DE3531101A1

DE3531101A1 - Ein nicht thrombenbildendes heparin und ein verfahren zu seiner gewinnung

Info

Publication number: DE3531101A1
Application number: DE19853531101
Authority: DE
Inventors: Nicolás Huberto Olivos Behrens
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-08-31
Filing date: 1985-08-30
Publication date: 1986-03-13
Also published as: GB8521640D0; GB2164346A; GB2164346B

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing: H. Weickmahn, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing. H. Liska, Dipl.-Phys. Dr. J. Prechtel

H/F/Va

8000 MÜNCHEN 86
POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22

TELEFON (089) 98 03 52 TELEX 522621

TELEGRAMM PATENTWEICKMANN MÜNCHEN

3 0. Aug, 1985

Nicolas Huberto Behrens
Wineberg 3030, 1636 Olivos, Argentina

Ein nicht thrombenbildendes Heparin und ein Verfahren

zu seiner Gewinnung

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein nicht thrombenbildendes Heparin und ein Verfahren zu seiner Gewinnung.

Heparin ist ein sulfatiertes Polysaccharid, welches aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten aufgebaut ist.

Jede Einheit enthält einen D-Glucosaminrest und einen Uronsäurerest. Uronsäure kann sowohl vom D-Glucuron oder vom L-Ioduronsäuretyp sein. Beide Zucker sind zu unterschiedlichen Graden sulfatiert und einige Glucosamine sind N-acetyliert.

Heparinpräparationen sind polydispergiert und haben ein Molekulargewicht, das von 5.000 bis 30.000 Dalton reicht und wobei das durchschnittliche Molekulargewicht 15.000 Dalton beträgt.

Heparin wird in der Medizin als ein Antikoagulant verwendet und wird hauptsächlich angewendet bei

(a) akuten peripheren arteriellen Verschlüssen,

(b) Applikationen, die mit antikoagulierenden Medikamenten kombiniert wurden, z. B. die Induktion einer antikoagulierenden Therapie 24 Stunden vor dem Einsetzen des kumarinischen Effektes,

(c) Hämodialyse und Herzchirurgie mit extrakorporalen Flüssxgkeitsleitungen (flowstream),

(d) Patienten, die an hämostatischen Störungen leiden, welche durch intramuskuläre Koagulation hervorgerufen werden und

(e) der Prophylaxe der Venenthrombose in der voroperativen Phase.

Wenn eine Hämodialyse ausgeführt wird, so verhindert das normale Endothelium die Bildung von Thromben durch das Vorhandensein von Plamxnogenaktivatoren und durch die Produktion von Prostacyclin, welches die Plättchenaggregation hemmt. Andererseits weisen die Schläuche und Filter, die in den extrakorporalen Strömungsleitungen vorhanden sind, diese Eigenschaften nicht auf. Daher wird die Verwendung von Antikoagulantien und im besonderen von Heparin benötigt.

Figur 1 zeigt schematisch die extrakorporale Flüssigkeitsleitung und den Anwendungspunkt von Heparin bei den Konzentrationen, wie sie in der besagten Figur angegeben sind.

Heparin wurde als ein antithrombenbildendes Mittel eingeführt, um die Bildung von Thromben in extrakorporalen Systemen zu verhindern und es war und ist noch der Gegenstand von Kontroversen. Die Literatur berichtet über verschiedene Fälle von Thrombenbildung bei mit Heparin behandelten Patienten, obwohl die in vitro Koagulation effektiv verringert wurde.

Die beobachteten Folgen reichen von einer vollständigen oder teilweisen Verstopfung des Filters, der in dem extrakorporalen System verwendet wird, bis zum Verbrauch verschiedener Koagulationsfaktoren und häufigen Fällenvon Thrombocytopenie und Neutropenie.

In der klinischen Medizin herrscht die übereinstimmende Meinung darin, daß im Zusammenhang mit der Errichtung von Tampons, welche die Dialysefilter verstopfen, das Vorhandensein von Plättchen bemerkt wurde: Plättchen und Lymphocyten ohne Fibrin und neutrophile Lymphocyten und Plättchenaggregate.

Die Heparinqualität oder die respektive Sensibilität des Patienten darauf und auch die Aktivierung des Koagulationssystems, welches vom Kontakt des Blutes mit den künstlichen Oberflächen herrührt, konnte als Ursache des Problems durch einen Versuch nachgewiesen werden.

Plasmaproteine werden leicht von künstlichen Oberflächen absorbiert. Dieser Vorgang wurde bei physikalischen und chemischen Verfahren beobachtet, wie z. B. der Sigma-Potential-Ellypsometrie, radioaktiver Markierung und immunologischer Identifikation. Die adsorbierten Proteine waren Fibrinogen, d(-, ß-, /'-Globuline, Transferin, Ceruloplasmin und die Faktoren II, V, VIII, XI und XII.

Verschiedene Arbeiten wurden durchgeführt, die zeigten, daß die Plättchen aktiviert werden, wenn sie mit den Proteinen, die an den beobachteten Oberflächen liegen, in Kontakt treten. Dabei beginnt die Bildung von Plättchenaggregaten, die schließlich in der Aktivierung des Koagulationssystems endet.

In vivo Experimente zeigen einen Abfall in der Anzahl von Plättchen, wenn sie durch einen Dacron Wollfilter geleitet werden, ebenso zeigen sie Unterschiede in den ADP (Adenosindiphosphat) induzierten Plättchenaggregationen bei Plättchen, die vor und nach der Filtration gewonnen werden. Bemerkt wurde die Bildung von Thromben, die vom Kontakt der Plättchen mit der Membran des Dialysators cuprophan herrührt. Es sollte bemerkt werden, daß Heparin die Tendenz hat, diese Probleme zu verstärken, allerdings unter dem Hinweis, daß es die Plättchenaggregation in vitro hervorruft und in einigen Fällen wird dies aus immunologischen Gründen hervorgerufen.

Heparin ruft eine Neutropenie in vitro und in vivo hervor. Es konnte gezeigt werden, daß bei einer Konzentration von 0,2 IU/ml das Anhaften von Neutrophilen an Nylonfasern erhöht wird.

Jüngste Experimente haben gezeigt, daß der Alternativweg des Komplements aktiviert wird, wenn das Blut mit entweder der Cellulosemembran des Dialysators, den Silikonpolymeren in der Oxigenatormembran oder aber Nylonfiltern in Kontakt kommt, wobei dieses mit einer Leukopenie und einer Leukozytenaggregation einhergeht. Cpa ist der Faktor, der die Neutropenie und Leukozytenaggregation hervorruft. Es scheint wahrscheinlich, daß die Plättchenaggregation durch den Ausstoß von Leukozytenthromboxan A₂ hervorgerufen wird und daß derselbe auch der Plasmafaktor ist, der für die Heparin induzierte Plättchenaggregation in vitro benötigt wird. Der Heparin inhibierende Effekt auf Prostazyklin sollte zu diesem Phänomen gezählt werden.

Aggregationsexperimente, die mit heparinisiertem plättchenreichem Plasma durchgeführt wurden, und bei denen hohe ADP-Dosen hinzugefügt wurden, zeigten die Aggregatbildung und das Vorhandensein eines Fibrinnetzes, welches nur um jedes Mikroaggregat nachgewiesen wurde. Dies war allerdings nicht der Fall bei einer Entfernung größer als 200 μ«ι, wobei eine vollständige Koagulationshemmung durch Heparin nachgewiesen wurde. Dieses Phänomen war selbst bei Heparinkonzentrationen von 50 IU/ml nicht vermeidbar. Es wird angenommen, daß der Plättchenfaktor IV-Ausstoß die Heparinaktivität zwischen der Plättchenoberfläche und seiner Mikroumgebung neutralisiert und das Heparin nicht fähig ist, die Transformation des Plättchenaggregats in weiße Thromben zu verhindern, sobald das Aggregat eine kritische Größe erreicht hat.

Es wurden verschiedene Lösungen dieses Problems versucht. Im besonderen:

(a) Verfahren, bei denen Heparin an die Polymere gebunden wurde, um auf diese Weise eine nicht thrombenbildende künstliche Oberfläche zu erhalten, sowie die Anwendung von Prostaglandinen und Albuminen. Es wurden ebenfalls Versuche unternommen, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der verschiedenen Materialien zu verändern;

(b) die in vivo Anwendung der Plättchenaggregations-Inhibitoren wie z. B. Aspirin und Sulfinpirazon, mit denen gute Ergebnisse bei der Verhinderung der Thrombocytopenie und einem verminderten Thromboserisiko erreicht wurden, obwohl in diesen Fällen die Hämostasis des Patienten schwierig zu kontrollieren ist;

(c) die mögliche Anwendung von Heparinen mit geringem Molekulargewicht, da gezeigt werden konnte, daß diese Heparine eine geringere Wirkung auf die Plättchen haben als Heparine mit hohem Molekulargewicht und daß Fraktionen, die eine hohe Affinität mit Antithrombin III aufweisen, wahrscheinlich eine geringere Aggregation hervorrufen als diejenigen mit einer geringen Affinität.

Andererseits betrifft die vorliegende Erfindung ein Heparin, welches frei von Aggregations-hervorrufenden Effekten auf die Segmentkernige ist, und dabei das Entstehen von Nebenwirkungen vermeidet und sie betrifft weiter ein Verfahren zur Gewinnung des besagten Heparins.

Die folgende Technik wurde für die quantitative Messung der Aggregation von Humanneutrophilen in vitro angewendet:

(a) Isolation der Humanneutrophile:

Venöses Blut (heparinisiert mit 5 IU/ml) wurde mit einem Drittel seines Volumens mit Dextran bei Raumtemperatur für 90 Minuten versehen (6 % Dextran in physiologischer Lösung mit 0,3 molarem Phosphatpuffer, pH 7,2 (PBS)). Der überstand wurde bei 400 g für 5 Minuten zentrifugiert und der Niederschlag in 1 ml HBSS-A suspendiert (die Tanklösung enthält 0,5 g 0,5%iges Albumin. Sie enthält kein Calcium, da es einen inaktivierenden Effekt auf Segmentkernige hat). Calcium wird im Aggregometer hinzugegeben.

Verunreinigungen von roten Körperchen wurden einer 20-sekündigen Lyse durch 6 ml destilliertes Wasser unterworfen und 2 ml 3,5%ige Natriumchloridlösung hinzugegeben. Danach folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 40Q g und eine Resuspendierung des Niederschlag in 5 ml HBSS-A.

Die Suspension wird in eine 5 ml Ficoll-Hypaque gebracht und bis 400 g für 35 Minuten bei 4⁰C zentrifugiert.

(10 ml 9% Ficoll; 4 ml 33 % Hypaque, Dichte: 1090).

Der so erhaltene Niederschlag (button) sollte 95 bis 99% Segmentkernige enthalten.

Danach wird mit HBSS gewaschen und in 1 ml resuspendiert und die Zellen gezählt. Die Beschaffenheit (feasibility) wurde durch essentielles Färben mit 90%igem Tripanblau gemessen.

Die endgültige Suspension wurde auf 10.000 bis 15.000 Segmentkernige pro mm³ gebracht.

(B) Aggregationstechnik

Die Aggregation der Segmentkernigen erfolgte nach dem Verfahren von Craddock unter der Verwendung

τ;

eines Crono Log 240 Aggregi
Road, Hovertown, Pa.19083).

τ;

eines Crono Log 240 Aggregometers (West Park

Die Aggregation wurde durch die Zugabe von 50 μΐ Heparin ausgelöst und die Zunahme der Lichttransmission auf einer Skala aufgezeichnet, die das auf eine maximale Transmission mit 50 % (V/V) einer segmentkernigen Verdünnung in HBSS-A geeicht ist.

Das Endvolumen in der Küvette betrug 500 μΐ und die Konzentration der Segmentkernigen war 9x10 Segmentkernige/ml.

um die höhere oder niedrigere Aggregationsaktivitat von Heparin zu bestimmen, wurde die MAC als das Minimum der Aggregationskonzentration in μg/ml Heparin definiert, welches einen im Aggregometer feststellbaren Aggregationseffekt hervorruft.

Figur 2 zeigt die Aggregometerkurven in einem Experiment mit verschiedenen Heparindosen. Es ist ersichtlich, daß je höher die Heparinkonzentration ist, umso größer die Abweichung der Nadel ist, welches die Aggregation der Segmentkernigen ist.

Es wurde dann ein Experiment durchgeführt um zu zeigen, daß sich die Aggregationsaktivitat gleich verhält wie die Heparin:

Heparin wurde auf eine Sepharose-AT III-Säule adsorbiert und anschließend mit einem Natriumchloridgradienten eluiert. Sowohl niedrige (LAH) und hohe (HAH) AT III Affinitätsfraktionen wurden isoliert.

Diese beiden Fraktionen wurden dann bezüglich ihrer Aggregationswirkung getestet und wie aus der Kurve von Fig. 3 ersichtlich, wirken nur diejenigen Moleküle als Aggregantien, die an AT III adsorbiert wurden und die alle Eigenschaften von Heparin aufweisen.

Schließlich wurde noch ein Experiment durchgeführt, bei welchem gezeigt wurde, daß Segmentkernige einen besonderen Rezeptor für Heparin aufweisen. Es wurde nachgewiesen, daß andere auf Segmentkernige wirkende Aggreganzien auch dann noch aggregierend wirken, wenn die Segmentkernigen zuvor teilweise mit Heparin stimuliert wurden, oder anders herum, Heparin wirkt auch dann noch auf Segmentkernige, wenn diese zuvor schon durch andere Aggreganzien stimuliert wurden (Fig. 4a und 4b). Andererseits ist die Aggregation inhibiert, wenn die Zellen zuvor mit einem Heparin vorbehandelt wurden, das eine geringe Aggregationsaktivität hat oder wie nachfolgend bezeichnet, mit einem nicht thrombenbildenden Heparin und sie daraufhin einer Aggregation mit Heparin unterworfen werden sollen (Fig. 4c). Dies bedeutet, daß beide Heparine denselben Rezeptor haben, aber daß das Heparin, egal ob es ein aggregierendes oder kein aggregierendes Heparin ist, auf der Oberfläche der Segmentkernigen einen anderen Rezeptor hat als die bekannten Aggreganz ien.

Das nicht Thromben erzeugende Heparin, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, wird durch Gelfiltration gewonnen. Im folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben:

600 g Darmschleimhautheparin vom Rind wurde auf eine Biogel P-30, 24x200 cm Säule (erhältlich bei Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA) gebracht und mit 0,5 M NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 7,4 eluiert. Es wurden Fraktionen zu je 500 ml aufgefangen.

Das Molekulargewicht wurde mit Dextransulfaten von bekanntem Molekulargewicht als Kontrollsubstanzen bestimmt. Das Molekulargewicht der untersuchten Heparine reichte von 40.000 bis 10.000 Dalton.

Die antikoagulierende Aktivität des Heparins wurde mit der Methode, wie sie in US-P XX, 1980 beschrieben ist, berechnet.

Die Bitter und Muir Methode wurde zur Bestimmung der Heparxnkonzentration verwendet.

Fig. 5 zeigt eine charakteristische Reinigung.

Die Fraktionen A und C der Bio-Gel P-30 Säule (Fig. 5) wurden genommen und es wurde eine Alkoholfällung mit 5 Volumen 96%igem Ethanol durchgeführt, um so Salzüberschüsse abzutrennen und das Heparin zu konzentrieren, danach wurde auf +5⁰C abgekühlt und über Nacht präzipitiert. Der überstand wurde dekandiert und die Heparin enthaltende Paste wurde filtriert und mit einem Ethanol-Wasser-Gemisch (5:1)

gewaschen. Schließlich wurde der Niederschlag getrocknet, bis der Ethanol verdunstet war und der Feuchtigkeitsgehalt hinnehmbare Werte angenommen hat. Die Ausbeute bei diesem Durchflußverfahren (process of passage) aus handelsüblichem Heparin (Pharmacopea Argentina oder USP-artige Qualität) an nicht thrombenbildendes Heparin betrug 70%, bezogen auf die gemessene Substanz oder 73 %, bezogen auf IU. Der so erhaltene Niederschlag wurde lyophilisiert.

Das nicht thrombenbildende Heparin zeigte die folgende analytische Beschaffenheit:

Aktivität: 170 USP/mg

Aggregation: MAC ^ 40 units (gemäß der

zuvor beschriebenen Technik)

Aussehen: amorphes hygroskopisches

Pulver

Farbe: weiß

Geruch: geruchlos

Schwermetalle: gemäß USP XX

Gesamtstickstoff: id.

Proteine: id.

1 % Lösung p/ü pH: id.

Feuchtigkeit: 2 %

Fieber erzeugende

Stoffe: keine

Toxizität: gemäß USP XX.

Aus den gegebenen Erklärungen und den zuvor beschriebenen Techniken kann gefolgert werden, daß

1. in der Farmacopea-artigen Qualität Heparin in Fraktionen existiert, die Neutrophile und Segmentkernige in vitro aggregieren lassen.

2. dieses Phänomen die Neutropenie, die in Patienten unter Heparin gefunden wurde, erklärt und ist mit dem Verstopfen von Filtern bei der Hämodialyse verwandt ist.

3. andere Heparineigenschaften, eingeschlossen diese, die in der Famacopea berichtet werden, keine Anomalien zeigten. Zum Beispiel wurde mit Heparin keine Plättchenaggregation in vitro beobachtet. Die KCCT (Kaolin-Cephalin-Koagulationszeit) Messungen in Patienten unter Heparin erwiesen sich als normal.

4. diese Ergebnisse zeigen, daß das thrombenbildende Risiko, das bei handelsüblichem Heparin auftritt, durch das Vorhandensein einer Fraktion hervorgerufen wird, die die Fähigkeit aufweist, Neutrophile zu aggregieren.

5. eine aggregierende Aktivitätseinheit (aggregating activity unit) beschrieben wird, wobei die MAC (minimale aggregierende Konzentration) dazu dient, ein nicht thrombenbildendes Heparin zu definieren und es von einem thrombenbildenden Heparin (handelsüblichem Heparin) zu unterscheiden: wenn die MAC größer als 40 μg/ml ist, dann ist das Heparin nicht thrombenbildend, da Werte unter 40 ug/ml zu dem handelsüblichen Heparin gehören, das die zuvor beschriebenen Nachteile aufweist.

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Im folgenden wird eine ausführlichere Erklärung der zuvor erwähnten Figuren gegeben:

Fig. 1 zeigt ein extrakorporales Fließschema während des Hämodialyseverfahrens. Das Patientenblut wird von der Vene (1) zu der Dialysepatrone (3) mittels der Pumpe (2) gepumpt, die Dialysepatrone ist in die Waschlösung (4) getaucht, die wiederum vom Tank (5), der eine Temperatur von 37⁰C hat, versorgt wird und die verbrauchte Lösung durch den Auslaß (6) entfernt wird. Heparin trifft auf das Serum im Tank (7) und das abgezapfte Blut (stripped blood) geht durch den Filter (8), der mögliche thrombenartige Aggregate zurückhält, um dann in das korporale Kreislaufsystem durch Kanal (9) zurückzugelangen. Die Filter werden nur einmal verwendet und dann verworfen, Patronen werden verwendet und ungefähr viermal mit Formaldehyd gewaschen.

Dosierung: Zuerst 5000 Iü/ml Heparin werden

mittels einer 1,2 ml Bolusinjektion zu Beginn appliziert und dann tropfenweise 1 ml/Stunde während der vierstündigen Hämodialyse.

Fig. 2 zeigt die Aggregation von Segmentkernigen (PMNs), die durch erhöhte Heparinkonzentrationen hervorgerufen wird.

Fig. 3 zeigt die PMNs-Aggregation, hervorgerufen durch verschiedene Heparinfraktionen, die durch AT III-Sepharose-Affinitätschromatographie gewonnen wurden. HAH = Heparin mit

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einer hohen AT III Affinität (high AT III affinity heparin), LAH = Heparin mit einer niedrigen AT III Affinität (low AT III affinity heparin).

Fig. 4a zeigt die PMNs-Aggregation, die durch das chemotaktische Agens PMLP bei einer PMNs-Inkubation mit Heparin hervorgerufen wird.

Fig. 4b zeigt die Heparin induzierte PMNs-Aggregation bei einer PMNs-Inkubation mit FMLP.

Fig. 4c zeigt die Aggregation von PMNs, die mit einem nicht thrombenbildenden Heparin (HNT) vorbehandelt wurde und anschließend einer Behandlung mit thrombenbildendem Heparin (HT) unterzogen wurde.

Fig. 5 zeigt eine Bio-Gel P-30 Chromatographie von Rinder-Natriumheparin, 600 g Heparin wurden auf eine Bio-Gel P-30 Säule 20x200 cm aufgebracht und mit 0,5 M NaCl, 5 mM Tris HCL, pH 7,4, eluiert, wobei Fraktionen zu 500 ml genommen wurden.

A-&, Heparinaktivität (USP/ml) , (mg/ml) ,

. . 100/minimale Aggregationskonzentration (MAC)

(100 ml/ng).

OWGlNAL INSPECTED

Claims

Patentansprüche

1. Ein nicht thrombenbildendes Heparin, welches frei von aggregierenden Wirkungen auf Segmentkernige ist, dadurch gekennzeichnet , daß es die folgende analytische Beschaffenheit aufweist:

Aktivität: 170 USP/mg

Aggregation: MAC ^ 40 units

Schwermetalle: gemäß USP XX

Gesamtstickstoff: id.

1 % Lösung pH p.u.: id.
Fieber erzeugende

Stoffe: keine

Toxizität: gemäß USP XX.

2. Ein Verfahren zur Gewinnung von Heparin nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch das Aufbringen von normalem Heparin auf eine molekulare Piltratxonssäule, die ein Gel enthält, welches Moleküle auftrennt, die zwischen 1500 und 35000 Dalton liegen, die Elution mit einer Lösung, die einen pH im Bereich von 6 bis 8 hat, das Sammeln der Fraktionen und das Abtrennen und Lyophilisieren des so erhaltenen, nicht thrombenbildenden Heparins.