JPH0672886B2 - 生物学的特異親和反応のための方法及びキット - Google Patents

生物学的特異親和反応のための方法及びキット

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JPH0672886B2
JPH0672886B2 JP59500782A JP50078284A JPH0672886B2 JP H0672886 B2 JPH0672886 B2 JP H0672886B2 JP 59500782 A JP59500782 A JP 59500782A JP 50078284 A JP50078284 A JP 50078284A JP H0672886 B2 JPH0672886 B2 JP H0672886B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、不均質系における生物学的特異反応に基づく
分析的測定法実施の改良及び簡素化法、並びにそれに使
用するためのマトリツクスに関する。
多数の生化学的測定法は、レセプター及びリガンド間の
生物学的特異親和反応（biospecific affinity reactio
n）に基づく。かかる反応の例としては、例えば抗原抗
体反応のような免疫化学反応、例えば酵素−基質又は酵
素−補酵素、レクチン−糖のような酵素測定法等が挙げ
られる。通常リガンドは測定される成分であり、液体中
に溶解されており、一方レセプターは液体と接触する担
体上に固定される。測定可能な基で標識された既知量の
リガンド、又はいわゆるマーカーを、非標識のリガンド
と競合させることにより、又はその替りに非標識のリガ
ンドとの反応後に担体に過剰量の標識リガンドを加える
ことにより、非標識のリガンドの量を測定することがで
きる。
例えば、放射線免疫測定法、すなわちいわゆるRIA法に
おいては、放射性同位元素がマーカーとして使用され
る。この技術においては、例えば、試料中の抗原分子
は、担体に結合した抗体上の有効位置に対して、添加さ
れた同位元素標識抗原分子と競合する。反応後に、非結
合物質は洗浄により除去され、担体上の残留放射線活性
量は、試料中の抗原の濃度を示す。あるいは前記に従
い、抗原試料は、同位元素標識抗原の添加の前に、抗原
試料を担体上に添加してもよい。
担体として、ゲル又はセルロースの粒子、紙製小デイス
ク、又は単に試験管の内壁が使用されてきた。しかしな
がら、当該生物学的特異反応は実際には比較的速やかに
進行し、従つて前記のタイプの担体で得られる不均質反
応系においては、溶液中の輸送現象は、縦反応速度及び
それにより測定可能な程度まで反応が進行するのに要す
る時間を決定するものである。
自由液体中では、輸送、すなわち対流による濃度差の均
一化があり、一方界面では、吸収液体層が常に存在し、
これを通して、輸送が拡散のみにより成される。この反
応速度を決定する拡散層の厚さは、撹拌によつて減らす
ことができ、それ故反応系の撹拌又は振動は拡散依存を
軽減するのに使用される。総反応速度を増加するのに使
用されるもう一つの方法は、担体の表面積を拡大するこ
とである。これにより、例えば、微小ゲル粒子として担
体を形成することにより撹拌なしで実質的な拡散に対す
る非依存性が成しとげられた。
しかしながら拡散依存を軽減するこれらの方法は不利な
点にも関連する。それというのも、撹拌を行なうことは
特別な装置を必要とし、かつ一定の撹拌状態を保つこと
が困難であるために、その再現性は必ずしも満足できる
ものではない。また他方では、例えば前記の微小ゲル粒
子により担体の表面拡大を行い、物質輸送速度を増大さ
せるならば、分離及び洗浄工程はむしろより複雑にな
る。更に、担体から液相を分離するために遠心分離が必
要である。
本発明は、不均質系における生物学的特異親和反応の反
応速度を最適化するための新規方法に関し、同時にこの
方法により、撹拌及び遠心分離を行うことを必要としな
いより簡単でより確実な分析方法を提供するものであ
る。本発明は、表面積拡大及び拡散層厚の減少の組合せ
に基づいており、すなわち、開孔性の液体吸収マトリツ
クス体の中で全反応が完全に行われ、その細孔中にはレ
セプターが固定されておりかつそのレセプターは、固相
表面間の距離が当該の反応体の反応速度が、少くともマ
トリックス結合レセプターと反応すべき溶解成分又はリ
ガンドの拡散速度に対して実質的に非依存になる程度に
拡散層を制限するように、選択された限定空隙容量をマ
トリックスは有するという概念に基づいている。
マトリツクス体は“自己含有空間”を形成し、その有孔
性のために大きな表面積能力を有する。従つて、比較的
小さな大きさでよく、好ましくは適する支持体上に支持
されていてもよく、従つて特別な反応容器は必要ない。
分析における種々の流体は容易に、例えばピペツト又は
同様のもので滴下により加えられ、かつ例えば弾力性マ
トリツクス物質の圧出により除去するかあるいは吸引
器、ピペツト又は任意のその他の適当な方法で吸引され
る。
本発明による有孔性マトリツクス体内で反応を行うこと
は、従来法よりも良好な再現性及びより迅速な分析方法
を提供し、かつマーカーの測定のための特定の場合以外
はいかなる特別な装置も必要としない。従つて本発明方
法はその若干の変法において、後記のような、例えば当
業者に慣用の極めて簡単な手段で遂行される。
本発明に従つて、有孔性マトリツクスにおける生物学的
特異親和反応を遂行することは、それ自体従来技術にお
いて公知である。例えば、英国特許第1,420,916号明細
書は、放射線免疫測定反応のような、生物学的特異反応
において使用するための反応セルを開示しており、この
反応セルは、孔を備えた支持体上に支持された有孔吸収
生物質のマトリツクスパツドを包含する。１反応成分を
マトリツクス内に、例えば凍結乾燥形で供給し、他の反
応成分を実際の試験中に加えると、形成される微粒子反
応生成物はマトリツクス中に保持される。しかしなが
ら、英国特許明細書による有孔マトリツクス中で反応を
行なう目的は、第一に慣用法において液体水面上での反
応容器への撥ね及び湿潤によつて起る試料ロスを避ける
ことである。従つて、前記の特許明細書においては、本
発明によるような、溶解成分の拡散速度に依存しないマ
トリツクスを形成してそのマトリツクス中で分析反応の
反応速度を促進及び最適化する可能性は追求されておら
ず、実現もしなかつた。このことはその他の多数の発
表、例えばEP-A-13156、SE-B-407114、US-A-3951748及
びEP-A-51183の方法及び装置にもあてはまる。かかる非
拡散依存性は確かに孔の寸法及びマトリツクスの幾何学
について特別な要件が求められるが、以前の方法で定義
する理由もなかつたし、特別な問題やまして本発明によ
るその解明はあり得なかつた。
次に、本発明の方法の問題となる本質についての簡単な
理論的説明を続ける。それについての理論的方法に依る
と、不均質系においては一定の厚さの層、いわゆるネル
ンスト拡散層（Nernstdiffusion Layer）が形成され、
その中で輸送が拡散のみによつて行なわれるが、それに
反してこの層の外側の溶液は対流によつて完全に混合さ
れる。前記の如く、層の厚さは撹拌により小さくし得る
が、はげしく撹拌した場合も、10-100μｍの範囲の厚さ
の拡散層が残る。
厚さＬを有する平均な拡散層について、安定状態の層中
でかつ拡散層の平坦な限定表面間に拡散物質の供給又は
除去がない場合に、次の関係が拡散種の濃度に適用可能
であることが知られている： 〔式中ｘは限定表面に対する縦座標軸であり、COはｘ＝
０である時の濃度であり（すなわち、層の１表面部
分）、かつCLはｘ＝Ｌである時の濃度である〕。
従つて傾き を持つ濃度勾配直線が形成され、従つて、拡散層を通る
全流は次の式により表わされる。
〔式中Ｑは自由液体容積Ｖ中の溶解成分の量であり、ｄ
は拡散層の厚さであり、Ｄは拡散定数であり、かつＡは
固体相の面積である〕。（前記の式1-3はフイツクの第
１及び第２法則から容易に誘導される。〕 Ｑを除く全てのパラメーターは定数であり、Ｑは時間と
共に指数的に変化する。系は拡散限定であつてはならな
いので、拡散過程の半減期は化学的反応の半減期よりも
短くなければならない（これは溶解成分が関係する限り
一次反応速度に従うと思われる）。従つて拡散過程の半
減期は、Ａを大きくおよび／又はｄを小さくすることに
より減らすことができる。
しかしながら、毛細管（本発明のマトリツクスの細孔の
最も簡単な場合である）において、拡散は平らな表面の
代りに２つの同心性の円筒面の間で起ると考えねばなら
ず、この場合式（１）は次式に置き換えられる。
〔式中、rOは外側の円筒表面の半径であり、rLは内側の
円筒表面の半径であり、かつＫは定数である〕。平坦は
拡散層の場合と違い、直線的濃度勾配は得られず、この
場合は次の式が得られる。
しかしながら、内側円筒表面の半径が外側の半径の1/e
（〜0.37）である特別な場合について、式（５）は次の
式に簡明化される。
固体相が半径rOを有する毛細管の壁よりなる系につい
て、溶解相の濃度は、ｒ＜0.37・rOについては半径に依
存性はなく、かつｒ＝rOについてゼロと考えられ、かつ
定常勾配はその間に保たれ、式（３）に類似の次の関係
が示される： ここで毛細管の半径は拡散層ｄに相当する。前記式
（３）と同様の方法で、拡散過程の半減期は、Ａを増加
させることおよび／又はｄを減少させることによつて短
かくすることができる。前記の如く、ｄは従来法の撹拌
により、又は本発明に依り系の物理的大きさを制限する
ことにより小さくすることができる。従つて、毛細管の
拡散層は、毛細管直径の半分よりも決して大きくあり得
ない。
この毛細管モデルは本発明の有孔性マトリツクスに適用
することができ、この時毛細管半径は細孔半径に相当す
る。当該の反応系及び濃度範囲について、化学反応の半
減期は1-10分間、拡散定数は10-7−10-6cm2/aの範囲で
あると考えられる。これらの値を式（７）にあてはめる
と、有効固体相面積20cm2/液体容積100μｌに対して、
達成されるべき非拡散依存性のための、ｄ（又はrO）と
して最高値約100μｍが得られる。
固相表面の有効寸法はｄに依存する。ｄよりも小さい大
きさの表面積増大要素が存在する範囲では、これらは有
効表面Ａに貢献しない。それは拡散層と自由液体との間
の界面の増加が起らないからである。
前記の円筒状毛細管孔の特別な場合の直径約100μｍの
値は、示された条件下で達成さるべき非拡散依存性のた
めの円筒状細孔を有する本発明なマトリツクスの最大孔
直径の近似値としてみなされ得る。勿論、マトリツクス
の細孔形状は、本発明範囲内においては、説明した円筒
状形から実質的に変化してよく、従つて細孔の寸法／形
状に関する要件は、マトリツクス細孔中で起る拡散過程
が、特定の直径／面積／容積寸法を有する円筒状毛細管
孔中で得られるそれに実質的に等しくなるようなものと
して述べることができる。
細孔の理想的最高寸法からの特定の偏差は、結果に対し
て本質的で実際的ないかなる影響も与えないが、マトリ
ツクス物質は比較的に均質であるべきである。従つて、
液体で満されておりかつ液体中に溶解した成分とマトリ
ツクス骨格に固定した成分との間の比較的に厚い拡散層
をひきおこすものより大きな中空又は空隙は決してある
べきではない。更に、マトリツクス骨格は、（少なくと
も広い範囲ではなく）透過可能でもなく、有孔性を呈し
てもならず、それによつて限定不可能な拡散層を生成す
る。当然、固定成分でマトリツクスを製造するために細
孔寸法の避けられない下限がある。しかしながら、これ
は当業者により容易に実現され、従つてここで更に議論
する必要はない。
一定のマトリツクス物質の適当な細孔寸法及び必要な均
質性は、例えば異なる細孔寸法のマトリツクス物質中の
反応速度を従来法の不均質系中の反応速度（この際拡散
依存性は撹拌又は振動により実質的に除かれる）と、あ
るいは相応する表面積拡大系、例えば前記の微小ゲル粒
子と比較することにより、当業者には比較的簡単に経験
に基づいて測定し得る。
前記の有孔性の要件が満足すれば、マトリツクスは、液
体試料、洗浄溶液等がマトリツクス体により直ちに吸収
及び保持され得る程の毛細管現象を得る。当然の生物学
的特異親和反応における液体媒体は通常水なので、マト
リツクス物質の細孔表面は、マトリツクスにより吸収及
び保持される液体のために親水性であるべきである。そ
れとは別の疎水性物質の親水性吸収表面は、界面活性剤
での処理、又は後に説明するような公知技術での耐久表
面処理により得られる。おそらく、固定成分又はレセプ
ターをマトリツクス中に適用する場合には、疎水性細孔
表面は十分に親水性である。
マトリツクス物質は硬質又は軟質いずれでもよい。軟質
マトリツクスは、更に後記するような具体例について好
ましいものである。本発明の目的のために必要な有孔性
は、例えば焼結したもの、繊維又はスポンジ物質におい
て達成され得る。マトリツクス物質は種々の物質から選
択され得、例としては、ガラス、金属、種々のプラスチ
ツクス、例えばポリウレタン、ポリビニルアルコール、
ポリエチレン、ナイロン、及び特定の天然海綿、繊維物
質等が挙げられる。しかしながら、有利にはマトリツク
ス物質は、可溶性又は不溶性の多糖類、それ等の誘導体
又は多糖類を被覆した合成物質から選択される。使用で
きる多糖類の例は、セルロース、デキストラン、アガロ
ース、澱粉等であり、これらは例えばその付着性を増す
ためあるいはその溶解性を減らすために架橋結合のよう
な誘導化を受けても良い。特に適する物質は、その乾燥
重量の7-20倍の水吸収能力を有するセルロース泡状物又
は相応するその他の同様の特性を有する多糖類泡状物で
ある。セルロース泡状物の中で、特にウエテツクス（We
ttex、登録商標）及びスジ（Sugi、登録商標）の商品名
で市販されているものが挙げられる。ウエテツクスは、
セロプラストAB社（celloplast AB,Norrkoping,Swede
n）により市販されたセルロース泡状生成物のための登
録商標であり、これは乾燥状態でその乾燥重量の約10-1
5倍の水吸収能力を有する。スジは、ケツテンバツハ
デンタル社（Kettenbach Dental,Eschenburg,West-Germ
any）により市販された同様の生成物のための登録商標
である。
固定成分又はレセプターは共有結合によりマトリツクス
に結合され得る。この結合においては、例えば米国特許
第3,645,852号明細書中に開示された（この開示はこの
参照により具体化される）いわゆるCNBr-法が、極めて
有利であることが判つた。中空又は空隙の表面は、使用
するリガンドに対するその特性を改善する為に、例えば
液相中の成分がマトリツクス骨格に非特異的に結合する
のを阻げるために、任意に変更されてよい。前記の物質
を包含する固型体又は基質の表面を、例えばゲル又はポ
リマー層で被覆するための種々の技術は当業者に公知で
ある。新規の有利な表面被覆方法は、欧州特許出願第83
850274.8号明細書（この告知はこの参照により具体化さ
れる）に記載され、これはポリマー層で被覆した表面に
関係し、その架橋結合度は、例えば架橋結合度が基質か
ら外へ向つて減少するように、深さで調節される。これ
は例えば合成有孔ポリマー基体中のCNBrを吸収し、続い
てこれを、適当なpHを有する多糖類溶液（例えばアガロ
ース）中に浸すことにより達成される。このように基体
の孔は異方性CNBr-架橋結合アガロース層により被覆さ
れ、これに成分が固定され得る。
前記に依り拡散限定動力学を避けるための条件は満足さ
れたという事情にもかかわらず、固相がゲル又はポリマ
ー層よりなるかまたはそれによつて備えられ、それに１
反応成分が固定された場合に、固定化成分の低下した見
かけの濃度を引きおこす反応中の溶解成分の“内部”濃
度勾配が形成される。十分に高い見かけの濃度（真の濃
度よりも80％大きい）は、周知のテイーレ単位（Thiel
e′s module）ωが系について、２よりも小さい場合に
得られる。これは次式に示される。
〔式中ｚはゲル層の厚さであり、αはゲル層中の反応
の半減期であり、かつはゲル層中に溶解した成分の拡
散定数である〕。がＤに等しく、かつαが全系の前
もつて仮定した半減期の100分の１である場合に、ｚ＜1
5μｍならばω＜２という要求は満足される。従つて、
約15μｍよりも低い厚さを有するゲル又はポリマー層
は、総反応速度に対して重要性を持たないものとみなさ
れる。
本発明で使用するためのマトリツクス体は任意の適する
形態、例えば立方体、塊、球、粒子等で形成される。本
発明の目的のために、マトリツクス体は、例えばプレー
トに接着させたり、プレートのフレームあるいはウエル
に固定することにより、支持体に適当に備えつけられ
る。
レセプター成分は、切断されるか個々の小さなマトリツ
クス体に形成される前に、マトリツクス体に適当に固定
される。勿論、レセプター成分の適用は、前もつて形成
されたマトリツクス体に行なうこともできる。
本発明の方法及びマトリツクス体が使用され得る生物学
的特異反応の例としては、例えば抗原あるいはハプテン
と抗体との間の反応のような免疫学的反応、例えば酵素
−基質又は酵素−補酵素、レクチン−糖、IgGの蛋白質A
-Fc部分、ピオチン‐アビジンといつた酵素反応、例え
ばアセチルコリン‐アセチルコリン受容体といつた神経
伝達体／受容体反応等が挙げられる。免疫学的反応に関
しては特に本分析方法におけるレセプター又はリガンド
としてモノクローナル抗体の使用が挙げられるべきであ
る。
行われ得る種々の分析方法の中で、放射線免疫測定法
（RIA）及び酵素免疫測定法（ELISA）を挙げることがで
き、この際、放射活性で標識された基又は酵素が各々検
出可能な基又はマーカーとして使用される。螢光の又は
燐光のマーカー、化学的ルミネツセンスを示すマーカー
等に基づく方法も挙げることができる。
分析方法は、マーカーが検出されるリガンドと競合する
ようにするか、又はサンドウイツチモデルに依り、先ず
試料を加え次いで標識抗体の過剰量を加えるような慣用
法で実施することができる。その他の技術の中では、二
重抗体法（DASP）及びRAST（放射線アレルギー吸収試
験）が挙げられる。
前記のように、本発明の方法は以前に使用された方法に
比較して著しく迅速でかつ簡素化された方法であり、そ
れというのもマトリツクス体が大きな表面積能力を有す
る自己含有空間を形成するからであり、この中で添加液
体は再現可能な型で吸収及び保持され、かつ生物学的特
異親和反応は、拡散限定動力学を避けながら、最適速度
で進行する。特定の型式の分析、例えば同位元素又は酵
素で標識したリガンドを加える前に試料をマトリツクス
に加える前記のRIA又はELISAにおいては、本質的にマト
リツクス体の全吸収容量を利用しなければならない。か
かる場合には、マトリツクスによる吸収可能な最高容積
に関するわずかな不足は適当に充足される。試料及びマ
ーカー物質が有効反応位置に対して競合する試験方法に
ついては、全マトリツクス容積は使用される必要はな
い。実際の使用に適する液体容積は、例えば約10μｌか
ら約1mlである。
本発明の方法及びマトリツクス体が適用される分析方法
においては、マーカーに関する測定は慣用法で（液体を
マトリツクスから分離した後に）マトリツクス体上で、
又は分離した液相上で当該の分析の方法に依り行なうこ
とができる。
本発明の方法は極めて簡単な測定システム、特にカラー
マーカーに基づく分析方法を拡張するものである。すな
わち測定は慣用法で反射光度法によりマトリツクス表面
上で直接行なうことができる。分離した液相上の測定の
ために、マトリツクス体のための特別な支持体を設計す
ることができる。その下方には、マトリツクス体中に吸
収され得る最高液体容積よりも少なくとも若干大きい容
積を有する小容器を備える。マトリツクス物質が弱親水
性であるならば、細孔中に保持される液体容積は、例え
ばヘプタンのような疎水性液体により容器中に完全に置
き換えられる。次いでマトリツクス体の下の容器中に置
き換えられた液体のカラー強度に関する測定は、慣用の
光度測定法により行なうことができる。
もう一つのカラー分析系は、マトリツクス体中のマーカ
ーの反応後に、第一マトリツクス体よりも小さい細孔寸
法を有し、カラー反応の基質を含有し得る第二マトリツ
クス体をそれにあふれた液相をぬきとるために適用する
ことよりなる。
次に、本発明の試験方法の簡単な具体例を、A-Dが異な
る方法工程を示す添付図面図１に関して記載する。
図中、本発明のマトリツクス体１はプレート２に固定さ
れる。マトリツクス体１はマトリツクス骨格に結合した
適当なレセプターを有する。例えば、抗原を有する試料
に関する酵素免疫測定法（EIA）を行なう場合は、レセ
プターはこの抗原に対する抗体である。マトリツクス体
の吸収容積に対応する試料の適量を、ピペツト３を用い
て各マトリツクス体１に加える。適当な時間（例えば10
分間）インキユベートした後、プレート２を回転させ、
吸収物質４、例えば紙に対して加圧し、マトリツクス体
１中の全液体をそこに吸引させる（Ｂ）。次いで洗浄溶
液を滴下壜５で供給し、次いで洗浄溶液は前記と同様の
方法で吸収物質に吸引される。
この工程は十分な洗浄を達成するために数回くり返す。
試料と同じ容積の酵素−抗体複合体をピペツトで直接マ
トリツクス体１に加え（Ａ）、例えば約10分間再びイン
キユベートする。もう一度前記と同様の方法で再度洗浄
を行ない（Ｃ）、次いで酵素マーカーを作用させるべき
基質を滴下壜６を用いて加える（Ｄ）。約５〜10分間後
に、結果は視覚的に判定できる。
本発明を行なうための前記のキットは、勿論その１例に
すぎず、本発明の原則に基づくその他の非常に多くのキ
ットを使用することができる。
次に、本発明を若干の非限定例につき説明する。
実施例１ この例は、連鎖球菌Ａ抗原の準定量のためのサンドウイ
ツチ型酵素免疫測定法における固体相としてスポンジ状
微細孔性セルロース物質の使用を記載する。
抗体の結合 ウエテツクス布（ウエテツクスはビスコースから製造し
た白色スポンジ状セルロース泡状物質に対する登録商標
であり、これは乾燥状態で厚さ約２−4mm、重量約250−
350g/m2、かつその乾燥重量の約10−15倍の水吸収能力
を有する：セロプラストAB社より市販）から、正方形片
（５×5mm）をはさみで切つた。次いで、かかる断片100
枚を0.1NHCl、蒸留水、0.1M NaOH再び蒸留水で各々洗
浄した。次いで上清液を吸引により完全に除去し、0.6M
リン酸塩緩衝液（pH11.7）20mlを加えた。セルロース物
質の活性化のために、反応容器を氷浴中に置いた。活性
化は蒸留水中１％CNBr-溶液20mlの添加により開始し、
ガラス棒を用いてゆつくり撹拌しながら正確に６分間継
続した。この後に、ウエテツクス片をガラス‐フイルタ
ーロート上で蒸留水で注意深く洗浄した。次いで断片を
アセトン処理及び室温でのアセトンの蒸発により乾燥さ
せた。活性化ウエテツクス片を、抗体と結合させるま
で、＋４℃でデシケーター中で貯蔵した。
抗体（ガンマ‐グロブリン分画）を、抗体希釈曲線に依
り0.1M NaHCO3中に100倍希釈した。30mlをCNBr-活性化
ウエテツクスの100片に加えた。結合反応は＋４℃で振
盪なしに一晩継続した。次いでウエテツクス片は順に、
0.1M NaHCO3、0.1Mトリス.HCl、pH8.0及び洗浄緩衝液
（0.1M リン酸塩緩衝液中0.3M NaCl、0.1％ トウイ
ーン20、0.01％ NaN3、pH7.4）で注意深く洗浄した。
同様の方法で慣用の瀘紙に抗体を結合させた。
抗体の取り込み 108細菌/ml及び106細菌/mlから抽出した連鎖球菌Ａから
の２種の異なる濃度の多糖類抗原を各々使用した。前記
の洗浄緩衝液及びウエテツクス片を陰性対照として使用
した。試料100μｌを、前記のように抗体と共有結合さ
せたウエテツクス片及び濾紙の両方に加え、１、３、10
及び30分間インキユベートした。この後に支持体を洗浄
緩衝液で洗浄し、抗体2.4μg/mlに希釈した、連鎖球菌
Ａ抗原に対する抗体にガラクトシダーゼを結合した酵素
−抗体複合体（この複合体はフアルマシア社 Pharmaci
a AB、Swedenから市販により得られる）100μｌを加
え、１時間インキユベートし、次いで支持体をもう一度
前記のように洗浄した。上清液を吸引により除去し、o-
ニトロフエニル‐β‐ガラクトシド200μｌを酵素基質
として加えた。30分後に酵素反応を0.5M Na2CO3 500
μｌで中止した。上清液を使い捨てポリスチレンキユベ
ツトに移し、自動フイルター分光計により405nmで（LKB
7400ウルトララブシステム Ultralab system）比色測
定した。結果は第２図に示され、ここでは曲線Ａ及びＣ
は、抗原濃度各々108細菌/ml及び106/mlでのウエテツク
ス支持体に対する取り込みを示し、曲線Ｂは108細菌/ml
で濾紙に対する取り込みであり、曲線Ｄはウエテツクス
片での対照であり、かつ曲線Ｅは濾紙での対照である。
この図から、抗体に対する支持体としてのウエテツクス
での反応速度は、濾紙でのそれよりも極めて高く、かつ
プラト‐レベル（平衡）は抗原の高及び低濃度両方とも
数分間で達成されたことが明らかである。
検出限界の測定 このEIAシステムの検出限界を測定するために、連続的
に希釈した連鎖球菌抗原での標準曲線を作成した。抽出
物の細菌濃度は108/mlから104/mlまで変化させた。各希
釈物100μｌを、抗体を結合させたウエテツクス片と共
に15分間インキユベートした。次いで布片を前記のよう
に洗浄し、前記で使用したのと同じ緩衝液で100倍に希
釈した前記の酵素−抗体複合体100μｌをウエテツクス
片と共に更に15分間インキユベートした。最後の洗浄工
程後、酵素活性を前記と同様の方法で測定した。得られ
た標準曲線から、この迅速な免疫測定により細菌含量を
105細菌/mlの量まで下げることが可能であることが判つ
た。
試験方法 次いで抗体を結合したウエテツクス片を、第１図に関し
て前記したような装置での試験方法を示すために使用し
た。
ほとんど乾燥した抗体を結合したウエテツクス片（水は
吸引した）をプラスチツク製スライド（第１図中２）上
に置き、スライド上には膠（RX膠、カスコ社 Casco A
B、Sweden）をウエテツクス片の固着場所に施こしてお
いた。15分間後に、布片はスライドに固着した。次いで
抗原試料50μｌを直接ウエテツクス片に適用した。全液
体を吸収し、10分間インキユベートした後に、スライド
を回転させ、ウエテツクス片を濾紙に対して加圧し、更
に洗浄溶液（前記と同様の緩衝液）を滴下壜で加えた。
洗浄溶液を前記と同様の方法でウエテツクス片から圧出
させ、極めて少量の洗浄溶液を必要とするだけのこの洗
浄工程を、３回繰り返した。次いで前記で使用した酵素
−抗体複合体50μｌを加え、更に10分間インキユベート
した。次いで洗浄工程をくり返し、最後にウエテツクス
片を前記のo-ニトロフエニル‐β‐ガラクトシド基質で
湿潤させた。その後結果は5-10分間以内に視覚的に判定
できた。25％エチレングリコールを含有する、0.4M炭酸
塩緩衝液、pH9.0で反応を中止することにより、数時間
安定した正反応を保持することができた。
実施例２ この例においては、本発明の有孔性ポリマーの抗原の取
り込みを、緻密ポリマーのそれと比較し、この際抗体は
各ポリマーに適用したアガロース層に結合させた。
アガロース層での被覆 アガロース27mgを水10ml中に入れ、アガロースが融ける
まで沸騰水浴上で撹拌下に加熱した。次いで溶液を一晩
冷却させた。この後に12.5M水酸化ナトリウム溶液2.5ml
を加え、混合物を１時間激しく撹拌した。
厚さ1mmのプレキシグラス（Plexiglas、登録商標）の５
×5mm正方形デイスク及びポリ酢酸ビニルの厚さ6mmの有
孔性単線を押出した直径5mmの円筒プラグ（エレクトロ
ードストリツプ、Electrode strip、フアルマシアAB
社）を、しつかりした栓を備えた臭化シアンの結晶を入
れたガラス管に各々導入した。１時間後、デイスク及び
プラグを取り出し、各々前記の製造したアガロース溶液
各500μｌ中で２時間インキユベートした。溶液を吸引
し、デイスク及びプラグを、各々0.5M重炭酸ナトリウム
溶液でくり返し洗浄し、この溶液中に24時間貯蔵した。
抗体の結合 デイスク及びプラグを、pH11.5の0.5Mリン酸カリウム溶
液4ml及び水9mlに臭化シアン1gを溶解した溶液1mlを入
れた、氷浴中に浸したビーカー中に移した。18％硫酸ナ
トリウム溶液で沈殿させた羊からのラビツト‐IgGに対
する抗血清（マイルズ ラボラトリーズ社Miles Labora
tories Ltd.,England）200μｌを入れた管中にデイスク
及びプラグを各々移し、当初容積の0.15M塩化ナトリウ
ム溶液中に溶解し、0.1％トウイーン20を含有する0.1M
重炭酸ナトリウム溶液中で50倍に希釈した。４℃で一晩
インキユベートした後、溶液を吸引し、デイスク及びプ
ラグを0.1％トウイーン20を含有する0.5M重炭酸ナトリ
ウム溶液で10分間３回、リン酸ナトリウムに関して0.1M
であるpH8の0.1Mエタノールアミン溶液で４時間、かつ
塩化ナトリウムに関して0.15Mであり0.5％トウイーン20
を含有する0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.4で30分間５回
各々洗浄した。
ラビツト‐IgG-125Iの製造 反応ガラス管を氷浴上に置いた。管に、0.2Mリン酸ナト
リウム、pH7.0中1mg/mlのラビツト‐IgG（マイルス ラ
ボラトリー社）50μｌ、1.5mMクロラミンＴ（メルク社
Merck、分析用）100μｌ及びNa-125I、500mCi/ml（ニ
ユーイングランドニユークリアーNew England Nuclear,
USA）0.72μｌを加えた。２分間後、0.1Mチオ硫酸ナト
リウム溶液20μｌ及び0.1Mヨウ化カリウム溶液50μｌの
添加により反応を中止した。チオ硫酸ナトリウムに関し
て0.05Mであり、かつ0.05％トウイーン20及び２％ヒト
血清アルブミン（シグマ社Sigma.USA）を含有するpH7.4
の0.05Mリン酸ナトリウム溶液で平衡にしたセフアデツ
クスG-25（Sephadex G-25、フアルマシアAB社）を有す
るカラムで反応混合物を脱塩した。空隙分画を0.1％ト
ウイーン20を含有するpH7.5の0.1M硫酸ナトリウム溶液
で４倍に希釈した。
抗原の取り込み 0.1％トウイーン20を含有するpH8の0.1Mリン酸ナトリウ
ム10mlに、前記のように製造したラビツト‐1gG-125I
10μg/ml溶液10μｌを加えた。この溶液200μｌ中に、
アガロース被覆デイスク及びプラグを入れ、１分間、３
分間、15分間、１時間及び５時間各インキユベートし
た。次いでデイスク及びプラグを、0.5％トウイーン20
を含有する0.3M塩化ナトリウム溶液で各々洗浄し、残留
放射能を測定した。付加した総活性に対する％での測定
放射能を次の表に示す。
前記の表から、抗原の取り込み及びそれによる反応曲線
の平坦化（これは実質的に反応の完了を示す）が、デイ
スクよりも有孔プラグに対しての方がかなり速やかに起
ることが明らかである。従つて生物学的特異親和反応に
基づく生物学的試験におけるかかる有孔プラグの使用
は、緻密担体基質上に行なわれた対応する試験よりも実
質的に短かいインキユベーシヨン時間でよい。
実施例３ hGH-測定 直径6.2mmを有する微細孔デイスク（ウエテツクス、セ
ロプラスト社）を、１％BrCN-溶液で活性化した。各デ
イスクに羊抗‐hGH-抗体（Na2SO4沈殿により羊抗血清か
ら製造した）５μｇを結合させた。製造したデイスク
を、0.9％NaCl、0.3％デキストランT40（フアルマシア
AB社）及び0.05％NaN3を含有するpH7.4の0.05Mリン酸
ナトリウム緩衝液中に＋４℃で保持した。
hGH-測定を行なう前に、余剰の緩衝液を水吸引器に連結
したノズルを用いてデイスクから除去した。各試験管に
ウエテツクスデイスク１枚及びhGH非含有馬血清（hGH非
含有希釈液、フアデバスhGH PRIST〔Phadebas hGH PRI
ST、登録商標、フアルマシアAB社〕）中の純粋hGHの種
々の希釈液（0.5-150μU/l）100μｌを加えた。試験管
を23℃で15分間インキユベートし、次いで各デイスクに
塩溶液250μｌを５回添加し、添加の間に吸引して微細
孔デイスクを洗浄した。125 I-抗hGH-溶液（ラビツト中に産したlgG-抗体、フア
デバスhGH-PRIST、9ng/試験管）100μｌを、試験管に加
え、23℃で２時間インキユベートした。次いでデイスク
を前記のように洗浄し、その後放射能をガンマ‐カウン
ターにより測定した。結果は次の表２に示す。
BrCN-活性濾紙に結合した抗‐hGH-抗体（フアデバスhGH
-PRIST、フアルマシアAB社）で同様の結果を得るために
は、最初のインキユベーシヨンは23℃で３時間必要と
し、一方第二のインキユベーシヨンのためには同じ温度
で約16時間必要とする。従つて、濾紙の代りにこの微細
孔マトリツクスを使用することにより、インキユベート
時間は著しく減少し、濾紙による従来のPRIST法での20
時間に対して、全試験時間は３時間以下となる。
実施例４ インシユリン測定 直径6.2mmを有する微細孔デイスク（ウエテツクス、セ
ロプラストAB社）を１％BrCN-溶液で活性化した。各デ
イスクに、抗‐モルモツト‐IgG-抗体（Na2SO4沈殿によ
り羊から製造した）５μｇを結合した。エタノールアミ
ン処理を含む洗浄後、デイスクを0.9％NaCl、0.3％デキ
ストランT40（フアルマシアAB社）及び0.05％NaN3を含
有するpH7.4の0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液中で４℃で
保持した。
試験管に次の試薬を加えた： pH6.5のリン酸塩緩衝液（１％ヒト血清アルブミン、0.0
5％NaN3および0.1Mリン酸ナトリウム）中のヒトインシ
ユリンの種々の希釈物25μｌ、125 I-インシユリン50μｌ（フアデバス‐インシユリン
試験、フアルマシアAB社、約40pg/管）、 pH7.4のリン酸塩緩衝液（0.05Mリン酸ナトリウム、0.9
％NaCl、0.3％ヒト血清アルブミン、0.05％NaN3）中に
希釈したモルモツト‐抗‐インシユリン抗血清25μｌ。
試験管を23℃で１時間インキユベートし、前記のような
抗‐モルモツトIgG-デイスク１枚を各試験管に加えた。
この添加の前に、過剰の緩衝液を水吸引器に連結したノ
ズルを用いてデイスクから除去した。インキユベートは
23℃で1.5時間行なつた。次いでデイスクを0.05％レネ
ツクス30（Renex 30、ポリオキシエチレンエーテル；ア
トラスケミイ社、Atlas Chemie、Essen、West-German
y）を含む塩溶液250μｌで５回洗浄した。塩溶液の各添
加の後に、直ちに液体を吸引した。試験管の放射能はガ
ンマ‐カウンターで測定した。分析結果を次の表３に示
す。
前記から明らかなように、競合型免疫測定は、撹拌なし
の短時間のインキユベートと、結合及び遊離トレーサー
のための迅速で簡便な分離工程により液相中で行なうこ
とができ、その際遠心分離あるいはその他の複雑な装置
は必要ない。
実施例５ この例においては、本発明の微細孔担体マトリツクス
を、抗原の取り込みに関してそれを時間の関数として、
巨大粒及び微細粒を反応動力学的に比較する。
抗体の活性化及び結合 巨大粒 直径45−165μｍ、球状のアガロース（セフアロース‐6
B、フアルマシアAB社、Sweden）0.5gを、ガラスフイル
ターG3上で水で洗浄し、氷冷ビーカー中に移した。0.5M
リン酸カリウム緩衝液（pH11.5）4ml及び水に9ml中に臭
化シアン（ポリサイエンセス社Polysciences、Warringt
on、Pennsylvania、USA）1gを溶解した溶液1mlを加え
た。６分後、ゲルを再びガラスフイルター上に移し、氷
冷水で洗浄した。硫酸ナトリウムで沈殿させた羊からの
ラビツト‐IgG（マイルス ラボラトリー社、England）
に対する抗‐血清を、0.1％トウイーン20を含有する0.1
M重炭酸ナトリウム溶液で、蛋白質濃度0.3mg/mlに希釈
し、この溶液1mlを乾燥吸引アガロースゲルに加えた。
６時間注意深く振盪した後に、pH8の0.1Mリン酸塩緩衝
液中の0.2Mエタノールアミン2mlを加え、振盪を一晩続
けた。次いでゲルをpH4の0.1M酢酸塩緩衝液で、続いて
0.9％塩化ナトリウム、0.3％デキストランT40（フアル
マシアAB社）及び0.5％トウイーン20を含有するpH7.4の
0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。
微細粒 直径１−３μｍ、粒状のアガロース0.5gを、洗浄工程に
おける分離をガラスフイルターでの代りに遠心分離（エ
ツペンドルフ Eppendorf 3200）により行なつたことを
除いて前記のように処置した。
有孔デイスク 直径4.25mmを有する微細孔デイスク（ウエテツクス、セ
ロプラストAB社）20枚を、抗体溶液が15μg/mlであるこ
と及びその2mlを入れたことを除いて、“巨大粒”の頁
で前記したように処置した。
時間の関数としての抗原の取り込み 巨大粒及び微細粒 0.1％トウイーン20を含有するpH8の0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液中に1ml当りラビツト‐IgG-125I 10mgを溶解
した溶液200μｌに、抗体結合アガロース粒2mg（すなわ
ち、ラビツトIgG 2mg/結合に使用した蛋白質６μｇ）
を加えた。次いで巨大粒及び微細粒を各々、４本の試験
管に配分した２つのバツチに分け、その１つのバツチは
振盪せずに管をゆつくりと回転させるだけでインキユベ
ートし、もう一つセツトした試験管は振盪装置（IKA-Vi
brax-VXR、セツテイング1500 IKA-Werk、Staufen、Wes
t-Germany）により反応期間中激しく振動させた。
３、15、60及び180分間の反応時間の後に、各々に0.1％
トウイーン20を含有する0.3M塩化ナトリウム溶液1mlを
加えた。ゲルを遠心分離して、溶液を吸引した。同様の
方法でもう一度洗浄した後に、ゲルによつて取り込まれ
た放射能を測定した。
有孔デイスク 前記のようなラビツト‐IgG-125150μｌを、吸引乾燥し
た抗体結合微細孔デイスクに加えた（すなわち、ラビツ
ト‐IgG 0.5ng/結合に使用した蛋白質1.5μｇ）。３、
15、60及び180分間の反応時間の後に各々溶液を吸引
し、0.1％トウイーン20を含有する0.3M塩化ナトリウム
溶液でデイスクを２回洗浄した。デイスクにより取り込
まれた放射能を測定した。
得られた結果を次の表４に表わす： 前記の結果から、激しい振盪又は粒子の大きさの減少に
より得られる動力学的改善は、本発明による微細孔担体
によつても得られることが判る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ビヨークマン，ルーネ スウエーデン国、エス‐740 22・ベーリ ンゲ、アロツペヴエーゲン・10 (56)参考文献 特開 昭49−21187（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−46191（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−67860（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ） 液体を吸収及び保持することが可
    能で且つその細孔表面に固定化した第１レセプター成分
    を有する自己支持担体マトリックス体を調製し、 （ｂ） 測定する第２リガンド成分が溶解している液体
    の所定量の試料をとり、 （ｃ） 前記第１及び第２成分を反応させて固定化複合
    体を形成させ、 （ｄ） 前記形成した固定化複合体を前記第２成分と反
    応可能な第３成分と反応させて前記マトリックス中の固
    定化複合体の形成を検知及び任意に定量する ことから成り、 前記所定量の試料は該マトリックス体と接触させて、該
    マトリックス体に完全に吸収及び保持され、前記第１レ
    セプター成分は前記マトリックスの細孔表面に共有結合
    され、並びに、前記マトリックス体は、10〜100μｍの
    拡散層に対応する且つ試薬が容易に通過できるのに充分
    な大きさである細孔を有することを特徴とする、不均一
    系における生物学的特異反応に基づく分析方法。
  2. 【請求項２】マトリックス物質が、ガラス、金属、例え
    ばポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
    ン、ナイロン、多糖類及びその誘導体のようなポリマ
    ー、多糖類被覆の合成物質、天然海綿及び繊維物質から
    選択されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】マトリックス物質が、多糖類、多糖類誘導
    体及び多糖類被覆の合成物質から選択され、好ましくは
    前記の多糖類がゼルロース、デキストラン、アガロース
    及び澱粉から選択されることを特徴とする請求の範囲第
    ２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記生物学的特異反応が免疫化学反応であ
    ることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のい
    ずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】第１固定化レセプター成分と液体に溶解し
    た第２リガンド成分を反応させて固定化複合体を形成さ
    せ、この固定化複合体を第２リガンド成分と反応可能な
    第３成分と反応させて前記固定化複合体の形成を検知及
    び任意に定量することから成る不均一系における生物学
    的特異反応に基づく分析を実施するための、前記液体を
    吸収及び保持できる開孔系を有する自己支持担体マトリ
    ックス体から成り、前記第１レセプター成分を細孔表面
    に固定化して有する多孔マトリックスであって、前記第
    １レセプター成分が前記マトリックス体の細孔表面に共
    有結合しており、及び、前記マトリックス体が、10〜10
    0μｍの拡散層に対応する且つ試薬が容易に通過できる
    のに充分な大きさである細孔を有することを特徴とする
    前記多孔マトリックス。
  6. 【請求項６】マトリックス物質が、ガラス、金属、例え
    ばポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
    ン、ナイロン、多糖類及びその誘導体のようなポリマ
    ー、多糖類被覆の合成物質、天然海綿及び繊維物質から
    選択されることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の
    多孔マトリックス。
  7. 【請求項７】マトリックス物質が、多糖類、多糖類誘導
    体及び多糖類被覆の合成物質から選択され、好ましくは
    前記の多糖類がセルロース、デキストラン、アガロース
    及び澱粉から選択されることを特徴とする請求の範囲第
    ６項に記載の多孔マトリックス。
  8. 【請求項８】マトリックス体の細孔表面が、その他の物
    質の表面改良層で被覆されることを特徴とする請求の範
    囲第５項ないし第７項のいずれか一項に記載の多孔マト
    リックス。
  9. 【請求項９】その他の物質がポリマー層であることを特
    徴とする請求の範囲第８項に記載の多孔マトリックス。
  10. 【請求項１０】前記ポリマー層の厚さが約15μｍよりも
    小さいことを特徴とする請求の範囲第９項に記載の多孔
    マトリックス。
  11. 【請求項１１】第１固定化レセプター成分と液体に溶解
    した第２リガンド成分を反応させて固定化複合体を形成
    させ、この固定化複合体を第２リガンド成分と反応可能
    な第３成分と反応させて前記固定化複合体の形成を検知
    及び任意に定量することから成る不均一系における生物
    学的特異反応に基づく分析を実施するためのキットであ
    って、少なくとも一つのマトリックス体とそのマトリッ
    クス体を支持するホールダーとから成り、前記マトリッ
    クス体が、前記液体を吸収及び保持できる開孔系を有す
    る自己支持担体マトリックス体から成り、且つ、その細
    孔表面に共有結合により固定化された第１レセプター成
    分を有し、且つ、10〜100μｍの拡散層に対応し、試薬
    が容易に通過できるのに充分な大きさである細孔を有す
    ることを特徴とする前記キット。
JP59500782A 1983-02-02 1984-02-02 生物学的特異親和反応のための方法及びキット Expired - Lifetime JPH0672886B2 (ja)

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