JPS5917996A - レバウディオサイドａの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キク科に属するステビア　レパウディアナ　
ヘルドニー　（ＳｔｅｖＩａ　ｒｅｂａｕｄＩａｎａ　
ＢＥＲＴＯＮＩ　）の葉や茎に含まれる甘味成分である
レバウディオサイドＡ　（Ｒｅｂａｕ−ｄｉｏｓｄｅＡ
　）の発酵法による製造方法に関するものである。

更に畔しくは、ステビオサイドとβ−１，３グルコシル
糖化合物とを含有する水溶液又は水懸濁液に、ストレプ
トマイセス属に属し、ステビオサイドとβ−１，３グル
コシル糖化合物との間におけるβ−１，３グルコシル転
移活性を有する酵素を産生じ、ステビオサイドをレバウ
ディオサイドＡに転換し得る能力を有する微生物の培養
液、菌体、それらの菌体処理物またはその微生物から分
離された前記β−１，３グルコシル転移活性を有する酵
素を作用させることを特徴としたレバウディオサイドへ
の製造方法に関する。

レバウディオサイドＡ（β−１，３−モノグルコシルス
テビオサイド）はステビア葉や茎に２〜６％程度含才れ
、主成分であるステビオサイド（６〜１２％）に次いで
含量が高い。これまでステビア甘味料としてはこの岡者
の混合物として使用されているが、ステビオサイドは苦
味を有し後味が残るのに対し、レバウディオサイドΔは
苦味のないまろやかな甘味を有し、蔗糖に対比した甘味
倍率も高い。

これまでのステビア甘味料の呈味質の改善法としては天
然糖類、アミノ酸を添加する方法等が多く試みられてき
たが、最近ステビオサイドに糖を付加させ、カロリーを
上げることなく苦味を解消した新規なステビア甘味料が
開発されている。（特開昭５４−５０７０号公報）しか
しながら、ステビオサイドに比べ甘味倍率が低下すると
いう欠点を有していた。このことよりレバウディオサイ
ドＡが単独あるいは高含有量のステビア甘味料の開発が
熱望されている。従来、レバウディオサイドＡを得る方
法としては、ステビア乾燥葉から抽出、精製して得られ
たステビオサイドとレバウディオサイドへの混合状態か
らステビオサイドを晶析除去後、再結晶をくり返す方法
で行われているが、収率が悪いため、レバウディオサイ
ドＡを抽出時に高含有にする必要がある。ステビアの育
種によりレバウディオサイドＡの含有量を高めたステビ
ア葉の品種改良も試みられているが、遺伝による形質維
持の不安定がら現状としては実用性に乏しい。

スを付加しステビオサイドをレバウディオサイドＡに変
換させることを目的とした発明を観に完成し、特願昭５
７−３１４７９号として出願法である。その先願発明は
、ステビオサイドとβ−１，３グルコシル糖化合物例え
ばカードラン、パキマン、ラミナリン等のβ−１，３結
合を有する糖化合物を含有する水溶液に、これらβ−１
，３グルモあるステビオールの水酸基に結合したβ−Ｄ
−グルコースの０３位に転移しうる活性すなわちβ−１
，３グルコシル転移活性を有する微生物の培ＩＩ！嫂、
菌体または菌体処理物を反応させてレバウディオサイド
Ａを生成させることを目的とするものである。

しかしながら、この先願発明の方法では、レバウディオ
サイドＡを含む２種以上のβ−１，３グルコシルステビ
オサイドを生成するが、レバウディオサイドＡへのそル
変換率は２０％以下であり満足できるものではなかった
。そこで本発明者らは更にステビオサイドを著しい選択
性を以てレバウディオサイド八に高変換する能力を有す
る微生物を検索すべく、広く自然土壌界から多くの微生
物を分離し、その中から、ストレプトミセス属に属し、
強いβ−１，３グルコシルトランスフエラーゼ活性を有
している微生物を見出すとともに、該微生物により高モ
ル変換率でステビアサイドをレバウディオサイドＡのみ
に変換する能力を見出し、本発明を完成させるに至った
。

即ち、本発明はステビオサイドとβ−１，３グルコシル
糖化合物とを含有する水溶液または水懸濁液に、ストレ
プトマイセス属に属し、ステビオサイドとβ−１，３グ
ルコシル糖化合物との間におけるβ−１，３グルコシル
転移活性を有する酵素を産生し、ステビオサイドをレバ
ウディオサイド八に転換し得る能力を有する微生物の培
養液、菌体、菌体処理物またはその微生物から分離され
た前記β−１゜３グルコシル転移活性を有する酵素を作
用させることを特徴とするレバウディオサイドＡの製造
方法を提供するものである。

本発明で使用されるストレプトミセス属の菌は、β−１
゜３−トランスフェラーゼを含有し、ステビオサイドと
β−１，３グルコシル糖化合物とによりレバウディオサ
イドＡを生産する菌であればいずれでも良いが、好まし
くは、以下に畔細に説明するストレプトミセス　エスピ
ー　ＤＩＣ−１０８、ストレプトミセス　エスピー　Ｄ
ＩＣ−１４６である。

また他の好ましいものとしてこれらの菌株を人工的に変
異処理即ち化学的、物理的手段による変異誘発処理を行
うことにより得られる人為的突然変異株、あるいは自然
変異株も全て含まれる。

本発明で好ましく使用される前述の２株の菌学的性質は
次のとおりである。

〔ストレプトミセス・丘スビー　ＤＩＣ−１０８の菌学
的性質〕（１）　　形態的特徴 使用した培地（Ｉ　ＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の
生育は優れており、デンプン無機塩、オートミール寒天
、イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。

胞子形成気菌糸は直状又は直曲状である。胞子は橢円体
で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ×１．０〜１
．２μである。

走査型電子顕微鏡による観察では胞子の表面構造はイボ
状（賀ａｒｔｙ　）である。

（２）　　各種培地における生育状態 １）シェフロース硝酸塩寒天培地（３７℃）薄茶色の基
ｔ４：ｒＪ糸状に灰色の気菌糸を形成し、溶解性色素は
みとめられない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）薄黄
白色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。

また溶解性色素はみとめられない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−
隘５３７℃） 薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられない。又、溶
解性色素はみとめられない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地　３７℃）
無色の発育上に緑灰色の気菌糸を着生し、溶解性色素は
みとめられない。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７，３７℃）薄茶
色の発育上に培養７日目では気菌糸は着生せず、１４４
日目白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素はみとめら
れない。

６）栄養寒天培地（３７℃） 緑灰黒色の発育上に薄縁灰色の気菌糸を着生し、溶解性
色素はみとめられない。

７）イースト麦芽寒天培地（Ｉ　ＳＰ培地−２，３７℃
）薄茶色の生育上に薄縁灰色の気菌糸を着生する。水溶
性色素の生成はみとめられない。

８）オートミール寒天培地（Ｉ　ＳＰ培地−３，３７℃
）無色の生育上に緑茶灰色の気菌糸を着４−シ、水溶性
色素の生成はみとめられない。

（３）　　生理的性質 １）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験ては、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度は３７℃〜４５
℃である。

２）ゼラチンの嫂化：陰性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陰性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・鉄寒天
培地、ｌＳＰ培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：′ｐ４性（分解ゾーンに白いリ
ングを形成） ６）炭素源の利用性（プリ１′ハノ１、ゴドリーブ寒天
培地−９，３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、１．−　ラムノース
、Ｄ−マンニトール、ガラクトースをよく利用して生育
し、シェフロース、ラフ４ノース、サリシンは利用しな
い。

７）細胞壁組成 ■ＳＰに記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
ｅ　１に属する。

以上の性状から、本菌株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　）属に属し、また気菌糸の色調か
ら灰色系（ＧｒａｙＳｅｒｉｅｓ）に含まれ、メラニン
様色素を生成しないノン・クロモジェニック・タイプの
菌種に属している。

これらの性状から本菌株の分類上の位置について既知菌
種を検索すると、ストレプトミセス・アラビカス（Ｓｔ
ｒｅｐ−ｔｏｍｙｃｅｓ　ａｒａｖｉｃｕｓ）　　（Ｉ
ｎｔ、Ｊ、ｏｆ　Ｓｙｓ、Ｂａｃｔｅｒｌｏｌｏｇｙ　
　（インターナシロナル・ジャーナル・オプ・システマ
グ・ツク・バクテリオロジーの略称）νｏｆ　、　１８
　　階２　　ｐ、２９４　’６Ｂ　）　、ストレプトミ
セス・グリセオフラバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｇｒｉｓ−ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅ
ｕｓ）　　（Ｉｎｔ、Ｊ、ｏｆ　Ｓｙｓ、Ｂａｃｔｅｒ
ｌｏｌｏｇｙνｏ１．１８　　ｍ２　　ｐ、１４２“６
Ｂ）　、ストレプトミセス・マテンシス（ＳＬｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｍａＬｅｎｓｉｓ　）　（Ｉｎｔ、Ｊ、
ｏｆ　Ｓｙｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ−１ｏｇｙ　　ｖｏｌ
、Ｉ８　　Ｎａ２　　ｐ、３４４°６８〕、がＤＩＧ−
１０８に近縁の菌種としてあげられる。そこで発酵研究
所の保存株であるストレプトミセス・アラビカスＩ　Ｆ
　Ｏ−１４０３５、ストレプトミセス・グリセオフラバ
スＩＦＯ−１２３７２、ストレプトミセス・マクロスボ
レウスＩ　Ｆ　Ｏ−１２７９４そしてス培養して比較す
ると、ストレプトミセス・アラビカス及びストレプトミ
セス・グリセオフラバスはデンプンの分解性がないこと
で明らかにホーと異なる。ストレプトミセス・マクロス
ポレウスとストレプトミセス・マテンシスはデンプンの
分解性はどちらもみられるがホー特有の分解ゾーン中に
白いリングを形成するのはストレプトミセス・マテンシ
スによってみられた。ストレプトミセス・マテンシスＩ
　Ｆ　Ｏ−１２８８９とホーを比較すると表−１のよう
に各培地における気菌糸の色調に若干の違いがみとめら
れるものの、その他の菌学的性状は非常によく一致して
いる。

従って本菌株はストレプトミセス・マテンシスに極めて
近縁の種と考えられる。しかしながら、β−１，３−グ
ルコシルトランスフェラーゼ活性の有無の点で大きく真
なっており、即ち本菌株はβ−１，３糖化合物からグル
コースをステビオサイドに転移させる活性を有するが、
ストレプトミセス・マテンシスは該活性を有せず、又生
育至＊温度が低いなど差があることなどから、ホーをス
トレプトミセス・マテンシスに近縁の新種として、スト
レプトミセス・エスピー　ＤＩＣ−１０８と同定した。

なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、歓工研菌寄第６５９３号として受託されている
。

表　　　−１ 〔ストレプトミセス・エスピー　ＤｒＣ−１４６の菌学
的性質〕 Ｏ）形態的特徴 使用した培地（ＴＳＰ培地を含む）上での栄養菌糸の生
育は優れており、グルコース・アスパラギン寒天培地以
外いずれの培地上においてもよく気菌糸を形成する。

胞子形成気菌糸はらせん状（Ｓｐｉｒａｌ）である。胞
子と橢円体で大きさは短径×長径０．７〜０．８　メｔ
　Ｘ　１．２〜１．４μである。走査型電子顕微鏡によ
る観察では、胞子の表面構造は平滑（Ｓｍｏｏｔｈ）で
ある。

（２）各種培地における生育状態 １）シェフロース硝酸塩寒天培地（３７℃）無色の生育
上に灰褐色の気菌糸を形成し、溶解性色素はみとめられ
ない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７’ｃ）薄
黄色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。また溶解
性色素はみとめられない。

３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−
階５３７℃） 薄灰褐色の生育て紫白灰色の気菌糸を形成する。溶解性
色素はみとめられない。

４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地３７℃）薄
茶色の生育上に赤灰色の気菌糸を着生し、培＃１４日目
ごろにコロニーの裏面に赤色の色素を生成する。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７，３７℃）灰黒
色の発育」−に茶白灰〜黒仄色の気菌糸を着生し、拡散
性色素はみとめられない。

６）栄養寒天培地（３７℃） 灰褐色の発育」二に白灰色の気菌糸を形成し、培ｌ１１
４日目にコロニー裏面に赤〜朱色の色素を生成する。

７）イース（・麦芽寒天培地（［ＳＰ培地−２，３７°
Ｃ）茶色の生育１−に凹条灰色の気菌糸を着生する。水
溶性色素の生成はみとめられない。

８）オートミール寒天培地（Ｉ　Ｓ　Ｉ）培地−３，３
７°Ｃ）灰褐色の生育−１−に赤灰色の気菌糸を着生し
、培＃１４０目ごろにコロニーの裏面に赤色の色素を生
成する。

（３）生理的性質 ｌ）生育温度範囲 酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度は３７℃〜４５
℃である。

２）ゼラチンの液化：Ｉｌｌ性 ３）脱脂乳の凝固及び 脱脂乳のペプトン化：陽性 ４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・軟寒天
培地、ＩＳＰ培地６）：陰性 ５）デンプンの分解性：陰性 ６）炭素源の利用性（プリドハム、ゴドリーブ寒天培地
、ｒｓｐ培地−９，３７℃） Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フラクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、ラ
フィノース、Ｄ−マンニトール、ガラクトースをよく利
用して生育し、シュクロースとサリシンは利用できない
が、または疑わしい。

７）細胞壁組成 ＩＳＰに記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
ｅ　１に属する。

以上の性状から、本菌株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ　）属に属し、また気菌糸の色調が
ら、灰色系（Ｇｒａｙｓｅｒｉｅｓ　）に含まれ、メラ
ニン様色素を生成しないノン・クロモジェニック・タイ
プの菌種に属している。これらの性状から本菌株の分類
上の位置について既知菌種を検索すると、ストレプトミ
セス・オリバセウス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅｓｏ
ｌｌｖａｃｅｕｓ　）　　（ｒｎｔ、Ｊ、ｏｆ　Ｓｙｓ
、ＢａｃＬｅｒｉｏｌｏＨｙ　ｖｏｌ、１８　　Ｔｈ２
ｐ、１５４°６８〕が最も近縁の種としてあげられる。

そこで発酵研究所の保存株であるストレプトミセス・オ
リバセウスＩ　Ｆ　０−３４６９と同−条件丁・で比較
すると、表−２のように、オートミール寒天培地、及び
スターチ無機塩寒天培地りでの気菌糸の色において違い
がみられるが、その他の菌学的性状は非常によく一致し
ている。

従って本菌株はストレプトミセス・オリバセウスに極め
て近縁の種と考えられる。しかしながら、β−１，３−
グルコシルトランスフェラーゼ活性の有無の点で大きく
異なっており、即ち本菌株はβ−１，３糖化合物からグ
ルコースをステビオサイドに転移させる活性を有するが
、ストレプトミセス・オリバセウスは該活性を有セず、
又生育至適温度が低いなど差があることなどから、ホー
をストレプトミセス・オリバセウスに近縁の新種として
ストレプトミセス・エスピーＤＩＣ−１４６と同定した
。

なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請し、微工研菌寄第６５９４号として受託されている
。

表　　　−２ 本発明で使用されるβ−１，３トランスフエラーゼは、
これら好ましい微生物を、通常の微生物が利用し得る炭
素源、窒素源、無機成分など公知の栄養源を含有する液
体培地で好気的条ｆ［で常法により培養して得られる。

炭素源としては、例えばスターチ、アミロース、カード
ラン、パキマン、ラミナリン、アミロペクチンなどの多
糖類、メタノール、グリセリン、高級アルコール等のア
ルコール１１、コハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸
類おＪびその塩知、鍛粉、麦芽糖、ブドウ糖、ラムノー
ス等の糖類があげられ、好ましくはバキマン、カードラ
ン、ラミナリンである。窒素ｆｇＪ、！＝Ｌでは、例え
ば硫安、塩安、リン安、楠酸ナトリウム、尿素、ペプト
ン、カゼイン等有機無機いずれでも使用できる。

炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養
源としては、例えば各種糖蜜、コーンステイーブリーカ
ー、オー）ミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母、酵母
エキス、ポテトエキス、麦芽エキスなどがあげられる。

無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リン酸−ナ
トリウム、硫酸マグネシウム、微量金属類などが挙げら
れる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加するこ
ともできる。使用濃度としては、０．１〜４０重量％が
用いられる。また醗酵中の発泡を抑制するため１．【）
重量％以下の消泡剤を添加してもよい。消泡剤としては
、シリコーン、大豆油など通常の消泡剤を用いる。

培養方法は、振盪培養、通気培養などの好気的液体培養
が適しており、ｐＨ５，ｏ〜８．０．２０°Ｃ〜５０℃
で１〜６日、望ましくはｐ１１６．５〜７．５．３５℃
〜４０℃で２０前後培養する。

この様に本発明で好適に使用されるストレプトマイセス
・エスピーＤＩＣ−１０８同１４６の条苗はｊ１１常の
ストレプトマイセス属微生物より生育至適温度が高いの
で高温で培養でき工業的に有用な菌種である。

又、本発明で使用される菌株のモル変換率は、減少した
ステビオサイド×１．２ その、モル変換率は、従来の値である２０％より明らか
に大きく、５０〜９９％程度の数値を示す。更に、本発
明の菌株は、ステビオサイドの減少率も従来と同程度で
あり、減少したステビオサイドが高変換率でレバウディ
オサイド八に変換するものである。

本発明に用いるステビオサイドとけ、高度にＩｌｌ製さ
れたステビオサイドに限られることなく、ステビオサイ
ドとレバウディオサイドへの混合物であっても良く、さ
らに他の夾雑物を含有している相製品であっても、同様
に本発明を実施することができる。

本発明の方法に用いるβ−１，３グルコシル糖化合物と
しては、好ましく使用されるストレプトミセス・エスピ
ーＤＩＣ−１０８もしくはストレプトミセス・エスピー
ＤＩＣ−１４６等によってステビオサイドからレバウデ
ィオサイドＡを生成するものであればいずれでも良いが
、例えば、パキマン、カードラン、ラミナリン、酵母細
胞壁又は酵母細胞壁の部分分解物、ここで言う酵母とは
、例えばサツカロマイセス属、キャンディダ属、ピヒア
属、シゾサソ力ロマイセス属、トルロプシス属、ハイセ
ヌラ属等を言うものであり、更にリュウコシン（珪藻類
の細胞壁）、カロース（高等植物ハセオラス細胞壁）、
パラミロン（単細胞藻類の細胞壁）、リケナン（コケの
抽出物）、イネ科植物の種子胚乳より得られる糖類（こ
こで言うイネ科植物とはイネ、オオムギ、コムギ等を指
称する）、などのβ−１，３グルコシル糖化合物含有物
が挙げられる。それらのうち＆ＴＡなものとしては、バ
キマン、カードランやラミナリンが挙げられ、これらは
入手し易い点からもより好ましい。尚、カードランとは
、β−１，３グルコシド結合を主体とする水不溶性のβ
−グルカンであり、その懸濁液を加熱するとかたい弾力
性のある熱不可逆性のゲルをつくる多糖の総称である。

このものは現在のところ微生物によってつくられたもの
が市販されている。（＾ｇｒ、ＢＩｏ１．Ｃｈｅｍ、、
２９．Ｔ５７．　’６５又は発酵と工業３６，２．　’
７８参照）。

本発明で好ましく使用されるストレプトミセス・エスピ
ーＤ　Ｉ　Ｃ−１０８あるいはストレプトミセス・エス
ピーＤＥＣ−１４６を培養した培養液及び菌体はバシヂ
式で反応させてもよいし、公知の方法により菌体を固定
化して連続的に変換反応を行わせることもできる。

本発明の転移反応条件は、ステビオサイドとβ〜１．　
３グルコシル糖化合物とを含有する水溶液に、ストレプ
ト＜セス・エスピーＤＩＣ−１０８又はストレプトミセ
ス・エスピーＤＴＣ−１４６の培養液、菌体、菌体処理
物、又はこれらより分離されたβ−１，３グルコシル転
移活性を有する酵素を反応させればよい。反応に用いる
ステビオサイドは、精製ステビオサイドの場合、反応線
中のステビオサイドの濃度を約０．１〜約１０重責％と
し、β−１，３グルコシル糖化合物の濃度を約０．１〜
約３０％重量％とすればよい、これらの反応液のｐＨと
温度はβ−１，３グルコシルトランスフエラーゼが反応
してレバウディオサイドＡを生成させうる条件であれば
よいが、通常ｐＨ３〜１０好ましくはｐＨ５〜８、温度
２０〜７０℃好ましくは３０〜５０℃が適当である。こ
のようにしてレバウディオサイド八を生成せしめた反応
溶液は、そのままでも甘味料として使用できる。また必
要に応じて、酵素あるいは菌体を加熱失活させイトＸＡ
Ｄ−２（商品名、オルガノ社製）等、又はイオン交換相
Ｉｌｌ′ｌ（例えばＨ型強酸性イオン交換ｍ１ｌｔｌお
よび０１１型弱塩基性イオン交換樹脂）を用いて脱塩し
、これを濃縮してシラツブ状の甘味料とするか、又は乾
燥、粉末化して粉末状の甘味料とすることもできる。

更に脱塩した反応溶液を精製してレバウディオサイド八
を分離採取して甘味料とすることもできる。この際、濃
縮、乾燥、粉末化は公知の方法、例えば減圧濃縮、膜濃
縮、真空乾燥、噴霧乾燥等の各種方法が自由に用いられ
る。このようにして得られたレバウディオサイドＡの甘
味度は、甘味度の測定条件によっても異なるが一般には
、反応に用いたステビオサイドの固型物重量に見合う甘
味度に比べおよそ１．３倍強い。またその甘味の質は、
苦味や渋味等の嫌味がなく、まろやかな甘味であって砂
糖に似ており、残株の切れもよい。

このレバウディオサイドＡは、苦味、嫌味、アク味等が
全くない無臭、白色の粉末で水に可溶であるためステビ
オシト及びグリチルリチンの共存比率、又液体、粉末状
の条件下で任意に共存させることがで今る。また、レバ
ウディオサイドＡは、サッカリン及びその塩類、サイク
ラミン酸ナトリウム、ジヒドロカルコン、アスパラテー
ム等の周知の合成甘味物質と忙＝共用してその呈味特性
を有効利用することが可能であり、これらの合成は味物
質の１＠又は２種以上に本化合物を添加使用すれば、合
成甘味物質特有の苦味、嫌味等の不快味を改良すること
が可能となる。

また、レバウディオサイドＡを賦形剤、希釈剤、吸着剤
的に使用されている砂糖、果糖、ブドウ糖、乳糖、水飴
、デキストリン、デンプン等の周知の糖類甘味に添加使
用することにより、甘味が増強され、従来の使用量より
も、大幅にその使用量を削減することが可能となるｉ更
に本化合物をソルビット、マルチトール、マンニトール
、キシリトール等の砂糖よりも甘味度が低い低カロリー
甘味物質に添レバウディオサイドＡはこの様に一般食品
及びダイエツト食品、医薬、医薬部外品、煙草、飼料等
の甘味源として使用できることはいうまでもない。

例えば、し上う油、粉末しまう油、みそ、粉末みそ、も
ろみ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末
すし酢、中華の素、天つゆ、めんつゆ、ソース、ケチ十
ノブ、焼肉のタレ、カレールー、シチューの累、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシラツブ等の各種の調味料、せんべい、あられ、お
こし、錫類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊かん、
水筆かん、ビリー、カステラ、飴等の各種和菓子、パン
、ビスケット、クラッカー、クツキー、パイ、プリン、
バタークリーム、カスタードクリーム、シス−クリーム
、ワツフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チリコレート
、チフ、−インガム、キャラメル、キャンデー等の各種
洋菓子、アイスクリーム、シ十−ベソト、アイスキャン
デー等の氷菓、果実のシロップ漬、水密等のシロップ類
、フラワーペースト、ビーナツツペースト、フラーペー
スト等のペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ
清、糖菓などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、ネ枚
清、らっきょう漬等の漬物類、ハム、ソー打−ジ等の畜
肉製品類、食肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チク
ワ、天ぷら等の魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、さきする
め、ふぐのみりん干等の各種珍味類、のり、山菜、する
め、小魚、貝等で製造されるつくだ魚類、煮豆、ポテト
サラダ、コンブ巻等のそう菜食品、魚肉、畜肉、果実、
野菜のビン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒等の酒類
、コーヒー、ココア、ジュース、＃！酸飲料、乳酸飲料
、８乳酸菌飲料等の清涼飲料水、プリンミックス、ホッ
トケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席
しるこ等即席飲食品等の各種飲食物、嗜好物のせ味付に
使用できる。

その他、医薬品及び医薬部外品としては練肉みがき、口
紅、リップクリーム、内服薬、トローチ、肝油ドロップ
、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬等への甘味剤として
使用することも自由に行いうる。

以下に、本発明の方法およびそれによって得られる甘味
料について実施例により具体的に説明するが、以下の％
は重量基準とする。

実施例１ ＋１１　　β−１，３グルコシルトランスフエラーゼの
調製ストレプトミセス・エスピーＤＩＧ−１０８（ｍ１
研菌寄第６５９３号）を酵母エキス０．２Ｗ／Ｖ％、ポ
リペブト７０．２Ｗ／Ｖ％、グルコ−ス０．５％Ｗ／Ｖ
％、ＭｇＳＯ４−７１１２００、１Ｗ／　Ｖ　％、Ｋ２
１１ＰＯ４０，２％Ｗ／　Ｖ　９Ａカラｆｌ　ル培地５
１に植菌し、同時に別殺菌したカードラン１００ｇを加
えて３７℃で４０時間通気攪拌培養した。得られた培養
液を遠心分離して、その上清を硫安０．８飽和で塩析し
、β−１，３グルコシルトランスフエラーゼ活性を有す
る粗酵素標品（１）を得た。

このときの酵素活性は約１０００単位であった。なお、
ここでいう酵素活性１単位とは、ｐＨ７，０，０，１Ｍ
のリン酸へを生成させるに必要な酵素（Ｍ白）量である
。

（２）　　転移反応（レバウディオサイドＡの製造）ス
テビア甘味料（商品名、ステビア−ＤＴＣ，大日本イン
キ化学社製）１０ｇ、カードラン（和光純薬工業社製）
２０ｇ、先に調製した粗酵素標品（Ｎの１０単位を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）　　１１に懸濁させ、
５０℃で３０分間攪拌し、反応させた。反応液を濾過し
た後９０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた。この
溶液を合成吸着樹脂ダイヤイオンＨＰ−２０（商品名、
三菱化成社製）にＳ、ν、＝２で通し、ステビオサイド
類を吸着させた後、９５％エタノールで脱着した。脱着
液のエタノールを減圧留去した後、強酸性イオン交換樹
脂であるアンバーライトＩＲ−１２０１１（Ｈ型、商品
名、ロームアンドハース社製品）、弱塩基性イオン交換
樹脂であるアンバーライトＩＲ＾−９３（０１１型、商
品名、ロームアンドハース社製品）にＳ、Ｖ、＝　２で
通して脱塩した。

ついでこれを７０℃以下で減圧濃縮し、真空乾燥して粉
末のレバウディオサイドＡを２．７ｇ、ステビオサイド
を３．３ｇ含んだ試料陽２（改良甘味料と称す）を得た
。一方、対照品（試料−１）として、あらかじめ加熱失
活させた粗酵素標品を用いて同様に反応させ、吸着樹脂
、イオン交換樹脂で精製したものではレバウディオサイ
ドＡは１．４ｇ、ステビオサイドは５．２ｇであった。

これと試料１１ｈ２とを比較すると、β−１，３グルコ
シルトランスフエラーゼの粗酵素標品（１）を作用させ
ることにより、ステビオサイドが約３６％減少し、レバ
ウディオサイドＡが約９３％増大していることが確認さ
れた。この反応のモル変換率は５７％であった。

なお、モル変換率は で計算される。

比較例１ セ 実施例１の粗酵素標品（Ｉ）に代えてド否−ゼ（協和醗
酵社ｌ）を０．１％濃度、５０℃、３時間反応させた以
外は全く同様の操作を行ったところ、ステビオサイド３
．６ｇとレバウディオサイドＡ　１．６　ｇを含んだ混
合物が得られ、実施例１の反応を行わなかった試料１と
比較してステビアサイドが１．６ｇ（３１％）減少し、
レバウディオサイドＡが０．２ｇ（１４％増加）生成し
ていることが確認された。

この反応のモル変換率は１０％であった。

（３）改良甘味料の甘味度試験 試料階１、隘２の０．０２％及び０．０５％水溶液を調
整し、砂糖の１〜７％の水溶液を０．５％濃度段階で１
３種の標準溶液を作製し、これらについて甘味度試験を
行った。試験は試料溶液と標準溶液との２点比較法で、
２０名のパネル員により、室温２０℃で行い、その結果
を表−３に示す。

表　　　−３ ＋１１１０．０２％水溶液の場合 （１）１０．０５％水溶液の場合 表−３の＋ａ＋及び（ｂｌの結果から、試料隘１の甘味
度は０．０２％水溶液で砂糖濃度３％（甘味度１５０倍
）に相当し、０．０５％水溶液で砂糖濃度６９＜（甘味
度１２０倍）に相当する。同様に試料Ｎｏ、　２の甘味
度は砂糖濃度の各々３，５％および６．５％に相当する
ので改良１↑味料の甘味度は、用いたステじオサイドに
見合う１１味度のおよそ１，１〜１．２倍の甘味度と’
Ｆｉ＋断される。

（４）　　改良甘味料の味質ａべ験 試料ｋｌの対照品と試料Ｉｌ＆１２の改良は試料とを用
いて甘味の質の違いの比較を行った。前記甘味度試験で
求めた甘味度から算出して、各試料を３％、６％、１０
％の砂糖水溶液に相当するけ味度の水溶液に１１整した
。そして各甘味度で試料Ｉｌ＆１１、拭料隔２の試料溶
液につきその味質の良否を対比した。

試験は、２０名のパネル員により２０℃の室温で行った
。

その結果を表−４に示す。

表　　　−４ 表−４の結果から、拭料陶２の改良甘味料の甘味質は、
いずれの甘味度の場合も試料ｉｔの対照品よりすぐれて
いることが明らかである。

実施例２　（レバウディオサイドＡの分離、確認）（１
）　　ステビオサイドからの合成 純粋ステビオサイド１０ｇ１カードラン２０ｇ、実施例
１（１）で得られたβ−１，３グルコシルトランスフ工
ラーゼ相酵素標品〔■〕　１０単位を０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０＞１１に懸濁させ、５０℃で１時間
攪拌し反応させた。反応液を濾過した後、９０゛Ｃで１
０分間加熱し酵素を失活させた。そして、ステビオサイ
ドが４．８ｇ減少していることを確認した。この溶液を
合成吸着樹脂ダイヤイオンＩＩＰ−２０２００ｍｌに通
し、ステビオサイド類を吸着させたのち、８０％エタノ
ールで脱着し、溶媒を留去し減圧乾燥させた。

これをクロロホルム：メタノール：水＝３Ｃ）：２５：
４の溶媒に溶解し６０　Ｑｍ７！のシリカゲルカラム（
ＷａｋｏｇｅｌＣ−３００、商品名、和光純薬社製）に
吸着後、上記溶媒で展開し、レバウディオサイドＡに相
当するフラクションを分取し、減圧濃縮乾固後、レバウ
ディオサイド人相当の白色粉末３．５ｇを得た。（拭料
階３と称する）−この反応のモル変換率は６０％であっ
た。

（２）天然レバウディオサイドへの抽出一方、乾燥ステ
ビア葉１５０ｇを３１の塩水（５０℃）にて３時間、２
回抽出し、３１まで濃縮した。抽出液よりタンパク類を
除去後、合成吸着樹脂ダイヤイオンＩＩＰ−２１を４０
０ｍＪカラムに充填しＳ、Ｖ、＝　２．０でカラムを通
してス・Σ−ビオサイド類を吸着さ（た。その後９５％
エタノール７５０　ｍ　１．をＳ、Ｖ、＝　２．０で通
して脱着した。脱着液のエタノールを滅王留去した後、
乾固品を６００＋ｎＩｌの水に溶解した。溶解液を、強
酸性イオン交換相１１１１１Ｒ−１２０Ｂ　（Ｈ型）１
３０ｍｌ！充填カラム中にＳ、ν、＝２．０で流し、次
いで弱塩基性イオン交換樹脂であるＩＲ＾−９３（０１
（型）に９００ｍｌをＳ、Ｖ、＝　２．０で通して脱塩
した。ついでこれを７０℃以下で減圧濃縮、真空乾燥し
て粉末の精製ステビア（商品名、ステビア−ＤＩＣ）お
よそ２０ｇを得た。この精製ステビアを５倍量（Ｗ／Ｗ
）の熱メタノール（６０℃）に溶解し、次いで冷却後沈
殿を濾過した。＃ｆ通過液減圧乾固し、その１０ｇをワ
コーゲルＣ−３００のカラムクロマトグラフィーに供し
た。

クロロホルム：メタノール：水−６，５：　３　：　Ｉ
　　（Ｖ／Ｖ／Ｖ）の溶媒組成で溶出し、ステビオナイ
ド１．１６　ｇとレバウディオサイドＡ０．７ｇを単離
した。

拭料階３は、高速液体クロマトグラフィーによる分析で
はこのレバウディオサイド八と同じ保持時間をもち、ま
たシリカゲル６０Ｆプレート（メルク社１）にスポット
してクロロホルム：メタノール：水＝３０：２０：４の
溶媒組成で展開すると、ステビオサイドのＲｆ値を１と
したとき、０．８４のＲｆ値を示すレバウディオづイド
Ａと一蚊した。また”Ｃ−ＮＭＲによる構造確認におい
て、田中ら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ−ｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ、陶１３．１００５°７６）により記載されたレバウ
ディオサイドへのデータと合致した　ＮＭＲスペクトル
を示した。

（表−５、第２図および第３図参照） 以上の結果、ステビオサイドとカードランを基質とし、
β−１，３グルコシルトランスフｙラ一ビ粗酵素標品を
作２３７〜２３９℃であった。

表　　　−５ １３Ｃ−ＮＭＲ測定値 比較例２ 実施例２の粗酵素標品〔、■〕に代えて、ドリセラーゼ
（協和醗酵社製品）０．１％濃度で、５０℃、２時間率
反応させた以外は全く同様の操作を行ったところ、ステ
ビオサイドが５ｇ（５０％）ｍ少し、レバウディオサイ
ドＡ０．３９ｇ（３，９％増加）生成していることがｉ
＃Ｒされた。

この反応のそル変換率は６．５％であった。

実施例３ 実施例１（１）と同様の培地組成からなる培地５７１に
ストレプトミセス・エスピーＤＩＣ−１４６（￥Ｉｌ工
研菌寄第６５９４号）を植菌し、実施例１と同様の方法
で、３７℃、４０時間通気攪拌培養を行った。得られた
培養液を遠心分離してその上清を硫安０．８飽和で塩析
し、β−１，３グルコンルトランスフエラーゼ活性を有
する粗解ａ標品（Ｉｔ）を得た。

このときの酵素活性は約９１０単位であった。

ステビア−ＤＩＣ（ステビオサイド５１％、レバウディ
オサイドＡ　Ｉ　４．５％含有）１０ｇ、カードラン１
０ｇ１前記調製酵素ＣＩ＋３９．１単位を０．１Ｍ’Ｊ
ン＃緩衝液（ｐＨ７，０）１１に懸濁させ、５０℃で２
時間反応させた。実施例１　ｆｉ＋と同様に吸着樹脂で
精製した後乾固し、高速液体クロマトグラフィーによる
分析の結果、ステビオサイド３２％、レバウディオサイ
ドＡ２６％を含んだ白色の固体Ｉ１．５ｇを得た。

このときのステビオサイドからレバウディオサイド八へ
のモル変換率は約９４％であった。

実施例４ ステビア−ＤＩＣに代えてステビ°ｒ葉の水抽出液（ス
テビオサイドｔ１が約７４％、レバウディオサイドＡ　
１４．５％含有したもの）５００ｍｌとカードブ７１０
０ｇを０．１Ｍリン＃＆ｌ衝液（ｐＨ７，０）に加えて
総容量を５．０１にした。

それに実施例１−（１１でＳａｔ、た粗酵素標品５０単
位を加えて、４０℃で４時間攪拌し、反応させた。反応
液を濾過した後、９０℃で１０分間熱処理を行って酵素
を失活させた。この溶液をイオン交換樹脂アイバーライ
）　ＩＲ−１２０Ｂ及びＩＩＩＡ　−（）３をｉ＋ｆｌ
Ｌでステビア葉抽出物中の夾雑物を除いて得られたステ
ビオサイド類の巾のレバウディオサイドＡ含量は２５％
であり、もとのステビア葉抽出液中のレバウディオサイ
ド八に比べておよそ１．７倍増大していた。

【図面の簡単な説明】

図面において、第１図はレバウディオサイドＡと賦才４
３の薄層クロマトグラムを、そして１１２図、第３図は
レバウディオサイドＡと試料３の’Ｃ−ＮＭＲヂャート
を示す。 特許出願人　大日本インキ化学工業株式会社高　Ｌ　図 （クロロ・ｔｌ［ム、ヌタノー几：水＝３０：２０：４
）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ステビオサイドとβ−１，３グルコシル積比合物とを含
   有する水溶液または水懸濁液に、ストレプトマイセス属
   に属し、ステビオサイドとβ−１，３グルコシル糖化合
   物との間におけるβ−１，３グルコシル転移活性を有す
   る酵素を序生じ、ステビオサイドをレバウディオサイド
   八に転換し得る能力を有する微生物の培養液、菌体、菌
   体処理物またはその微生物から分離された前記β−１，
   ３グルコシル転移活性を有する酵素を作用させることを
   特徴とするレバウディオサイドＡの製造方法。