックス体に行なうこともできる。

本発明の方法及びマトリックス体が使用され得る生物学的特異反応の例としては 、例えば抗原あるいはハプテンと抗体との間の反応のような免疫学的反応、例え ば酵素−基質又は酵素−補酵素、レクチン−糖、ＩｇＧの蛋白質Ａ−Ｆｃ部分、 ビオチン−アビジンといった酵素反応、例えばアセチルコリン−アセチルコリン 受容体といった神経伝達体／受容体反応等が挙げられる。免疫学的反応に関して は特に本分析方法におけるレセプタースはりガントとしてモノクローナル抗体の 使用が挙げられるべきである。

行われ得る種々の分析方法の中で、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）及び酵素免疫測 定法（ＥＬＩＳＡ）を挙げることができ、この際、放射活性で標識された基又は 酵素が各々検出可能な基又はマーカーとして使用される。螢光の又は燐光のマー カー、化学的ルミネッセンスを示すマーカー等に基づく方法も挙げることができ る。

分析方法は、マーカーが検出されるリガンドと競合するようにするか、又はサン ドウィッチモデルに依シ、先ず試料を加え次いで標識抗体の過剰量を加えるよう な慣用法で実施することができる。その他の技術の中では、二重抗体法（ＤＡＳ Ｐ）及びＲＡＳＴ（放射線アレルギー吸収試験）が挙げられる。

前記のように、本発明の方法は以前に使用された方法に比較して著しく迅速でか つ簡素化された方法であシ、それというのもマトリックス体が大きな表面積能力 を有する自己含有空間を形成するからであり、この中で添加液体は再現可能な型 で吸収及び保持され、かつ生物学的特異親和反応は、拡散限定運動力学を避けな がら、最適速度で進行する。特定の型式の分析、例えば同位元素又は酵素で標識 したりガントを加える前に試料をマトリックスに加える前記のＲＩＡ又はＥＬＩ ＳＡにおいては、本質的にマトリックス体の全吸収容量を利用しなければならな い。かかる場合には、マ）　ＩＪラックスよる吸収可能な最高容積に関するわず かな不足は適当に充足される。試料及びマーカー物質が有効反応位置に対して競 合する試験方法については、全マトリックス容積は使用される必要はない。実際 の使用に適する液体容積は、例えば約１０μｔから約１ｍｌである。

本発明の方法及びマトリックス体が適用される分析方法においては、マーカーに 関する測定は慣用法で（液体をマトリックスから分離した後に）マトリックス体 上で、又は分離した液相上で当該の分析の方法に依シ行なうことができる。

本発明の方法は極めて簡単な測定システム、特にカラーマーカーに基づく分析方 法を拡張するものである。すなわち測定は慣用法で反射光度法によりマトリック ス表面上で直接行なうことができる。分離した液相上の測定のために、マトリッ クス体のための特別な支持体を設計することができる。その下方には、マトリッ クス体中に吸収され得る最高液体容積よりも少なくとも若干大きい容積を有する 小容器を備える。マトリックス物質か弱親水性であるならば、細孔中に保持され る液体容積は、例えばヘプタンのような疎水注液体によシ容器中に完全に置き換 えられる。次いでマトリックス体の下の容器中に置き換えられた液体のカラー強 度に関する測定は、慣用の光度測定法により行なうことができる。

もう一つのカラー分析系は、マトリックス体中のマーカーの反応後に、第一マト リックス体よシも小さい細孔寸法を有し、カラー反応の基質を含有し得る第二マ トリックス体をそれにあふれた液相をぬきとるために適用することよシなる。

次に、本発明の試験方法の簡単な具体例を、Ａ−Ｄが異なる方法工程を示す添付 図面図１に関して記載する。

図中、本発明のマトリックス体１はプレート２に固定される。

マトリックス体１はマトリックス骨格に結合又は吸着した適当なレセプターを有 する。例えば、抗原を有する試料に関する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を行なう場 合は、レセプターはこの抗原に対する抗体である。マ）ＩＪックス体の吸収容積 に対応する試料の適量を、−ペット３を用いて各マトリックス体１に加える。適 当な時間（例えば１０分間）インキュベートした後、プレート２を回転させ、吸 収物質４、例えば紙に対して加圧し、マトリックス体１中の全液体をそこに吸引 させる（Ｂ）。次いで洗浄溶液を滴下壜５で供給し、次いで洗浄溶液は前記と同 様の方法で吸収物質に吸引される。

この工程は十分な洗浄を達成するために数回くシ返す。試料と同じ容積の酵素− 抗体複合体をピペットで直接マトリックス体１に加え（Ａ）、例えば約１ｏ分間 再びインキュベートする。もう一度前記と同様の方法で再度洗浄を行ないＣＣ） 、次いで酵素マーカーを作用させるべき基質を滴下壜６を用いて加える（Ｄ）。

約５〜１０分間後に、結果は視覚的に判定できる。

本発明を行なうだめの前記の装置は、勿論その１例にすぎず、本発明の原則に基 つくその他の非常に多くの装置を使用することができる。

次Ｋ、本発明を若干の非限定例につき説明する。

実　施　例　１ この例は、連鎖球菌Ａ抗原の準定量のためのサンドウィッチ型酵素免疫測定法に おける固体相としてスポンジ状微細孔性セルロース物質の使用を記載する。

抗体の結合 ウニテックス布（ウニテックスはビスコースから製造した白色スポンジ状セルロ ース泡状物質に対する登録商標であり、これは乾燥状態で厚さ約２−４罪、重量 的２５０−３５０ｇ／ｍ２、かつその乾燥重量の約１０−１５倍の水吸収能力を 有する：セロプラス１−ＡＢ社よシ市販）から、正方形片（５ｘ５ｍ）ｉはさみ で切った。次いで、かかる断片１００枚を０．１ＮＨＣ４，蒸留水、０．１　Ｍ 　ＮａＯＨ再び蒸留水で各々洗浄した。次いで上清液を吸引により完全に除去し 、０．６　Ｍ　リン酸塩緩衝液（１）Ｈｌｌ、７）２０Ｍを加えた。セルロース 物質の活性化のために、反応容器を水浴中に置いた。活性化は蒸留水中１％ＣＮ Ｂｒ−溶液２０Ｍの添加によジ開始し、ガラス棒を用いてゆっくり攪拌しながら 正確に６分間継続した。この後に、ウニテックス片をガラス−フィルターロート 上で蒸留水で注意深く洗浄した。次いで断片をアセトン処理及び室温でのアセト ンの蒸発により乾燥させた。

活性化ウニテックス片を、抗体と結合させるまで、＋４℃でデシケータ−中で貯 蔵した。

抗体（）、ンマーグロブリン分画）を、抗体希釈曲線に依り０．１Ｍ　ＮａＨＣ Ｏ３中に１００倍希釈した。３ＱｍｌをＣＮＢｒ−活性化ウニテックスの１００ 片に加えた。結合反応は＋４℃で振盪々しに一晩継続した。次いでウニテックス 片は順に、０．１　ＭＮａＨＣＯ３，０，１Ｍ１−リス、ＨＣｌ、　ｐＨ８，０ 及び洗浄緩衝液（０，１Ｍリン酸塩緩衝液中０．３Ｍ　ＮａＣｔ、０．１％トウ ィーン２０．０．０１％ＮａＮ３．　ｐＨ７，４）で注意深く洗浄した。

同様の方法で慣用の濾紙に抗体を結合させた。

抗体の取り込み １０　細菌　７Ｍ及び１０　細菌／　ｍＡから抽出した連鎖球菌Ａからの２種の 異なる製置の多糖類抗原を各々使用した。前記の洗浄緩衝液及びウニテックス片 を陰性対照として使用した。

試料１００μｔｆ、前記のように抗体と共有結合させたウニテックス片及び濾紙 の両方に加え、１．３．１０及び３０分間インキュベートした。この後に支持体 を洗浄緩衝液で洗浄し、抗体２．４μｇ／ｍｌに希釈した、連鎖球菌Ａ抗原に対 する抗体にガラクトシダーゼを結合した酵素−抗体複合体（この複合体はファ／ ｌ／’７シア社Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎから市販により得ら れる）１００μｔを加え４．１時間インキュベートし、次いで支持体をもう一度 前記のように洗浄した。上清液を吸引により除去し、０−ニトロフェニル−β− ガラクトシ）２００μｔを酵素基質として加えた。３０分後に酵素反応を０．５ 　Ｍ　ＮａｚＣ０３５００μｔで中止した。上溝液を使い捨てポリスチレンキュ ベツトに移し、自動フィルター分光計により４０５ｎｍで（ＬＫＢ７４００ウル トララブシステム　Ｕｌｔｒａｌａｂ　ｓ３’ｓｔｅｍ　）比色測定した。結果 は第２図に示され、ここでは曲線Ａ及びＣは、抗原濃度各々１０８細菌／ｍｅ及 びｌＯ６／ｍｌでのウニテックス支持体に対する取り込みを示し、曲線Ｂは１０ ８細菌／成で濾紙に対する取り込みであり、曲線りはウニテックス片での対照で あυ、かつ曲線Ｅは濾紙での対照である。

この図から、抗体に対する支持体としてのウニテックスでの反応速度は、濾紙で のそれよりも極めて高く、かつプラトーレベル（平衡）は抗原の高及び低濃度両 方とも数分間で達成されたことが明らかである。

検出限界の測定 このＥＩＡシステムの検出限界を測定するために、連続的に希釈した連鎖球菌抗 原での標準曲線を作成した。抽出物の細菌濃度は１０８／祷から１０’／ｍｌ　 まで変化させた。各希釈物１００μｔを、抗体を結合させたウニテックス片と共 に１５分間インキュベートした。次いで布片を前記のように洗浄し、前記で使用 したのと同じ緩衝液で１００倍に希釈した前記の酵素−抗体複合体１００μｔを ウニテックス片と共に更に１５分間インキュベートした。最後の洗浄工程後、酵 素活性を前記と同様の方法で測定した。得られた標準曲線から、この迅速な免疫 測定により細菌含量を１０５Ｍ菌／ゴの量まで下げることが可能であることが判 った。

試験方法 次いで抗体を結合したウニテックス片を、第１図に関して前記したような装置で の試験方法を示すために使用した。

はとんど乾燥した抗体を結合したウニテックス片（水は吸引した）をプラスチッ ク製　スライド（第１図中２）上に置き、スライド上には膠（ＲＸ膠、カスコ社 Ｃａ５ｃｏ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）をウニテックス片の固着場所に施こしてお いた。１５分間後に、布片はスライドに固着した。次いで抗原試料５０μｔを直 接ウニテックス片に適用した。全液体を吸収し、１０分間インキュベートした後 に、スライドを回転させ、ウニテックス片を濾紙に対して加圧し、更に洗浄溶液 （前記と同様の緩衝液）を滴下壜で加えた。洗浄溶液を前記と同様の方法でウニ テックス片から圧出させ、極めて少量の洗浄溶液を必要とするだけのこの洗浄工 程を、３回繰り返した。次いで前記で使用した酵素−抗体複合体５０μｔを加え 、更に１０分間インキュベートした。

次いで洗浄工程をくり返し、最後にウニテックス片を前記の０−ニトロフェニル −β−ガラクトシド基質で湿潤させた。その後結果は５−１０分間以内に視覚的 に判定できだ。２５％エチレングリコールを含有する、０．４　Ｍ炭酸塩緩衝液 、Ｉ）Ｈ９，Ｏで反応を中止することにより、数時間安定した正反応を保持する ことができた。

実　施　例　２ この例においては、本発明の有孔性ポリマーの抗原の取り込みを、緻密ポリマー のそれと比較し、この際抗体は各ポリマーに適用したアガロース層に結合させた 。

アガロース層での被覆 アガロース２７Ｍ１を水１〇−中に入れ、アガロースが融けるまで沸騰水浴上で 攪拌下に加熱した。次いで溶液を一晩冷却させた。この後に１２．５　Ｍ水酸化 ナトリウム溶液２．５Ｍを加え、混合物を１時間激しく攪拌した。

厚さ１ｍのプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ、登録商標）の５×５鵡正方形 デイスク及びポリ酢酸ビニルの厚さ６■の有孔性単線を押出した直径５陣の円筒 プラグ（エレクトロー−トストリップ、Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ　５ｔｒｉｐ、ファ ルマシアＡＢ社）を、しつかシした栓を備えた臭化シアンの結晶を入れたガラス 管に各々導入した。

１時間後、ディスク及びプラグを取シ出し、各々前記の製造したアガロース溶液 釜５００μノ中で２時間インキュベートした。

溶液を吸引し、ディスク及びプラグを、各々０．５Ｍ重炭酸ナトリウム溶液でく シ返し洗浄し、この溶液中に２４時間貯蔵した。

抗体の結合 ディスク及びプラグを、ｐＨ１１，５の０．５Ｍリン酸カリウム溶液４１１！７ ！及び水９ゴに臭化シアン１ｇを溶解した溶液１ゴを入れた、水浴中区浸したビ ーカー中に移した。１８％硫酸ナトリウム溶液で沈殿させた羊からのラビッ）− ＩｇＧＫ：対する抗ｍ？ｉｌ（マイルズラボラトリーズ社Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、　＊Ｅｎｇｌａｎｄ　）　２００μノを入れた管中 にディスク及びプラグを各々移し、当初容積の０．１５　Ｍ塩化ナトＩＪウム溶 液中に溶解し、０．１饅トウイーン２０を含有する０、１Ｍ重炭酸ナトリウム溶 液中で５０倍に希釈した。４Ｃで一晩インキユベートした後、溶液を吸引し、デ ィスク及びプラグを０．１％トゥイーン２ｏを含有する０、　５　Ｍ重炭酸ナト リウム溶液で１０分間３回、リン酸ナトリウムに関して０．１ＭであるｐＨ８の ０．１　Ｍエタノールアミン溶液で４時間、かつ塩化ナトリウムに関して０．１ ５　Ｍでる。ＩＣ０，５％トウィーン２０を含有する０、１Ｍリン酸ナトリウム 、ｐＨ７，４で３０分間５回各々洗浄した。

ラビット−ＩｇＧ−Ｉの製造 反応ガラス管を水浴上に置いた。管に、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０ 中１ダ／ｒＩＬｌのラビット−ＩｇＧ（マイルスラボラトリー社）５０μノ、１ ．５ｍＭクロラミンＴ（メルク社Ｍｅｒｃｋ、分析用）１００μノ及びＮａ−１ ２５■、５００　ｍｃｉ　／Ｎ　にューイングランドニュークリアーＮｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　ＵＳＡ　）　０．７２μノを加えた。２分間 後、０．１　Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液２０μノ及び０．１Ｍヨウ化カリウム溶 液５０μノの添加により反応を中止した。チオ硫酸ナトリウムに関して０．０５ 　Ｍであシ、かつ０．０５％トウイーン２０及び２％ヒト血清アルブミン（シグ マ社Ｓ　ｉｇｍａ。

ＵＳＡ）を含有するｐＨ７，４の０．０５Ｍリン酸ナトリウム溶液で平衡にした セファデックスＧ　−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５，７アルマシアＡＢ 社）を有するカラムで反応混合物を脱塩した。全隙分画を０．１％トウィーン２ ｏを含有するｐＨ７，５の０．１Ｍ硫酸ナトリウム溶液で４倍【希釈した。

抗原の取シ込み ０．１％トウィーン２ｏを含有するｐＨ８の０．１Ｍリン酸ナトリウムｌＯ−に 、前記のように製造したラビット−１ｇ　Ｇ　−１２５１１０μｇ／ｒｌｌ溶液 １０μノを加えた。この溶液２００μノ中に、アガロース被うディスク及びプラ グを入れ、１分間、３分間、１５分間、１時間及び５時間各々インキュ村−トし た。次いでディスク及びプラグを、０．５％トゥイーン２ｏを含有する０、　３ 　Ｍ塩化ナトリウム溶液で各々洗浄し、残留放射活性を測定した。付加した総活 性に対する係での測定活性を次の表に示す。

前記の表から、抗原の取シ込み及びそれによる反応曲線の平坦化（これは実質的 に反応の完了を示す）が、ディスクよシも有孔プラグに対しての方がかなシ速や かに起ることが明らかである。従って生物学的特異親和反応に基づく生物学的試 験におけるかかる有孔プラグの使用は、緻密担体基質上に行なわれた対応する試 験よ沙も実質的に短かいインキュベーション時間で直径６．２６を有する微細孔 ディスク（ウニテックス、七ロブラスト社）を、１％ＢｒＣＮ−浴数で活性化し た。各ディスクに羊抗−ｈＧＨ−抗体（Ｎａ２Ｓ　Ｏ，沈殿によシ羊抗血清から 製造した）５μＩを結合させた。製造したディスクを、０．９％ＮａＣＪ、０． ３係デキストランＴ４０（ファルマシアｚＡＢ社）及び０，０５％ＮａＮを含有 するｐＨ７，４の０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中に＋４Ｕで保持した。

ｈＧＨ−測定を行なう前に、余剰の緩衝液を水眩引器に連結したノズルを用いて ディスクから除去した。各試験管にウニテックスディスク１枚及びｈＧＨ非含臂 馬血清（ｈＧＨ非含有希釈液、ファデパスｈＧＨＰＲＩ　ＳＴ　ＣＰｈａｄｅｂ ａｓ　ｈＧＨＰＲＩ　ＳＴ、登録商標、ファルマシアＡＢ社〕）中の純粋ｈＧＨ の種々の希釈Ｗ（０，５−１５０μＵ／Ｊ　）　１００μノを加えた。試験管を ２３０で１５分間インキュイードし、次いで各ディスクに塩溶液２５０μノを５ 回添加し、添加の間に吸引して微細孔ディスクを洗浄した。

ゝ５■−抗ｈＧＨ−溶液（ラビット中に産したＩｇＧ−抗体、ファデパスｈＧＨ −ＰＲＩＳＴ、９ｎｇ／試験管）１００μＪを、試験管に加え、２３Ｃで２時間 インキュベートした。次いでディスクを前記のように洗浄し、その後放射能をガ ンマ−カウンターにより測定した。結果は次の表２に示す。

ＥｒＣＮ−活性ａ紙に結合した抗−ｈＧＨ−抗体（ファデパスｈＧＨ−ＰＲＩＳ Ｔ、ファルマシアＡＢ社）で同様の結果を得るためには、最初のインキュベーシ ョンは２３Ｃで３時間必要とし、一方第二のインキュイージョンのためには閤じ 温度で約１６時間必要とする。従って、濾紙の代夛にこの微細孔マ）　ＩＪラッ クス使用することによシ、インキュベート時間は著しく減少し、濾紙による従来 のＰＲＩＳＴ法での２０時間に対して、全試験時間は３時間以下となる。

直径６．２９’ＦＣ有する微細孔ディスク（ウニテックス、七ロブラストＡＢ社 ）を１％ＢｒＣＮ−溶液で活径（た。各ディスクに、抗−モルモツ）　−ＩｇＧ −抗体（ＮａＢＳＯ４沈殿により羊から製造した）５μｙを結合した。エタノー ルアミン処理を含む洗浄後、ディスクを０．９　％　ＮａＣノ、０．３％デキス トラｙＴ４０（ファルマシアＡＢ社）及び０．０５　＊　ＮａＮａを含有するｐ Ｈ７，４の０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で４Ｃで保持した。

試験管に次の試薬を加えた： ｐＨ６，５のリン酸塩緩衝ｉ（１％ヒト血清アルブミン、０．０５−　−−　＋ ＋　ｂ　％、　ｖ＋’　＋　ｗ　％ｒ　＋＋　＋）石泊ユ　Ｌ　ＩＩ　＾　ｔｓ ｔｈｒｒｓ　し　ｋ　ノ　１／、１１ｉ　１１１／の檀々の希釈物２５μノ、 １２５１−インシュリン５０μノ（ファデパスーインシュリン試馳、ファルマシ アＡＢ社、約４０ｐｇ／管）、ｐＨ７，４のリン酸塩緩衝液（０，（１５Ｍリン 酸ナトリウム、０．９係ＮａＣム０．３％ヒト血清アルブミン、０．０５％Ｎａ Ｎ８）中に希−モルモットＩｇＧ−ディスク１枚を各試験管に加えた。

この添加の前に１過剰の緩衝液を水吸引器に連結したノズルを用いてディスクか ら除去した。インキュベートは２３Ｃで１．５時間行なった。次いでディスクを ０．０５％レネツクス３０　（Ｒｅｎｅｘ３０、ポリオキシエテレンエーテル： アトラスケミイ社、ＡｔｌａｓＣｈｅｍｉｅ、　Ｅｓ５ｅｎｓ　Ｗｅｓｔ　−Ｇ ｅｒｍａｎｙ　）　を含む塩溶液２５０　ｆｉＪで５回洗浄した。塩溶液の各添 加の後に、直ちに液体を吸引した。

試験管の放射活性はガンマ−カウンターで測定した。分析結果を次の表３に示す 。

前記から明らかなように、競合型免疫測定は、攪拌なしの短時間のインキュベー トと、結合及び遊離トレーサーのための迅速で簡便な分離工程によシ液札中で行 なうことができ、その除遠心分離あるいはその他の複雑な装置は必要ない。

実施例５ この例においては１本発明の微細孔担体マトリックスを、抗原の取シ込みに関し てそれを時間の関数として、巨大粒及び微細粒を反応運動力学的に比較する。

符表昭６０−５００３８４　（１Ｑ） 直径４５−１６５μｍ１球状のアガロース（セファロース−６Ｂ、ファルマシア ＡＢ社、Ｓｗｅｄｅｎ　）　６．５Ｉを、ガラスフィルターＧ３上で水で洗浄し 、水冷ビーカー中に移した。０．５　Ｍ　’Ｊン酸カリウム緩衝液（１）Ｈｌｌ −５）４ゴ及び水９尼中に臭化シアン（ポリサイエンセス社Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎ ｃｅｓ、　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５３ｒｌｖａｎｉａ。

ＵＳＡ）１　、Ｐを溶解した浴液１１１Ｌｌを加えた。６分後、ゲルを再びガラ スフィルター上に移し、氷冷水で洗浄した。ｍｅナトリウムで沈殿させた羊から のラビット−ＩｇＧ　（フィルタ　ラボラトリ−社、Ｅｎｇｌａｎｄ　）に対す る抗−血清を、０．１％トウイーン２０を含有する０、１Ｍ重炭酸す）　Ｉ）ラ ム溶液で、蛋白質義度０．３η／−に希釈し、この溶液エゴを乾燥吸引アガロー スゲルに加えた。６時間注意深く振盪した後に、ｐＨ８の０．１　Ｍ　！Ｊン酸 塩緩衝液中の０．２Ｍエタノールアミン２ＩＩｌｔを加え、振盪を一晩続けた。

次いでゲルをｐＨ４の０．１Ｍ酢酸塩緩衝液で、続いて０．９％塩化ナトリウム 、０．３％デキストランＴ４０（ファルマシアＡＢ社）及び０．５チトウイーン ２０を含有するｐＨ７，４の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。

微細粒 直径１−３μｍ、粒状のアガロース０．５．９’ｋ、洗浄工程における分離をガ ラスフィルターでの代シに遠心分離（エツペンドルフＥｐｐｅｎｄｏｒｆ　３２ ００　）によ９行なったことを除いて前記のように処置した。

有孔ディスク 直径４．２５１１１１８を有する微細孔ディスク（ウニテックス、セロプラスｈ ＡＢ社）２０枚を、抗体溶液が１５μｉ／ＩｒＬｌであること及びその２ｍｌを 入れたことを除いて、′巨大粒”の項で前記したように処置した。

０．１％トウイーン２０を含有するｐＨ８の０．１Ｍυｙ酸ナトジナトリウム緩 衝液中ｌ当りラビッ）　−ＩｇＧ−”Ｉ　１０■を溶解した溶液２００μノに、 抗体結合アガロース粒２Ｗ（すなわち、ラビッ）ＩｇＧ２ｍｇ／結合に使用した 蛋白質６μｇ）を加えた。

次いで巨大粒及び微細粒を各々、４本の試験管に配分した２つのノ々ツチに分け 、その１つのパッチは振盪せずに管をゆつくシと回転させるだけでインキュベー トし、もう一つセットした試験管は振盪装置（Ｉ　ＫＡ　−’Ｖｉｂｒａｘ　− ＶＸＲｓセツティング１５００Ｉ　ＫＡ　−Ｗｅｒｋ−５ｔａｕｆｅｎ、　Ｗｅ ｓｔ　−Ｇｅｒｍａｎｙ　）により反応期間中激しく振動させた。

３、工５．６０及び１８０分間の反応時間の後に、各々Ｋ　Ｏ，１％トウイーン ２０を含有する（１３Ｍ塩化ナトリウム溶液１Ｍを加えた。ゲルを遠心分離して 、溶液を吸引した。同様の方法でもう一度洗浄した後に、ゲルによって取り込ま れた放射能を測定前記のようなラビット−ＩｇＧ　−”Ｉ　５０μ）を、吸引乾 燥した抗体結合微細孔ディスクに加えた（すなわち、ラビッ）　−ＩｇＧＯ，５ ゴｇ／結合に使用した蛋白質１．５　ｔｔ＆　）。３．１５．６０及び１８０分 間の反応時間の後に各々溶液を吸引し、０．１チトウイーン２０を含有する０、 ３Ｍ塩化ナトリウム溶液でディスクを２回洗浄した。ディスクにより取り込まれ た放射活性を測定した。

得られた結果を次の表４に表わす： 前記の結果から、激しい振盪又は粒子の大きさの減少により得られる動力学的改 善は、本発明による微細孔担体によっても得られることが判る。

浄書（ｆ−１容をこ変更なし− 一 昭和５９年１２月７３日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＳＥ　８４１０００３３２、発明の名称　生物学的特 異親和反応のための方法及び装置３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ファーマシア・アー・べ一 ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル６、補正により 増加する発明の数 ７、補正の対象　特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、出願人の代 表者の欄、図面の翻訳文及び委任状８、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面中、出願人の代表者を別紙 の通り補充する。

■鮮明な図面の翻訳文を別紙の通り補充する。（内容に変更なし）（３）委任状 および翻訳文を別紙の通り補充する。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体中に溶解されている第１成分又はリガンドと、液相に接触している担体 上に不動化されておシかつ前記第１成分に対して生物学的特異親和性を有して不 動化複合体を形成する第２成分又はレセプターとの間の不均質系における少なく とも１種の生物学的特異親和反応に基づく分析方法であって、その際かかる反応 を、少なくとも１種のマーカーの存在に関して前記の固定複合体又は前記の分離 液相を測定することによシ検知および任意に定量し、かつその際液体吸収有孔マ トリックスを担体として使用し、前記の１種又はそれ以上の生物学的特異反応が 前記のマトリックス内で起るようにその細孔の中に不動化成分を存在させる方法 において、液相の吸収及び保持可能な開口毛細管有孔系を有しかつ限定された空 隙の大きさを有する物質体反応速度が、少くともマトリックス体において対応す る不動化成分と反応すべき溶解反応成分の液相中での拡散に少くとも実質的に非 依存であることを特徴とする前記方法。 ２、マトリックスが、１種又はそれ以上の溶解成分のマトリツ円筒形細孔を有す るマ）　ＩＪラックスそれに実質的に相当するような細孔寸法を有することを特 徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ３、マトリックス物質が、ガラス、金属、例えばポリウレタン、ポリビニルアル コール、ポリエチレン、ナイロン、多糖類及びその誘導体のようなポリマー、多 糖類被覆の合成物質、天然海綿及び繊維物質よりなる群から選択されることを特 徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 ４、マトリックスが、多糖類、多糖類誘導体及び多糖類被覆の合成物質よりなる 群から選択され、好ましくは前記の多糖類がセルロース、デキストラン、アガロ ース及び澱粉よシなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第３項記載 の方法。 ５、前記の１種又はそれ以上の生物学的特異反応べ・免疫化学反応であることを 特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項いずれかに記載の方法。 ６、　マトリックス体の細孔表面が、その他の物質の表面改良層、例えばポリマ ー層で被層されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項いずれかに記 載の方法。 ７、前記の層の厚さが約１５μｍよシも少ないことを特徴とする請求の範囲第６ 項記載の方法。 ８．請求の範囲第１項記載の方法を実施するための有孔マトリックスで、１種又 はそれ以上の前記の生物学的特異反応のための少なくとも１種の反応成分が固定 されているか又は固定され得る開口毛細管細孔系よりなり、前記の細孔系は反応 を行なう際に添加液体を完全に包含及び保持するように調整され、かつ前記の溶 解及び固定した成分の間の細孔系内での１種又はそれ以上の前記の生物学的特異 反応の総反応速度は細孔系中の１種又はそれ以上の固定成分と反応すべき１種又 はそれ以上の溶解反応成分の液相における拡散に少くとも実質的に非依存である ような限定された空隙寸法を有することを特徴とする前記有孔マトリックス。 ９、マトリックス物質が、１種又はそれ以上の溶解取分のマトリックス中の拡散 工程が約２００μｍよυも小さい直径の円筒形細孔を有するマトリックスのそれ に実質的に相応するような細孔寸法を有することを特徴とする請求の範囲第８項 記載の有孔マトリックス。 １０、マトリックス物質が、ガラス、金属、例えばポリウレタン、ポリビニルア ルコール、ポリエチレン、ナイロン、　多糖８及びその誘導体のようなポリマー 、多糖類被覆の合成物質、天然海綿及び繊維物質から選択されることを特徴とす る請求の範囲第８項又は第９項記載の有孔マトリックス。 １１、マトリックスが、多糖類、多糖類誘導体及び多糖類被覆の合成物質よりな る群から選択され、好ましくは前記の多糖類がセルロース、デキストラン、アガ ロース及び澱粉ニジなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１０項 記載の有孔マトリックス。 １２、マトリックス体の細孔表面が、その他の物質で、かつ約１５μｍよりも小 さい厚さを有する表面改良層で被覆されることを特徴とする請求の範囲第８項な いし第１１項いずれかに記載の有孔マトリックス。 １３、前記の固定成分が細孔表面又は前記の表面改良層に共有結合していること を特徴とする請求の範囲第８項ないし第１２項いずれかに記載の有孔マトリック ス。 １４、液体中に溶解した成分とそれに対して生物学的特異親和性を有し液体と接 触した担体上に固定されたもう一つの取分との間の少なくとも１種の生物学的特 異親和反応に基づく分析方法を実施するだめの装置であり、請求の範囲第８項な いし第１３項に記載のマトリックス体の少なくとも１種のマトリックス体（１） を支持する支持体（２）よシなることを特徴とする前記装置。