JPS59149901A - ヘパリンの精製および分別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ースアミノグリガン類）および合成もしくは半合成ヘパ
リノイド並びにこれらの誘導化合物を精製および分別す
るための新規な分離方法に関する。

予防および治療領域において臨床的に使用される凝固抑
制性で抗血栓性の作用をするグリコースアミノグリカン
であるヘパリンは複雑なヘテロ化学構一造を有する。他
のグリコースアミノグリカンのように、この化合物はア
ニオン性（ジー）サツカリドユニッートが線状に繰り返
し結合して構成される。ヘパリンの場合、約７０％の１
，４一結合Ｌ一イテユロン酸（　Ｌ−　Ｉ　ｄ　ｕ　ｒ
　ｏ　ｎ　ｓ菖旧゛ｅ）およびＤ−グルコースアミンが
存在する。イテユロン酸残基は２−位において〇一硫酸
塩化され、グルコースアミン構成要素はＮ−硫酸塩化さ
れ，、サツカリド骨格の６−位は、〇一硫酸塩化されて
いる。さらに、β−グルクロン酸および６−〇一硫酸塩
化されたＮ−アセチル−α−１）一グルコースアミンモ
見出されている〔カス（Ｂ．Ｃ：ａｓｕ）、ｐＨａｒｍ
ａｃｏｌ　＋Ｒｅｓ　。

Ｃｏ＋ｎ＋ｎｕ　＋１　、旦、（１）、（１９７９）　
］　。

しかしながらヘパリンは天然物としては蛋白質。

とは異なって、単一構成要素の反復ユニットを示さず、
このため原則的には種々の生合成か制限される。

市販のヘパリンの不均一性（Ｈｅ　ｔ．ｐｒｏｇｃｎ　
ｉ　ｔ’Ｍｔ　）は、一グルコ゛ースアミン残基および
ウーロン酸残基の変換性要素の場合のように、元素組成
の不一定な成分において特にあられれる。市販のヘパリ
ンは通常４，０００〜約３　０，０　０　０の広い分子
量分布を示す（分子量マキシマゝム１２，０００〜１５
，０００）。等電点焦点法および電気泳動法によって、
ヘパリン中には非常に多くの異なったアニオン性ｐ長い
単一ヘパリン鎖の混合物が存在することが確かめられテ
ィる〔ジョ７　７　７　（　Ｅ．Ａ，Ｊｏｈｎｓｏｎ）
友よびミュロイ（Ｂ．Ｍｕｌｌｏｙ）、Ｃｏｒｂｏｈｙ
ｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ５１、１１９（１９７６
）］　。

分析方法の改良の過程において、市販のヘパリンが少量
の別のグリコースアミノグリカンの変換性成分、例えは
デルマタン硫酸塩およびヘパラン硫酸塩を含有すること
が明らかになったが、これらは生物学的活性および分子
量の点でヘパリンから区別される。セファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−１００Ｒまたはセファデツク
スＧ＝５０Ｒカラム蕃用いるゲル濾過によるヘパリンの
分離によって□いくつかの高分子量および低分子量の不
純物が示・　この事情４ま例えはロシト、（Ｒ，ＬｏＳ
ｉｔｏ）らの論文にも記載されている［Ｊ、Ｃｂｒｏｍ
ａｔ、　２２６　、’６１〜６７（１９’８１　）参照
〕。ヘパリンの調製において蓚酸塩、炭酸塩、硫酸塩お
よび他の鉱物塩等の低分子量不純物切除去方法は例えば
゛英国特許第１７．６０２，４３９号明細書に記載され
ている。

ヘパリンの不純物としてはその他に少量の核酸′もしく
は核酸分解生成物１．蛋白質およびアミノ酸が検出され
ている。

不純物含有量か薬局方の許容範囲内にあったとしても、
薬剤の安全性の理由によってヘパリン塩から高分孕量の
ヘパリン類似不純物および低分子量の大抵は塩様の不純
物を除去する処理が必要で・ある。

注射に導したヘパリン調製品の安定性もヘパリンの純度
によって影響を受ける。

ヘパリンは組織または個々の細胞内においては遊離状お
よび蛋白質に結合して存在する種々の分子形態で検出さ
れている。臨床的に使扇されるへバリン塩は屠殺動物の
肺または腸粘膜から酢酸カリウム溶液、アルカリ性硫酸
アンモ゛ニウム溶液等〜を用いる抽出敲よって得られ、
組織内に自然に存　在する一部分は非常に大きなヘパリ
ン分子の最小の大きさを有した生成物茎常導与える。

しかしながら精製方法は、このような高分子量および低
分子量の不純物は別と毛て、高分子量および低分子量の
フラクション中のヘパリン原料も同時に除去しなければ
ならない。

常套ρ未分別へ１＜　ＩＪンを臨床的応用における特　
。

調製方法が知らレテイる〔Ｚツカ−（Ｖ、Ｖ、Ｋａｋｋ
ａｒ）、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　％２８４．３７５〜ヘパリン分解生成物は西独国
特許公開公報第３１０２６２１号、ＰＣＴ／ＵＳ８１１
００５１９に配牌された方法により化学的または酵素的
に調製することフタできる。種々の分子量のヘパリンフ
ラクションは鎖の長さおよび組成に応じて血液凝固をし
ばしば強く抑制するか流血を増加させるので、これが出
血の危険のジノ掛を乃えることになる。ヘパリンの平均
分子量と分子構造または抗血栓性もしくは出血性特性と
の関係は詳細には知られていないが、凝固機構を解明で
きるようにするために、フラクション中のヘパリンの分
子量分布を狭く維　　　・°持することが望ましいξ考
えられている。

臨床的な応用においてヘパリンの有用な効果はま・ず第
一にその抗血栓性、抗凝固性または抗高脂血性の・活性
に基づく。

このようなフラクションの調製法としては次のものが挙
−げられる： ヘパリン分子の′より小さなフラグメントへの化学的分
解法（この場合、硫酸塩を再使用するための化学的な処
理をしはしはおこなわれなければならない）１７例えば
−エタノールを用いる分別的沈殿法１、親和性クロマト
、グラフィー法（例えば固定された抗トロンビン■の場
合）、例えばセファデックスＧ７１００　　を用いるゲ
ル濾過、電気泳動法（簀電点焦点法）、イオン交換体を
用いるクロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフ
ィー、限外濾過法、震盪法、密度勾配を用いる超遠心分
離法、およびこれらの方法の任意の併用法。

化学的分解法は別として、化学的構造もしくは電荷、電
荷密度、鎖長またはこれらに依存する特性のようぴ物理
的特坤における差、例えば溶解度差、または抗トロンビ
ン■のような血漿蛋白質に対する個々のヘパリン鎖の結
合親和性の差に基づく分別方法は利用し尽くされている
。

一部は従来から分析的μ測定手段として用いられている
これらの方法は、生成物は高い生物学的疑固活性を保持
しているが、収量が非常に少ないか、選択率が不十分で
あるという欠点を有する。

他方、いくつかの方法は特に経済的な観点から実用的で
はない。例えはゲル濾過法においては十分に長いクロマ
トグラフィーカラムを用いた場合の選択率が満足な結果
を与える。

従蘂顧みられなかった別の点は、はとんどすべての分離
法にお九）で、所望の生成物は低い濃度で得られるにす
ぎないということである。従って、比較的少量の生成物
を含んだ多量の液体が得られ、これは多くの労力、原鼾
および時間を、必要とする略処理に付される。・このた
め全体の分離および仕上げ過程での収量は自ずと低下し
、特に実験によって示されたように、特に希釈溶液がら
分別される貴重なヘパリンは約８０％回収されるにすぎ
ない。このような処理は例えばエタノールまたはアセト
ンを高濃度＜＞８．’ｏ％）で使用してヘパリン塩を沈
殿させる処理で、少量の生成物を沈殿させるのに非常に
多量の溶媒を必要とするために全プロセスは非常゛なコ
スト高となる。さらに、塩を含まない生成物を得るため
には溶解再沈殿処癲か少なくとも１回その後でおこなわ
れる。これに続いて７パリン沈殿物が母液から分離され
、乾燥処理に付される。

断続的ｊこおこなわれる一濃縮過程譬さらに大規模な自
動化あ可能性を妨げる。ヘパリン分別の以下の計算例は
この問題を説明する。

、　　１．１１．の溶離剤に溶解したヘパリンーナトリ
ウ′ム２８０ｇを長さ９’Ｏｃｍ、’　　カラム体積９
６１！のセファデックスＧ−１００カラム〔ファーマシ
ア　　　か社（Ｆａ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）市゛販品Ｋ
　Ｓ　３７０　〕　　に付すゲル濾過において、所望の
低分子量分別生成物９０ｇ含有溶出液２０Ｊを得た。生
成物の平均へバリン濃度は０．４５％である。エタノー
ルの最終濃度が８０％（Ｖ／Ｖ）の生成物９０ｇを完全
に沈殿させるにはエタノール８０Ｉ！を必要とした。

合加的な濃縮処理として希釈ヘパリン溶液をアニオン交
換体、例えばレバチット（Ｌｅｗａｔｉｔ）Ｒマたはド
ーペックス（Ｄｏｗｅｘ）　　に執着させ、次いでｐＨ
および／またはイオン強度の変化による適当な条件下に
おいて再び脱着させた。

ヘパリン−ナトリウムが再び溶離可能な収量およびヘパ
リンフラクションに対する材料の吸着能を試験した。こ
の場合、夾雑イオン（例えばＣａ２＋）が取り込まれた
り、ヘパリンが化学変化（加水分解）シたりする溶離条
件を避けるように注意す。

べきである。この試験の結果から、交換体の容量は経済
的に使用するには低すぎることが明らかとなった。

′結合されたヘパリンのｆＨ’ｆ、収量は、ヘパリンフ
ラクションが交換体から小さな体積で、即ち濃縮されて
溶離されたときには不十分である（５０〜６０チ）。大
きな溶離体積を使用すると収量は増加する。同等（ｉｓ
ｏｋｒａｔｉｓｃｈｅｒ）　／−傾斜溶離、イオン強度
、　ｐｔＩ＝値に関する溶離条件を変化させても効果は
なかった。

未精製調製品からヘパリンを単離するのに前記イオン交
換体を使用することについて説明したが、この方法は、
濃縮処理として少量の溶離緩衝剤を用いて吸着されたヘ
パリンを経済的に溶出させることか必要な場合でも断念
される。しかしながら、この通用できない溶出処理には
更に沈殿−理、を伺随させなければならない。

上述のことより次のことが結論づけられる・：精、製お
よび分別処理の全費用は固有の分離／分別処理の費用に
依存するだけでなく、その後でおこなわれる濃縮処理に
よって非常に大きな影響を受ける。

従来顧慮されなかったコスト要因は、精製／分別された
ヘパリン塩をまず第一に保存安定性の固体物質として単
離し、次いで再び溶解させて注射に適した形態くし、ヘ
パリンまたはその塩の代わりに適度に濃縮された溶液と
して精製／分別過程に続いて直接側の容器に移すこ、と
である。

ヘパリン含有溶液を限外濾過に付す°方法は西独国特許
公開公報第２９　４５　５９５号および同第３１０６　
８７６　号に開示されて〜いる。

このような溶液の限外濾過法は、ヘパリンおよびマンガ
ン塩を用いて前処理したヒトの血漿の脂蛋白質分析の範
囲以外にも利用されている〔ラッセル・ワーニング（Ｇ
、Ｒｕ５ｓｅｌ−Ｗａｒｎｉｃｋ）、ＪｏｈｎＪ　、Ａ
ｌｂｅｒｓ　Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２４／６．９ｏｏ
〜９ｏ４（１９７８）参照〕。

この方法においては′、部分的に酸性ｐＨ−値、好まし
くはｐＨｌ〜５．５で操作しなければならないという点
で不利である。常に酸性のｐＨ−値に維持することは、
西柚国特許公開公報第２９４５５９５　号に記載されて
いる′ように、所定の膜を使用する際の生成物の分子量
を調整するのに役立つ。

しかしながら酸性ＰＩＩ・−値は制限されたヘパリンあ
安定性に対して不利である。特に長時間にわたって限外
濾過する場合には、）バリンの加水分解と不活性化、が
強で顧慮される。従って限外濾過に伺される溶液の追求
するだけ価値のあるｐＩ−１−領域は６“０〜８・０で
ある・　　　　　　　　　　　　　１発熱原その他にζ
注入液および注射液カマら発熱憔物質、△（”Ｙ”ｇｅ
’１斤、見かけの分子量限界１０，０００の膜を用いる
限外濾過法によって除去することが知られている〔コツ
ペンシュクイナ−（Ｇ玉ｏｐｐＣｎｓ　ｔ　−ｃｉｌｉ
ｅｒ）　　ら、Ｉ’ｈａｎｎ、Ｉｎｄ　、３３、１９、
８２７〜９３１、（１９７６）　２Ｂ照〕。しかしなが
らこの場合には、限外心過膜を妨けられないで通過でき
る低分子量の作用物質または内容物質を含有する溶液が
常に処理に伺される。発熱性物質並びに作用物質が膜に
保持される場合でもこの方法は明らり）に利用できない
。分子量限界１０，０００の膜はヘパリンの低分子量の
みを通過させることができるので、発熱性２勿質を含ま
ない限外濾液中には低分子のヘパリンフラクションのみ
が存在する。従ってこの方法による収量は少ない。さら
に、限外濾液は出発溶液に比較して非常に希釈されるの
で、ヘパリンから発熱性物質を除去するためのこの方法
は工業的な規模には不適である。

細菌の少ない条件下で前述の共存物質を分離も　　゛し
くは選択的に分別し、同時に濃縮することを可能にする
、操作法が経済的で連続的であり、操作が集約的な分離
、および精製方法が要請される。この場合、生成物は沈
殿処理に付すことなく分離／精製処理後にそのまま注射
に適した濃縮物となり、ただちに別の容器に移せるべき
ものでなければならない。

本発明は、ヘパリン、その塩および／またはその誘導体
を限外濾過によって精製、分別および同時に発熱物質除
去する方法において、ヘパリンまたはその塩の水溶液を
２枚膜限外濾過処理に付すに際して、ヘパリンおよびそ
の誘導体をまず第１段階として相対的により大きな分子
透過性を有した限外濾過膜ｌを透過させ、次いで第２段
階として相対的により小さ゛な分子透過性を有した限外
濾過膜ＩＩで保持することを特徴とするヘパリンおよび
その誘導体の精製、分別および発熱性物質除去方法に関
する。ヘパリンの一部のみ、即ち所望のＢＩＳ　３）の
みを透過させることもｂ］能である。

ヘパリンを％５ｆ　ＭＱおよび分別するための本発明方
法は以下の利へをもたらす異なった分離領域を有する少
なくとも２枚の限外濾過膜を使用する。

このｒ法は少１■）の液′体を用いておこなわれる・。

全操作は連続的に相互に移行する非常にわずかな集約的
操作過程から成り、自動化が可能である。

高分子および低分子の不純物の分離が可能である。同；
１−５にこの方法は操作条件の選択によってヘパリンの
分別に適用できる。生成物の分子量は狭い限界内で調整
可能である。この方法は細菌の少ない条件下で゛の゛操
作を可能にする。生成物は注射に適した形態でそのまま
別の容器に移すことができる。

本発明による２軟膜法を第２図に基づいて以下に説明す
る。

（１） ヘパリンは第１限外濾過膜仏全通して限外濾過されるの
で、所望の純度もしくは分子量分布を有した生成物は高
分子量の夾雑物および／またはヘパリン構成成分から分
離さむて該膜を通過する。

得られた限外濾液工はヘパリンを低濃度で含有する。

この濃縮は、ヘパリンを全くまたはほんのわずかしか透
過しないが塩類と水を通過させる分離物（２） 性を有した第２の限外濾過膜緊用いておこなわれる。

液体の脱離によって、出発溶液中のヘパリン濃　一度は
常に高められるので（このことによって粘度増加と膜工
を通乞限外濾液流の減少がもたらされる）、出発容積は
一定に保たれなけれはならない。

から塩溶液を供給し、次いで、限外濾液Ｉ（生成４１ 本発明によるこの配置の利点は、液体循環中のができ、
ヘパリンの損失がなく、生成物受容器内で生成物の純化
が常におこなわれることである。

ヘパリン出発溶液にはイオン強度を高めるために塩、好
ましくは食塩を添加しなければならない。

これらは塩様の低分子不純物と共に、装置の第１の分１
々１１部もしくは分別部（膜１片を閉鎖させて生成物受
容器内の生成物含有塩溶液を水と交換する〔透析濾過（
１）ｉ、ｌ［１ｌｔｒａｔｉｏｎ）、　）ことによって
生成物受容器内から容易に除去される。膜ＩＩのヘパリ
ンに対する小さな透過性に基づいて、ヘパＩＪ　７の損
失は（はとんど）おこらない。限外心液１を溶液を経時
的にほとんど任意に（約２５襲まで）純化させることが
できる。全系（特殊鋼製導管、ポンプ）は１１２０２を
用いる常套の処理法によって一化学的に殺菌する。流体
の供給は滅菌性フィルタ通気される。

さら”に、小さすぎる細孔分布を有する膜を広げる、即
ち、分離膜Ｉを通ろ５バリンを通過挙動を調整する簡単
な方法が見い出されだ′。これはその度ごとに存在する
膜の未知の再現性を顧慮すると、その度ごとに同一の生
成物を調製するためには非常に重要である。水溶性有機
溶媒、例えばインプロパツールをヘパリン溶液に少量添
加するこ゛とによって、分離膜Ｉを通過するヘパリン分
は増加する。即ち生成物の平均分子量はより大きな値へ
ずれる。ナルコールの存在により粘度が高くなるために
限外、慮過速度は幾分低下するか、生成物の分子量は調
整できるのでこの短所は許容でき、単に分離時間が長く
なるに過ぎない。

水溶性有機溶媒を添加するこの処理によって生成物の分
子量分布、即ち膜Ｉが出発ヘパリンの低量子分を分離す
る［横断部（Ｓｃｂｎｉｔｔｓｔｅｌｌ’ｅ）Ｊを、正
確に調整されていない膜の場合でも要求に適合させるこ
とができる。適切な溶媒濃度は個々の場合において実験
的に例えば高圧液体クロマト・グラフィーを用いて決め
られるもので、使用するヘパリン分離、分離媒体のｐＨ
−値およびイオ、ン生成物受容器内で得られたヘパリ□
ンの分子量分。

布のインプロパツールによる変化を第３図に示す。

即ちセファテックスＧ−ｊ００　　カラムを用いたいく
つ力≧のヘパリン分離の溶離ダイヤグラムである。この
場合、カラム溶出液の２０５　ｎｍにおける吸光度を溶
離体積に対して描いである。

第３ａ図は未分別の出発ヘパリン（ＰＩＩ　７．’Ｏ）
の溶離プロフィールを示す。

第３ｂ図は第３ａ図のヘパリンをＡｍ１ｃｏｎ　Ｉｌｌ
　−１゛３０限外Ｊハ過膜で分離したフラクションの溶
離プロフィールを示す（限外濾過媒体：ヘパリンナトリ
ウム５％、ＮａＣ４５３００ｍＭ、添加剤なし）。

第３Ｃ図は限外濾過媒体以外は第３ｂ図の場合と同様の
溶離プロフィールを示す（限外濾過媒体：ヘパリンナト
リウム５％、ＮａＣｌ　３００．ｍＭ、イソ・プロパツ
ール２％）。

第３ｄ図は限外濾過媒体以外は第３ｂ図および第３Ｃ図
の場合と同様の溶離プロフィールを示す（限外濾過媒体
：ヘパリンナトリウム５％、Ｎａｐ、／３００ｍＭ、イ
ンプロパツール７．５％）。

第３ｅ図は限外濾過媒体以外は第３ａ図〜第３ｄ図の場
合と同様の溶離プロフィールを示す（限外濾過媒体：ヘ
パリン５％、ＮａＣ，ｇ　　３００ｍＭ、インプロパツ
ール１５％）。

第３ｂ図〜第３ｅｐか゛ら、得られたヘパリンの分子量
分布が左側のより高分子量側にずれることが明らかであ
る。アルコール含有量を７．５％から１５％まで高めて
も溶離プロフィールに変化はみられない。

２軟膜法の利点を以下に説明する。

７　ミコン（Ａｍｉ　ｃｏｎ　）Ｉ−Ｉ５　Ｐ５　Ｑ−
４３膜を用いてヘパリン−ナトリウム５００ｇを分離す
る場合、膜ＩＩ　（アミコンＨ５Ｐ、１　＞？通す濃縮
過程を閉鎖した状態では、１６時間の分離で低分子ヘパ
リンフラクション２５０ｇを含む限外濾液８０１が得ら
れる。濃縮過程を含む本発明方法を使用する場合、生成
物受容器内の全液体量は７．５１である″（実施例１）
。ヘパリンの最終濃度３，３％は更に濃縮するか、水を
加えることによって変えることができる。

分離後にヘパリンを沈殿させるには、本発明方法を使用
する場合にはアルコールを３ＣＩＪ必要とするか、濃縮
処理を伴わない常套の方法の場合、ヘパリンを沈殿させ
るにはアルコール２４ｏｌを添加しなけれはならない。

前述の方法の好ましい態様においては、分離のため有機
カチオンを有するヘパリン塩を使用する場合、ヘパリン
の沈殿を観察することなく、高濃度の有機溶媒の存在下
に操作することができる。

この場合、ヘパリンの変化しない分別挙動が観察され、
非常に狭く区分された分子量分布を有した再現可能なフ
ラクションを得ることができる。

カチオンとしては例えばモノアルキルアンモニウム塩、
ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキル７７モ、−ラ
ム塩、テトラアルキルアンモニウム塩または置換アリー
ルアンモニウム塩が肩用である。この場合、有機ヘパリ
ン塩の分離は単に膜の溶媒安定性によって制限されるだ
けである。

使用する膜、出発物質に加える食塩のような添加物質の
濃度、６．０〜８．０の範囲のｐＨ−値、使用するヘパ
リン塩・および水溶性有機溶媒添加物を変化させること
によって、前述の２軟膜法を用いて適当な純度もしくは
分子量分布のヘパリンを調製することが可能である。こ
の場合被分離もしくは被精製ヘパリン溶液に食塩を最終
濃度５０ｍＭ〜３Ｍで添加すると、限外濾過速度が著し
く増加する。被分離もしくは被精製ヘパリン溶液のイオ
ン強度を少なくともｘＯｏｍＭ、好ましくは２５゛Ｏ１
鼎グの中性塩（食塩）によって一定に調整する場合でも
、チャージからチャージへの限外濾過プロセスの再現性
は保持される。本発明による分離および精製法は常に十
分高い濃度の塩の存在を条件とする。

本発明方法による分離条件をさらに変化させることに′
よって他のポリアニオン性でポリ硫酸塩化された最も広
義のヘパリン類似性を示す広い分子量分布を有する物質
、例えばコンドロイチン硫酸塩、ヘパラン−酸塩、ヘパ
リチン硫酸塩、ケラタン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ヒ
アルロン酸　（１１ｙａｌｕｒｏＷｉ゛旧ｅ）もしくは
ヘパリン類似体（「ヘパリノイド」−）を精製し、分別
することができる。

ここでヘパリノイドはヘパリンの作用と類似する作用、
特に凝固阻止作用を示す物質として定義される。従って
これらの物質はそれらの作用において電接に関係してい
るが、ヒトの組織においテモ種々の範囲に見出されるグ
リコースアミ／グリカンのような化学的構造を有する。

しかしながら、その化学構造が製造に際して変形される
天然物質、即ち半合成ヘパリノイド用基本生成物であっ
てもよく、また比較［１３３最近になってヘパリンとは
化学的な共通性を有さない全合成ヘパリン類似体の開発
が増えている〔シュミッッ・ヒユーブナ−（ｔＪ。

Ｓｃｈｍｉ　ｔｚ−＝ＩＩ’ｔｉＬｎ１ｅｒ）著、［ヘ
パリノイドは治療上ヘパリンの代替物となるが？」（第
２１０頁以下）、「止血、血栓形成匣内および動脈硬化
症」、ファン・デ・ロー（Ｊ、ｖａｎｄｃ　Ｌｏｏ）お
よびアスペック（Ｆ、Ａｓｂｅｃｋ’）　＠、シャッタ
オワ−・フェアラーク（Ｆ、に、Ｓこｈａ　Ｌｔ　ａ’
ｕｅ　ｒ’　Ｖｅ’ｒ’ｌ　’ａｇ　）　（１’９８２
　）参照〕。

ヘパリノイドオたはヘパリン類似体はコノ意味刃例えば
デキストラン硫酸塩、硫酸塩化されたポリサツカリドま
たは硫酸塩化されたペクチン誘導体、セルロース硫酸塩
およびベントサンまたはキシラン−ポリ硫酸塩である。

本発明方法を化学的に変化させたヘパリン（ヘパリン誘
導体）またはヘパリン分解生成物の精製および分別に使
用して高分子または低分子の成分を分離することもでき
る。

本発明方法により所定の膜を通して限外濾過されたヘパ
リンの分子量分布が水溶性有機溶媒の添加によってずれ
るという可能性は、膜製造業者によって明記された市販
限外濾過膜の溶媒適合性によって制限される。従って本
発明によればポリスルフォン膜に対しては次の溶媒また
はこれらの混合物が考慮される：ブタノール（７０％）
、エタノール（２５％）、２−エトキシエタノール（１
チ）、インプロパツール（２５％）、ジェタノールアミ
ン。

本発明においてはセルロースアセテートヲ基材とした膜
〔サルトリウス社（Ｆｉｒｍａ　５ａｒｔｏｒｉｕｓ）
、ゲッチンゲン〕に対しては例えは次の溶媒またはこれ
らの混合物が使用される：メタノール９８％、エタノー
ル９Ｂ係、インプロパツール、ｎ−プロパツール、アミ
ルアルコール、ブタノール。

もちろん他の溶媒、例えばテトラヒドロフラン、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリ
ル等も１１分離膜の耐久性がこれらの溶媒によって損イ
つれない限り使用してもよい。

前記方法の範囲内において、見かけの除去限界（Ａｕｓ
ｓｃｂｌｕｓｓ、ｇｒｅｎｚ）１０，０００〜５０＋Ｏ
ＯＯの限外濾過膜Ｉを用いる本発明による２軟膜法で操
作し、さらに所望により生成物中のヘパリンの平均分子
量を変化きせるために水溶性有機溶媒、好ましくはイン
プロパツールを添加することによって発熱性物質を分離
することもできる。溶液はその他にイオン強度を高める
ために生理学的に許容される。

中性塩、例えばＮａＣ４を含有する。膜■のみかけの除
去限界は、ヘパリンが通過せずかつ分子量範囲が約１，
０００にならないように選定さ株、る。生成物受容器内
のヘパリンの収量は水溶性有機溶媒の添加によって増加
する。

本発明を以下の実施例によって詳述する。

実施例１ 平均分子量約１５．ＯＯＯの市販のヘパリン−ナトリウ
ム、５００　ｇを２０　ｍＭ食塩溶液ＩＣＲに溶解させ
、ｐＨ−値はＩＮ　ＮａＯＨを用イテ７．０ニ補正し、
この溶液を０．２μｍ膜フィルタ−〔サルト＋）　ｒｙ
　ス（Ｓａｒ’ｔｏｒｉｕｓ）　ＳＭ　１１１０７　〕
を用いて滅菌濾過した。

この出発溶液を第２図に示す限外濾過分離系へ供給した
。この分離系は次の限外濾過膜を含む：膜Ｉ：みかけの
分子量限界５０，０００のアミコン中空繊維カプセルＨ
５）’５ｏ−４３ 膜ｌＩ：みかけの分子量限界１，０００のアミコン中空
繊維カブ序ルＨ５Ｐｉ−４３ すべての溶液の塩層は２０℃に保った。

第２図は分離系統のフローチャートを示す。

ポンプＩお筆び■：ヒギエツタ（Ｈｙｇｉｅｔｔａ）１
０〔ヒルゲ社（Ｆ　ａ　、Ｈ−ｉ　１　ｇ　ｅ　Ｇｍｂ
Ｈ）製；１．ボーテンハイム〕 すべての貯蔵容器、導管、ポンプ等は既知の方法によっ
て滅菌した。閉鎖分離系は滅菌フィルターを通して排気
した。ヘパリン溶液は３００４小で循環させた。膜ｌを
通った限外濾液流は分離のはそれぞれＱ、５９ｂａ類あ
った。

限外濾液工は生成物受容器内に捕集された。貯蔵容器内
での液体損失は、０．２５　Ｍ　’ＮａＣｊ’を含・む
「貯蔵溶化からの相当する補給に二って、限外濾液Ｉが
少なくとも７．５ｅ捕集泰れるまで調整された。次いで
濃縮膜■を備えた第２限外姐過サイクルを作動させ在。

限外濾液■はヘパリン出発溶液へ戻した。その後の操作
過程においては、ヘパリン出発溶液と生成物受容器の体
積を、膜ＩおよびＩＩの人口圧を時々変化させることに
よって一定に保った。

限外濾過サイクルＩにおけ全分離は１６時間後に中止し
、サイクル■のみを透析濾過として作動させた。１．こ
の場合、限外濾液■の代りにＨ２Ｏを生成物受容器内へ
供給した。主成分としてＮａＣ：Ｊと低分子ヘパリンネ
純物を含有した限外濾液ＩＩは廃棄した。限外濾液■中
に塩化物が検出されなくなったときに透析濾過を中止し
た。生成物受容器内のヘパリン濃度は３．３３％であっ
た。全体積は７．５１となった。既知の方法によってヘ
パリンの活性と濃度を調整また後、膜■を通して溶液を
さらに濃縮して５０００ＵＳ　Ｐユニット１０．ｓｍｚ
（ヘパ、リン１０％（ｗ／ｗ　）に相当〕に調整し、凝
固活性をさらに再検査し、０．２μ乳膜フイルターを用
いて濾過した。この溶液は沈殿処理に付す′ことなくす
ぐに１ｍｌ破砕アンプルに封入した。

対照試験の結果、封入ヘパリン溶液には細菌も発熱性物
質も含まれていなかった。

ヘパリン塩溶液および生成物受も器中のヘパリン生成物
濃度の経時変化を第４図にグラフで示す。

ヘパリン濃度はトルイ・ジンブルーまたはアズール（Ａ
ｚｕｒ）　Ａを用いる光度測定試験によって求めたＣ　
ラム（Ｌａｍ）、ジノｖヘル）　（Ｓｉｌｂｅｒす、Ｂ
　ｉ　ｏｃｈｅｍ　。

参照〕。

第５図は、セファデックスＧ−１０ｏｌＬカラム（１，
５Ｘ１００ｃ＋ｎ）を用いてヘパリン出発原料、保持液
（Ｉ（ｃｔｃｎＬａｔ）およ、び生成物受容器内に捕集
出発原料に含まれる塩様の低分子不純物および高分子不
純物は分離された。

精製されたヘパリン（Ｇ）および出発原料（Ａ）の化学
分析の結果を以下に比較して示す。

１、元素組成 Ａ　　二　Ｃ２４，５’４　％、　Ｈ’３．６５　％　
、　Ｎ２．１３％、　５１０．８７％Ｇ　：　Ｃ２４，
０６％、ｌ−１３，１７％、Ｎ２．１４％、５１０．８
８％２　遊離アミノ酸含有量 Ａ　：　９．０４　μＴｎ　０１／１００１ｎ９Ｇ：検
出限界以下（０，５ｔｔｍｏ、ｇ／ｌ、□ｏｒｎｇ）３
、硫酸塩、蓚酸塩、炭酸塩および塩化物含有量Ａ：全全
体０．３％（塩化物含有せず）Ｇ：全体で０．０５％（
塩化物含有せず）４、燐酸塩含有量 Ａ：（３１係 Ｇ：検出されず 実施例２ 次の膜を使用する以外は実施例１の手順に準拠して操作
した。

膜Ｉ：みかけの除去限界が分子量３０，０００のアミコ
ンＨＩＰ　３０−４３ 膜ＩＩ：みかけの除去限界が分子量１，０００のアミコ
ンＨＩＰ　１−４３ 分離条件は実施例１のように選定した。生成物受容器内
に捕集されたヘパリンの分離から、膜■を用いた場合の
生成物の分子量極大が低゛分子領域におび）で広く分布
ことか明らかとなった。従って、イソフロパノールを用
いてアルコール濃度ヲ徐々に増加させ、生成物受容器内
の生成物の分子量分布を高圧液体クロマトグラフィーに
よって調べた′〔スギスカ（Ｎ、Ｓｕｇｉｓｋａ）、ペ
トラセック（Ｆ、Ｊ。

Ｐｅｔｒａｃｅｋ）、Ｆｅｄ’、Ｐｒｏｃ’、　３６　
（１）、８９〜９２（１９７７）参照〕。

結果を表−１に示す。分子量の尺度はピーク極太の保持
時間で示す。出発溶液は０．２５　Ｍ　ＮａＣｊ５中に
常にヘパリンナＩ−ＩＪウムを５％含有した。ｐｉ−Ｉ
［直は７０であった。比較としてエタノールを用いてさ
らに２種の試別について調べた。

対照試験においては常に得られた保持時間の差がカラム
分離に影響を反ぼす溶媒効果によってひき起こされない
ことを再検査した。このため、生成物受容器内のヘパリ
ンをエタノールで沈殿させ、−再び溶解沈殿させ、固体
分を溶解させ、ＨＰ　Ｌ　Ｃによって分離した。この場
合、保持時間に差がないことが確認された。

表−１ Ｍｆｆヘパリンをより多量に調製するために、この膜に
対してはイソプロｌ／クノール濃度７．５％を選択した
。

実施例３ 限外濾過膜としてアミコンＩ（Ｉ　　Ｐ２Ｏ−４３（Ｉ
）およびＨＩ　　Ｐｉ−４３（ＩＩ）を使用した。

出発溶液（２０°Ｃ）は５％ヘパリンナトリウム溶液２
５０−１２５０　ｍＭ　ＮａＣ／！（ｐＨ７，０）　、
７．５チ、インプロパツール（Ｖ／Ｖ　）を含有した。

両方の膜を用いた限外濾過は実施例１の記載の手順に準
拠して操作した。しかしながらこの場合、「貯蔵溶液」
は２５　ＱｍＭ　ＮａＣ１および７％インプロパツール
（Ｖ／Ｖ）を含有した。ヘパリンナ）　ＩＪウム１２５
ｇから、生成物受容器内には精製されたヘパリン５５ｇ
が得られた。インプロパツールを使用しない対照試験に
おいては、精製へ）４リン２．２ｇが得られた。・透析
濾過処理に付すことによってインプロパツールは完全に
除去された。

実施例４ 膜ｌ−１１Ｐ２Ｏ−４３（りおよびＨＩ　　Ｐｉ−４３
（ＩＩ）を川１・）、実施例３に記載の手１ｔｌｉ’ｉ
にｉｌ−拠して操作した、。

有機溶媒添加物の種類および濃度を変化させることによ
って２軟膜法を実施した〔５％へ）ＲＩＪノントリウム
溶液２５０　ｍｔ、２５０　ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ（ｐｔ
１７０　）　、　１□１１人ＩＳと２０℃〕。

試験結果として生成物受容器内のヘパリンナトリウム量
およびヘパリン極太（ｌｌｌ）ＬＣ法）の保持哨間を表
−２゛に示す１、 表−２ 実施例５ 次の２枚の血液透析膜を使用し、実施例３の場合と同量
の添加剤を用して操作した： 膜■：セ：＋　７　（Ｓｃｃｏｎ）ｌＱ３　［ブラウン
・メルズ：／ゲン社（Ｒ，Ｂｒａｕｍ　Ｍｃｌｓｕｎｇ
ｅｎ　ＡＧ、］膜■Ｉニジアカツブ（ＤＩＡＣＡＩ”）
　（ブラウン・メルズンゲン社製） これらの血液透析膜の物質は再生セルロースである。

次の２種類のヘパリン溶液を使用した：（ａ＞　　　２
５Ｑｌ’ｎＭ　　Ｎ；１ｃｅ（ｐＩＩ７．０）中へ（ｌ
ノンナトリウム５％（ｂ）　　、　、２５　ＱｍＭ　　
Ｎ、ａｃ、ｊ？　（ｐＩ−１７，０）中〜（ｌノンナト
リウム５％（インプロパツール５％添加） （ａ）および（ｂ）溶液を用いたときの収量はそれぞれ
４．３ｇおよび５．７ｇであった。

実施例６ ２５０　ｍＮ４　ＮａＣｊ２　（ｐＨ７，０）中ニヘハ
リンナトリウ、ムを５％含有し、アセトンを３％添加し
た出発溶液を用いる以外は実施例４、に準拠して操作し
た。

ヘパリンの収量は６．９ｇであった。

得られたヘパリンをセファデックス　Ｃ７−１００カラ
ム（１，５Ｘ　１００σ）を用いたゲル濾過に付したと
ころ、対照試験に比べてより大きな平均分子量を示した
。得られたヘパリンの溶離体積は１１０−で、アセトン
を含まない場合の溶離体積（対照）は１１９ｍ１．であ
った。

実施例７ 実施例１と同様の手順によって操作した。

出発溶液 ２５ＱｍＭ　ＮａＣｊ７（ｐｉｆ７．０）中にヘパリン
ナトリウム　５％含有溶液　２５０ｍ１ （ａ）アセトン３％添加溶液 （ｂ）対照（アセトン無添加） 膜Ｉ：ザルトリウスＳＭ’１４５３９　（みかけの分子
量限界１０，０００　の非対称セルロースアセテート膜
） 膜Ｉに血液透析器シアカップ（ブラウン・メルズンゲン
社製） （ａ）の場合には、生成□物受容器から単離された物質
の分子量分布（゛セファデックスＲＧ−１００を用りた
ゲル濾過による）は出発物質に比べて変化しなかった。

溶媒アセトンは膜Ｉを明らかに害する。

対照試験（ｂ）におけるビーク極零の溶離体積は１０５
ｍ１．てあった。出発原料のピーク極太の溶離体積は１
０２７＋＋／ｌ　であった。

実施例８ 、　　　　　＼ ヘパリン−ナトリウム５０ｇを■１２０５００ｒｎｌに
溶解させ、これを１−’ｌ　　型のカチオン交換体〔ド
ーペックスＲ−５０ＷＸ８；　２００〜４００メツシユ
〕を含むカラム（４，５ｘ　３０ｃｍ’　）にかけ、酸
性のカラム溶離液を捕集した。ヘパリン酸溶液を回転エ
バポレーターを用いて濃縮し、トリエチルアミンを用い
てｌ）　Ｈを７０に調整した。この溶液を改めて濃縮し
た。

ヘパリン−トリエチルアンモニウム塩ヲ用いて次の出発
溶液を調製した： １ｅ：５％ヘパリン−トリエチルアンモニウム３５　％
／チタノール この溶液を次の膜を用いる限外濾過に付した：膜■：血
液透析器ゼコン１０２ 膜■：血液透析器シアカップ 両方の膜を用いる限外濾過後、生成物受容器内へ水を添
加し、限外濾液■中に塩化物およびエタノールが検出さ
れなくなるまで膜■を用いて透析濾過をおこなった。、
固体状Ｎ　ａ　Ｃｌを添加して最終濃度を０．５Ｍに調
整し、エタノール（８０％）を用いてヘパリンを沈殿さ
せた。この沈殿操作を再度飛り返した。乾燥させたヘパ
リン−ナトリウムの分子量分布をセファデックスＲＧ−
１００カラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ　）上でのゲル濾
過によって調べた（第６図参照）。

比較のために実施例５’　（ａ）　（アルコール無添加
）の分子量分布も示す。

実施例９ 発熱性物質含有ヘパリン−ナトリウム塩（軟膏回状）か
ら発熱性物質を除去するために、２５０ｍＭＮａＣｌ！
溶液（ｐＨ７，ｃＱ中にヘパリン５％含有溶液２５０ｄ
を実施例１に記載された手順に従って限外濾過に付した
。

いずれの場合も膜ＩＩとしては中空繊維膜（アミコンｌ
−１１Ｐｌ、−４３）を使用し、膜Ｉ　としては中空繊
維膜アミコン１１１　　ＰＩＯ−４３またはＨＩ　　Ｐ
　３　Ｑ　−４３を使用した 各膜配置、例えはｌ（Ｉ　　ＰＩＯ−４３（膜工）およ
び１．１１　　ＰＩ−４３（膜■）に対しては２回の試
験、即ちインプロパツールを１０％添加した試験と無添
加の試験をおこなった。試験結果として、生成物受容器
内の収量および発熱性物質の存在〔リムルス試験（Ｌｉ
ｍｕ　Ｉ　ｕ　ｓ　−１’ｃ　ｓ　ｔ　）を調べた１、
これらの結果を表−３にまとめて示す。

実施例１０ ヘパリン−ナト１リウムまたはヘパリン−トリエチルア
ンモニウム塩８ｇを（１２５ｈ４　ＮａＣ１！　溶液に
溶解させ、これを実施例５に記載の手順に従って限外濾
過゛に付した。

膜工：血液透析器ゼコン１０２ 膜■：血液透析器シアカップ （ａ）ヘハ！Ｊ　７−　ｆ　ｌ−リウム８ｇを０−２５
　Ｍ　ＮａＣＪ溶液に溶解させ、これを本発明による２
軟膜法によって限外濾過に付した。

（ｂ）実施例８のようにして調製したヘパリン−トリエ
チルアンモニウム塩８ｇを０．２５　Ｍ　ＮａＣＪ溶液
に溶解させ、（ａ）のようにして限外濾過に付した。

（Ｃ）ヘパリン−トリエチルアンモニウム塩８ｇをエタ
／−ル３５％（Ｖ／ｖ）含有０．２５Ｍ食塩溶液中で限
外濾過に付した。

出発溶液（保持液）中のヘパリンおよび膜Ｉをを用いて
沈殿させ、Ｈ２Ｏ中に再び溶解させた後、再度沈殿させ
、遠心分離処理゛に付し、沈殿物を真空下５０℃で乾燥
させた。

単離されたヘパリンの分子量分布は高圧液体クロマトグ
ラフィーによって調べた。表−４にこれらの結果をまと
めてボす。ピーク極太の保持時間を分単位で示す。

この試験結果から明らかなように、アルコール３５％含
有溶液（Ｃ）の場合の分子量分布はより高分子量側にず
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は市販ヘパリンの溶離ダイアグラムでめゐｐ 第２図は本兜明方法ケ実施するための装置の一態様を示
すフローチャートである。第２図において、（１）は限
外濾過膜Ｉ　、（２１は限外濾過膜■、（３）はヘパリ
ン出発溶液タンク、（４）に生成物受容器、（５）は貯
蔵溶液タンク、（６）は供給水タンク、（７）はポンプ
、（８）は滅菌フィルター通気口、（９）はパルプ、（
ｌＯ）は流量計を示す。 第３ａ図〜第３ｅ図は種々の限外濾過媒体の溶離ダイア
グラムである。第３ａ図において、（ｕ）ｎ　−Ｗｆ　
Ｗ　（７）ヘパリン−ナトリウム、　（１２）は塩不純
物を示す。 第４（２）は実施例１におけるヘパリン塩溶液および生
成物受容器中のヘパリン生成物の濃縮過程を示すグラフ
である。第４図において、（］３）は保持　。 賢文工中のヘパリン幌反の経Ｈ＋６減少２１に、（１４
）は生１反物′ン谷：得内のヘパリン幌族の経時増加父
化を示１−０ 第５　＋＊１　ｉグ火施し１］】におけ心ヘパリン出光
ｊ京判、保持液および稍製ヘバリノの溶離ダイアグラム
である。第５図において、（ａ＋は訃１６製ヘパリン、
ｔｂ＋ａ木精製出プＯ生成物、ｔＣ）は出光溶液内に残
留する保持液の溶１す１］ダイアグフム葡示す〔溶１１
Ｊ−后１］：５＋ｎＭＴＲＩＳ−クロリドの０．５　Ｍ
　ＮａＣＡ’溶液（ｐｌｌ　７．４　）　；Ｒｉ　ｉ”
ｉｌｌ速度：　９Ｉｎ／！　／　ｈ　Ｊ。 第６図に実施例８における調製ヘパリンおよび実施例５
の試料（ａ）（アルコール無添加）の画一１１ダイアダ
ラムである。第６図において、（ａ　ｌ　Ｉｒｉ　２Ｎ
　製ヘパ１ルン、（ｂ）は火Ｉｆｆ例５’（ａｌ゛で調
製されたヘパリンの溶量［タイアクラムを示す〔吸光度
：　’２０５　ｎｔｎ　（−レンジ０：２．）；溶離剤
：５１ｎＭＴＲＩＳ−クロリドの（３５Ｍ　ＮａＣｌ！
溶？＆　（ｐｉ　７．４　）　、；溶離速度：９ｒｎ１
．／ｌｌ）。 ＦＩＧ。４ ２’　　　　４　　　　　６　　　　　　Ｂ：　　　　
　ｔｏ　　　　　　＋２　　　　　１４ｈｒ艮クト；、
膚、λ拍時間 ′／鼎馳時間 手続補正書は式） １事件の表示 昭和５８年特許願第　２２７８１４　　　　号２発明の
名称 ヘパリンの精製および分別方法 ３補正をする者 国籍　スイス国 ４代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、中匪塩を含有するヘパリンまたはその塩の水溶液を
   ２軟膜限外濾過処理に利すに際して、ヘパリンおよびそ
   のす・導体をより大きな分子透過性を有した限外ン慮過
   膜ｌを透過させ、次いでより小さな分子透過性を有した
   限外濾過膜、１．■で保持することを′ｌ″′Ｉ徴点大
   るヘパリン、゛その塩および／″またはそのＮＲＳ−ｆ
   体の１．Ｉｆ製、分別および脱発熱原フ、法。 ２　膜ｌか見かけの分子量限界１０，０００〜５　ｆ）
   、’０００、好ましくは３０，０００〜５０＋　００　
   ’０を有した第１項記載の方法。 ３　膜ＩＩかヘパリン分子に対して不透過性であり、見
   かけの分子部＝１奴界２００〜５，０ＯＣＩ、好ましく
   は１，０００を崩した第１項記載♀方法。 ４、　ヘパリンに対する膜Ｉの分子透過性が水溶性有機
   溶媒の添加によって増失される第１項から第３〕゛岬、
   ）すれかに記載の方法、 ５　有機溶媒としてメタノール、エタノール、インプロ
   パツールもしくはアセトンまたはこれらの混合物を０〜
   ８．０　％、好ましくは２〜１５％の濃度で使用する第
   １項から第４項いザれかに記載の方法。 ６、μ■−領域６〜８、好ましくは６５〜７０でおこな
   う第１項から第５項いずれかに記載の方法。 ７１．中性塩としてＮａＣ，ｇまたはＣａ　Ｃ７３２ヲ
   使用する第、１項から第６項いずれかに記載の方法。 ８、塩濃度が０，０５〜３Ｍ、好ましくは０．２５Ｍで
   ある第１項から第７項いずれかに記載の方法。 ９　発熱性物質をヘパリン含有溶液から分離する第１項
   から第８項いずれかに記載の方法。 ｌＯ，ヘパリンをそのナトリウム塩もしくはカルシウム
   塩の形、有機窒素含有イオンの塩、好ましくはモノアル
   キルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニラ仏塩、トリ
   アルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム
   塩もしくはアリールアンモニウム塩またはこれらの誘導
   体の形、またはポリマー性有機□アンモニウム塩、好ま
   しくはボリエチレンイミン塩、プロタミン塩もしくはポ
   リリジン塩の形で使用する第１項から第９項いずれかに
   記載の方法。 １１・　まず第一に分離もしくは精で処理を膜１を用い
   て行ない、膜Ｈによって保持さ′れｉこヘパリンを生成
   物受容器に捕集し、低分子不純物および中性塩を水添加
   下に膜■を通して透析濾過゛する第１項か・ら第１０項
   いずれかに記載の方法。 １２　　透析濾過を食塩溶液添加下に、生成物受容器内
   のヘパリン溶液が１００〜５００ｍ’　　Ｏｓｍ’の全
   浸透圧を示す濃度のもとでおこなう第１１項記載の方法
   。 １３　　透析濾過をＣａ　Ｃｉ　２溶液添加下、μＩ　
   ６．０〜８．０のもとておこなう第１１項記載の方法。 シ１４−１温度２〜８０°Ｃ１好ましくは２０〜３５°
   Ｃのもとでおこなう第１項から第１３項いずれかに記載
   の方法。 １５、透析濾過処理後に、最終濃度７０シ９０％（ＶＡ
   りのエタノールを用いて精製−ヘパリンの沈殿をおこな
   う第１項から第１４項いずれかに記載の方法。 １６、出発溶液中に含まれる高分子ヘパリイを、最終濃
   度７０〜９０％（Ｖ／ｖ）のエタノールを用いる一沈殿
   番とよって回収する第１項から第１４項いずれかに記載
   の方法。 １７、　　ヘパリン谷有溶液を１〜２５％、好ましくは
   ４゛〜１５％の濃度で使用する第１項から第１４項いず
   れかに記載の方法。 １８　　ヘパリンとして他のグリコースアミノグリカン
   まλ′１ま合成もしくは半合成ヘパリノイドを精製する
   第１項から第１７項いずれかに記載の方法。 １９、第１項から第１８項いずれか（と記載の方法によ
   って調製されたヘパリンまたはその誘導体を含有する薬
   、剤。