JPS5917981A - ハイブリド−マ - Google Patents
ハイブリド−マInfo
- Publication number
- JPS5917981A JPS5917981A JP57126309A JP12630982A JPS5917981A JP S5917981 A JPS5917981 A JP S5917981A JP 57126309 A JP57126309 A JP 57126309A JP 12630982 A JP12630982 A JP 12630982A JP S5917981 A JPS5917981 A JP S5917981A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hybridoma
- mouse
- antibody
- culture fluid
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はハイプリドーマに関するものである。
詳しくは、ＢＲＴＦＭ系マウスの精子または精漿抗原に
対する抗体を産生すイ）ノ・イブリドーマに関するもの
である。
対する抗体を産生すイ）ノ・イブリドーマに関するもの
である。
近年、種々の抗原で免疫した哺乳類、例えばマウスのリ
ンパ球を骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合して、目的と
するモノクロナール抗体（単一クローン性抗体）を産生
するハイプリドーマ（雑種細胞）を得る試みがなされて
いる。
ンパ球を骨髄腫細胞（ミエローマ）と融合して、目的と
するモノクロナール抗体（単一クローン性抗体）を産生
するハイプリドーマ（雑種細胞）を得る試みがなされて
いる。
ハイプリドーマが産生ずるモノクロナール抗体は、従来
の抗血清に比し特異性が格段に高いために、臨床診断、
治療等の医学分野での応用や物質精製手段としての用途
が期待される。
の抗血清に比し特異性が格段に高いために、臨床診断、
治療等の医学分野での応用や物質精製手段としての用途
が期待される。
本発明者等は受精および発生、分化の機構を分子レベル
で解析する手段として、ＢＲＴＦＭ系マウスの精子また
は精漿抗原に対するモノクロナール抗体を産生ずるハイ
プリドーマの調製、単離を試み本発明を達成した。すな
わち、本発明の要旨は、ＢＲＴＦＭ系マウスの精子また
は精漿を免疫源として免疫したマウスのリンパ球を骨髄
腫細胞と融合させて得られるハイプリドーマに存する。
で解析する手段として、ＢＲＴＦＭ系マウスの精子また
は精漿抗原に対するモノクロナール抗体を産生ずるハイ
プリドーマの調製、単離を試み本発明を達成した。すな
わち、本発明の要旨は、ＢＲＴＦＭ系マウスの精子また
は精漿を免疫源として免疫したマウスのリンパ球を骨髄
腫細胞と融合させて得られるハイプリドーマに存する。
本発明の詳細な説明するに、ＢＲＴＦＭ系マウスの祖先
は、１２２７年、Ｎ、 Ｄｃｒｏｖｏｌｅｋａｉａ−Ｚ
ａｖａｄｓｋａｉａ によりフランスで発見され、Ｌ、
０１Ｄｕｎｎ により米国ニューヨークで繁殖飼育
された。／？７３年本発明者等はり、 Ｂｅｎｎｅｔｔ
より上記マウスの子孫を譲り受け、独自のＢＲＴＦＭ系
統を樹立するため兄妹交配を繰り返している。
は、１２２７年、Ｎ、 Ｄｃｒｏｖｏｌｅｋａｉａ−Ｚ
ａｖａｄｓｋａｉａ によりフランスで発見され、Ｌ、
０１Ｄｕｎｎ により米国ニューヨークで繁殖飼育
された。／？７３年本発明者等はり、 Ｂｅｎｎｅｔｔ
より上記マウスの子孫を譲り受け、独自のＢＲＴＦＭ系
統を樹立するため兄妹交配を繰り返している。
本発明の対象とするＢＲＴＦＭ系マウスはその過程で得
られたもので、第１７染色体上に優性突然変異Ｔを有し
、その突然変異はホモの状態で胚致死を、ヘテロの状態
で恒量をもたらす。
られたもので、第１７染色体上に優性突然変異Ｔを有し
、その突然変異はホモの状態で胚致死を、ヘテロの状態
で恒量をもたらす。
一般に、マウスの精子は、尖体（ａｃｒｏｓｏｍｅ）、
頭部および尾部に分けられ、それぞれの部域には、各部
域に特異的な亀疫源（抗原）が存在する。また、精漿に
も精漿に特異的な抗原が存在する。
頭部および尾部に分けられ、それぞれの部域には、各部
域に特異的な亀疫源（抗原）が存在する。また、精漿に
も精漿に特異的な抗原が存在する。
本発明のハイプリドーマは、ＢＲＴＦ’Ｍ系マウスの精
子または精漿で雌マウスを免疫し、そのリンパ球を骨髄
腫細胞と融合させることによって調製される。すなわち
、例えばＢａ１ｂ１０雌マウスにＢＲＴ’ＦＭ系マウス
の精子を注射して免疫した後、膵臓を取り出し、肝臓細
胞（リンパ球）を単離する。一方、別にネズミの骨髄腫
細胞を培養し、上記膵臓細胞と培養液中で混合し、融合
剤例えばポリエチレングリコールを添加して該バイブＩ
Ｊドーマに対して選択的な培養液中で培養し、培養液中
の抗体価をチェックし、抗体を産生じているハイプリド
ーマのみを選択、単離する。
子または精漿で雌マウスを免疫し、そのリンパ球を骨髄
腫細胞と融合させることによって調製される。すなわち
、例えばＢａ１ｂ１０雌マウスにＢＲＴ’ＦＭ系マウス
の精子を注射して免疫した後、膵臓を取り出し、肝臓細
胞（リンパ球）を単離する。一方、別にネズミの骨髄腫
細胞を培養し、上記膵臓細胞と培養液中で混合し、融合
剤例えばポリエチレングリコールを添加して該バイブＩ
Ｊドーマに対して選択的な培養液中で培養し、培養液中
の抗体価をチェックし、抗体を産生じているハイプリド
ーマのみを選択、単離する。
選択培養液としては、ＨＡ Ｔ培ＩＩ液（後記）を使用
する。ＨＡＴ培養液中では、ハイプリドーマのみが生存
し、未融合の骨髄腫細胞およびリンパ球は生存し得ない
。具体的には、細胞浮遊液を適当に希釈して、多数の独
立した凹みを有する平底微量培養皿の各凹みに数個ハイ
プリドーマが出現するように分注し、さらにＨＡＴ培養
液を分注して培養し、培養液中の抗体価をしらべ、抗体
価の高いもののみを選択して培養を続は次いで後記実施
例に示すようにクローニングの過程を経て抗体産生クロ
ーンを増殖させる。
する。ＨＡＴ培養液中では、ハイプリドーマのみが生存
し、未融合の骨髄腫細胞およびリンパ球は生存し得ない
。具体的には、細胞浮遊液を適当に希釈して、多数の独
立した凹みを有する平底微量培養皿の各凹みに数個ハイ
プリドーマが出現するように分注し、さらにＨＡＴ培養
液を分注して培養し、培養液中の抗体価をしらべ、抗体
価の高いもののみを選択して培養を続は次いで後記実施
例に示すようにクローニングの過程を経て抗体産生クロ
ーンを増殖させる。
以上のよ５Ｋして調製されたハイプリドーマは、それぞ
れＢｌ’ｊＴＦＭ系マウスの精子または精漿の異った部
域（抗原）と特異的な反応を示し、また、後記実施例に
示すように、種々の哺乳類の精子または精漿圧力して異
った交叉反応性を有する。本発明のハイプリドーマは、
受Ｗｔ、発生、分化、発癌の機構の解析の手段として有
用であるとともに、種々の哺乳類の不妊症の診断薬ある
いは避妊薬としての用途が期待される。
れＢｌ’ｊＴＦＭ系マウスの精子または精漿の異った部
域（抗原）と特異的な反応を示し、また、後記実施例に
示すように、種々の哺乳類の精子または精漿圧力して異
った交叉反応性を有する。本発明のハイプリドーマは、
受Ｗｔ、発生、分化、発癌の機構の解析の手段として有
用であるとともに、種々の哺乳類の不妊症の診断薬ある
いは避妊薬としての用途が期待される。
以下に本発明を実施例についてさらに具体的に説明する
が、これに限−られるものではない。
が、これに限−られるものではない。
なお、実施例における標準培養液およびＨＡＴ培養液は
、それぞれ下記を指示する。
、それぞれ下記を指示する。
標準培ｇＩ液： ＲＰＭＩ １４＜ｚＯ［：グランドア
イラントハイオロジカルコーポレーション（Ｇｒａｎｄ
工ｒｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）製の培養液〕にグルタミン（２ｍＭ）、ピ
ルビンｉ（１ｍＭ）、ペニシリン（！Ｏμ／ｍｌ ）
、ストレプトマイシン（１０）ｚ９／ｍｅ）、ｉｊ係ウ
シ胎児血清（グランドアイランドバイオロジカルコーポ
レーション製）を加えたもの。
イラントハイオロジカルコーポレーション（Ｇｒａｎｄ
工ｒｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ’ｌ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）製の培養液〕にグルタミン（２ｍＭ）、ピ
ルビンｉ（１ｍＭ）、ペニシリン（！Ｏμ／ｍｌ ）
、ストレプトマイシン（１０）ｚ９／ｍｅ）、ｉｊ係ウ
シ胎児血清（グランドアイランドバイオロジカルコーポ
レーション製）を加えたもの。
ＨＡＴ培養液：ｏ、ｏ３ｒｒｇのチミジンと０．１．３
Ａ／ｆｌのヒポキサンチンを／ ００１１１１の蒸溜水
に溶かして濾過滅菌する（ １００倍ＨＴ保存液）。ノ
ア、 ｊ ｍ９のアミノプテリンｉ ／ ００ ｒｒｔ
ｌの蒸溜水に溶かす（１０００倍アミノプテリン液）。
Ａ／ｆｌのヒポキサンチンを／ ００１１１１の蒸溜水
に溶かして濾過滅菌する（ １００倍ＨＴ保存液）。ノ
ア、 ｊ ｍ９のアミノプテリンｉ ／ ００ ｒｒｔ
ｌの蒸溜水に溶かす（１０００倍アミノプテリン液）。
ｉｏｏｍｔのｉｏｏ倍Ｉ（Ｔ保存液と１０ｒｎｌの１０
００倍アミノプテリン液に９ｏｍｌの蒸溜水を混ぜる（
３０倍ＨＡＴ液）。これにｒｏ ｏ ｍｌの標準培養液
を加えてＨＡＴ培養液とする。
００倍アミノプテリン液に９ｏｍｌの蒸溜水を混ぜる（
３０倍ＨＡＴ液）。これにｒｏ ｏ ｍｌの標準培養液
を加えてＨＡＴ培養液とする。
実施例
（１）免 疫
生後１０週口のＢａ１ｂ１０雌マウスの頭皮下に、Ｂ１
７７Ｍ４マウス第１＜Ｚ伏目の精巣上体と輸精管より得
た精子／Ｘ／、！：１７個を注射した。
７７Ｍ４マウス第１＜Ｚ伏目の精巣上体と輸精管より得
た精子／Ｘ／、！：１７個を注射した。
その後λ週間間隔でλＸ／（：１７個の精子を同じ雌マ
ウスの腹腔に３回注射した。最後の注射から１週間目に
マウスの面液を採取し、血清を精子抗体について調べた
。融合の３日前に２×１０７個の精子を雌マウスの腹腔
内に注射した。
ウスの腹腔に３回注射した。最後の注射から１週間目に
マウスの面液を採取し、血清を精子抗体について調べた
。融合の３日前に２×１０７個の精子を雌マウスの腹腔
内に注射した。
（２） ＃朦細胞の単離
上記の免疫した昨マウスを殺して無菌的に膵臓を取り出
す。血清を含まない標章培養液でよく洗う。膵臓をステ
ンレスメツシュの上にのせてガラス棒でつぶし１、バラ
バラにする。
す。血清を含まない標章培養液でよく洗う。膵臓をステ
ンレスメツシュの上にのせてガラス棒でつぶし１、バラ
バラにする。
ｊ ｍｌの無血清標準培養液をメツシュの上から流し、
Ｐ液を遠沈管に入れる。／ ｇ ｏ Ｏｒｐｍｓｊ分で
遠沈し、上清を捨ててｊ ｍｌの無血清標準培養液を加
える。同じ操作をさらに２回くり返す。最後に浮遊液の
一部をとって細胞数を数える。全部で／、ｔＸｌＯ８個
の細胞を融合に用いる。
Ｐ液を遠沈管に入れる。／ ｇ ｏ Ｏｒｐｍｓｊ分で
遠沈し、上清を捨ててｊ ｍｌの無血清標準培養液を加
える。同じ操作をさらに２回くり返す。最後に浮遊液の
一部をとって細胞数を数える。全部で／、ｔＸｌＯ８個
の細胞を融合に用いる。
（３）骨髄腫細胞
ｓｐｚｌｏ−Ａｇ／４ Ｃネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）
２λ６：、２Ａ？Ｃ／９７♂）〕のネズミ骨髄腫株細胞
を標準培養液で培養した。融合相手として対数中期の細
胞を使用した。
２λ６：、２Ａ？Ｃ／９７♂）〕のネズミ骨髄腫株細胞
を標準培養液で培養した。融合相手として対数中期の細
胞を使用した。
（４）細胞融合操作
骨髄腫細胞を集めて無血清標準培養液で遠心洗浄を３回
繰り返すＣＣｌ１００ｒｐ％ｊ分）。
繰り返すＣＣｌ１００ｒｐ％ｊ分）。
ａ×ｉｏｔ個の骨髄腫細胞を上記の方法で準備した。／
、ｔＸｌＯ”個のマウス膵臓細胞を混ぜて遠心し、上清
を捨てる。予め滅菌しておいたポリエチレングリコール
／１００（和光紬薬社製）を無血清標準培養液で５０％
に稀釈して３７℃に温めておく。上記細胞沈渣を攪拌し
てガラスのピペットでかきまぜながら／ ｙｎｌのポリ
エチレングリコールｌ／分間かけて滴下する。さらに１
分静かに攪拌を続ける。７ｍｌの無血清標準培養液を、
細胞を攪拌しながら１分間かけて滴下する。この操作を
もう一度繰り返す。細胞液を攪拌しながら７ｍｌの熱血
清培養液を２〜３分かけて加える。こ〜までの操作を６
〜７分で終わらせる。ｉｒｏｏｒｐｍで５分間遠沈し、
上清を捨てて１０ｒｎｌの標準培養液を加える。細胞の
大きな集合塊をピペットでこわしてさらに１０ｍ１の標
準培養液を加える。
、ｔＸｌＯ”個のマウス膵臓細胞を混ぜて遠心し、上清
を捨てる。予め滅菌しておいたポリエチレングリコール
／１００（和光紬薬社製）を無血清標準培養液で５０％
に稀釈して３７℃に温めておく。上記細胞沈渣を攪拌し
てガラスのピペットでかきまぜながら／ ｙｎｌのポリ
エチレングリコールｌ／分間かけて滴下する。さらに１
分静かに攪拌を続ける。７ｍｌの無血清標準培養液を、
細胞を攪拌しながら１分間かけて滴下する。この操作を
もう一度繰り返す。細胞液を攪拌しながら７ｍｌの熱血
清培養液を２〜３分かけて加える。こ〜までの操作を６
〜７分で終わらせる。ｉｒｏｏｒｐｍで５分間遠沈し、
上清を捨てて１０ｒｎｌの標準培養液を加える。細胞の
大きな集合塊をピペットでこわしてさらに１０ｍ１の標
準培養液を加える。
（５）ハイブリドーマの選択
上記細胞浮遊液をり６個の小さな凹みを持つ平底微量培
養皿（０，／ｍｅ／凹み）に分注する。３７℃、ＩＱ％
炭酸ガスータθ％空気の満ちた温室で培養する。翌日各
回みに０．／ＷＬｔのＨＡＴ培養液を加える。上記環境
で培養を続ける。３日目ごとに各凹みからθ、／ｍｅの
培養上清を捨て、０． ／ ｔｎｌの新しいＨＡＴ培養
液を加える。λ週間後に培養液中の抗体価を調べて抗体
を産生じているもののみ、２４ｔの凹み（１ｍｌ／凹み
）を持つ培養皿に移して培養を続ける。この時に培養促
進のため各凹みにｌ×１ｏｔｃｒｊマウヌの胸腺細胞を
加える。各凹みにｏ、 ｚ ｔｎｔずつのアミノプテリ
ンを含まないＨＡＴ培養液（ＨＴ培養液）を加える。３
日後にｏ、 ｚ ｍｌのＨＴ培養液を加える。数日かけ
て徐々に標準培養液に置き換える。上清の抗体価を調べ
て充分高いものを次の操作に移す。
養皿（０，／ｍｅ／凹み）に分注する。３７℃、ＩＱ％
炭酸ガスータθ％空気の満ちた温室で培養する。翌日各
回みに０．／ＷＬｔのＨＡＴ培養液を加える。上記環境
で培養を続ける。３日目ごとに各凹みからθ、／ｍｅの
培養上清を捨て、０． ／ ｔｎｌの新しいＨＡＴ培養
液を加える。λ週間後に培養液中の抗体価を調べて抗体
を産生じているもののみ、２４ｔの凹み（１ｍｌ／凹み
）を持つ培養皿に移して培養を続ける。この時に培養促
進のため各凹みにｌ×１ｏｔｃｒｊマウヌの胸腺細胞を
加える。各凹みにｏ、 ｚ ｔｎｔずつのアミノプテリ
ンを含まないＨＡＴ培養液（ＨＴ培養液）を加える。３
日後にｏ、 ｚ ｍｌのＨＴ培養液を加える。数日かけ
て徐々に標準培養液に置き換える。上清の抗体価を調べ
て充分高いものを次の操作に移す。
なお、抗体−は、後記する抗体産生能の試験により測定
した。
した。
（６） ハイブリドーマのクローニングｊ週令のマウ
スの胸腺をバラバラにして、遠心洗浄を３回くり返した
ものを１０７個／ １ｎｔになるように標準培養液に浮
遊する。り６の凹みのうち３６の凹みにはｊ細胞／凹み
、次の３乙の凹みにはｌ細胞／凹み、最後の２≠の凹み
にはＯ０ｊ細胞／凹みになるように適当に稀釈したハイ
ブリドマ細胞浮遊液を入れる。
スの胸腺をバラバラにして、遠心洗浄を３回くり返した
ものを１０７個／ １ｎｔになるように標準培養液に浮
遊する。り６の凹みのうち３６の凹みにはｊ細胞／凹み
、次の３乙の凹みにはｌ細胞／凹み、最後の２≠の凹み
にはＯ０ｊ細胞／凹みになるように適当に稀釈したハイ
ブリドマ細胞浮遊液を入れる。
３６７℃、１９％炭酸ガス−９０％空気の温室で培・養
を続け、３日目と１２２日目一滴ずつの標準培養液を加
える。細胞が充分に増えた所で、培養液中の抗体価を調
べる。抗体を産生じているクローンのみを増殖させて同
じ操作をもう１回繰り返す。
を続け、３日目と１２２日目一滴ずつの標準培養液を加
える。細胞が充分に増えた所で、培養液中の抗体価を調
べる。抗体を産生じているクローンのみを増殖させて同
じ操作をもう１回繰り返す。
以上に述べた方法により、表１に示すように、ｉ２種類
のハイブリドーマクローンが分離された。これらのハイ
ブリドーマの産生ずるモノクロナール抗体のうち５個は
、精子の尖体に、１個は精子頭部に、／ ＩＩ！］は精
子尾部に、そして５個はｆｉｌｆ漿に、それぞれ特異的
に結合する。またこれらのモノクロナール抗体は、表７
の通り、種々の哺乳類と交叉反応性を示す。
のハイブリドーマクローンが分離された。これらのハイ
ブリドーマの産生ずるモノクロナール抗体のうち５個は
、精子の尖体に、１個は精子頭部に、／ ＩＩ！］は精
子尾部に、そして５個はｆｉｌｆ漿に、それぞれ特異的
に結合する。またこれらのモノクロナール抗体は、表７
の通り、種々の哺乳類と交叉反応性を示す。
表 ７
なお、抗体価の測定は下記の間接螢光抗体法によって測
定した。
定した。
抗体価の測定（間接螢り゛Ｃ抗体法）
マウスの精巣上体と輸精管を切り出し、中の精子をリン
酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させる。遠心洗浄した俊、１
ｘｌＯ５／ｒｎｌの濃度に懸濁して０．０２ｍ１をあら
かじめアルブミン膜で被ったスライドガラスの上に滴下
して３０分風乾させる。
酸緩衝液（ＰＢＳ）に浮遊させる。遠心洗浄した俊、１
ｘｌＯ５／ｒｎｌの濃度に懸濁して０．０２ｍ１をあら
かじめアルブミン膜で被ったスライドガラスの上に滴下
して３０分風乾させる。
これに抗体を含むと思われる培養液をｏ、ｏｚｍ１滴下
し、室温、温室でｔｏ分放置した後、ウシ血清アルブミ
ンを含むＰＢＳ中でよく洗う。これにフルオレツセイン
イソチオンアネート（Ｆ工ＴＣ）を結合させたウサギの
抗マウス免疫グロブリンＧ（冨士臓器製）を７０倍に稀
釈したものｏ、 ｏ ｚ ｍｉを滴下し、暗温室で３０
分反応させる。含アルブミンＰＢ８でよく洗った後、螢
光顕微鏡で観察する。骨髄腫細胞（ＢＰ、２１０−Ａｇ
／１ＬＬ）の培養上清を用いた場合と抗体価が同等以下
と認められたもの（螢光が認められない）を陰性（−）
とし、−抗体価が高いと認められたもの（鮮明な螢光が
認められる）を陽性（＋）とした。また、明ら′かに陽
性とはいい難いが、陰性よりは強い螢光を示す場合を擬
陽性（±）とした。
し、室温、温室でｔｏ分放置した後、ウシ血清アルブミ
ンを含むＰＢＳ中でよく洗う。これにフルオレツセイン
イソチオンアネート（Ｆ工ＴＣ）を結合させたウサギの
抗マウス免疫グロブリンＧ（冨士臓器製）を７０倍に稀
釈したものｏ、 ｏ ｚ ｍｉを滴下し、暗温室で３０
分反応させる。含アルブミンＰＢ８でよく洗った後、螢
光顕微鏡で観察する。骨髄腫細胞（ＢＰ、２１０−Ａｇ
／１ＬＬ）の培養上清を用いた場合と抗体価が同等以下
と認められたもの（螢光が認められない）を陰性（−）
とし、−抗体価が高いと認められたもの（鮮明な螢光が
認められる）を陽性（＋）とした。また、明ら′かに陽
性とはいい難いが、陰性よりは強い螢光を示す場合を擬
陽性（±）とした。
出願人 三菱化成工業株式会社
代理人 弁理士 長谷用 −
ほか１名
４２６−
Claims (1)
- （１） Ｂ ＲＴ Ｆ Ｍ系マウスの精子または精漿
を免疫源として免疫したマウスのリンパ球を骨髄腫細胞
と融合させて得られる・・イブリドーマ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57126309A JPS5917981A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | ハイブリド−マ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57126309A JPS5917981A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | ハイブリド−マ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917981A true JPS5917981A (ja) | 1984-01-30 |
Family
ID=14931992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57126309A Pending JPS5917981A (ja) | 1982-07-20 | 1982-07-20 | ハイブリド−マ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5917981A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4786545A (en) * | 1986-02-28 | 1988-11-22 | Seiko Epson Corporation | Circuit substrate and method for forming bumps on the circuit substrate |
| JPH04268454A (ja) * | 1991-02-21 | 1992-09-24 | Fuso Yakuhin Kogyo Kk | 精子の受精能試験キットおよび試験法 |
-
1982
- 1982-07-20 JP JP57126309A patent/JPS5917981A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4786545A (en) * | 1986-02-28 | 1988-11-22 | Seiko Epson Corporation | Circuit substrate and method for forming bumps on the circuit substrate |
| JPH04268454A (ja) * | 1991-02-21 | 1992-09-24 | Fuso Yakuhin Kogyo Kk | 精子の受精能試験キットおよび試験法 |
| JP2898428B2 (ja) * | 1991-02-21 | 1999-06-02 | 扶桑薬品工業 株式会社 | 精子の受精能試験キットおよび試験法 |
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