JPS5922515B2 - 微生物によるシアノ酢酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物を利用してシアン酢酸を製造する方法に
関する。

さらに詳しくは、エチレンシアンヒドリンを主たる炭素
源として資化し、シアン酢酸を生産する能力を有するシ
ュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属する細菌を
エチレンシアンヒドリン、窒素源、無機塩および適当な
栄養源を含む培地に好気前に培養すること、または上記
の細菌を予め適当な培地に大量培養集菌した静止菌体を
エチレンシアンヒドリンおよび無機塩を含む培地に懸濁
し、好気的に接触反応させることによりシアン酢酸を生
成、蓄積させ、これを単離回収することを特徴とする微
生物によるシアノ酢酸の製造法である。

シアン酢酸は有機化成品の中間原料として有用な化合物
であり、従来モノクロル酢酸をシアン化して作る化学的
合成法が公知である。

近年、微生物工業の発展に伴い、石油および石油化学製
品を発酵原料とした微生物反応が多数試みられており、
従来化学合成で製造されていた化合物を微生物を利用し
て有機合成しようとする思考が進みつつある。

本発明者らはシアン酢酸の新しい製造法として微生物を
利用する方法に着目し、石油化学工業製品として安価に
且つ大量に供給され得るエチレンシアンヒドリンからシ
アン酢酸を生産する微生物について種々検討を行なった
。

細菌によるアルコール類の酸化反応については、古くか
ら酢酸菌によるエタノールよりの酢酸の生成が知られて
いる。

特に、Ｋ、Ｋｅｓ ｔｅ ｒｓ等は石油化学二次製品と
しての各種ジオール化合物がアセトバクター属、グリコ
ノバクター属などの細菌により酸化されてヒドロキシカ
ルボン酸が生成することを報告している。

（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ、９ｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
２８ １６４〜１８０（１９６４））Ｌかるに、これ
らの細菌はエチレンシアンヒドリンに対しては、資化註
、シアノ酢酸生産性が極めて悪く、エチレンシアンヒド
リンのアルコール基を酸化してシアン酢酸を生成させる
微生物として好ましいものとはいえない。

本発明者らはエチレンシアンヒドリンを資化シ、シアン
酢酸を生産する能力の強い菌株を見出すべく種々検討し
た結果、シュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属
する細菌が極めて多量にエチレンシアンヒドリンよりシ
アノ酢酸を生成蓄積することを見い出し、本発明を完成
した。

以下本発明の詳細な説明する。

（１）菌株 本発明者らが見い出したエチレンシアンヒドリンからシ
アン酢酸を生産する能力を有する菌株は、例えば、シュ
ードモナスエルギノーザ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａ
ｅｒｕｑｉｎｏｓａ） ＩＦＯ３９０１、シュードモ
ナスオバーリス （ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌ １ｓ）Ｉ ＡＭ
１００２ 、シュードモナスデスモリチ力（ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓｄｅｓ ｍｏｌｙｔｉｃａ） Ｉ Ｆ
Ｏ１２５７０、シュードモナスベンドレリ（ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｖｅｎｄｒｅｌｌｉ）ＩＦＯ３８９９、プ
ルビバクテリウムアンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎ ｉａｇｅｎｅｓ Ｉ ＡＭ
１６４５ 、 プレビバクテリウムリネンス（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｎｅｎｓ） ＩＦ０１２１
４１などである。

上記の菌株でＩＦＯの記号を記した菌株は財団法人１１
醗酵研究所”、ＩＡＭの記号を記した菌株は東京大学゛
応用微生物研究所“から入手可能な既知の菌株である。

また、本発明に使用される細菌は上記の具体例のほか、
シュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属し、エチ
レンシアンヒドリンからシアノ酢酸を生成する能力を有
する菌株はすべて用いることができる。

（２）培地 本発明に使用する培地は主炭素源としてのエチレンシア
ンヒドリンのほか窒素源、無機塩、その他生育捉進物質
を程よく含有するものであれば、合成、天然いずれの培
地でも使用できる。

エチレンシアンヒドリンは高濃度では微生物の生育を阻
害することもあるので、通常は培地中の濃度を０．５〜
２．０％と低濃度とし、エチレンシアンヒドリンの消費
とともに０．５〜２．０％濃度を維持するように新しく
エチレンシアンヒドリンをフィードすることが望ましい
。

また少量の糖類例えばグルコース、稠密などを加えると
好結果が得られることが多い。

窒素源としてはは含窒素化合物にして資化し得るもので
あれば、いずれも使用可能であるが、通常硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムなどの無機窒素源のほかペプ
トン、カザミノ酸、コーンステイープリカー、肉エキス
等が単独または２種以上混合して使用される。

しかし、これは最大生育に必要な量以下に制限して加え
ることが目的物質を多量生産するために必要な要件であ
る。

無機塩としては通常リン酸カリウム塩、硫酸マグネシウ
ム塩等があげられる。

以上のほかに必要に応じてビタミン類、アミノ酸、ペプ
チド、核酸などの有機微量要素として例えば酵母エキス
、コーンステイープリカー、肉エキス、麦芽エキスなど
、さらに微量金属として鉄、亜鉛、マンガン、銅、カル
シウムなどの塩類を添加することができる。

培地組成の一例を示すと以下の如くである。

エチレンシアンヒドリン５〜２０ ｒｒｔｌ／ ｌ、
硫酸アンモニウム１〜１０ｊｊ／ｌ、リン酸二水素カリ
ウム０．２〜２ｊｌ／ｌ、リン酸−水素ニナトリウム０
．２〜２９／！ｌ硫酸マグネシウム７水塩０、１〜５
ｇ／１１ 、硫酸鉄７水塩ｔ〜１０ｍｐ／Ａ酵母エキス
またはコーンステイープリカー０．１〜５ｇ／１３の割
合で水道水に溶かしＰｔ（７〜８に調整する。

（３）培養条件 培養はＰ）Ｉを７〜８に調整し、別に前培養した種菌を
接種し、２５〜３７℃の温度で２〜６日間通気撹拌培養
、振盪培養等の好気的条件で行なう。

培養が進むにつれて培養物中にシアン酢酸が蓄積し、Ｐ
Ｈが低下すると細菌のシアノ酢酸生産能力が低下するの
で、適当な時期に炭酸カルシウムまたは水酸比ナトリウ
ムを培地のＰＨが酸性にならないように遂次添加し、生
成したシアン酢酸をカルシウム塩またはナトリウム塩と
し、培地のＰＨを巾計付近に保持することにより効率よ
く多量のシアノ酢酸を培地中に生成蓄積させることがで
きる。

また、反応系を単紳にし、培養物中からシアン酢酸の分
離、回収を容易ららしめるために上記シュードモナス属
、ブレビバクテリウム属の静止菌体を用いた酵素法も採
用可能である。

すなわち、前記性質を有するシュードモナス属またはブ
レビバクテリウム属に属する１菌株をグルコース３〜１
０ｇ／１３゜ペプトン５〜１０ＥＩ／１１．肉エキス３
〜１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム２〜３ｇ／１３．エチレ
ンシアンヒドリン０．５〜２ ｍ７／ Ａの割合で水道
水に添加し、ＰＨを７〜８に調整した培地に接種し２５
〜３７℃で１〜３日間好気的条件下で培養し多量の菌体
を生産する。

この培養液から菌体を分離、洗浄し、この静止菌体をエ
チレンシナンヒドリン５〜２０１１Ｌｌ／ｌリン酸二水
素カリウム１〜３９／！１１硫酸マグネシウム７水塩１
〜３９／ｌの割合で水道水に添加し、ＰＨを７〜８に調
整した反応液に乾燥菌体重量１〜２０Ｖｌの割合で懸濁
し、２５〜３７℃で好気的条件で接触反応させる。

この際シアン酢酸の生成に従って反応液のＰＨが低下す
るので、炭酸カルシウムまたは水酸化ナトリウム等でＰ
Ｈを７〜８に調整しつつ反応させることにより多量のシ
アン酢酸を生成させることができる。

（４）シアン酢酸の分離回収 培養物または静止菌体懸濁液よりシアン酢酸を分離回収
するには通常シアン酢酸の分離回収に用いられる任意の
手段を用いることができる。

例えば、培養物中または反応液中にシアン酢酸がカルシ
ウム塩として存在するときは培養物または反応液を硫酸
酸註にして遊離のシアン酢酸とし、遠心分離または沖過
により菌体、硫酸カルシウムを分離除去し、母液をエー
テル抽出、抽出液よりエーテルを留去しシアン酢酸を得
る。

以下実施例により本発明の方法をさらに具体的に説明す
る。

実施例 １ グルコース１０ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、’）ン酸二
水素カリウムＩＩ、硫酸マグネシウム７水塩１ｇ、コー
ンステイープリカー３ｇを水道水１１に溶解し、ＰＨを
７に調整した培地１００ＴｒＬｌを５００ＴＬｌ容積の
三角フラスコに分注し、１２０℃で１０分間殺菌した。

この培地にシュードモナスエルギノーザ（ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＦ０３９０１を
接種して、３０℃で２０時間振盪培養した。

次いで、別に殺菌したエチレンシアンヒドリン１ ｍｌ
、炭酸カルシウム０．！ｌを新たに加えてさらに３０°
Ｃで９６時間振盪培養を続けた。

この培養液１１を遠心分離により菌体、余剰の炭酸カル
シウム等を除去し、母液を硫酸酸註にして９０時間連続
エーテル抽出を行なった。

このエーテル層からエーテルを留去して融点６５〜６６
℃の結晶９．２ｇを得た。

この結晶は融点、元素分析値、ペーパークロマイトグラ
フィー、赤外線吸収スペクトルなどの諸性質が標準シア
ノ酢酸に完全に一致した。

（標準シアノ酢酸：和光紬薬■製。純度９５．０％以上
） 本発明により合成したシアン酢酸結晶と標準シアノ酢酸
の物性値を比較して示すと次の通りである。

（イ）溶剤Ａ：ｎ−ブタノール／蟻酸／水＝４／１．５
／溶剤Ｂ：エタノール／２８％アンモニア水／水−８０
１５／１５ 実施例 ２ エチレンシアンヒドリン１ｍｌ、グルコース５ｙ１肉エ
キス５ｇ、ペプトン５ｇ、硫酸アンモニウム２ｇ、リン
酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩１ｙを
水道水１１に溶解し、ＰＬ（を７ニ調整した。

この培地１００ｍ１容積の三角フラスコに分注し、１２
０℃で１０分間殺菌した。

この培地にシュードモナスエルギノーザ（ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） Ｉ Ｆ ０３９０
ｉを接種し、３０℃で２日間振盪培養し、菌体を生産
した。

この菌体を培養液から遠心分離（６０００ｒ、ｐ、ｍｌ
０分間）し、Ｐ Ｈ６，８のリン酸緩衝液で２回洗浄
し、静止菌体を得た。

別にエチレンシアンヒドリン１０７７１１、リン酸二水
素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩１ｇを水道水
１１に溶解しＰＨを７に調整した反応液１００１１１１
を５００ｍ１容積の三角フラスコに分注し、これに前記
の方法で取得した静止菌体を懸濁し、３０℃で４８時間
接触反応させた。

この際エチレンシアンヒドリンの酸化が進み、シアン酢
酸が生成することに従って培地のＰＨが低下するので、
炭酸カルシウム０．５ｇを加えて生成したシアン酢酸を
カルシウム塩にすると共に培地のＰＩ（を弱アルカリハ
に保った。

この反応液１１から実施例１と同様の操作によりシアン
酢酸の結晶１０．９．！ｌｉ’を得た。

実施例 ３ 実施例２と同様の方法でシュードモナスオバーリス（ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ）ＩＡＭｌ ００
２の静止菌体を用いて４８時間の振盪培養の結果反応液
１１から８．５Ｉのシアン酢酸を得た。

実施例 ４ 実施例２と同様の方法でプレビクテリウムアンモニアゲ
ネス（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉＨｍａｍｍｏｎｉａｇ
ｅｎｅｓ） Ｉ ＡＭ １６４５の静止菌体を用いて４
８時間接触反応の結果、反応液１１から６．２ｇのシア
ノ酢酸を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エチレンシアンヒドリンを主たる炭素源として資化
   し、シアノ酢酸を生産する能力を有するシュードモナス
   属、プレビバクラテリウム属に属する細菌をエチレンシ
   アンヒドリンに接触せしめ、シアン酢酸を生成、蓄積さ
   せ、これを単離回収することを特徴とするシアン酢酸の
   製造法。 ２ 前記シュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属
   する細菌をエチレンシアンヒドリン、窒素源、無機塩お
   よび適当な栄養源を含む培地に好気的に培養してシアン
   酢酸を産出せしめることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の製造法。 ３ 前記シュードモナス属、ブレビバクテリウム属に属
   する細菌を予め適当な培地に大量培養集菌した静止菌体
   をエチレンシアンヒドリンおよび無機塩を含む培地に懸
   濁し、好気的に接触反応させ、シアン酢酸を産出せしめ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造法
   。